REPLICAÇÃO DE DNA

Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Conteúdo...Conteúdo...

- Replicação do DNA e ciclo celular;

-Origem de Replicação;

-Mecanismos básicos de replicação

- Fases da replicação*Início*Alongamento*Término

GENÉTICA BACTERIANAGENÉTICA BACTERIANA

- O DNA bacteriano é circular;- O cromossomo de E. coli, por exemplo, contém cerca de 4 milhões de pares de bases e é aproximadamente 1000 vezes mais longo que a célula.

Estrutura da dupla hélice

1953: Watson and Crick

Estrutura espacial da dupla héliceEstrutura espacial da dupla hélice

Replicação do DNAReplicação do DNA

DNADNADNADNA

RNARNA

ProteínaProteína

Replicação

Transcrição

Tradução

Trasncrição Reversa

Escherichia coli

Escherichia coli

1

2

3

4

Replicação do DNA x Ciclo Celular


TEMPO DE GERAÇÃO: 20 MINUTOS



“O ciclo de replicação e início da formação do septo

ocorrem bem antes do processo de divisão”

Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação

Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação

- Metilação – DNA hemi-metilado- Ligação física com a membrana- Garante que a origem será ativada uma vez por ciclo





Eucariot

os

Região do DNA onde a replicação começa

Origens de procariotos e eucariotos – ricas em AT

Procariotos, plasmídeos e vírus - uma origem

Eucariotos – várias origens

E. coli – região de 245 pb essencial à replicação

4 seqüências de 9 pb - TTAT(C/A)CA(C/A)A

3 seqüências de 13 pb ricas em AT

INÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEMINÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEM

OriC d

o cr

omos

som

o de

E.col

i

OriC d

o cr

omos

som

o de

E.col

i

1- Complexo inicial

1- Complexo inicial

52 kDa52 kDa

autocooperaçãoautocooperação

2- Complexo aberto

2- Complexo aberto

3- Complexo pré-priming3- Complexo pré-priming

HU e HU e IHFIHF

DnaB - DnaB - helicasehelicase

Proteínas presentes na origem de replicação de E. coli

DnaA Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos

DnaB (helicase) Desenrola o DNA

DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem

HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação

Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA

Single strand binding (SSB)

Liga a fita simples de DNA

RNA polimerase Facilita a ação da DnaA

DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita

Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC

Processo semiconservativo

Início da replicação - Origem

Movimento da forquilha de replicação

Unidirecional ou bidirecional

Direção da replicação

5’ 3’

Semi-descontinuidade da replicação

O processo pode ser dividida em:

- Inicio da replicação- Forquilha de replicação- Terminação

Regras básicas do processo de replicação

Regras básicas do processo de replicação

A replicação do DNA é semi-conservativa?A replicação do DNA é semi-conservativa?

A replicação do DNA é semi-conservativa

A replicação do DNA é semi-conservativa

Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958

Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958

Cultivo em meio14NH4Cl

Cultivo em meio15NH4Cl

Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl


Semi-conservativa

Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

1. Origem + Término

2. Durante um ciclo celular, a origem de replicação pode ser ativada mais de uma vez em procariotos e uma vez em eucariotos

3. O cromossomo de uma célula procariótica constituem um único replicon

4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons

INÍCIO DA REPLICAÇÃOINÍCIO DA REPLICAÇÃO

A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado

A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado

O genoma bacteriano circular constitue um único replicon

O genoma bacteriano circular constitue um único replicon

A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min

Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

O genoma eucariótico constitue vários repliconsO genoma eucariótico constitue vários replicons

A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min

Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes

Fase S demora ~ 6 h em uma célula somática

A replicação é bidirecional em

procariotos

A replicação é bidirecional em

procariotos

MOVIMENTO DA FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO


MOVIMENTO DA FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO


A replicação é unidirecional em

eucariotos

A replicação é unidirecional em

eucariotos

DIREÇÃO DA REPLICAÇÃODIREÇÃO DA REPLICAÇÃO

A adição dos nucleotídeos para o alongamento da cadeia é SEMPRE no sentido 5’-3’

SEMI-DESCONTINUIDADE DA

REPLICAÇÃO

SEMI-DESCONTINUIDADE DA

REPLICAÇÃOA replicação ocorre de maneira contínua em uma das fitas e descontínua na

outra fita


Procariotos - Genes menores- Cromossomo circular- Bidirecional- UMA ORIGEM

Eucariotos- Genes e cromossomos

maiores- Unidirecional - VÁRIAS ORIGENS

ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA

ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA

Helicases (DnaB)

DNA Polimerase

Primase

SSB (Single Strand Binding Protein)

Topoisomerases

DNA ligase

PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI

PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI

SSB Liga a fita simples de DNA

DnaB (helicase) Desenrola o DNA

Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA

DNA Polimerase III

Sintese da fita nova

DNA Polimerase I Preenche as lacunas e remove os primers

DNA Ligase Liga os fragmentos

DNA girase Superenrolamento

DNA POLIMERASES

E PRIMASES

DNA POLIMERASES

E PRIMASES

As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicaçãoAtividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação

DNA POLIMERASESDNA POLIMERASES

E. coli - DNA

Polimerase I

# polipeptídeo de 928

aa, replicação e reparo

de DNA

E. coli - DNA

Polimerase I

# polipeptídeo de 928

aa, replicação e reparo

de DNA

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas

Pol IPolII PolIIIPolimerização 5’ 3’ + + +Exonuclease 3’ 5’ + + +Exonuclease 5’ 3’ + - -

Número de subunidades 1 4 10Tamanho em kDa 103 90 ~900

Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000

Eucariotos - DNA polimerases

- primase

e - reparo do DNA

- replicação do genoma nuclear

- replicação do DNA mitocondrial

Bacteriófagos - T4 DNA Polimerase

Outras - Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus)

Pfu DNA polimerase (Pyrococcus furiosus)

DNA POLIMERASESDNA POLIMERASES

Thermus aquaticus

-Estável a temperaturas de 177 graus;

-Estável a temperaturas de 177 graus;

Temperatura Ótima: 72 graus

Temperatura Ótima: 72 graus

TAQ DNA POLIMERASETAQ DNA POLIMERASE

Forquilha de ReplicaçãoForquilha de Replicação

A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA

Fita contínua

Fita descontínua

Síntese da Fita descontínua

Síntese da Fita Contínua

REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA

Fita contínua (líder)

Fita descontínua

Fragmentos de Okazaki:

1000 a 2000 nt (PROCARIOTOS) 100 a 200 nt (EUCARIOTOS)


Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua

A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA

A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas

A DNA ligase sela as quebras

Síntese das fitas contínua e descontínua é independenteSíntese das fitas contínua e descontínua é independente

A DNA ligase sela as quebrasA DNA ligase sela as quebras


O complexo de replicaçãoO complexo de replicação

A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha

Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas

O primossomo afasta uma das fitas molde

Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas


Da origem ao término da replicaçãoDa origem ao término da replicação

Problema!!!Problema!!!

Término da replicação- genomas lineares

Término da replicação- genomas lineares

REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR: o modelo demonstra o surgimento de extremidades não pareadas após a remoção dos

primers no final da replicação

Término da Replicação

Formação de Concatâmeros

Término da replicação

Telômeros

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