REPORTE FINAL DEL SERVICIO SOCIAL - …148.206.53.84/tesiuami/UAM7302.pdf · Cromatografía en columna Cromatografia en columna de intercambio ibnico Cromatografia en capa fina Variables

U N I V E R S I D A D A U T O N O M A M E T R O P O L I T A N A

REPORTE FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

1 9 8 5

h

CONTENIDO

I 11 111 I V

v VI V I I

Título del programa Introducci6n Antecedentes Objetivos Actividades desarrolladas Discusibn Conclusibn

VXXZ Resumen Aphdice A, Espectronetrfa Ultravioleta

Espectrofotbmetto ultravioleta Manejo de la muestra Interpretacih de resultados

Espectrofot6metro infrarrojo Preparacidn de la muestra Interpretacibn de espectros

Aphdtce B. Espectrometrla Infrarroja

Aphdice C. Resonancia MagnCtica Nuclear Aparatos Manejo de la muestra Desplazamientos quimicos

Aphdice O. Cromatografia Cromatografía en columna Cromatografia en columna de intercambio ibnico Cromatografia en capa fina

Variables experimentales Preparaci6n de las placas Fase &vil Aplicacibn de las muestras Desarrollo de la cromatografia Detecci6n de las manchas Valores de Rf

Bibliograf ia.

I TITULO DEL PROGRAMA

''Apoyo al estudio y control de muestras, a los estudios de ingeneria y a la actualizaci6n de manuales de administraci6n".

I1 INTRODUCCION

En la evoluci6n del hombre desde la apropiación directa de 10s productos de la naturaleza hasta el cultivo de cosechas y el cuidado de los animales, sus respuestas a las diferencias de los recursos producen variaciones de regiones delimitadas en tipos de actividades econ6micas. Entre los pueblos cuya unidad de or- ganizaci6n era la familia grande o tribu, pudo perfeccionarse una considerable divisi6n de ocupaciones del trabajo, de tal modo que pronto surgieron trabajadores especializados en labranza y produs ci6n agrícola y en ciertas ocupaciones de artesanfa. Con el crecimiento de la familia econhica surge la aldea con edificioq es-

peciales para diversos tipos de produccibn y casas separadas para los trabajadores y sus familias,

Se experiment6 también la necesidad de usar mas tierras, de tal modo que frecuentemente la aldea quedaba separada por consi- derables distancias de l o s campos, pastos y bosques que la man- tenfan, Tuvo que proyectarse un sistema de caminos que facilita- cen el transporte de trabajadores y provisiones entre la aldea y

las zonas de trabajo distantes, pronto la estructura local de 0- cupaciones empez6 a incluir comerciantes, almacenistas, banque- ros y muchas otras de las ocupaciones urbanas conocidas actualmente. 1

Con las facilidades cada vez mayores en la comunicaci6n y

en el transporte, era inevitable que tarde o temprano los resi- dentes de la aldea descubrieran ciertos tipos de artículos que po- dían comprar mas baratos en otras partes de lo que les costlaria producirlos en su aldea, o bien animales y productos agrícolas que no eran faciles de obtener en su entorno, Como resultado de esta

1 Harold H. Mc Carty y James B, Linderg, Introducción a la geogra- fía ecodmica, tr, Adolfo A , de Alba, Fondo de Cultura Económica, Mgxico, 1974, p. 102,

situaci6n surgen los mercados como un sitio específico al que Con- curren gente de distintas regiones con el fin de intercambiar mercancias, Un ejemplo de esta actividad lo constituy6 el tianguis de Tlatelolco en el que **estaban presentes cuantos géneros dd mer- caderías existían en toda la Nueva GspaAa'*. 2

Durante el tiempo que se mantuvo el coloniaje en nuestro país el comercio exterior fué exclusivo con EspaAa, m& una vez lograda la independencia se diversifid grandemente favorecido por el avaz ce de los medios de comunicación y transporte, permitiendo a Méxie co el intercambio comercial con paises tan lejanos como Japdn o Aug tralia, se dice actualmente que '*es tal la interdependencia de los países en el mundo, que todos los sectores de actividad acusan en

mayor o menor medida lo que sucede en otro**. 3

"La competencia en los mercados internacionales, cada vez m6s a- guda, ha obligado a numerosos paises a realizar esfuerzos decidi- dos que permitan a sus productos manufacturados la concurrencia a tales mercados.

Si ello es cierto para todos l o s paises en general, aún lo es mbs para aquellos que, como el nuestro, deben adquirir equipo y tecnología que todavfa no produce y que exige su desarrollo,

Por otra parte, el aprovechamiento parcial de la capacidad instalada de numerosas ramas de la industria nacional, implica mayores costos de producci6n, que es preciso reducir,aumentando la exportacidn y capacitando al pais para que pueda acudir ventajosa- mente al mercado internacional.

Es evidente, por tanto, la necesidad de un régimen de fomento a la exportación acorde con la actaal coyuntura econ6mica nacional e internacional que aumente la producción y ventas de artículos manufacturados al exterior mediante estímulos fiscales a sus produc- tores". 4

2 Miguel Leon-Portilla. Los ant&uos mexicanos a través de sus cró- nicas y cantares, Fondo de Cultura Econ6mica, México 1977, p.113.

3 Manuel Salvat (dire). El desarrollo económico, Salvat Editores,

4 Ley Aduanera y Disposiciones Complementarias, Secretarfa de Ha- EspaAa, 1975, (Grandes Temas, 251, p. 59.

cienda y Crédito Público, México, 1982, p.70,

La Secretaria de Hacienda y Crédito Público es la institu- ci6n encargada de regular las actividades de importaci6n y expor - taci6n pdr lo que en los antecedentes se da una breve reseña de su origen y actividades, se hace mención también de las activida des que delega a la Dirección de Laboratokio Central.

Las operaciones temporales objeto de estudio del Departame2 to de Ingenieria, son descritas ampliamente con el fin de que pueda entenderse las actividades desarrolladas en los estudios de Ingenieria. Se dan tambien los fundamentos para las operaciones de importaci6n y exportación definitivas.

E1 trabajo realizado en el Departamento de Desarrollo se de2 cribe por medio de cuatro muestras en las que se utilizan las técnicas analíticas :lue son usadas con mayor frecuencia en la i- dentificaci6n de las substancias destinadas a este departamento, ellas son: cromatografía, espectroscopía de infrarrojo, de ultravioleta y de resonancia magnética nuclear.

En l o s apéndices se hace la revisión de la teoría, metodolo- gía, instrumental y usos de cada una de estas técnicas analíticas:

Apéndice A Espectrofotometría de luz ultravioleta. , Apéndice B Espectrofotometría de infrarrojo Apéndice C Espectroscopía de resonancia magnética

nuclear. Apgndice D Cromatograf fa :

1. Cromatografía en columna 2. Cromatografía de intercambio i6nico 3. Cromatografía de capa fina.

1x1 ANTECEDENTES

El 8 de noviembre de 1821 se expide el Reglamento Provisional para el Gobierno Interior y Exterior de las Secretarías de Estado y del Despacho Universal, Las bases org6nicas de la RepGblica Mexics na de 1843, le dan el car6cter de Ministerio de Hacienda y el decrg to del 12 de mayo de 1953 le denominan por primera vez Secretarfa de Hacienda y Credit0 Público.

Entre sus atribuciones estan las de dirigir los servicios adua nales y practicar inspecciones y reconocimientos de existencias en almacenes, con objeto de asegurar el cumplimiento de las disposiciones fiscales, las que lleva a cabo a través de la Dirección G=

neral de Aduanas quien entre otras actividades Tiene la de recau - dar los impuestos, derechos y aprovechamientos aduanales y exigir la garantía por las prestaciones fiscales probables.

Resolver sobre las solicitudes de devolución de impuestos y

derechos aduaneros pagados de mas y con,trolar las fianzas y adeu- dos fiscales por operaciones aduanales,

Dictaminar los actos presumibles de infraccibn al C6digo Adus nero y disposiciones relativas. Autorizar y fiscalizar las operaciones de importacibn, exportacih, trhsito y reembarco, retof nos, operaciones temporales y contenedores, asi como la interna- cibn de mercandas de la zona fronteriza al interior del pals.

Aplicar los subsidios otorgados conforme al presupuesto de egresos y las franquicias, exenciones y reducciones de impuestos de acuerdo con la Ley de Industrias Nuevas y Necesarias y de con- formidad con lo establecido por el C6digo Aduanero,

Intervenir en la aplicación de las reglas 8Q y 14Q de la tarifa del Impuesto General de Importaci6n, y en los estudios sobre cuotas arancelarias de importacibn y exportación.

Resolver los recursos de inconformidad por controversia ara= celaria y los asuntos relativos a la clasificaci6n y peritaje a- rancelarios,, para lo cual se auxilia de la Direccibn General de Laboratorio Central que tiene como funciones:

Identificar mediante anslisis y estudios de car6cter qufmico, fisico y de ingenieria, las mercancías sujetas a impuestos de - importaci¿n, exportacih, producci6n y otros,

Realizar peritajes técnicos para la Procuraduria Fiscal de la Federación,

Auxiliar a la Casa de Moneda y a los Talleres de Impresi6n de Estampillas y Valores en la comprobación de especificacibnes de materiales, de papeles de seguridad y tintas de impresibn,

Determinar la calidad de los articulos de consumo de la Se- cretaria de Hacienda y Crédito Público.

Proporcionar asesorfa en la selección y compra de maquinaria y equipo para el uso de la Gecretaria

Proporcionar, previo pago de los derechos correspondientes, servicios y asistencia técnica en aspectos analiticos, de inves- tigación y de ingenieria a instituciones del sector público y

de la iniciativa privada. 2

1 Manual de Organizaci6n del Gobierno Federal, 3a ed,, Secreta- ria de la Presidencia, México, 1976, pp, 261-262.

IV OBJETIVOS

Ratificar lo declarado por los importadores y exportadores, en el caso del Departamento de Ingenieria por medio de balances de masas determinar las mermas y desperdicios que se tienen en las operaciones de importaci6n y exportaci6n temporales. Mientras que en los laboratorios, por medio de pruebas físicas, an6lisis qufmico e instrumental se comprueba que los materiales correspon- dan a la fracción arancelaria a la que han sido asignados,

V ACTIVIDADES DESARROLLADAS

Antes de mencionar las actividades que desempeire en el Depar- tamento de Ingeniería señalaré la importancia y caracterfsticas que tienen las operaciones temporales, con el fin de crear un mar- co de referencia que aclare el funcionamiento de éste Departamento y la necesidad de tales actividades.

"El fin principal de la modalidad del régimen de importaci6n temporal, es el de permitir a las empresas nacionales ofrecer sus productos o servicios a los mercados extranjeros a precios competitivos, contribuir a crear mejores posibilidades de empleo a la mano de obra nacional y permitir la incorporaci6n de insumos naci2 nales, generando divisas,

En efecto al permitir la introducción de materia prima o productos semielabarados sin el pago de impuestos a la importacibn, el industrial abarata sus costos y por tanto encuentra aliciente para producir con fines de exportación.

Teniendo en cuenta que los procesos industriales tienen dif.5 rente duración, acorde con su mayor o menor complejidad, no pueden señalarse plazos uniformes para su realizacibn y por ello se deja a criterio de la autoridad el otorgamiento del plazo en que pueden permanecer dentro del territorio nacional las mercancias extranje- ras sin el pago de importación que les corresponderfano 1

1 Ley Aduanera y Disposiciones Complementarias, Secretaria de Ha- cienda y Crédito Público, México, 1982, p.69,

En el Diario Oficial del miércoles 17 de marzo de 1971 se public6 el Acuerdo que dispone los requisitos a que se sujetar6n las operaciones temporales de importaci6n y exportación a que el mismo se refiere. PRIMERO.- Se sujetaran a las disposiciones del presente Acuerdo las operaciones temporales siguientes:

A. Importaciones temporales de: 1, Materias primas; 2, Productos semimanufacturados; 3 , Productos terminados; 4 , Envases; 5. Moldes, dados y matrices; 6. Piezas, partes, dispositivos, utensilios y aparatos cuando

sirvan como complemento de aparatos, maquinas o equipos destinados a la exportaci6n; y ,

7 , Mdquinas, aparatos y equipos cuando estén destinados a la- bores de reparación o reacondicionamiento.

B. Exportaciones temporales de: 1. Materias primas; 2. Productos semimanufacturados; 3 , Productos terminados; 4. Envases; a) Conteniendo productos nacionales para retornar vacíos al pais; y ,

b) Vacios para retornar al pais conteniendo productos extra2 jeros.

5, Moldes, dados y matrices; 6, Msquinas, aparatos y equipo para su reparación y reacondicionamiento, 7, Prodixtos defectuosos que regresen al extranjero, en un

plazo no mayor de 120 días a la importaci6n de la mercancfa, para substituirse por otros iguales. SEGUNDO,- La autorizaci6n de las operaciones temporales enuncia- das estar6 sujeta al estudio y opinión previa de la Dirección Ge- neral de Estudios Hacendarios y Asuntos Internacionales , la cual

considerara para ello la estructura de capital de la empresa, el acuerdo de abastecimiento interno, la contribución a la balanza de pagos y la utilización de insumos de producci6n nacional.

Las empresas deber6n estar establecidas conforme a las leyes mexicanas y contar con instalaciones y maquinarias adecuadas, TERCERO,- La importaci6n dd materias primas, productos semfmanu- facturados o terminados, sólo se autorizarán si el producto a els borar contiene, como minimo, un 40% de costo de manufactura de origen nacional , CUARTO,- Para los efectos de este Acuerdo, el grado de incorpo- raci6n nacional se determinar6 estableciendo el costo de manufactura de las mercancias exportadas en la forma siguiente:

I,- Materias primas y articulos semiterminados o terminados, iz tegrantes del producto, asi como sus envases puestos en la f6brica que haya realizado el proceso de manufactura final:

a) nacionales b) importados 11.- Combustibles y otros materiales auxiliares necesarios para

la fabricacih, también puestos en dicha f6brica : a > nacionales b) importados 111.- Energia utilizada directamente en la fabricación. 1V.- Mano de obra directa, comprendiendo los salarios y las

prestaciones estipuladas en los contratos de trabajo; y, V.- Depreciación de maquinaria y equipo y amortización de

construcciones e instalaciones, las que en conjunto no excederan d

del 10% del total de las fracciones anteriores. El grado de incorporación'nacional ser6 la proporción que re-

sulte de dividir la suma de estos conce'ptos, excluyendo los inci- sos b) de las fracciones I y I1 entre su total. .QUINTO.- Dentro del m6ximo del 60% del costo de manufactura de importaciones se podr6 conceder la importación temporal de los artí- culos objeto del presente Acuerdo, en los casos en que exista pro- ducción nacional, cuando se demuestre que el precio de los pr$uc-

tos nacionales, tomando en cuenta todos los elementos de juicio necesarios, impida la concurrencia del producto final a los mercados internaciohales. SEXTO.- La Secretarfa de Hacienda y Crédito Público queda facul- tada para autorizar deducciones hasta de un 5% del peso, unidades o valor de la materia prima importada temporalmente, a su retorno al extranjero, por concepto de mermas o desperdicios, de acuerdo con lo declarado en el pedimento de importaci6n correspondiente.

