“UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE TLAXCALA”

Ingeniería en Biotecnología

Microbiología Aplicada

PROFESOR:

Ricardo Hernández Martínez

REPORTE DE PRÁCTICA:“Conservación de cepas fúngicas por liofilización”

ALUMNAS:Elizabeth Maldonado Lima

María Itzel Maldonado Vásquez

GRUPO: 5to “B”

FECHA DE ENTREGA:05 de Abril de 2013

“Conservación de cepas fúngicas por liofilización”

OBJETIVO:

Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

Conservar un cultivo puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación.

Obtener células genéticamente estables.

INDICACIONES DE SEGURIDAD:

1. Verificar que el área de trabajo esté limpia y proceder a la desinfección.2. Verificar que la balanza esté nivelada y limpia para poder iniciar el pesado de medio de

cultivo.3. Colocar cuidadosamente la autoclave y los materiales a esterilizar para prevenir accidentes.4. Verificar constantemente para que no tenga problemas al estar esterilizando.5. Sacar el material estéril con guantes protectores para evitar quemarse con los materiales

estériles.6. Cuidadosamente sembrar la cepa biológica para evitar contaminación.

Términos específicos.

Medio de cultivo: medio que contiene los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de microorganismos en condiciones de pH y temperatura favorables.

Agar: es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C.

Esterilización: método de eliminación de cualquier forma de vida microscópica.

Liofilización: La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo vacío.

INTRODUCCIÓN:

Desde hace mucho tiempo los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener cultivos microbianos a manera que las propiedades que los hacen importantes, permanezcan estables (1).La preservación de cepas debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de dichos cultivos. El conocimiento de las peculiaridades de las disímiles técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento continúo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos es difícil, ya que deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.

El método de conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable(1).

LIOFILIZACIÓN:La liofilización es un proceso de deshidratación de productos bajo baja presión (vacío) y moderada temperatura. En la liofilización no ocurre la evaporación del agua a partir del estado líquido - normal en procesos de secados - sino la sublimación del hielo. Por este motivo los productos deben permanecer obligatoriamente solidificados (congelados) durante el secado.

La liofilización es un conjunto de procesos – no solo el secado – y en ello el material resultante se presentará seco, pero con todas las características del producto original - forma, color, aroma, sabor y textura estarán preservados en el producto seco. Eso diferencia y destaca el proceso de liofilización de los otros utilizados en deshidrataciones (2).

CONGELAMIENTO:

En las liofilizaciones, los congelamientos de los productos son las etapas principales, pues interfieren directamente en las apariencias y en las cualidades de los productos finales. No hay una regla general para la fase de congelamiento de todos los productos que pueden ser liofilizados - es necesario determinar experimentalmente cada producto.

En muchos casos, cuando una solución acuosa es enfriada, la cristalización del agua se inicia abajo de su punto de solidificación. En este momento, en un sistema en lo que haya falta de enucleación, el producto se podrá tornar super frío (muy frío) y la cristalización se realizará precipitadamente por un simple choque físico.

Si un producto es rápidamente enfriado podrán ocurrir formaciones de cristales irregulares que, fatalmente, imposibilitarán un secado uniforme. Esto – comúnmente – ocurre en los congelamientos realizados en los interiores de las propias cámaras de secado de los liofilizadores y es uno de los motivos que nos llevó a preferir desarrollar y recomendar el uso de congeladores.

Congelamientos lentos llevarán que el agua contenida en el producto forme grandes cristales de hielo con formación de estructuras relativamente abiertas después del secado (sublimación). Grandes cristales (puntiagudos), también, pueden romper las membranas celulares de los productos.

Congelamientos rápidos producirán cristales pequeños que aglomerados dificultarán el pasaje y la retirada del vapor de agua, sublimándose durante el secado.

La técnica más adecuada para cada producto deberá ser individualmente ensayada tomando en cuenta, entre otros factores, el perfil de la temperatura, el recipiente que lo contiene, la conductividad térmica del recipiente y del producto y el ambiente super frío (congelador). También la concentración y la viscosidad del producto influenciarán decisivamente en todo el proceso. Evitándose disociaciones y super frío las propiedades originales de los productos serán preservadas y, por tanto, métodos reproductivos y controlados deberán ser utilizados (2).

