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REPLICACIÓN DEL ADN
Tres modelos de replicación del ADN
•La replicación del ADN es semiconservativa
•Una de las cadenas (parental) se conserva y
actúa como templado o molde para la síntesis
de la cadena complementaria
El modelo de Watson y Crick de la replicación del ADN
Modelo de Watson-Crick de replicación
1. Doble hélice original
2. Las cadenas se separan
3. Las bases complementarias
se alinean al templado
4. La ADN polimerasa
une los nucleótidos
alineados en una nueva
cadena contínua
1958 – Matthew Meselson y Franklin Stahl
Pruebas experimentales de lareplicación semiconservativa
•¿Como diferenciar a la cadena parental de la cadena hijadel ADN
•Se les ocurrió incorporar de manera controladaisótopos pesados de 15N a la nueva cadena sintetizada
Transfer to 14N
Etc.
Invalidates
conservative
Invalidates
discontinuous
• Es un proceso complejo que ocurre durante lafase S del ciclo celular
El mecanismo molecular de la replicación del ADN
Dos etapas : iniciación y elongación
1) Iniciación
Consiste en desenrollar a la doble hélice en el origen de
replicación y mantenerla así hasta que se posicionan las
proteínas de iniciación y el primosoma.
ADN ds
Horquilla de replicación
Mecanismos de síntesis de ADN en E. coli
Inicio de la replicación en E. coli
La síntesis de ADN comienza en el genoma bacteriano en un sitio
específico denominado ori C y termina en un punto fijo denominado ter C.
Las bacterias tienen un solo origen de replicación
Tanto en procariotes como en eucariotes la replicación es bidireccional.
ADN de E. coli
Origen de replicación
ter C (terminacion)
El origen es rico en AT
Replicación de DNA: iniciación
Mecanismo de iniciación
•El ADN se relaja en el origen de replicación con la
ayuda de las proteínas de iniciación.
•El ADN de doble cadena se “funde”
• La helicasa también se une a las proteínas de
iniciación y utiliza energía para desenrollar al
ADN.
Helicasas:Grupo de enzimas que usan energía para romper
los enlaces de H.
Se unen al ssDNA y se mueven en dirección 5’-3’.
5’
3’3’
5’
origin
helicase
Se requiere la síntesis de un iniciador para que
comienze la DNA polimerasa
•Las dos cadenas de DNA son antiparalelas•La síntesis de DNA:
• Se lleva a cabo de manera continua en una cadena
• De manera discontinua en la otra cadena
La síntesis de DNA es semidiscontínua
• Con una cadena adelantada y otra retrasada
5’
3’
3’
5’
Cadena contínua
adelantada5’3’
5’3’ Cadena retrasada
discontínua
Dirección de replicación
5’ 3’
origen
La DNA polimerasa no puede inciar la síntesis
Sin un extremo 3-OH libre.
La RNA primasa crea un iniciador corto de
RNA para proporcionar una extremo 3’-OH
para para que la DNA pol III inicie la síntesis
La helicasa y la primasa forman un compejo en
la horquilla de replicación (RF=replication fork)
denominado primosoma
•La helicasa separa las dos cadenas de DNA en la
horquilla de replicación
•La primasa hace los iniciadores de RNA tanto en
la cadena adelantada como en la retrasada.
•La primasa se mueve en la dirección 5’-3’
5’
3’3’
5’
origen
helicase
primasa
La primasa no requiere un 3’-OH libre.
Inicia de manera contínua en la cadena
retrasadaadelantada
retrasada
Primasa:
5’
3’
Se mueve en la dirección
5’-3’ sintetizando al
iniciador
Iniciador de RNA
5’3’3’
5’
La primasa se une a la helicasa para formar al
primosoma. La primasa es activada por la helicasa
Proteínas de unión al DNA de cadena simple
(ssDBP): Estabilizan al ssDNA, para que las
• Cadenas no se re-asocien entre cadenas
complementarias o intramolecularmente.
• Protege al DNA de la degradación
• Estímula a la DNAP III.
Síntesis de ADN: Elongación
• La elongación es semi-discontínua
•La síntesis de la cadena retrasada del DNA se lleva
a cabo en fragmentos de 1000-2000 bp denomi-
nados como fragmentos de Okazaki.
•Okazaki encontró fragmentos de DNA unidos a
pequeños iniciadores de RNA.
The Mechanism of DNA Replication: Elongation
Las cadenas de DNA son antiparalelas
La síntesis de DNA ocurre de
manera contínua en la cadenaadelantada y de manera dis-
contínua en la cadenaretrasada.
•La primasa reinicia muchas veces
en la cadena retrasada.
•El primosoma se mueve en la direc-
ción 5’-3’.
•La primasa hace los iniciadores
en dirección 5’-3’.