Se entender& por mermas los efectos que se consumen en el desarrollo del proceso de elaboraci6n cuya integraci6n al produc- to que retorna no puede comprobarse; y por desperdicios los residuos sobrante de los efectos después de sometidos al proceso que

con ellos se realice. A diferencia de las mermas, los desperdicios ser6n compro-

bados por la Aduana correspondien,e, haciendo constar su destruc- ci6n total o retorno al extranjero.

Podran autorizarse porcentajes de deducción mayores a los

señalados acreditando su necesidad, Los envases y empaques utilizados para el translado de las

mercancias, tendr6n igual tratamiento que los desperdicios, pero sin sujetarlos a porcentaje determinado. SEPTXM0.- &n el caso de la importaci6n temporal de maquinaria se I autorizar&, a juicio de la Direcci6n General de Estudios Hacenda- rios y Asuntos Internacionales, cuando sirva de complemento a maquinaria ya instalada en la empresa y que por las caracterlsticas del producto a elaborar resulta inconveniente su importación de- finitiva.

Las importaciones se otorgar6n por una sola vez y la produc- ci6n obtenida debera enviarse integramente al exterior del país. OCTAVO.- En el caso de moldes, dados y matrices, la importacih temporal se resolver6 en función de la produccibn nacional, de la finalidad a que se destinen y del volumen de producci6n que resul- tara de su empleo, NOVENO.- Se permiti& la exportaci6n temporal de materias primas y

ar t jcu los semimanufacturados para acabar los o acond ic ionar lo s en e e l e x t r a n j e r o m e d i a n t e p r o c e d i m i e n t o s d e c a r e c t e r i n d u s t r i a l q u e

no s e a p o s i b l e r e a l i q r en e l p a i s , a su r e torno se c u b r i r a n l o s impues tos de importac i6n correspondiente sobre e l valor agregado e n e l e x t e r i o r . DECIM0.- Cuando se exporten envases vacíos que en s u r e t o r n o a l pa i s contengan productos gsvados , éstos Últimos pagarsn impuestos conforme a l a T a r i f a d e l Impuesto General de Importación, exi- g iéndose prev iamente e l permiso de importación, cuando e l produc- to a s € l o r e q u i e r a . DECIMO PRIMERO.- Se a u t o r i z a r 6 l a exportaci6n temporal de m6qui- n a s , a p a r a t o s y equipo para ser reparados o reacondic ionados en e l ex t ran je ro , s i empre y cuando d ichos procesos no puedan r e a l i - z a r s e e n e l p a i s , s u j e t d n d o s e a l pago de impuestos de importaci6n c u a l q u i e r efecto que se les agregue e n e l ex ter ior" ... '*GECXMO TERCERO .- Los i n t e r e s a d o s g a r a n t i z a r 6 n en cua lqu ie ra de l a s f o r m a s p r e v i s t a s por e l CCidigo F i s ca l de l a Federac i6n e l mo2 to d e l o s i m p u e s t o s c o r r e s p o n d i e n t e s , i n c l u y e n d o los a d i c i o n a l e s que procedan m6s e l 10% de todos e l los , por po s ib l e s concep to s de mul tas . DECIMO CUARTO.- La Secretar ia de Hacienda y Créd i to Púb l i co ex ig i - r6 e l permi so de l a Secre tar i a de Indus t r i a y Comercio, e n e l caso de que la mercanc ia se e n c u e n t r e s u j e t a a l régimen de permiso prev io . DECIMO QUINTO*- E l plazo de permanencia en e l p a i s e f e c t o s m a t e r i a de una operacibn temporal ser6 de seis meses, computado conforme a l a s f e c h a s q u e s e ñ a l a e l a r t i c u l o 11 del C6digo Aduanero.

b

La o p e r a c i 6 n d e b e r 6 i n i c i a r s e d e n t r o de los se is meses conta- dos a p a r t i r d e l a f e c h a d e s u a u t o r i z a c i b n p o r p a r t e de l a Secre- t a r i a de Hac ienda y Créd i to Públ ico . A j u i c i o d e l a misma se o t o r - gardn pr6rrOgaS por una sola vez y por un término no mayor de seis meses a p a r t i r d e l a f e c h a d e s u v e n c i m i e n t o . DECIMO SEXTO.- E l régimen de importaciones temporales también PO-

d r6 ser otorgado a f a b r i c a n t e s n a c i o n a l e s p o r 10 que se refiere

al volumen de produccibn destinadas a abastecer a las zonas y pe- rímetros libres de aquellos productos terminados que actualmente son importados sin que esto sea en perjoicio de los elaborados 10- calmente con materias primas nacionales. DECIMO OCTAVO,- El incumplimiento de cualquiera de las obligaciones que derivan de las disposiciones que anteceden implicar6 la pérdida de l o s derechos correspondientes, sin perjuicio de las sanciones y responsabilidades que para el retorno de las mercancias fijen el Código Aduanero de los Estados Unidos Mexicanos y el Reglamento para la expedición de permisos de importacibn de mercancias sujetas a restricciones, en cuya virtud expide los peg misos relativos la Secretaría de Industria y Comercio.

*

1

Corresponde al Departamento de Ingenieria por medio de un balance de masa determinar las mermas y desperdicios del material en régimen temporal que ha sido sometido a manufactura en nuestro país. Para ello una'vez que se recibe la autorización. de ip? portaci6n o exportación temporal, se abre un expediente a la empresa, se investiga su domicilio y número telefónico, se establece contacto con ella para confirmar sus datos e informarse quién es su representante legal y a que domicilio se enviar& la corres- pondencia que este estudio produzca, as$ como la ubicacibn de la planta.

Se enviar6 una solicitud de informaci6n en la que de acuerdo con el tipo de industria se pediran datos como diagrama del proceso, reacciones, rendimientos, datos estadísticos de produccihn, peso, dimensiones.

En caso de que 15 días después del acuse de recibo de la solicitud de información no se hayan recibido los datos requeridos, se enviar6 a la empresa un oficio recordatorio, Si han transcurri- do 15 días después del acuse de recibo del oficio recordatorio y no se ha obtenido la informaci6n solicitada, se enviar6 un segundo oficio recordatorio del que a partir de la fecha de su acuse de recibo se conceden 15 dias para proporcionar lo requerido, de no hacerlo se proceders a cancelar de nuestros controles el expediente de la empresa, retirando el departamento su ingerencia en

tal operación con la consiguiente pérdida de la fianza que la empresa deposit6 ante la autoridad aduana1 correspondiente.

Cuando se recibe la información en el tiempo señalado se

hacen c6lculos preeliminares, investigaci6n bibliográfica y una visita técnica a la empresa cuando el material esté sometido al proceso de manufactura, c o n el fin de verificar la informaci6n de la empresa así cOmo las mermas y desperdicios resultantes del estudio hecho en el Departamento de Ingeniería. El estudio se envía a la aduana correspondiente para que continúe con los tr6- mites establecidos para las operaciones temporales,

En el período del 1Q de j u l i o al 30 de septiembre en el e-

partamento de Ingenieria desempefié las siguientes actividades: 1) Administrativas

Registro de autorizaciones de importación y exportación tez porales, Apertura de expedientes y llenado de tarjetas de control, Búsqueda del número telefónaco de la empresrry comunicaci6n con su representante legal, Llenar formato de solicitud de informaci6n. L; Q.nar formato recordatorio, Llenar formato de cancelaci6n de controles y cancelación normal.

2) Técnico-Administrativas Revisión de expedientes y de información proporcionada por el causante, Redactar oficios recordatorios. Redactar oficios de cancelaci6n de controles.

3 Técnicas Fijar fecha de visita a la empresa.

Las actividades de los otros servicios del Laboratorio Cen- tral estan basadas en lo establecido por la Ley Aduanera: "Articulo 63.- Las mercanccas que se introduzcan al territorio nacional o se extraigan del mismo, podrán ser destinadas a algu- no de los regímenes aduaneros siguientes:

1.- Definitivos A.- De Importación 0, - De ExportaLiÓn

11,- Temporales A,- De Importación a).- Para retornar al extranjero en el mismo estado b).- Para elaboración, transformaci6n o reparacibn, c).- Para depósito industrial.

B.- De Exportacidn a).- Para retornar al país en el mismo estado, y

b) Para elaboración, transformacibn o reparación. 111.- Importaci6n para Reposicidn de Existencias 1V.- Dep6sito Fiscal V.-. Trdnsito de mercancfas." 1

Y

**Articulo 6Q.- La entrada al territorio nacional o la salida del mismo de mercancías debe realizarse por lugar autorizado. Quienes efectúen su transporte por cualquier medio, estan obligados a pre- sentarlos ante la autoridad ad,uanera junto con la documentaci6n exigible. 2

"Articulo 15.- Las mercancías quedarán en dep6sito ante la aduana en los recintos fiscales destinados a este objeto o en aquellos otros autorizados para este fin, con el propósito de destinarlas a un régimen aduanero.

Durante el tiempo en que las mercancias se encuentren en de- p6sito ante la aduana se prestar6n los servicios de almacenaje, an6lisis de laboratorio y vigilancia, y la autoridad aduanera to- mar6 las medidas necesarias para la salvaguarda y protecci6n del

' intergs fiscal y de las propias mercancias. Artfc:.llo 16.- Las mercancías que están en depósito ante la aduana podr6n ser motivo ue actos de conservación, exsmen y toma de

-3, Ley Aduanera y Disposiciones Complementarias, Secretarfa de Hacienda y Crédito Público, México, 1982,-pjbd30 4~,cap$tulo 4 0 , ~ . 2Ibid. Titulo Segundo, Capf tulo segundo, p. 2 3 70

muestras, caso e n e l cual se pagarfin los impuestos que a e l l a s co- rrespondan." "Articulo 25. - Quienes importen o exporten mercancias est6n obliga -

3

dos a presentar ante la aduana un pedimento en l a forma O f i c i a l a- probada por l a , S e c r e t a r i a de Hacienda y Crédito Público, que conten - d r a los datos referentes a l régimen aduanero a l que se pretenden destinar y los necesarios para l a determinación y pago d e los i m - puestos a l comercio ex ter ior , A dicho pedimento se debera acompa- fiar:

1.- En Importaci6n a).- La factura comercial cuando e l valor d e l a s mercancias que

ampare exceda de 10,000 pesos con firma autógrafa, redactada en e 2 pafiol o acompafiada de su traducci6n y con datos suficientes para identif icar la mercancia;

b).- E l conocimiento d e embarque en t r & f i c o marítimo o guia en t rs f i co aereo , ambos revalidados por l a empresa porteadora;

c).- Los documentos que comprueben e l cumplimiento de las ob l i - gaciones en materia de res t r i cc iones y de requis i tos especia les , y

dl.- La comprobaci6n del origen y de l a procedencia de l a s mercancias cuando corresponda, y

11,- En Exportaci6n: a ) , - La factura que exprese el valor comercial d e l a mercancia, b ) Los documentos que comprueben e l cumplimiento d e las obliga-

ciones en materia de res t r i cc iones y de requisitos especiales. No se exigir& la presentaci6n d e facturas comerciales,

Articulo 29.- Presentado e l expediente, la autoridad aduanera pro- cedera, en presencia del sol ici tante, a efectuar e l reconocimiento aduanero de l a s mercancías en e l r e c i n t o f i s c a l o f iscal izado.

Para los efectos d e e s t a Ley, e l reconocimiento aduanero con- s is te en e l ex6men de l a s mercancias d e importaci6n o exportaci6n o de sus muestras, para precisar s u origen, naturaleza, composi- ci6n, estado, cantidad, especie, envases, peso, medidas y demas c a r a c t e r í s t i c a s a f i n d e comprobar e l cumplimiento de las obligaciones establecidas en e s t a Ley, n

3 Ib. Titulo Segundo, Capitulo tercero, p. 24. 4 Ib. Título Tercero, Capftulo segundo, p. 2 7 ,

**Articulo 45,- Las mercandas estan afectadas directa y preferentg mente al cumplimiento de las obligaciones y créditos fiscales gen2 rados por su entrada o salida del territorio nacional,

En los casos previstos por esta Ley, las autoridades fiscales las retendran o procer$n a perseguirlas o secuestrarlas a menos que se compruebe que han sido satisfechos dichas obligaciones y crédi- tos n 5

ffArtfculo 48,- La base gravable del impuesto general de importa- ci6n, es el valor normal de la mercancía a importar,

Por valor normal se entiende el que correspondería a la mer- cancía en la fecha de su llegada al territorio nacional conforme a lo dispuesto por el articulo 3 8 , como consecuencia de una venta efectuada en condiciones de libre competencia entre un comprador y un vendedor independientes uno del otro,

Para la determinaci6n de la base gravable no se tomaran en cuenta las variaciones normales de precios si las mercancias llegan al pais dentro de un plazo de 3, meses a partir de su adquisi- ción, Se entiende por fecha de adquisición la de la factura de venta o la del contrato.

Se estimarfin como variaciones normales de precios, aquellas que se deban a situaciones competitivas de mercado,

Como excepción a lo dispuesto en el psrrafo primero, La Se- cretaria de Comercio, escuchando a la de Hacienda y Crédito PÚ- blico, y en los términos de la legislaci6n respectiva podr6 fijar y modificar los precios oficiales de las mercancías de impor- tación,

En los términos del p6rrafo anterior los precios oficiales se fijarfin o modificarAn, sólo tratdndose de importaciones, que , puedan ocacionar perjuicios a la industria o a la economia nacional y constituirdn la base minima para la aplicaci6n del impuesto general de importaci6n. Articulo 56,- La base gravable del impuesto general de exportaci6n es el valor comercial de las mecandas en el lugar de venta, y deber& consignarse en la factura comercial, sin inclusión de fletes y seguro, Cuando las mercancías referidas tengan, sefíalado precio oficial, se aplicar6 éste si resulta m8s alto que el comercial,

5 Ib, Titulo Tercero, Capitulo tercero, p.29

Cuando las autoridades aduaneras cuenten con elementos para suponer que los valores consignados en dichas facturas no constituyen los valores comerciales de las mercancías, haran la compro- bacibn conducente para la imposición de las sanciones que procedan, Articulo 57 , - Los impuestos generales de importación y exporta- ción se determinarh aplicando a la base gravable establecida en, los artículos 48 y 56, respectivamente, la cuota que corresponda conforme a la clasificación arancelaria de las mercancías.

La base gravable a que se refiere el articulo 48 servir5 también para las determinaciones del impuesto del 2% sobre el valor base del impuesto general de importación .