En el proceso – liofilización - el congelamiento del producto es un factor determinante por definir la cualidad y el aspecto final del producto. Los principales métodos para ejecutarlo son:

1) Enfriamiento por contacto directo del producto con una superficie o ambiente enfriado: es una técnica estática, en la cual el dispositivo enfriador debe permitir una disminución de orden de 1 a 4ºC/min hasta la temperatura segura. Para la mayoría de los productos un freezer comercial -18ºC/-20ºC será suficiente, además de recomendable.

2) Enfriamiento rotacional en un baño refrigerante: es un método dinámico más usado para grandes cantidades de líquidos y tiene dos variantes:

Spin freezer: el frasco montado (puesto) en un dispositivo es girado en su eje longitudinal y el producto distribuido por la fuerza centrífuga, se solidifica en las paredes (Ilustración 1).

Shell freezing: es una técnica similar a la del spin freezer, pero usando un montaje horizontal (Ilustración 1).

Ilustración 1. Muestra las diferencias ente un spin freezer y un Shell freezer.

Para la reactivación de los hongos:

1. Abrir el tubo, bajo un ambiente estéril, añadir 1 ml de agua estéril y dejar reposar durante 30 minutos (rehidratación).

2. Tomar una pequeña cantidad de la suspensión y sembrarla en placas de petri con medio de cultivo.

Es conveniente realizar la reactivación de la cepa almacenada antes de empezar a trabajar con cualquier método, pasándola por un insecto hospedante con la finalidad de comprobar su viabilidad y pureza (2), cabe mencionar que también se puede añadir una pequeña cantidad de agua peptonada para la reactivación del hongo, en caso de que no se obtenga respuesta inmediata de crecimiento.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:

Equipo necesario para el desarrollo de la práctica

1 Cultivo puro de A. Niger 2088

1 Paquete de algodón

2 Mecheros Gasas

3 Matraces Erlenmeyer de 125 mL

1 Incubadora

1 Parrilla de calentamiento

1 Autoclave

1 Matraz Erlenmeyer de 1000 mL

1 Agitador magnético

2 Tubos de rosca

3 Vasos de pp de 250mL

1 Balanza analítica

1 Probeta de 100 mL

Masking tape

1 Asa bacteriológica

Marcador indeleble

1 Espátula

Cubre bocas

Sustancias o insumos

Medio PDA Agua destilada

Leche descremada Alcohol

METODOLOGÍA.

1. Se preparó el medio de cultivo.

2. Se sembraron las cepas por estría en tubo.

3. Se incubó la cepa por 7 días. (Ilustración 2).

Ilustración 2. Cepas inoculadas por estría en tubo después de 7 días. njbjb

4. Una vez esporulada la cepa, se agregaron 5mL Tween 80 al 0.01% estéril para formar una suspensión. (Ilustración 3).

Ilustración 3. Adición de Tween.

5. Se adicionaron 0.5 mL de la suspensión de esporas a cada matraz y se incubó por 7 días (Ilustración 4).

Ilustración 4. Cepas de A. Niger 2088.

6. Una vez esporulada la cepa, se cosechó con 20mL de leche descremada al 10% (Ilustración 5).

Ilustración 5. Adición de Leche descremada.

7. Se colocó la suspensión de esporas en un recipiente especial para la liofilizadora y se congeló a -60° C con una mezcla de hielo seco/acetona (Ilustración 6).

Ilustración 6. Congelación.

. 8. Se prendió la liofilizadora asegurándose de

que no tenga fugas para garantizar el vacío, asimismo, se verificó que la temperatura fuera de -80° C. Se colocaron las muestras en el liofilizador y se espero a que se eliminara el agua por completo (Ilustración 7).

Ilustración 7. Colocación de muestras en el liofilizador.

9. Por último, se colocaron las muestras liofilizadas a tubos ependorf, para dentro de 2 meses realizar la prueba de viabilidad de nuestra cepa de A. Niger 2088. (Ilustración 8).

Ilustración 8. Conservación de muestras liofilizadas.

RESULTADOS:

La prueba de viabilidad se realizó añadiendo agua a una pequeña porción de muestra liofilizada, incubándose durante 4 días a una temperatura de 30 °C (Ilustración 9).

Los resultados obtenidos, fueron el crecimiento de la cepa en las dos placas que fueron inoculadas, y arrojaron la aceptación de la viabilidad de la cepa liofilizada de A. Niger 2088.