Mecanismo de síntesis de ADN en E. coli
DNA Polimerasa (DNAP)•Adiciona nucleótidos al extremo de la cadena creciente de
ADN. Requiere de un templado o molde.
•Sólo puede añadir nucleotidos en la dirección 5’ a 3’•Requiere de un 3’-OH libre para polimerizar
•Adiciona nucleótidos complementando al templado
Hay tres tipos de DNAP (I, II y III)
Pol III es la enzima responsable de la síntesis de
las nuevas cadenas
Pol I es responsable de la remoción de los iniciadores
de RNATres actividades en las DNA polimerasas
1) Actividad polimerasa 5’-3’
2) Actividad exonucleasa 3’-5’ (edición)
3) Actividad exonucleasa 5’-3’ (degradación de iniciadores)
Después que ocurre la replicación del DNA, se deben
remover los iniciadores de RNA de los fragmentos
de Okazaki y unir las piezas sueltas.
No hay RNA en la cadena final, entonces:
• se debe remover el iniciador de RNA
• reemplazar con nucleótidos de DNA
• unir los fragmentos de DNA
Los fragmentos sintetizados de DNA de la cadena
retrasada deben de ligarse
Función de la DNA
polimerasa I
• remover el iniciador
de RNA (exonu-
cleasa 5’-3’)
• Rellenar los huecos
con nucleótidos de
ADN (polimerasa
5’-3’)
DNA ligasa:
Requiere ATP para sellar las muescas y crear el enlace fosfodiester
También, durante el desenrollado del DNA, se
forman nudos adelante de la horquilla de
replicación que deben ser eliminadosRF
Overwound ahead of fork
tension
Topoisomerasas:
La enzima topoisomerasa II (una girasa), corta
ambas cadenas de DNA para aliviar la tensión
creada por el superenrollamiento
Ejemplo: tratar de separar los dos hilos de
un cordel y notar como se crea superenrolla-
miento y tensión adelante del sitio de apertura
y a medida que se abre más, el enrollamiento
Se incrementa y se traslada hacia adelante.
Las toposiomerasas alivian este problema.
Bidirectional replication of a circular chromosome
Topoisomerases:
Consiste en la síntesis enzimática in vitro de millonesde copias de un segmento específico de ADN
REACCIÓN EN CADENA DELA POLIMERASA (PCR)
PCR: Polymerase Chain Reaction
(Reacción en cadena de la polimerasa)
•Es una técnica desarrollada en 1983 por
•Karen Mullis que permite sintetizar DNA in vitro
de manera enzimática.
•K. Mullis recibió el premio Nobel de química 10
años después
•Una muestra pequeña de DNa puede amplificarse
exponencialmente mediante PCR
•Es una de las técnicas más útiles y poderosas de
la Biología Molecular
MECÁNICA DE LA PCR
ADN molde, ADNpol, dNTPs, iniciadores, buffer
PCRgel de agarosa
Mezcla de reacción
ADN genómico
Mezcla de reacción de PCR:
ADN templado
Iniciador 1
Iniciador 2
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq polimerasa
Buffer PCR
H2O
Programa de PCR
temp, tiempo función
94 oC, 1 minuto desnaturalización
60 oC, 1 minuto alineamiento DNA-iniciador
72 oC, 1 minuto alargamiento del DNA
35 ciclos
Termociclador: Aparato de PCR para proporcionar
el programa requerido (temperatura y tiempo) para
amplificar ADN
Termociclador Hybaid
para 24 muestras
Termociclador Perkin
Elmer para 48 muestras
UTILIDAD DE LA PCR
•Diagnóstico clínico de patógenos como virus, bacterias,
micoplasmas de animales o de plantas.
•Para detectar y diagnosticar mutaciones causantes de
enfermedades hereditarias.
•Diferenciar un organismo transgénico de uno no transgénico
•Generar huellas genéticas de animales o plantas
(analisis forense, criminalístico, paternidad, etc).
•Usos especiales en biología molecular e ingeniería genética
A B C D E Yellow Mosaic on Okra leaves
2 036
1 636
1 018
506, 517396
PM
(pb)
M b 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 M
Panel A Panel B
Caracterización molecular del agente causal del
mosaico amarillo de la okra en Guerrero, México.
Marcadores
de ADN
indicativos
de geminivirus
Amplificación por PCR de secuencias específicas del
promotor 35S y de NPTII en ADN de Arabidopsis
transformada y de A. tumefaciens C58C1(pBI121)
Detección de
plantas
transgénicas
1, 2: f. sp. coffeae 3, 4: f. sp. ciceri5, 6: f. sp. radicis-lycopersici7, 8: f. sp. lycopersici9: garbanzo
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
RAPDs con cuatro formas especiales
de Fusarium oxysporum
Iniciador 09 Iniciador 14