Los impuestos adicionales se calcularan sobre el monto de 13s impuestos generales de importaci6n o exportación, segGn corresponda, Artículo 59,- Los importadores y exportadores de mercancías deter - minar6n en calidad liquida los impuestos al comercio exterior, para lo cual en el pedimento, bajo protesta de decir verdad, manifeg tardn:

1,- La descripción de las mercancias y su origen; 11.- El valor normal de las mercancías en importación o el va-

lor comercial en exportación y, en su caso el precio oficial; 111.- La clasificación arancelaria que les corresponda, y 1V.- El monto de los impuestos causados con motivo de la irnpor-

tacibn y exportación. Artfculo 61.- Los impuestos al comercio exterior y l(3s dereeos causados se pagardn por los importadores o exportadores en el pla 20 de 15 días h6biles siguientes a aquel en que haya concluido el reconocimiento aduanero, o la verificación fisica de las mercan- cZas en su caso.

El pago se har6 al contado ante la aduana de despacho, excep- to que legalmente deba efectuarse ante otra autoridad, 6

Al Departamento de Desarrollo y Separaciones llegan las mUeS+ I 1 -. , I +,Y : <!Lj , I .

tras”qu& se: reciben por primera vez en el Laboratorio Central a qUie - nes se les har6 un estudio completo con el fin de caracterizarlas (elaboración de protocolo), con el fin de que no haya duda de su identidad, ademas esto permite seleccionar la prueba mas sencilla para realizar su pronta identificaci6n en 1as.ocaciones posteriores en que lleguen al Laboratorio C&ntral,rteR destinadas entonces a otros servicios quienes podr6n comparar sus resultados con le. referencia proporcionada por el Departamento de Desarrollo y Sepa- ciones cuyos protocolos estan registrados con un número al cual se conoce como T. I, (,tarjeta interna).

Se Y *‘

La informaci6n técnica que acompaila al pedimento de importacibn o exportaci6n de la muestra puede ser completa y proporcion nar: nombre comercial, nombre qufmico, fbrmula, propiedades físi- cas y qufmicas, as1 como USOS. Se hars entonces una consulta a la bibliografia especializada con el fin.’& conocer sus pruebas de identificaci6n, prefiriendo hacer las de tipo instrumental que son relatívamente f6ciles y rapidas y que permiten cmmparar los espectros graficados con la referencia indicada en el texto.

En el caso de que la f6rmula o nombre quimico no sea propor- cionado, se intentarb. For el nombre comercial~conocer su f6rmula consultando el Merck Index, Badtler Comercial, Chemical Abstracs,

De no obtener esta información se proceder6 a obtener un espectro de Infrarrojo y & de resonancia de la muestra original que nos de indicios de los grupos funcionales que contiene la molécula, con el fin de tomar las precauciones necesarias en caso de ser sustancias inflamables, t6xicas O explosivas,

J

La metodología para identificaci6n de un compuesto desconocido corrsiste en la determinación de sus propiedades físicas (pun - to de fusión, punto de ebullici6n, solubilidad. etc, $&vterminaci6n de cenizas, an6lis;is orghico elemental, de ellos se puede deducir la presencia de ciertos grupos funcionales que se cxrnprueban por m e d u de reactivos de clasificacibn, como es el caso del reactivo de Tollens para identificar aldehidos o del &cid0 nitroso en el c= so de aminas, Si los datos asf obtenidos junto con los de tipo espectrométrico..no-permiten la eleccibn ae una estructura entre v=

posibles, Se procede entonces a la preparaci6n de derivados,

que solucionen tal problema. En el caso de mezclas se procede primero a la identificacihn de

los compuestos de la mezcla y a la separación de los compuestos indi viduales con el fin de caracterizarlos, utilizando para esto técni- cas como la cromatografia de capa fina, cromatograffa de columna por intercambio iónico, destilación, extracción, etc.

Cuando se hayan realizado todos estos procedimientos y aun no sea determinada con seguridad la identidad del compuesto, puede pe- dirse un estudio de apoyo a los otros servicios del Laboratorio Central que de acuerdo al tipo de muestra puede ser: microbiolbgi- co, de espectroscopfa de masas, de cromatografha de gases, de di- fracci6n de rayos X, de emisión, de información bibligrsfica, etc. Integrando el resultado de este estudio a los datos antes obtenidos se concluye de que compuesto se trata.

t

METIL IONONA

Del Pierck Index' se obtuvo l a s i g u i e n t e información: Irona,- 6-metilionona. C14HiL O , peso molecular 206.32. C 31.5% H 10,75%, O 7.76%. 2s la f ragancia pr incipal de l a s v i o l e t a s , es aislado d e los g i z o n a s d e i r is o d e l o r r i s , La irona es una mez- c l a d e los is6meros alfa, beta y gama ironas, que tienen l a misma f6rmula condensada, Es un liquido ligeramente viscoso, d e co- l o r levemente amarillento, muy estable , no se decolora, En solu- ci6n alcoholica di luida se puede aprec iar e l o lor a v io le ta , Uso: e n perfumería,

Esta es una muestra que ya se ha recibido anteriormente p o r

l o que se t iene un número d e T. I , para s u espectro de resonan- c i a magnética nuclear, por l o q u e sera e s t a l a forma d e i d e n t i f i -

c a r l a ,

2

REACTIVOS

TdtBAC%orucaa d e carbono cloroformo etanol ace tona tetracloruro d e carbono con siloxano

MATERIAL DE V I D R I O

tubos d e ensayo d e 10 x 75mm pipetas Pasteur Tubo para resonancia magnética nuclear ( d e vidrio d e Sx180mm)

MATERIALZS V A R I O S

gradi l la esp6tula un trozo d e franela

ZQUIPO ZMPLEADO

Zspectrómetro d e resonancia magnética nuclear Varian EM-360, 60 MHz

1 The Merck Index, An Encyclopedia of Chemical and Drugs- Martha Windholz ( e d i t o r ) , Merck & Co, I n c , , 9 Q e d , , u.s,a, 1 9 7 6 , p.670

el otro, 1 m1 de tetracloruro de carbono, se observ6 que es m6s

soluble en éste Último reactivo por lo l ue se correr& la muestra en la mezcla de tetracloruro de carbono y tetrametilsilano (TMS). a

En otro tubo de ensayo se coloca lml de la muestra y 1 m1 de la mezcla de tetracloruro d,e carbono-TMS (de grado de pureza para uso de espectroscopía de RMN), se agita hasta obtener una mezcla homogénea y por medio de una pipeta Pasteur se lleva la muestra al tubo de resonancia, cuidando de que esté perfectamente limpio (antes de colocar la muestra, debe lavarse con tetracloruro de carbono, después con etanol y por Último con acetóna, colocandose en la estufa a 110 OC durante 10 minutos con el fin de eliminar cualquier residuo de estos solventes), se debe limpiar con un paño suave el exterior del tubo antes de colocarlo en el espectrómetro con el fin de eliminar las huellas digitales u otras manchas que puedan interferir al correr el espectro.

El aparato debe encenderse al menos 20 minutos antes de correr el espectro y calibrarse con el fin de obtener una adecuada resolu- ci6n, usando los tubos estandares que contienen diversas mezclas de compuestos bien identificados Que permiten un control exacto de la posición en que aparecen los picos. Usando la mezcla de cloro formo-siloxano el espectro debe marcar dos picos,uno en O ppm que corresponde a los protones del siloxano y el que est6 situado en 7 .3 ppm que identifica al protón del cloroformo. Se coloca en fase al espectro, lo cual se comprueba al mantenerse el grsfico sobre la linea horizontal escogida como referencia. S e sustituye el tubo de la soluci6n estándar por el de la muestra problema , se verifica que el TMS nos de el pico en O ppm y se elige la amplitud'del espec - tro, recorriendo el campo manualmente con la pluma graficadora le- vantada t empezando por los números pequeños aumentando paulatina- mente hasta lograr que los picos mayores ocupen aproximadamente el 90% de la altura de la hoja , Se permite entonces que la m&quina grafique el espectro de resonancia magnética correspond&ente a la muestta,

2 El apéndice se C ofrece amplia información de la RMN. 3 El TMS es usado como referencia, su pico qe ajusta a Bppm,

RESULTADOS Se adjunta el espectro obtenido para nuestra muestra trabaja-

da, en é1 se ha marcado la fórmula del compuesto y se rehaciona el tipo de protones con los picos que producen en la resonancia - magnébica nucleat, para esto nos hemos ayudado de la carta de co- rreaación de grupos funcionales (que también se adjunta! para la interpretación del espectro,

DISCUSION. Fracci6n arancelaria solicitada: 29.13 A 0,010 La partida solicitada especifica:

Partida 29.13.- Cetonas, cetonas-alcoholes, cetonas-fenoles, ceto - nas-aldehidos, quinonas, quinonas-alcoholes, quinonas-fenoles, quL nonas-aldehídos y ottas ace ton as,^ quihonas de funciones oxigenadas simples o complejas y sus derivados halogenedos, sulfonados, ni trados, ni trosados,

Subpartida A,- Cetonas, cetonas-alcoholes, cetonas-fenoles,cetonas- aldehidos, qu.Lnonas, quinonas-alcoholes, quinonas-fenoles, quinonas- aldehidos y otras cetonas y quinonas de funciones oxigenadas simples o complejas.

0.010 Iononas. 4

La solución problema es un liquido viscoso de &olor amarillo cla - ro que es soluble en tetracloruor de carbono (C C 1 4 ) , lo que nos per_ mite tener urja soluci6n ideal para el estudio de su resonancia mag- nética nuclear, ya que no existir6 ningún pico atribuible al solvente (ya <lue carece de protones). La compar&pi6n del espectro obtenido con los T. I, (colección de espectros) nos indica que se trata de una mezcla de dos compuestos: 5-(2,66-trimetil-1-ciclohexen-l-il) -4-penten-3-ona. y del 4-(2,66-tri@eti12-ciclohexen-l-il)-3-metil- 3-buten-2-ona, siendo éste Último el que estd presente en mayor pro- porci6n por lo que se le asigna su T. I, correspondiente a la muestra analizada, es jste compuesto el que se muestra en el espectro de in- terpretación de resultados.

.P

CONCLUSION, La muestra analizada es una alfa isometil ionona (metí1 ionona

gama 1. 4 Tarifa del Impuesto General de Importación. Secretaria de Co- mercio. Subsecretaria de Comercio Exterior. Dirección General de Aranceles, Tomo I, México, 1982. pp. 166-167

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N o 9 . o O

t . 1

BIOTINA

[ C H d y too H Hexahidro-2-oxo-1H-thieno b,4-d] imidazole-4-bcido pentanóico;

cis-tetrahidro-2-oxo-thien&[3,4-dJ -irnidazolina-4 &ido valérico; vitamina H; Coenzima R ; Bios 11; Biogpiderm. Cl0 H16 N2 O3 S; peso molecular 244.31~~. C 49.16%, H 6.60%, M 11.47% , 1 19.65%, S 13.12%. Factor de crecimiento presente en toda célula viviente en cantidades muy pequeflas. Interviene en la formación de enlaces de polipék tidos o proteínas. Fuentes ricas en Biotina (menos de 0.0001%) son

el riAÓn, el p&jcreas, la levadura y la leche. Las características que se dan a continuación son de Biotina aislada de rifi6n o leche. (Kegl's Pbiotina). Punto de fusión 232-233°,[~]201-+ 91 (c=l en 0.1 N NaOH). Punto isobléctrico pH 3.5 pH 0.01% soduci6n acuosa 4.5. Solubilidad en agua aproximadamente 22mg/100ml a 25OC, es mas soluble en agua caliente y en alcali dilufdr. Solubilidad en alcohol al 95% de aproximadamente 80mg/100 m1 a 25OC. Insoluble en ofros solventes org&nicos comunes. ';1 compuesto puro es estable al aire y temperatura. En soluciones neutras y mderadamente &cidas es estable durante varios meses, las soluciones alcalinas son menos es-

tables, pero parecen ser razonablemente estables por arriba de un pH de 9. Las soluciones ácidas pueden calentarse para esterilizar las. Es incompatible con ácido nitroso, agentes oxidantes, formal- dehido, cloramina T, y 6cidos y bases fuertes.

A w b .

1

Se tienen nueve muestras procedentes de distintos laboratorios en concentraciones de 1% y 2% de Biotina y como soporte almidh, carbonato de calcio, trifosfato de caicio y dextrina. La revisión de la literatura especializada indica el uso de cromatografia de capa fina para la caracterización de la Biotina, de varias técnicas se eligi6 la que se destribe en párrafos posteriores debio a su gran sensibilidad que permite la separación de la biotina en mezclas en que viene a muy baja concentraci6n.

REACTIVOS

Agua etanol HC1 0.5N

1 The Merck Index, Ob. cit. p p ~ 161-1620

NaOH 0.5N Ac. a c & t i c o g l a c i a l Acetona Metano1 Benceno Cloruro plat inic0 a l 10%

Ioduro d e potas io a l 6%

Iodo met6lico

MATERIAL DE V I D R I O

c6mara cromatogr6fica Matr6z aforado de 5 0 rnl

Jeringa d e 10 1 Vasos d e precipitados de 150 m 1 ( 8 )

vasos d e precipitados d e 30 m 1 ( 6 )

Matraz k i tasa to F i 1 t r o Gooch Var i l la o agitador Pipetas de 1 y 5 m l /

r

MATERIALES V A R I O S

Atomizador (aspersor) Esp6tula Manguera d e h u l e (para conectar a l inea de Vado). Placas de S i l i c a gel FZs4 Merck .

1

EQUIPO EMPLEADO

Balanza a n a l i t i c a P a r r i l l a e l é c t r i c a Agitadores magnéticos

TECNICA,

Las muestras vienen en forma de polvos (blancos), por l o que es necesario probar s u solubilidad con e l f i n d e obtener las solu cienes adecuadas para la apJicaciÓn de l a s muestras sobre l a placa crornatogEafica, los resultados se dan a continuación.

MUESTRA Abril 219 Abril 1436 Mayo 1237 Julio 298 Ago 2206

Sep 124 Oct 595

Oprt 23

To10 471

S O L U B I L I AGUA Z'I'ANOL

D A D

HC1 0,5N -

NaOH 0,5N -

- +

La prueba de solubilidad nos da dos grupos,uno soluble en agua y otro que no lo es, que se trabajaran separados.

Grupo 1 (Muestras solubles en agua), 1) Abre 1436 (1%) 2 ) Sep 124 (2%)

u

3 ) o& 595 (2%)

4 ) Ago 2206 (2%) 5 ) J u l 298 (2%)

6 ) T.1. 4 7 1

Se aplicaron sobre una placa d e S i l i c a Gel F 2 5 4 ( Merck 1 de

10xZOcm soluciones acuosas d e 150 m @ / m l para l a muestra que v iene a l 1% y d e 7 5 mg/ml para l a s que tienen 2% de Biotina, formando bandas d e 1 cm de ancho con 6 fl de cada solución separadas entre sf por 1 cm, como estandavse usa e l T.I. 4 7 1 cuya solución se pre-

par6 como se ha indicado en l a curva estandar. S e c o r r e l a cromatograf ia , se extrae la placa d e l a &mara y se deja evaporar e l s o l - vente . E l revelado nos muestra cinco mandhas blancas con Rf simi- l a r a l d e l T. % usado como estádaq.