Ilustración 9. Crecimiento y viabilidad de la cepa liofilizada.

DISCUSIÓN:

La utilización de la liofilización como parte de la conservación de un microorganismo de interés es muy importante en el campo de la biotecnología, esto debido a las grandes ventajas que tiene éste método, resalta el tiempo de supervivencia prolongado. La conservación por liofilización es un método de gran utilidad en el trabajo de las colecciones de cultivos que se emplean para el control microbiológico, como ejemplo (4). Esto puede ser aplicado, en nuestro caso a que en el laboratorio se realizó el mismo método para cepas repetidas, entonces podríamos hacer una sub-clasificación en donde podemos comparar, en un futuro, si hubo cambios estructurales o en sus características físicas, es decir, buscar que si cada equipo realiza pruebas manipulando la misma cepa, determinar cuál de esas cepas se desarrollo de mejor manera, es decir, más viable o estable genéticamente y de ahí seleccionar la mejor para aplicarla en donde se desee.

La implementación de este tipo de mecanismos de conservación a largo plazo para reservar cepas con características de gran interés, resulta una buena opción en los campos como el de la industria, la medicina, farmacéutica, alimentos, entro otros. Por lo cual es conveniente tener los elementos y las condiciones necesarias para la conservación de la viabilidad de una buena cepa. En contraste con los resultados obtenidos durante esta evaluación de la práctica con otros equipos, hubo problemas en cuanto a otras especies en las cuales no hubo crecimiento por parte de la cepa, haciéndonos reflexionar en que las condiciones en las que se dé el crecimiento afectaran directamente a la cepa; sin embargo, con esto podemos tener varias teorías, que en la elaboración de los medios de cultivo o durante la preparación del inoculo no hubo condiciones de esterilización

adecuadas (en caso de tener contaminación); a su vez, también se tuvo el problema de no crecimiento por parte del inoculo, esto se pude deber a que, precisamente el microorganismo no se haya incubado a su temperatura óptima, o no tuviera los requerimientos (nutrientes) necesarios para poder llevar a cabo el proceso de producción.

También se menciona que las sustancias empleadas durante este proceso son muy importantes, ya que estás le brindaron cierta ayuda a los microorganismos, tal es el caso que se consideró que el procedimiento evaluado, mantuvo la viabilidad de los cultivos liofilizados, y entonces se recomienda como sustancia lioprotectora de excelencia la leche descremada (sustancia proteica) por sus buenos resultados en la preservación de la viabilidad en el proceso de liofilización(4), es decir, que entonces con la liofilización lo que hacemos es alentar el metabolismo del microorganismo para pueda conservarse durante un largo tiempo, por ello la utilización de la leche descremada, la cual es rica en esos elementos fundamentales que requiere.

CONCLUSIONES:

Los objetivos se cumplieron y se demostró que la conservación de la cepa liofilizada, se realizó de manera adecuada, aunque falto más tiempo para estar más seguro de ello, ya que se produjeron células genéticamente estables y libres de contaminaciones, puesto que las placas contaron totalmente con las condiciones estériles adecuadas para el crecimiento adecuado de A. Niger 2088. Resaltando la liofilización como una buena opción para conservación de especies fúngicas.

REFERENCIAS:

1. Weng Alemán Z.; Díaz Rosa E.; Álvarez Molina I;”Conservación de microorganismos”: ¿Qué debemos conocer? Revista Cubana de Higiene y Epidemiología, vol. 43, núm. 3, 2005; Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología. Cuba. pp. 1-4

2. Recuperado de: http://api.ning.com/files/r36cjGKKUjHiYZQH-NMo80UEkCPVAiIYsidNyI15yUYlQDCH8ViroxVYM2-kcxgYLQl1ef39s4YBgbVCytr-kKVgvtRESq2U/ManualdeliofilizacinEsp..pdf

3. Castañedo V. y Ames T; Octubre de 2004, “Manual de Laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos” Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Perú. p.49

4. Burguet-Lago N., Sierra-Prado N., Brito-Godoy L.; (1 de Septiembre de 2012); “Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios Liorad”; Laboratorios Liorad, Reparto San Agustín, La Lisa, La Habana. Cuba. Hospital Luisa C. de Gandulfo, Buenos Aires, Argentina.