Grupo 2 (Muestras insolubles e n agua). 1) Abr 212 (2%)

2 ) May 1231 (2%) 3 ) Ago 2512 (2%)

4 ) O c t 2 3 (2%) S ) T o I. 471

Por l a información proporcionada por los importadores sabernos que e l soporte d e es tas muestras es almidón, siendo e s t e compuesto e l que ocaciona los problemas d e insolubilidad, sus partículas tiel?, den a hincharse y formar suspensiones viscosas muy d i f í c i l es d e ma- ne jar cuando se calientan o usan soluciones alcalinas, tratamientos a los que se sometieron con e l f i n d e incrementar la solubi l idad de

la Biot ina . Suponiendo que l a u n i ó n d e l a B i o t i n a a l almidón fuese de ti-

po super f i c ia l , se pens6 q u e una fuerte agitación de las soluciones acuosas d e es tas muestras puderan de jar l ibre a l a Biotina. Por tan - to se prepararon soluciones d e 500 mg de 50 m1 de agua d e cada mues- t r a y se agitaron a temperhtura ambiente d u r a n t e 1 hora ( sando los agitadores m6s grandes, 4 cm d e longitud,y la m6xima vel cidad d e l a p a r r i l l a magnética 1 3 , después se f i l t r a r o n a vació y se concentra-

;$! 4

3 Se hicieron varios ensayos modificando e l tiegpo.#e a i tac ióh a s í como la velocidad, siendo los resultados O p t l m O S 40s rePoz t ados .

ron mediante galentamiento en estufa de las SOlUCiOneS a Una temp@- ratura de 110 C, ya evaporadas se aplicaron en una placa de silica

F254 (Merck) en forma de bandas ( 6 ~ 1 ) por medio de una jeringa, Se corri6 la cromatografía, se dejó secar la placa y se revel6 con el reactivo iodoplatinato, pudiendo observarse la Biotina libre ya

que las manchas de cada una de las muestras se desplazaron distancias igualas a la recorrida por el esthndar.

Fu En una tercera placa de Silica GelqMerck) se aplicaron seis muestras, eligiendo al azar tres de cada grupo, adem&s del estsndar, se conservaron todas las características iguales a las descritas,fen la preparación de soluciones, en la aplicación de la muestra, la co2ce centraci6n de ellas, la placa usada, el sistema de solventes, cam- biando tan so lo el revelado,el cual se hizo por medio de vapores de Iodo metblico, obteniendo manchas cafés sobre un fondo amarillento con un Rf similar al del est6ndar y distancias aproximadamente iguales a las recorridas por las muestras en las otras placas realizadas,

DISCUSION

En el Apéndice D en la parte correspondiente a la aplicacih de la muestra se indica que debe hacerse en forma de puntos de tal forma que la muestra ocupe la menor area posible en el punto de a-

plicación, sin embargo, debido a la baja concentraci6h de la Bioti- na contenida en las mueStrlEts al revelar las placastuna vez desarro- llada la cromatografía) no era f&il Ilrbsialitasr ?as manchas, ya que al rociar el revelador no se obtiene una superficie coloreada uni- formemente, por tanto es dificil distinguir entre una area que contiene Biotina de otra A no tuvo contacto con la sustancia reveladoca+ por ello se opt6 por la aplicación en bandas que producen t” de mayor extensiÓn,mss f6ciles de observar,

*QhbhQS

Se utilizan las placas comerciales de Silica Gel F254(Merck), así como el revelador iodoplatinato indicado en la técnica original, pero como ambos son caros se ensayan sistemas en que se sustituye esa placa por otra sin marcador isot6pico y se revela con Iodo, obteniendo resultados satisfactorios, ya que siempre se busca encontrar la forma m6s sencilla y económica de identificar una sustancia,

Sabemos que e l valor numérico d e l Rf no es reproducible f i e l - mente entre una y otra pleaa cromatogr&fica, (ver bases te6ricas e n e l Apéndice O), pero como cada placa l leva un estádar de Biotins pura y es en referencia a é l l a comparación d e las distancias reco- rr idas d e cada mancha d e las diversas muestras, E l valor d e Rf es una propiedad c a r a c t e r i s t i c a d e cada sustancia ya que es e l resul-

tado de los numerosos factores que intervienen en l a cromatografia (esto implica miles d e equi l ibr ios que tienen lugar entre e l solvente, soporte y sustancia problema durante e l desarrollo d e l cromatograma), podemos por tanto afirmar que s i las o t ras sa%Uxbaliles aplicadas en l a misma placa se comportan d e igual manera que l a referencia usada, se t r a t a de l a misma sustancia.

La faacción arancelaria sol ici tada es 2 9 - 3 8 A 0 2 0 , se nos dice e n la Part ida 29.38,- Provitaminas y vitaminas naturales o reprodu- cidas por s íntesis ( incluso los concentrados naturales), así como sus derivados, en tanto se ut i l i cen principalmente como vitaminas, mezclados o no entre sf incluso en soluciones de cualquier clase.+ En la faacción A.20 se lee Únicamente e l nombre d e Vitamina H, que es o t r a nomenclatura d e la Biot ina .

En l a informaci6n que los importadores proporcionaron adjunta a l a muestra, se indica s u uso como preaparaci6n estimulante o complemento vitamínico, Como vemos en la faEtcciDÓn requerida no hay es- pecif icaciones cuantitat ivas, &lo se determina e l uso y vemos que e s t e s e cumple.

CONCLUSION, La ident i f icación cual i tat iva por cromatografia de capa fina

de l a s nueve muestras trabajadas nos indica que existen e n e l l a s huellas de Biotina.

* Tari fa d e l Impuesto General d e Importación, Secretaría de Comercio. Subsecretaria d e Comercio Exteriar. Dirección General d e Aranceles, México, 1982. Tomo X , p.146,

FUMEXOL 4m La información proporcionada por el importador es la siguiente:

Estado ffsico: liquido incoloro. Composici6n: Mezcla de alquil ester del &ido fOSf6rico Y conden-

sados de alquilenóxidos” de alcohol graso. uso: agente antiespurnante libre de silicones. Grado de calidad: industrial. Fracción declarada: 3819 A 999

Se hizo una revisión bibliografica para ampliar la informa- ciÓn,rn&s no se encontraron antecedentes de &1 entre los compues- comerciales registrados.

S e hhcieron espectros de infrarrojo y resonancia magnética nuclear de la muestra original mas no son satisfactorios debido a que se sobrelapan los picos de diferences compuestos, por lo que se procede a obtener la materia fija la que se coJocar6 en una columna crornatografica que permita obtener los espectros de las diferentes fracciones (g. &; fader, identificar los componentes de la mezcla.

REACTTVOS

Silica para el desecador Silica Gel para cromatografia en columna Cloroformo Eter Ace tona Metano1

MATERIAL DE VIDRIO Varilla de vidrio Tubos capilares columna para cromatografia con llave de teflón vasos de precipitados de 50 rnl ( 8 )

tubos para resonancia magnética nuclear pipeta de 5 m1 bureta de 100 m1

* Deri-vados del Óxido de etileno

MATERIALES V A R I O S

capsula de porcelana soporte universal pinzas para columna c r i s t a l d e NaCl para espectrofotómetro c r i s t a l de A g C l 1)

EQUIPO EMPLZADO

P a r r i l l a e l é t t r i c a estufa balanza analit ica CspectrofotÓmetro d e In f rarro jo Perkin Elmer 3998

ZspectrÓmetro de Resonancia Magnética Nuclear Varian EM-360

TBCNICA

Determinación de Materia Fija. Una cfipsula d e porcelana se coloca en la es tufa durante 2 ho -

ras a 100-105 C , después se coloca en e l desecador hasta que alcan c e l a temperatura ambiente (aproximadamente 3 0 minutos), se pesa, se coloca en e l l a l a s u s t a n c i a problena y se vuelve a pesar con e l f i n de conocdr e l peso exacto d e la sus tanc ia agregada, se anota y

se coloca en l a e s t u f a durante 2 horas , a l sacar la se coloca en e l desecador para que enfrie , se pesa nuevamente y por diferencia d e

pesos se calcula e l porcentaje d e materia f i j a y v o l 6 t i l .

O

Metodologia d e resolucidn de productos tensoactivos no iÓnicos. Se prepara l a columna conociendo l a cantidad en gramos de l a

mezcla que se quiere separar , se l lenar6 la columna con S i l i c a Gel en la s iguiente re lac ión : por un gramo de muestra se usar6n lOOg d e soporfie, llenando l a columna a una a l tura d e 7 a 10 beces s u diámetro.

Se coloca e n l a columna un poco de disolvente con e l que se iniciara. la cromatografía, se agrega un pedazp d e algodón compri- miéndolo en la base d e l a columna por medio de una v a r i l l a con e l f i n de q u e no queden en é l burbujas de a ire , entonces se agrega l a s i l i c a g e l suspendida en e l p r i m e r disolvente, se abre la l lave por l a que s a l e e l solvente, mientras que l a s i l i c a va formando e l empaque, se agrega s f l i c a g e l suspendida en disolvente hasta que se obtiene la altura deseada, entoces se coloca otro pedazo d e algoden

en 10 a l t o de l a columna, se debe cuidar que e l n i v e l del sovente siempre cubra l a capa de algodón para e v i t a r que l a Columna se Se-

que y no de una separación adecuada, 1

La muestra se disuelve en aproximadamente 1 m1 d e cloroformo y por medio de una pipeta se apl ica en la parte superior d e l a CO- lumna y se somete a l s iguiente programa de elución:

1) cloroformo 100 m 1 2) cloroformo-éter 99:l 3 I cloroformo-éter 5 0 : S O

4 ) cloroformo-acetona 5 0 : S O

5 ) cloroformo-metano1 95:5

6 ) cloroformo-metano1 90+10

7 ) cloroformo- metanol 6 6 : 3 3

8 ) metanol 10 o Con un f l u j o aproximado de 1 rnl/min se colectan las dis t intas

fracciones en vasos de precipitados y se evaporan sobre una parri- l l a , e l concentrado d e cada eloato se aplica por medio d e un tubo Capilar sobre l a superficie de un c r i s t a l d e Na C 1 sobre e l cual se forma una pelicula al evaporarse completamente e l solvente, se Coloca en c r i s t a l e n e l espectrofotómetre y se obt iene as1 e l espectro correspondiente a cada eluci6n. En l a s tres últ imas fraz ciones debe usarse un c r i s t a l d e cloruro de plata ya que e l meta- no1 como solvente d e naturaleza polar disuelve a s a l de sodio.

2

RESULTADOS

S e adjuntan los espectros de in f rarro jo de los ocho eloatos, se ha marcado sobfe e l los los dis t intos movimientos y &tomos que producen los diversos picos mostrados en dichos espectros.

DXSeUST6N E l ppograma de eluci6n a que se ha sometido l a muestra en l a

columna cromatogr6fica tiene como f i n obtener en la f racc ión c lo- roformica los materiales no polares como hidrocarburos, esteres monohidricos y ácidos grasos d e cadena larga,

En l a f racc ión 2 se e lu i rán los t r ig l i cér idos y alcoholes d e

cadena larga, l o s alquilfenoles, acidos grasos y aditivos no sur- factantes ,

1 En e l Apéndice D se dan los fundamentos d e l a cromatografía

2 Se hace una amplia r e v i s i b n d e la espectroscopia en Infrarro- en columna,

j o en e l Apéndice B

(%I 33NVUIYJSNW

3

3

c

. - .

1

3

3

3

3.

3.

3

bJ

O

O

c

O

o

En 10s eloatos 3 y 4 se tendrh los COm~UeStOS no ióniCOs S 2

lubles en aceite como: Eicidos grasos etoxilados y alqUi1 fenoles con un número inferior a 4 moles de Óxdo de etileno y monoéster de glicerol,

Las fracciones 5 y 6 eluyen tensoactivos no iónicos altamente hidrofílicos que contengan 10 moles de Óxido de etileno y poli oxietilenglicoles,

Las fracciones más polares ( 7 y 8 ) eluyen aditivos no surfaz tantes altamente hidrofilicos como glicerol y polioxietilenglico- les de alto peso molecular.

Los espectros importantes son los correspondientes a l o s eloa tos 1, 2 y 7 que nos permiten identificar alcoholes, ácidos grasos y 6cido fosfórico en la muestra analizada.

Las bandas caracteristicas observadas en el espectro de alcoholes resultan del alargamiento O-H y alargamiento G O , estas vibraciones son sensibles al enlazamiento de H (formación de pue; tes de hidr6geno1, Los modos de alargamiento C-O y flexi6n O-H no constituyen modos vibracionales independientes debido a que se

acoplan con las vibraciones de los grupos adyacentes, Alargamiento O-H libfe dan picos agudos en 3650-3584 cm"

(2.74 - 2.79prn1, pero sólo son observables en la fase de vapor o en soluciones muy diluidas de un solvente no polar. El enlazamiento de H intermolecular aumenta a medida que se incrementa la concentración de la solución y bandas adicbonales empiezan a apa recer a frecuencias menores, 3550-3200 cm" (2.82 - 3,13+4m), banda intensa en la región 1260-1000 cm'' (7.93-10.0/tm) del espectro. E1 modo de alargamiento C-O se acopla con la vibraci6n de alargamiento C-C, así que en los alcoholes primarios la vibra- ci6n podría describirse mejor como una vibración de alargamiento C-C-O asimétrica. 21 modo vibracional se complica adicionalmente por la aamificacidn y por las insaturaciones alfa y beta,

Alargamiento C-O. en los alcoholes y fenoles producen una

Flexi6n O-H, en el plano ocurre en la regi6n general de 1420- 1330 Cm-' (7.04 - 7,52fm). En alcoholes primarios y secundarios la flexiljn O-H en e1 plano se acopla con las vibraciones de abanL c0 C-H para producir dos bandas; la primera cerca de 1420 cm" (7.04$&)y la segunda cerca de 1330 cm" (7.52 *, sin embargo es- ?

bandas son de poco valor diagnbstico. LOS alcoholes tercia_ tios en que no puede efectuarse el acoplamiento, Illanifiestan u-

na banda simpme en esta región. 3

Los &idos carboxilicos tienen como movimientos caracterrs ticos el alargamiento O-H, alargamiento COO, alargamiento C=O y flexi6n O-H.

Los dfmeros de ácido carboxilico manifiestan una absorcidn de alargamiento O-H intensa y bastante amplia en la regi6n de 3300-2500 cm" (3.03- 4.Opm).

turados absorben cerca de 1760 cmw4 (5.60)fm). 21 grupo C=O en 10s &idos alifaticos saturados y dimerizados absorben en la rqp:.3n gi6n de 1720-1707 cm" (5.81 - 5.86pm).

Alargamiento C=O, los monómeros de los 6cidos alif6ticos sa%!-

Alargamiento C-O y FlexiÓn O-H. Dos bandas que se originan del alargamiento C-O y de la flexión O-H aparecen en el espectro de los ftcidos aarboxílicos cerca de 1320-1210 crno1(7.58-8.26pm) y cerca de 1440-1395 cm-'( 6.94 - 7-17? m) respectivamente, Las dos bandas implican cierta interacción entre el alargamiento c-0 y la flexión C-O-H en el plano. La banda de mayor intensidad Cerca de 1315-1280 cm" (7.60 - 7.81.m) para el caso de 10s dimeros, generalmente se considera como la banda de alargamiento c-0 Y por lo general aparece a modo de doblete en el espectro de 10s 6cidos grasos de cadena larga. La banda de flex168 C-0-H Cerca de 1440-1395 cm" (6.94 -7.17 m) es de intensidad moderada Y Se pregenta en la miema región que la vibración en tijera CH Y+

/ a 2 del grupo metileno adyacente al carbonilo.

Las vibraciones que caracterizan al grupo fosfato son alar- g ami en to P-OH en una banda intensa en

"

1040-910 ~m-~(9.62-11.0pm), alargamiento P-0-C alifstico que puede producir un doblete en 1050-970 cm-l(g.52 -10.30p) y al rededor de 830- 740 cm" (12.05- 13.51 m) como una banda intensa. 5

3 Silverstein M. Robert, et al. Identificación espectrométrica de compuestos orghicos, Ed. Diana, México, 1980, pp. 104-106.

4 Ib. PP. 214-115. T k i d a m nn. 139. IGa-

2.- Material d e vidrio: vasos de precipitados de 3 0 m l . v a r i l l a de vidrio (como agitador) f i l t r o s de v i d r i o sinterizado de 100 m 1 (Shoots) matraz Kitasato de 500 rnl.

/I Go? 6cb.

matraz Kitasato de lQS m l D columna para cromatografía con l l a v e de tef lón de 10mm-

de diámetro por 300 mm d e lOngitUd.de color ambar. 0

pipetas de 5 m l .

probeta d e 100 rnl

matraces volumétrico de 100 m l . 3.- Mateltiales varios:

c6psula de porcelana espdtula Celdas de cuarzo d e 1 cm piseta de paso para l e e r e n l a papel indicador pH r e g i ó n u l t r ~ v i o l e t a . algod6n franela. manguera ae pldstico para conexión del matraz Kitasato

a l a l í n e a d e vacio. papel aluminio.

4.- Equipo empleado estufa balanzq a n a l í t i c a desecador EspectBofotÓrnetro de Infrarrojo Perkin Elmer 3998

TECNICA. . \ . . , 3 t'

% de Humedad.- En una capsula de porcelana t"-do (colocada en estufa durante 2 horas a l l O ° C y después colocada e n un desecador para que e n f r í e y pueda obtenerse s u peso exacto sin humedad, debe manipularse con pinzas para evitar que e l co.ntacto con l a s manos a l t g r e s u peso constante) se pesa 1 g d e l a muestra y se seca a l O S o C de 3 a 4 horas, se enfrfa en desecador y por diferencia de

pesos se obtiene e l porcenta je d e humedad.

% d e Inerte,- ParaAeparar e l i n e r t e d e l a vitamina BI2 pesar e n un f i l t r o Goosch b~~%dexlOOmg. d e muestra seca. Lavar esto con a- gua destilada hasta q6(e no queden residuos d e col@s ro jo pero s i n

Q p30

http://lOngitUd.de

exceder 60 ml, filtrar al vacío y recolectaf el filtrado caantita- tivamente en un matraz Kitasato de 125ml. El filtrado se lleva a 100 ml. en un matraz volumétrico y se protege de la luz (forrando el matraz con papel aluminio), rotularlo como soluci6n A,

El filtro con el inerte se seca a 105OC durante una hora y media y posterioomente salcular el porcentaje de inerte por diferencia de pesos. Cuantificacibn de Vitamina B12 libre de inerte.

1,- Activacibn de resinas de intercambio: Pesar 2.5 g. de dietil-amino-etil-celulosa (DEAE) y suspenderla

en 100 m1 de solucitjn de &ido dorhidrico 0.5N, dejar reposar durante media hora, filtrar al vacfo en filtros de vidrio sinterizado (Shoots) con capacidad de lOOml y lavar con agua destilada hasta pH 4. Resuspender la resina en 100 m1 de hidr'6xido de sodio 0.5N, dejar reposar media hora, filtrar y lavar con agua hasta pH neutro.

Pesar 205 go de carboxi-metil-celulosa y suspenderlos en 100 m1 de hidr6xido de sodio 0,5N, dejar reposar durante media hora, f i l -

trar y lavar hasta pH neutro, Resuspender en 100 m1 de soluci6n de acid0 clohidrico 0.5N, dejar reposar media hora, filtrar y lavar hasta pH neutro. 2.- Empaque de columnas.

Cada resina se empaca en una columna, colocando primeramente fibra de vidrio o algodón al fondo de la misma, postefi.mente se llena con la resina. La de DEAE a una altura de 14 cm y la de CMC a 10 cm, en la parte superior de cada una se coloca un tap6n de al- godrjn, cuidando de no dejar secati la resina. 3,- Separaci6n de impurezas.

De la solución A tomar 2 alicuotas de 5 m1 cada una. Una de ellas se lleva a 100 m1 en un matrcqs volumétrico con agua destilada(so1u- ci6n B), La otra alfcuota se pasa por la columna de DEAE eluyendo con agua destilada, el eluente coloreado se recoledta en un matres volumétrico de 100 m1 hasta llegar a la marca de afore, al igual que las soluciones y B se pro9ege de la luz forrando con papel alumni0 su superficie y se rotula como solución C.

Estas soluciones (B y C) se leen en el espectrofotómetco de luz ultravioleta a 361 nm contra un blanco de agua destilada, cuidando que el aparato est& encendido con 15 minutos de anticipaci6n y

manteniendo las celdas limpias y manipulandolas por las caras o-

pacas.

de soluci6n de cloruro de sodio al 1% y las retenidas por la CMC con 100 m1 de soluci6n de 'pacido ac6tico 0.02N. Despu&s de eluir cada columna deben ser lavadas con agua destilada hasta pH neutro, desempacarse, almacenaraas suspendidas en agua tapandolas perfectamente hasta que se utilicen nuevamente.

Las impurezas retenidas en la coluana BEAE se eluyen con 100 m1

8

Resultados, Peso de la cspsula &pUb a&. 54.9082 g.

It w I? It

If I? t1 W 11 n

It + muestra 56.0321 seca 55,9694 .

Peso del filtro 6- &e, n tf n n & muestra 11 0 It W después de lavar y

secar 18.9232

Lectura en el espectrofot6metro en la regi6n ultravioleta: soluci6n B soluci6n c

0.56 0.55

CALCULOS:

% de',%ufi4dad

x 100 5.58% 1.1239 4

% de Inerte

% de Vitamina 812 Prktico. (% V. B12 P)

- x "nrp = % de vitamina BI2 prktico A 1 C

donde: A= absorbancia leida en el espectrofot6metro U.V. C= concentraci6n de I'a muestra expresada en g 2071: factor de conversib.

Solucidn B - x m - m x - M 100 = q.1 96 v B ~ ~ P sonl. B A' 1 0056 1 C 207

s<?luci¿3n C

% de Impuerzas Practico

%impurezas pc&ctico= % V B12P soln. B - % V B12 P sol%

B) Pureza Vit. B12

% V B12Pr6ctico

% V B12 Te6rico -54.1% X 100 -533 X 100 = 98.15% pureza V BI2

C) % Impurezas te6ricas.

(%impurezas Vit B12) (%impurezas prsctice) %impurezas te6ricas

% V B12 pr:ctico

S DISCUION ; I . L C * -

. .. . r - P -

En- fa fraccibn arancelaria declarada puede leerse: .- e'g.38 A 027 polvo desecado"prdven~~nte de la fermbntación b-ac- *teriana, conteniendo de 45$-al..55% de ci-anocobalamina, 'peetudOc0- - balaminas, cbbalaminds, Xale&%i.nerales, residuos protéidos, impurezas colorantes e inertes. 4

En el texto vemos que existe un rango en el contenido de vitamina por ello e.s necesario que nuestro an&lisis sea cuantitati- vo, por lo que ser6 necesario una cuidadosa determinación de pesos y volúmenes. En la técnica de an6lisis se usa la gran solubilidad de la vitamina BI2 que nos permite separala completamente de su soporte usando un pequeño volumen de agua, lo que puede c o ~ probarse con simple inspeccidn visual, ya que la vitamina e s de

4 Tarifa del ... Ob. cit. p. 183

un color rojo oscuro mientras que e l soporte es bEanco, S e a- provecha tanbrirén s u doloraci6n para obtener medidas d e absorbancia e n un espectrofotómetro ultravioleta comparando dos aLi cuotas de l a vitamina, una antes de pasarla por l a s columnas d e intercambio iÓnico y l a o t r a después d e e l l o , l a s l e c t u r a s correspondientes nos permiten sacar por diferencia e l contenido de impurezas coloridas ( con e l f i n de asegurarnos que l a dismi-

n u c i d n es debida a sustancian retenidas en l a s columnas es que se toma l a precaución de c u b r i r los matraces y d e u t i l i z a r colum nas d e color ambar), Otra d e las precauciones que se toman es man mantener l a s columnas de celulosas en l a s mejores condiciones (se cuidar6 que durante s u 880 se mantengan siempre húmedas, yas que de secarse se dañarían irreversiblemente), pues eswn material de importación sumamente caro,

Se hacen varias lecturas d e cada solución en diferentes lap- sos d e tiempo, obteniendo l a misma lec tura , lo que comprueba que las soluciones son estables y cumplen por tanto el requerimiento para la ap l i cac ión d e la espectrofotometria,

CONCLUSION' Los calculos realizados nos dan un contenido d e vitmina BI2

de 54.1% 1.85% de impurezas. E l soporte fué iddntificado mediante observación al microscópio somo harinas s i l íceas fósiles,

t5

dor) se realizan otras pruebas que confirmen los resultados y se somete a la supervisi6n del jefe del departamento antes de elaborar el reporte final.

Es notorio el contraste que ofrece el poco espacio dedica- do a la parte correspondiente a las actividades desarrolladas en el Departamento de Ingeniería y se debe principalmente a que las actividades fueron de tipo administrativo y a que no fuf autorizada a mostrar como ejemplo algGn estudio para la deter- minacidn de mermas y desperdicios, por no haber realizado yo el estudio y a la existencia de censura en cuanto al manejo de datos o procesos que son considerados como secreto industrial; por el mismo motivo no se proporcionan nombres comerciales o a las empresas a que pertenecen las muestras que se ofrecen como ilug tracidn del trabajo realizado en el Departamento de Desarrollo.

CONCLUSION

Del conocimiento de las atribuciones correspondientes a el Laboratorio Central y de las actividades que desarrolla vem08 que se cumplen los objetivos propuestos.

VI11 RESUMEN

La Secretarfa de Hacienda y CrCdiCo PGblico a travhs de la Direcci6n General de Aduanas autoriza y fiscalixa las operacíz ne5 temporales y contenedores, ass como la internacidn de merca2 d a s de la zona fronteriza al interior del pais. Ademds de intervenir en la aplicaci6n de las reglas 8Q y 14Q de la Tarifa del Impuesto General de Importaci6n y en los estudios sobre cue tas arancelarias de importacidn y exportacih.

El fin principal de la modalidad del &gimen de importa- ci6n temporal es el de permitir a las emprespls nacionales ofrecer sus productos o servicios a los mercados extranjeros a precios competitivos, contribuir a crear empleo a la mano de obra nacional y permitir la incorporaci6n de insumos nacionales gene-

La energía absorbida por la molécula puede aumentar las vibraciones o rotaciones de sus átornos o bien promover electrones a niveles energéticos superiores, La frecuencia particular de ra- diación que puede absorber una molécula dada, depende de los cambios vibracionaleC rotacionalespblectfonicos permi tidos en diahhc molécula, En la figura 2 se muestra un diagrama las caracteristicas del espectro electromagnético como su energía, longitud de onda, frecuencia, número de onda, así como la clase de transición que provoca en las moléculas y el tipo de espectroscopia usado en las regiones espectrales,

0

a(\

Por razones prscticas, la regítjn ultravioleta se divide ordinariamente en ultravioleta cercan@ o de cuarzo (regi6n en la cual el aire y el cuarzo son transparentes), que incluye la región de 200-750 nm (2000-7500 % , y el ultravioleta lejano o de vacío. Los espectrofotómetros Cary Q Beckmann determinan convenientemente los espectros en la región cercana, aunque las determinaciones a longitudes de onda de 200-220 nm sblo son confiables bajo condiciones especiales, se disponer, de instrumentos que pueden utilizarse hasta 175 nm. El ultravioleta lejano también requiere de técnicas especiales, ya que el aire que hay en el trayecto de la luz absorbe intensamente en esta región y no son fácilmente asequibles los instrumentos adecuados.

c I ^ \ u b @

El espectro ultravioleta se origina por excitaciijn electrbnica de la molécula con la luz irradiante, la consecuencia m6s importante, cuando se est6 interesado en estructuras quimicas, es que estos espectros peñalan la presencia de insaturaciones en la molécula absorbente, Esto se debe a qua coh pocas excepciones, solo las molé- culas que contienen enlaces múltiples tienen suficientes estados excitados estables para originar absorciones en el ultravibleta cer cano. A s í , los hidrocarburos saturados, los alcoholes y los éteres son transparentes en esta región, Adembs, las olefinas monofuncionales, los acetilenos, los ácidos carboxilicos, los esteres, las a- midas y las oximas, tienen máximos de absorción fuera de la región cercana (a urjos 200 nm) y sólo muestran el final de la absorción,

-

Otro grupo de compuestos que comprende a los aldehidos, cetonas compuestos alif6ticos nitrados y los ésteres de nitrato se caracte-

FIGURA 3 . Orbitales y r*. (a) Orbital de enlace, v. Ambos electro- . nes ocupan el orbital de enlace. El orbital de enlace tiene un pfano nodal en el plano de la molkcula. (b) Orbital antienlace, z.*. Un elec- trcin en el orbital de enlace, uno en el orbitd de crrltredace. Un orbital =* (untienluce) tiene un pluno nodd fior/wndic:~lar (11 fikrrro de

la molécula y bisectando el enldce carbono a ccllhono. .

Silverstein, ob. cit . , p. 245, -

- . . . .

Tabla 1 Datos de absorción para cromóforos aislados

Ejetnplo . .

"

EtilCnico

AcetilCnico Carbonilo

Carbonilo Carboxilo Amido

"Azometino Nitrilo A Z O

Nitroso '

Nitrato

Nitro

Nitrito

Sulfóxido

Sulfona

RCH=CHR Etileno

R - - W - R Acetileno RRI C=O Acetona

RHC-o Acetaldehído RCOOH Acido acético RCONHl Acetamida >C=N- Acetoxima -=N Acetonitrilo -N=N- Azometano -N=O Nitrosobutano

-ON01 Nitrato de etilo O

4 -N-. Nitrometano

O -ON0 Nitrito de amilo \

/ s=o Sulfóxido de ciclohexilmetilo

165 193 173 188 279 290 204

a 0 8 190

<160 347 300 665 270

271

218.5 346Sa 210

<180

15,000 10,000 6,000

900 15 16 60

5,000

4.5

-

-

100 20 12

18.6

1,120

1,500

-

n+n* n+n* n+n* n+n* n+n* n+n* n + n* n+n* n+n* n+n* n+n*

Vapor

Vapor n-hexano

Heptano Agua -

- Dioxano Bter

n + n* Dioxano

+ n* Eter de petr6leo n+n*

Alcohol

* Pico mas intenso del grupo de estructura fina. - .. . - - "". .-,e Ibid 9 p. 265, .

rizan por máximos de absorción en el ultravioleta cercano, pero éstos son de intensidades tan pequeiias que sólo son Útiles bajo circunstancias especiales, En la tabla 1 se da una lista de grupos funcionales aislados y sus msximos de absorción, puede verse que si el uso de la espectros&opia ultravioleta estuviera restringido a moli?culas monofuncionales, seria de utilidad muy limitada, Afortunadamente, aun grupos fuhcionales como los ole- finicos, acetilénicos y en general cuahquier función que tenga un doble o triple enlace, originan una fuerte absorción en el ultravioleta cercano cuando estan conjugados entre s í .

En una molécula cualquiera su energia total es la suma de su energla electrónica o de unión, de su energia -vibrational y

su energia rotacional cuyas magnitudes pueden ordenarse en orden decreciente: Eelec> Evib> Erot . La energia absorbida en la región ultravioleta conduce a cambios;> en la energia electr6nica que se manifiesta en transiciones de los electrones de Valencia de la molécula, Estas transiciones están dadas por la excita- ción de un electrón de un orbital molecular lleno (normalmente un srbtt'ta6t*Tde uni6n o p de no unión) al siguiente orbital de energía mayor (un orbital antienlaceu* o P), El orbital antienlace se designa por medio de un aterisco, por lo que la ttian- sición de un electrón desde un orbital de enlace W a un orbital de antienlacefi se indica en la forma T't"N* ,

5

Se explicar& el orbital de antienlace por medio de la absor ción ultravioleta del etileno, El doble enlace etilhico en su estado bgsico consiste de un par de electronesfde enlace y un par de electroneswde enlace, al absorber energía a 165 nm, uno de los electrones fl'de enlace se eleva al siguiente orbttal de mayor energia, que es un orbital de antienlace, lo q u e p m o s

.'' !J >

tra@ en el esquema de la figura 3 , los volumenes sombreados indican las regiones de m6xima densidad electrónica, Se observa que el electrón de antienlace no contribuye considerablemente a la constante de fuerza del enlace C a C , presentando el enlace Olefinic0 un gran carácter de enlace simple en su estado excitado.

/

En una molécula cualquiera la energía absorbida depende de la diferencia.de energía entre el estado b6sico y el excitado, cuanto menor es la diferencia de energía mayor es la longitud de onda de la absorción. El exceso de energía en el estado excitado puede dar como resultado la disociación o ionización de la molé- cula o puede volver a emitirse en forma de calor o luz. El des- prendimiento en forma de luz da por resultado la fluorescencia o djosforecencia.

Debido a que la energía ultravioleta es cuantificada e;h.es- 6 pectro de absorción originado por la transicih electrónica simple debe consistir en una linea discreta y simple, pero como la absor- ci6n electrónica queda sobrepuesta a los niveles rotacional y vibracional, los espectros de las moléculas en estado gaseoso consiq ten en picos de absorción estrechos (ver fig. 41, representando cada uno de los mismos una transición desde una combinaci6n particular de niveles vibracionales y rotacionales,en el estado b6sico electrónico hasta una combinación correspondiente en el estado excitado. En la qigura 5 se muestra un esquema en que los niveles vibracionales se designan come vo, vl, etc. A temperaturas normales, la mayoría de las moléculas en el estado básico electrónico estan en el nivel vibracional cero G , en consecuencia existen muchas transiciones posibles desde este nivel, las que estan representa- das como flechas.

Las principales caracteristicas de una banda de absorción son su posición e intensidad. La posición de la absorción corresponde a la longitud de onda de la radiaci6n cuya energía es igual a la requerida para la transición electrónica. la absoeción intensa se

presenta cuando la transición va acompañada de un gran cambio en el momento de transición, la absorción conemax 10 es una absor- ci6n de alta intensidad, las de baja intensidad corresponde a va-

b < 4

lores de fmax 10. 9'- 3

La intensidad de la absorción puede expresarse como transmitancia, (T)

r Iazintensidad de la energía radiante t " Io que incide en la muestra.

I= intendidad de la energía radiante que sale de la muestra.

http://diferencia.de

1 0.4 .

0.3 . (o l e

; 9 0.2 I 8

i r

0.1 '

- gaseous-phase CH,CHO

-

-

-

-

I I I I I I I I I 1 I I

240 260 280 300 320 340

Wavelength, nm

Figura 4, Espectro de absorción ultravioleta para el acetaldehído (CH3CHO) en estado gaseoso y en soluci6n acuosa, La estructura vibracional fina es claramente visible en el espectro de la fase gaseosa ya que un número de rtipidas resoluciones forman pequeiías protuberancias sobre la banda de absorción electrónica, En la soluci6n acuosa las interacciones soluto-solvente y soluto-soluto os- curecen la estructura fina y solo puede verse una banda suave de absorcih. E l espectro del acetal- dehido en fase gaseosa ha sido desplazado hacia a- rriba en 0.1 unidades de absorbancia para evitar que las curvas se sobrelapen. Nótese que la longitud de onda de m6xima absorci6n para el acetalde- hfdo es influida por su ambiente. Peters, ob. cit., p. 417,

- i

I

I C

v2-

I Vo-

l

; Vd-

v3 v, S*

I vo I

G

Figura 5, Diagrama de niveles electr6nicos de energfa para una molécula hipotética. Las flechas representan cambios de energfa que ocurren en la absorci6n de radiaci6n electromagnética. G representa el estado electr6nico basal, SI y S2 estados electr6nicos excikados y Vo,V , etc. los diversos niveles vibracionales en caAa estado electr6nico- Ibid., p. 416

La ley de Lambert-Beer nos penmite establecer una relación entre la transmitancia, el espesor de la muestra y la concentra- ción de las especies absorbentes:

log 10 T = kcb = A k= cte. caracteristica del soluto c= concentración del soluto b= longitud de la trayectoria a

través de la muestra, A= absorbancia (conocida también

como densidad óptica).

Cuando c se expresa en moles por litro y la longitud de la trayectoria se da en cm, la fórmula se escribe

A =€cb E = absorptividad molar(l1amado anti-

guamente coeficiente de extinción)

si la concentración (c) del soluto se define en g/l, la expre- si6n se transforma:

donde a es la absorpiiuidad y está relacionada con la absorptivi- A= abc

dad molar mediante e = aM M= peso molecular del soluto

La intensidad de una banda de absorción en el espectro ultravio - leta generalmente se expresa como la absortividad molar a la m6xima absorción, emax o log cmax, Cuando se desconoce la constitución de un material absorbente, la intensidad de la absorción puede expresa2 .se en la forma: % A

cb C= concentración en g/100ml b= ldngitud de la trayectoria a

través de la muestra en cm,

ESPECTROFOTOMETRO ULTRAVIOLETA. LOS aparatos modernos de este tipo estan constituidos por ciE

co secciones principales (mostrado en la figura 6 ) para un instrumento tipico de doble haz: 1) fuente de radiación 2 1 monocromador 3 ) fot6metro 4 ) área de la muestra 5 ) &rea del detector.

Fuente de radiación.. Constituida por un tubo de descarga de hidr6- geno, que e s sustituido por una 16mpara incandescente de tungkkeao

"" "-""" ~~ ~~~

1"""--

""_

. . "f "

Monocro~nador I

Fignra 6. Disposición óptica de un espectrofot6me- tro ultravioleta de doble haz. Silverstein, ob, cit., p. 248.

" 1

cuando se hacen determinaciones en la región visible. E1 espejo M1

se gira manualmente para enfocar la luz emitida de cualquiL_ ar fuente en la rendija de entrada Sl en el monocromador,

Monocromador,- Su función es la de dispersar las longitudes de onda eeparadas que provienen de la fuente. La luz que pasa a través de la rendija de entrada S1 se colima en rayos paralelos mediante el espejo esférico M3 y es reflejada al prisma de cuarzo P1, pasando a través de 61, la luz se refleja por medio de una superficie de espejo en la parte posterior del prisma, La dispersión se efectúa durante ambos pasos a través del prisma, la luz que sale de Pl se re-' f le ja a la rendija intermedia S2 por medio de los espejos M3 y PI4. Como el prisea dispersante produce una imagen curvada de una rendija lineal, la rendija de entrada SI es curva para compensar la cur- vatlra producida en la primera etapa del monocromador, De esta forma la imagen que incide en la r d i j a intermedia S2 es esencialmen- te lineal, La rendija .S2 consiste en una quijada sirjeple que se encuentra fija en una posición normal al espejo. La segunda quijada de la rendija es la imagen de la quijada fija en el espejo, El espejo, en la rendija S2 invierte el campo de haz de modo que la a- berración cromática introducida en la primera etapa del monocromador se elimine por medio de la segunda etapa del monocromador, La trayectoria de la luz a través de la segunda etapa (M5, M6 y P2) es la imagen de espejo de la correspondiente a trav&s de la primera etapa.

d

Los dos pribas P1 y P2 se hacen girar simultheamente , la lon I-

gitud de onda de la radiación que aparece en la rendija de salida S3 se determina por la posici6n angular de los prismas. El mecanismo de rotación de los prismas est6 acoplado con el tambor del registro, Por tanto en el monocromador doble se duplica 1a.dis- persión y se reduce la luz difusa, que mnsiste en longitudes'de onda indeseables, que aparecen en la rendija S3 la que es curva para compensar la curvatura introducida en la segunda etapa del monocromador. Fot6metro.- La luz monocrom6tica que sale de la rendija de salida S3 se transforma en pulsante por medio de un interruptor peri6di- co C y se divide en dos haces, de muestra y referencia, por medio

del divi$or de haces BS, Estos'haces se reflejan desde el divisor de haz por los espejos M7 y M8 .a través de los lentes Ll y L2 (que sirven para optimizar la naturaleza paralela de los rayos que pasan) al &rea de muestra.

Area de muestra,- Los haces que entran al 6rea de muestra se con- centran más conforme pasan por el área hacia los detectores, generalmente se colocan pequeAas celdas en la región más cercana al área de detector,

Los tubos fotomultiplicadores del área de detector se prote- gen de la exposición a la luz excesivamente brillante por medio de interruptores automáticos que sellan el área de detector cuando se abre el área de muestra,

Area de detector" Los haces de radiación que pasan al Brea del detector se enfocan en tubos fotomultiplicadores separados que generan un voltaje proporcional a la energía incidente en los detectores, El desbalance del voltaje producido de la absorcih de energía en el haz de la muestra, se balancea por medio de un voltaae equivalente que se derivq de una p0rciÓn de alambre deslizante. La plumilla del registrador se desplaza con los contactos en el alambre deslizante, cuando se hace uso de un alambre deslizante lineal, los espectros se registran enforma de longitud de onda contra transmitancia. Debido a que la absorbancia ds igual al log 1/T, el uso de un alambre deslizante cuya resistencia varia logarítmicamente con la longitud resulta en un registro lineal con respecto a la absorbancia, 1

Manejo de la muestra. Los espectros ultravioleta se determinan generalmente en las

fases de vapor y líquido, Existe variedad de celdas de cuarzo para la determinación de los espect;cos en fase gaseosa, las cuales estan equipadas con entradas y salidas de gas con longitudes de trayectoria desde 0.1 a 100mm, se dispone también de chaquetas de celda en las que se circulan líquidos con el fin de controlar la temperatura.

En la figura 1 se muestra una celda tipica en las determina-

T Silverstein, (Bids.,'- pp.:- 24A.254,

-"""

?

-. . - " " - . . . - . -. . . . ~- ..

I , Figura 7 . Boceto de una celda usada en espectrofotometría ultravioleta. Por simplicidad las paredes d e la ce lda se han representado infinitamente delga- das. Peters, ob. cit., p. 248-

"

I i

!

(Pd" (scattering (scattering from dirty window) solvent)

- from dust, r

"- - i

PO Blank (Pdh,

"_ "-

(absorption by solvent, foreign sample components)

(Pd-

. . Figura 8, Pérdidas de radiaci6n e n una celda en l a q u e no hay sustancia analí- tica presente, La separaci6n entre las líneas paralelas es una indicación es- quemstica d e l a potencia radiante. I b i d p. 4 2 1 9

.*'.. ,

cienes de líquidos, la cual tiene dimensiones eSt6ndares y est6 constituida de un material transparente (como cuarzo O vidrio Vy- cor), tiene dos superficies Óptimamente trasparentes en lados o- puestos y los o.tros dos son opacos (esmerilados) por los que se m% nipula. Existe una absorción aparente en una celda que no contiene ninguna espedie analítica qu’e es causada por la reflexión? de la radiaci6n incidente en las paredes de la celda, por la disper- sión de la radiación provocada por el polvo, huellas digitales y

otros materiales extrafios presentes sobre las paredes de la celda o suspendidas en el solfente, vea la fiqura 8. La absorci6n de la luz incidente por otro compuesto @”la muestra o por el solvente mismo, produce oh efecto similar. Esta pérdida de rarilbacih disminuye la potencia rediante efectiva que incide sobre la sustancia analizada de un valor original (Po) a uno menor (po)efectivo. Para una medición correcta ..-de la absorbancfa es necesario utilizar la (Polefectiva para ajustar el aparato a 100% de transmitancia (Ode absorbancia), lo que se realiza.usando otra celda con un 5Is.n

blanco.

~n?r-re:pqc kr”

El blanco es una solución idéntica a la muestra en todos sus aspectos, excepto en la especie que se va analizar, cuandopdco- lot* en el espectrofotómetro tendrá un efecto idéntico e n M reflexión, dispersi6n y absorción que la solución de la muestra, por lo que la potencia radiante transmitida debe ser igual a la efectiva incidente sobre la muestra analizada, (Po)efectiva. En muchos espectrofotómetros comerciales para evitar pérdidas indeseables de radiación en el ajuste de un blanco y la sustitución de é1 por la muestra, sf an diseñado compartimentos donde varias celdas son colocadas y pueden insertarse rápidamente en el paso de la radiación una vez que se ha ajustado la transmitancia a 100% (fig. 9 ) para obtenr sus valores respectivos de potencia radiante ( O %de transmitancia). Realizado con cuidado este mé- todo es capaz de condutir a medidas con - + 1% de precisi6n.

rc Q,*J .

Aunque las celdas m6s comunmente usadas son las descritas antekiormente, existen en forma comercial otras que varían:? en la longitud de su trayecteria desde 1 a 10 cms,, se dispone tarn- bién de tapones de relleno paral reducir el volumen y trayectoria de la celda de un centímetro culadrado. Se ofrecen también cel-

Tungsten I Lamp \

Two-Position , Mirror \ I

O 1 Deuterium

Lamp

Monochromator (Set Wavelength)

Slit ' Slit

I'

Movable Cell

Selector Photomultiplier Tube

Photomultiplier Power Supply

Adjustable - Current Amplifier

Shutter (Set IWYÓ T) 4 pZ-l Adjust

~ ._ .. ~ . ." ~~ ,

Figura 9. Diagrama esquem6tico de un espectrofot6metro ultravioleta de un sólo haz, tiene dos fuentes de radiaci6n y un selector de celdas, La elecci6n de la fuente deseada es por medio de un espejo m6vi1 ( 2 posiciones). Para poder realizar el conjunto de mediciones es necesario ajustar el aparato a 0% de transmitan cia lo que se hace empujando el. p6stigo frente al tubo fotomultr plicador, bloqueando en esta forma el paso de luz, se mueve entonces el control correspondiente hasta que marque O, El 100% de transmitancia se logra abriendo el p6stigo y colocando por me d i o del selector de celdas m6vi.1 en el paso de luz la celda que- contiene el blanco (1) y manipulando el amplificador de corriente hasta la marca de 100.

-

" Ib 9 p. 419.

das de volumen pequeño con longitudes de trayectoria de k m , em- pleadas cuando s610 se dispone de pequeñas cantidades de solución, las cuales son usadas junto con un condensador de haz con el fin de reducir al mínimo la pérdida de energia,

En la preparaci6n de una solución, la muestra se pasa con pre d? CDiQbCIr)O bt"

- cisi6n y se lleava ayvolumen $fun matraz volumétrico. Luego se toman cantidades alícuotas y se realizan diluciones adicionales hasta lograr la concentración deseada,

La limpieza de las celdas es muy importante, deben lavarse varias vecds con el solvente y comprobarse la absorción entre determinaciones sucesivas, pudiendo ser necesario limpiar las celdas con un detergente ó ácido nítrico caliente con el fin de remover las trazas de muestras anteriores.

Existen solventes grado espectral para análisis ultravioleta disponibles en forma comercial, estan libfes de absorciones de in- terferencia en las regiones sombreadas de la djigural6. Los solventes m6s usados son el ciclohexano, etanol al 95% y el 1,4 dioxano. La concentración aproximada que se debe usar puede estimarse, si se dispone de alguna información sobre el valor esperado para el m&- ximo valor de absorptividad molar,Cw,asf la escala de absorbancia delCary va de 0.0 a 2.4 unidades de absorbancia y para una curva en la que cmax= 10 tenga una absorbancia de 2.0, se ha visto que la concentración correcta es de 2 x lo'* molar cuando se utiliza una celda de 1 cm.

4

2

Interpretación de resultados. La identificación de grupos funcionales partiendo del conoci-

miento de las posiciones de los m6ximos de absorción, que es una técnica común en la espectroscopía infrarroja, es rara en el ultra violeta debido principalmente a que la mayoría de los grupos funcionales sencillos absorben débilmente o no absorben, adem& que los espectros de la mayoria de las mol6culas son relativamente sen cillos, sólo tienen uno o dos máximos en lugar de los diez o veifl te que son usuales en las curvas de infrarrojo. Por lo tanto, mu-' chos grupos funcionales absorben en la misma región.

Únicamente grupos funcionales muy específicos originen una ebsor-

-

-

Aunque a primera vista podría parecer una desventaja el que

2 Shriner, s. ~1;Id'eriti'ficzaciÓn SisternAtica de Compuestos Orggnicos, Ed, Limusa, Misxico, 1979, p. 230,

,Cloroformo

Ciclohaxano

1.,4-dioxano .. -, .

Etonol al 95.7.

n-hexono

Metano1

Agua

. . . "-1- ~ " "

Figura 10, Intervalos d e transparencia Útiles ( d e solventes) e n l a regi6n d e l ultravioleta cercano.

S i l v e t i s t e i n , ob. c i t . , p. 250.

. o

" . .

Figura 11. Absorcih ul travioleta de la colesta- 4-en9-3-ona ( a ) y el Óxido d e mesitilo (b)

Ibld., p. 2430

, "-.-" .-

t

ci6n en el uktravioleta y que el espectrofot6metro sea ciego a

los cambios que no afecten la unidad absorbente, estas limitacio nes son en gran parte responsables de la utilidad de la espectros- - copia en el ultravioleta en la investigación de estructuras, como es el caso de la confirmación cle una enona conjugada en una molé- cula compleja como es la tetosterona comparando su absorción .al.:. de otro compuesto m6s sencillo como el Óxido de mesitilo con una con juqacibn similar, (fig I?) ,

-

S

Se dispbne de una gran cantidad de material de referencia re- lacionado con la teorla e interpretación de los espectros ultravioleta, también yWdisponibles varias recopilaciones de espectros ultravioleta y datos de absorción entre los que destaoan por su u- tilidad:

c STA rJ

Ultraviolet Reference Spectra, Sadtler Research Laboratories, 3314-20 Spring Garden St,, Philadelphia, Pa, Sadtler - Reference Spectra - Commonly Abused Drugs U V Spectra, 1972, 3 0 0 U V Spectra Sadtler Research Laboratories, Inc, Sadtler Standar Ultraviolet S- pectra, 1972, 30 O00 espectra en 74 volumenes, Sadtler Research Laboratories Inc,

Electronic Spectral Data, Vols I, I1 y IV, Interscience, Nueva York, años 1960, 1960 y 1963 respectivamente.

Ultraviolet Spectral Data, Manufacturing Chemist Association Research Project, Carnigie Instituke of Technology, Pittsburgh,Pa.

Entre las ventajas que ofrece la espectroscopía ultravioleta como técnica analítica sfiencuerrtaa su sensibilidad, es posible ha ter determinaciones cuantitativas a concentraciones de especies moleculares tan pequeAas como IQ-~M, por ello tiene aplicaci6n en dos keas importantes: la primera llamada análisis de trazas en que

la espectrofotometría ultravioleta permite la medida cuantitativa de cdmponentes de la muestra que estan presentes en cantidades de una parte por millón en peso, En la segunda &rea, llamada microa- n&lisis, el componente principal puede ser determinado de una mues

-

i

tra extremadamente pequeAa, Comparada con los métodos volumétricos y

cionales, la espectrofotometría (os más repida los instruBentes fotométricos más modernos es 5 a 10 muestras por minuto,

gravimétricos tradi- y conveniente, Con

posible analizar de

APENDICE 3,

ESPECTROMETRIA INFRARROJA.

La radiacibn infrarroja st? refiere generalmente a la parte del espectro electromagnético comprendida entre las regiones v i s i - ble y la de microondas- De gran uso pr6ctico para el quimico org& nico es la porción limitada entre 4000 cm-' y 666 an-' (2.5-15.jjm). Actualmente existe un interés creciente en la region del infrarrojo cercano , 14 ,290-4200 cm-'(O.7-2.5/1(m) y la region del infrarro - jo lejano, 700-200 (14.3-501m).

Las posiciones de banda de los espectros infrarrojos se presentan ya sea como longitudes de onda o como números de onda. La micra (/K=10°6m) se ha utilizado comdnmente desde hace mucho tiempo como unidad para la longitud de onda A, pero recientemente hl término micra ha sido sustituido por el de micr6metro ( m=10-6m).

Attualmente se utiliza la unidad de número de onda (cm", recfprg ca de centimetro), pues es directamente proporcional a la energía y porque muchos de los nuevos espectrómetros son lineales en la escala de cm-'. Estas unidades; se pueden relacionar entre si como

r

sigue: cm S -1

r m x l o 4

Es bastante común que a los números de onda se les denomine frecuencias, esto no .es totalmente correctwya que los números de onda son l/h y la frecuencia es c/A, probablemente no sea un error muy serio mientras se tenga en mente que el témino faltante es la velocidad de la luz (c).

PL

Las intensidades de banda se expresan ya sea como transmitancia (t) o como absorbancia(A)- La transmitancia es la relacibn entre la potencia radiante transmitida por la muestra y la potencia radiante incidente en la mu.estra : T = . A

IO La absorbancia es el logaritmo de base 10,de la recíproca de

@a transmitancia: A = log*(J 1

T

La representacibn cl6sica de las moléculas orgsnicas han sido los modelos de bola y palo que nos crean una idea de rigidez, una forma m&s adecuada debe- seria conectando',. los &tomos por medio de resortes capaces de reproducir los movimientos de alargamiento, sacudimiento, torsi6n y balanceo que se presentan en las moléculas reales. La figura 1 nos muestra una esquematizqción de estos movimientos y su posición en un espectro infrarrojo.

'% *'. p.$ )i : + .' &*.

Existen dos tipos bssicos de movimiento molecular: alargamiento y flexión. Una vibración de alargamiento representa un m 2 vimiento rítmico a lo largo del eje del enlace de tal modo que la distancia interat6mica aumenta o disminuye. La vibrgci6n de flexibn puede consistir en un cambio en los Sngulos de enlace entre los enlaces con un átomo común o el m!ovimiento de un grupo de &tomos con respecto al restante de la molécula sin que se tenga al movimiento de los &tomos en el grupo con respecto al otro. Por ejemplo, los m 2 virnientos de torcimiento, balanceo y oscilaci6n implican un cambio en los 6ngulos de enlace con referencia a un grupo de coordenadas establecidas arbitrariamente en la molécula.

Las vibraciones que se observan en el infrarrojo son sdlo las que dan por resultado un cambio ritmico del momento dipolar de la molgcula . El campo electric0 alternante, producido por la distribg ci6n de carga cambiante que acornpafia a una vibración, acopla la u2" bración molecuaar con el campo eléctrico oscilante de la radiaci6n electromagnética.

Una molécula tiene grados de libertad en Ea misma cantidad que el total de grados de libertad de sus &tomos individuales. Cada b- tomo tiene 3 grados de libertad cjne'corresponden a Bas coordenadas cartesianas (x,y,z) necesarias para definir su posición relativa a los otros &tomos de la molécula . Una molécula con n &tornos en consecuencia tiene 3n grados de libertad. Para las moléculas no lineales, tres de los grados de libertad definen la rotación, y tres la traslaci6n; el restante 3n-6 grados de libertad son 10s grados de libertad vibracionales o vibraciones fundamentales, Las vibraciones fundamentales no im!plican un cambio en el centro de grq vedad de la molécula. La figura 2 nos muestra las tres vibraciones fujdamentales del agua que es una molécQEa triatómica no lineal,

& 3 4 ' 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15

- "

Figura 1, El segmento de espectro infrarrojo muestra los tipos de vibraciones que causan bandas de absorci6n comunmente(a la longitud de onda donde ellas ocurren). Los circulos negros representan dtomos de carbono , los cfrculos blancos &tomos de hidrbgeno, los otros dtomos son representados por los cuadrados. Las flechas se- fialan la direccidn de los movimientos vibracion8lea. Los alarga- mientos de enlace de carb6n ocurren, .ya sea, entre dos dtomos de carb6n o entre carb6n y otro' dtomo diferente. El hidrdgeno se flexiona y oscila en la regibn de 7.5 a 15 micr6metros. El movimiento fuera del plano de la p6gina es indicado por el signo + , Tomado del Folleto de Perkin- Zlmer, Infrared Spectrophotometers, Model 237B"odel 337, p. 5

-

. .- . ..

Fig. 3, Vibraciones fundamen tales de una molécula de CO;. Ibid 9 p. 870

..

,

En la figura 3 se ilustra las cuatro vibraciones fundament= les de la molécula de C02 (lineal p triat6mica). La vibracich de alargamiento sirn6trico (1) E! inactiva en el infrarrojo ya que no produce cambio en el momento dipolo de la molécu3bo Las vibraciones de flexi6n ( a ) y ( 4 ) son equivalentes y constituyen los componentes resueltos del movimiento de flexibn orientado a cualquier 6ngulo del eje internuclear; tienen la misma frecuencia y se dice que son doblemente degeneradas.

La figura 4 nos muestra lcts diversos modos de alargamiento y flexi6n de un grupo AX2 que aparece como una porci6n de molécula, por ejemplo el grupo CH2 en una molécula de hidrocarburo, La re- gla 3n-6 no se aplica debido a que el CH2 solamente representa una porci6n de la molécula,

El número té6rico de vibraciones fundamentales (frecuencias de absorcibn) raramente se pued.e observar debido a que los sobfe- tonos(m6ltiplekipletes de una frecuencia dada) y los tonos de com- binaci6n (suma de otras dos viblraciones) aumentan el número de bandas, mientras que otros fen6menos reducen el número de bandas entre 1,-

2.-

3.-

4.-

5.-

los que se encuentran: Las frecuencias fundamentales que se encuentran fuera de la región de 2.5- 15 micrometros. Las bandas fundamentales que son demasiado débiles para ser obdervadas. Las vibraciones fundamentales que tienen tal cercanía que llegan a juntarse. La presencia de una banda degenerada derivada de varias absorciones de la misma frecuencia en moléculas muy simé- tricas. La falla de ciertas vibraciones fundamentales en aparecer en el infrarrojo debido a la falta del cambio requerido en el carscter dipolar de la molécula.

Las asignaciones de la frecuencia de alargamiento pueden aprozi marse mediante la aplicación de la ley de Hooke, en la que l o s 6- tomos y su conexitin se tratan clam un oscilador armcinico simple formada por dos masas unidas po.r un muelle,la siguiente ecuación relaciona entre las frecuencias de oscilaci&, las mass& at6micas y la constante de fuerza de enl'ace:

VIBRACIONES DE ALARGAMIENTO

En tiiera o flexi6n en el plano (4 CHd

o

i y:\.& ' ', . y: . '

Torcimiento o flexi6n Oscilaci6n o flexi6n en el plano

Go CHd

F i g u r a 4. Modos v i b r a c i o n a l e s para el - g r u p o CH2 , 8 y 8 i n d i c a n el rnovimien- to p e r p e n d i c u l a r c o n respecto a l p l a n o d e l a p s g i n a .

3 p. 87-

en donde: u = frecuencia vibracional (cm") c= velocidad de la luz (cm/s) f- cte. de fuerza del enlace (dinas cm) 3

Mx, My = másas de átomo x 6 y (g)

El valor de f es aproximadamente de 5x10 dinas por centimetco 5

para el caso de los enlaces simples y de aproximadamente dos a tres veces este valor para los enlaces dobles-y triples respectivamen&e.

La pplicación de la fórmula dl alargamiento C-H, utiliean.do 19.8~10 -24 y 1.64~10 -24 gramos como valores de masa para C y H respectivamente sitúa a la frecuencia de vibracibn del enlace en 3040 cm ( 3 . 3 0 micrometros),en realidad las vibraciones de alargamiento C-H asociadas con los grupos metilo y metileno generalmente se observan en las regiones comprendidas entre 2960-2850 cm (3.38- 3.51 m) El cálculo no es preciso debido a que se han ignorado los

efectos que se derivan del medio que rodea al C-H dentro de la molé- cula. La frecuencia de la absorción infrarroja normalmente se utiliza para calcular la constante de fuerza de los enlaces.

-1

-1

Como una quia en la interpretacien de espectros en el infrarrojo se hacen algunas generalizacdones ya sea en forma de listado que relacionan los diversos grupos atóiicos con Pas longitudes de ónda caracteristicas a las que absorben o bien en forma de diagramas como el que se muestra en la figura 5 .

El conocimiento de la teoría estructural orgánica es esencial en cualquier uso de la espectroscopia en el infrarrojo, así el saber que la conjugacibn de un enlace doble carbono-carbono con un grupo carbonilo ( G O ) disminuye la cantidad de car6cter de enlace doble C=C tanto como la del C=O haciendo que cada una de las frecuencias se desplace hacia la regiCin,del enlace sencillo(disminuyendo). La acumulación de enlaces dobles tiene en cambio el caracter opues- to. Así los alenos muestran absorción de enlace C=C en 1950 cm-' en vez 1650 Cm" valor para 1OS enlaces aislados C=C,

, + i. . . -z

LES INORGANICAS OMPUESTOS DERIVADOS

E4 enlecke de hidrbgeno disminuye tanto la frecuencia de vi- bfaci6n longitudinal del hidrógeno como la del carbonilo cuando est6 implicado un grupo carbonilo. A s í la frecuencia del carbonilo de la N,Ndietilacetamida, en solución de dioxano, es de 1647 cm" (sin enlaces de hidr6geno1, pero en metano1 en donde forma puentes de H con el disolvente$ es de 1615 cm".

Los sustituyentes negativos pueden incrementar la frecuencia del carbonilo en los aldehidos, cetonas o &idos y sus derivados, como sucede en el acetato de etilo en que tiene absorci6n el carbonilo a 1745 cm" mientras que en el tricloroacetato de e- tilo absorbe a 1768 cm",

La tensi6n del anillo aumenta la frecuencia de la vibraci6n longitudinal de un enlace doble exoclfclico, que es debido al e- fecto de contracción del angulo entre &tomos de carbono unidos al dob&& enlace ( , k = C H 2 ) que va de su ahgulo normal de 120° hasta valores de l o g o , 90° y 60° que debe adquirir en los anillos de cinco, cuatro y tres miembros respectivamente, que conduce hacha aumentos sucesivos en la frecuencia de vibración longitudinal.

ESPECTROFOTOMETRO INFRARROJO. En la figura 6 se muestra un esquema del-sistema ÓPtiCo de un

espectrofotometro infrarrojo de doble haz, que es un aparate que puede dividirse en en 5 secciones principales, de cada una de las cuales se hablar& brevemente2 1) Fuente de radiación,- La rRdiaciÓn infrarroja ae"produce mediante el calentamiento eléctrico de una fuente (filamento de Nerst o Globar), a temperaturas dntre 3.000-1800 OC. El filamento de Nerst se fabrica a partir de un aglutinante y 6xidos de circonio, cerio y torio, mientras que el Globar est6 constituido por una pequeña varilla de carburo de silicio, La imagen de la fuente debe tener mayor amplitud que la amplitud m6xima de las rendijas, La radia- ción mdxima para el globar sei: presenta en la regih 5500-5000 cm" y decreceen un factor de 600 al aproximarse a la región de 600~rn-~. El filamento de Nerst proporciona su mexima energía de radiaci6n cerca de 7100 cm" y disminuye en un factor de aproximadamente 1000 al aproximarse a la región de frecuencia inferior,

La radiaci6n de la fuente se divide en dos haces por medio de los Bspejos MI y M2, los dos haces (el de referencia y el de la

muestra) se enfocan al Area de muestra por medio de los espejos M3

Y M*'

2) Area de la muestra.. Los haces de referencia y de muestra entran al &rea de muestra y pasa a través de la celda de refere&ba y la celda de muestra respectivamente. Los obturadores opacos, montados en el alojamiento de la fuente, permiten el bloqueo de cualquiera de los haces en forma indkpendiente, El área de muestra de un es- pectrómetro preciso incluye una amplia variedad de accesorios de muestra que varían desde las celdas de gas de 40m de trayectoria efectiva hasta las microceldas.

3) Fot6metro.- El haz de referencia pasa a traves del atenuador y se refleja por parte de los espejos M6 y M8 hacia el espejo de sector rotatorio M7, que alternativamente refleja el haz fuera del sistema y que transmite el haz hacia el espejo Mgo El haz de referencia est6 formado Bhora por un haz intermitente que tiene una frecuencia desde 8 a 13 ciclos For segundo d e p e n d i e n t o del instrumento particular. Este haz se enfoca por medio del espejo MIO so - bre la rendija S1 . El haz de muestra pasa a través del peine y

se refleja por medio del espejo M5 hacia el espejo del sector rotatorio M7, el cual transmite alternativamente el haz fu#era del sistema Óptico y lo refleja hacia el espejo Mg y posteriormente al espejo Mlo y la rendija S1,

SI representa el haz de referenda que ha sido transmitido por el espejo de sector rotatorio M7, o el haz de muestra que ha sido reflejado por M7, es decir, el haz de referencia y el de la muestra se han combinado en un haz simple de segmentos alternantes; esto establece una frecuencia conmutante en el detector que equiva - le a la velocidad de rotación Pi7.

se encuentra en una condición Óptica ngla. El peine en el haz de muestra permite el balanceo de los haces. La ptumilla de regiq tr0 se encontrar6 entonces en 1.00% de transmitancia cuahdo no est& presente la muestra. El atenuador se hace entrar y salir del haz

En cualquier momento dado, el haz enfocado sobre la rendija

Cuando los haces son de la misma intensidad, el instrumento

de referencia en respuesta a la señal originada en el detector por el h8z de la muestra, As1 cuando la muestra absorbe el haz de muestra, el atenuador se hac:e entrar al ha% de referencia has - ta que su intensidad se iguale con el haz de muestra.

4 ) Monocromador,- El haz combinado pasa a través de la rendija de admisión S1 hacia el espejo Ml1* el cual refleja hasta la grs tfcula de defracción G1, este haz se dispersa en varias frecuencias; se refaeja nuevamente hacia el espejo Mlb y posteriormente al espejo PIl2. El espejo MI2 1.0 enfoca el haz hacia la rendija de salida S*. La amplitud del intervalo de frecuencias enfocado sobre la rendija S2 se determina poW&a1amplitud de la rendija y

por la potencia de dispersión cle la gratícula. La banda de frecuencia de un haz dispersado y enfocado sobre la rendija S2 en cualquier momento esta determinado por el 6ngulo de gratfcula G1 en dicho momento, La totaci6n de la gratfcula Gi produce un ras- treo de bandas de frecuencia err la rendija de salida S2 y consecuentemente en el detector, Los filtros se insertan autom6tica- mente en la trayectoria de la radiaci6n en la rendija de salida en ciertas secuencias para eliminar la radiación indeseable (que corresponde a los múltiples ardnicos de la frecuencia por medir),

La resoluci6n mgxima se lcrgra mediante el uso de graticulas solamente en el intervalo de la m6ximaj efectividad de dispersi6n. En Corisecuencia, en los intrumcmtos modernos de alta resolucibn se hace uso de dos o m6s graticulas ( G1 y Gal.

Cuanto mas estrecha sea la amplitud de la rendija, mayor es la resoluci6n, por lo que se hace necesario reducir la salida de energía de la fuente a a frecuencias inferiores (longitud de onda mayores), En la mayoría de los instrumentos, la amplitud de rendija se programa para aumentar conforme disminuye la energia tram$ - rnitida por la fuente, con lo cual la energla del haz de referencia que entra al monocrornador es constante,

!3)'-Betector.- Después de abandonar la rendija de salida del monocromador, el haz se refleja por- medio del espejo aplanado M13 hacia el espejo elipsoidal M14. El foco del espejo elipsoide se encuentra en la rendija de salida S2 y en el detector. El detector

Figura 60 Sistema Óptico del espectrofot6metro infrarrojo de doble haz. Silverstein, ob, cite p,9:1:

Figura 7. Por medio de 'una jeringa hipodérmica con punta especial se introduce una cantidad de muestra en la celda para líquidos. Folleto Perkin-Elmer, ob. cit., p. 10

consiste en un dispositivo que mide la energia radiante por medio de su efecto de calentamiento, Dos tipos comunes de detectores son el termopar y el bolómetro.

En el detector de termopar, la energía radiante calienta una de ¿¶os Juntas bimetalicas y se produce una fuerza electromotriz en_ tre las dos juntas que es proporcional al grado de calentamiento. El bolómetro cambia de resistencia a causa del'calentamiento, sirve como un brazo de un puente, de modo que el cambio de temperatura origina una.:señal desbalanceada a través del circuito que puede am- plificarse y registrarse o utilizarse para activar un mecanismo que vuelva a estableceti el balance.

El detector percibe alternativamente el haz de referencia y de muestra a una frecuencia de conmutaciÓn determinada por la rotación del espejo del sector, cualquier cambio en la intensidad de radia- cidn debida a la absorción se detecta como una señal fuera de nulo. La sdfial fuera de nulo amplificada del detector se utiliza para si- tuar el atenuador Óptico de modo que la radiación del haz de referencia y el de la muestra se conserven en la misma intensidad, La proporci6n de atenuación requerida constituye una medida directa de la absorción por parte de la muestra. El movimiento del atenua - dor se registra por medio de l a plumilla de carta del registrador. 1

Preparaci6n de la muestra, Idealmente,los espectros cteberfan determinarse en fase de va-

por, en donde las interacciones entre moléculas son mhimas, Sin embargo por razones pfbcticas se ha buscado otras formas de obte- nerlos, se dan a eontinuación detalles de estas preparaciones.

El espectro de gases o líquidos de bajo punto de ebullición puede lograrse mediante la expansión de la-muestra en el interior de una celda al vacío, &stas celdas vienen equipadas con puntas de expulsión por -eongelaci6n que permiten la concentración de la mueg tra y la evacuaci6n de la-celda.. Las celdas utilizadas para determinaciones con gases varian en longitudes desde algunos centfhetros hasta varios metros, si bien el k e a de la muestra en los espectro- fot6metros infrarrojo estandar no permite el acomodo de celdas mayores de 10 cm, las trayectorias largas se pueden lograr mediante un sistema Óptico de rtllflexien mfiltiple,

La técnica en fase de vapor es de car6cter limitado debido

1 Silverstein, ?bo cit. pp, 91-92

a que existen muchos compuestos que no tienen la suficiente Presi6n de vapor para producir un espec.tro d e absorción Ú t i l -

LOS liquidos pueden examinarse en forma pura o en S O l u C i h -

LOS liquidas puros se examinan entre placas d e cloruro de sodio formando peliculas de aproximadamente 0.01 m m , por lo cual se requieren muestras con concentraciones entre 1-10 mg. Las muestras espesas de lfquidos p u m s generalmente absorben intensamente pro- duciendo espectros satisfactorios. Los l iquidos vol6t i les se exami nan en celdas selladas con separadores sumaraente delgados, u t i l i - zando ventanas de cloruro de plata para sustancias que d i s u e l v e n a l a s d e cloruro de sodio.

Las soluciones se manejan en celdas d e 0.1-lmm de espesor, se requieren volumenes d e 0.1-1 m 1 de s9luciones d e 0.0s a lo%, estas soluciones se introducen a la celda por medio de una jeringa hipodérmica,(ver figura 71, una.celda d e compensación q u e c o n t i 2 ne e l so luto puro se coloca en e l haz d e referenaiai E l espectro resultante corresponde al soluto excepto en l a s regiones donde e l solvente tiene una absorción intensa.

E l solvente seleccionado debe ser anhidro y razonablemente transparente en l a RgiÓn d e int.erés, cuando todo e l espectro es de i n t e r é s , se puede hacer uso d e varios solventes, corriendo un espectro con cada uno de e l l o s y abtenlendo parcialmente e l espectro d e l a muestra. Un par común de! solventes es el tetracloruro de

carbono y e l disulfuro de carbono. E l primero t iene muy poca ab- sorción a frecuencias superiores d e 1333 cm" (mayor de 7.5micro- metros), mientras que e l d i su l furo de carbono c a s i no absorbe a menos de 1 3 3 3 cm". Deben ev i tarse l as combinaciones de solven- t e s y solutos que reaccionen, c:omo los aminoalcohol& que reaccio- n a n lentamente con e l d i su l furo de carbono y con e l tekracloruro d e carbono.

Cuando sólo se dispone de algunos microgramos de muestra es necesario usar accesorios concc!avidad ultramicro en conjunto con un condensador de haz, existen comercialweh& con una longitud d e

t rayector ia d e - + 0.05mm y una capacidad de 0.8 microlitpos, LOS sólidos se examinan principalmente en forma de una pasta

untable, un disco prensado y película delgada. L O S sólidos insolubles en disolventes apropiados para deter-

minaciones en el infrarrojo, ordinariamente se determinan como

suspenciones en aceite. La susnensi6n se prepara mediante molienda del sólido en un mortéro de ágata en el que se agrega 1 Ó 2

gotas del aceite de molienda y se continúa moliendo hasta obtener particulas menores a 2 micrometros con el fin de evitar una d8s- persión excesiva. La suspensirjn se unta para obeteeer una pelí- cula fina (entre des cristales planos de shl), generalmente se usa nujol, aceite de petróleo de alto punto de &bulikci6n, como aceite de molienda, cuando las bandas de & s f @ hidrocarburo interfieren en el espectro, se puede hacer uso del fluorolwbe(po1imero completamente halogenado con C1 o F) o el hesad&orobutadieno. Las suspensiones untables de nujol y fluorolube permitten espectros libres de interferencias entre 4000 a 250 cm".

2

La técnica del disco prensado utiliza la característica de los haluros alcalin,os, de formar superficies tranparentes al ser prensadas, Una cantidad (0.5 a 1mg)de muestra y aproximadamente lOOmg de KBr(pu1verizado y seco) se muelen cuidadosamente en un mortero de &gata liso (operaci'bn mostrada en la figura 8), La mezcla se prensa para obtener una superficie transparente, utilizando matrices especiales a una presi6n de 704-1056 Kg/cm. La calidad del espectro depende de la calidad del mezclado y de la reducci6n del s6lido a partículas menores a 2 micrómetros. Puede usarse esta técnica para muestras muy pequefias (hasta un microgra mol utilizando junto a microdisco(con diametro entre 0.5-1.5mm) un condensador de haz.

2

La técnica de película depositada solo puede utilizarse con materiales que pueden$ ya sea,depositarse a partir de una solución o enfriarse a partir de una masa fundida en forma de microctista- les o en forma de una pelicula vidriosa. Las películas cristalinas generalmente originan una gran dispersión de laz, la orientaci6n especídica del cristal puedeyispectros muy diferentes a los obtenidos a partir de partículas orientadas al azar. Esta técnica resulta de gran utilidad en la obtención de espectros de pE&sticos y resinas.

2 Se debe tener cuidado en el manejo de las celdas de sal u- tilizando muestras libres de humedad, cuidad de no rayar sus superficids, almacenarlas en cajas junto ,con un adsorbente y evitar el contacto de los dedos con las superficies 6pticas.

I 1 Figura 8. Para analisis de s6lidos la muestra se mezcla con KBr en e l mortero d e dgata y después se prensa en l a ma- t r i z , resultando un disco que se coloca en el &rea d e muestra del espectro- fotómetro. Folleto Perkin-Elmer, ob, cit . , p . l o

Interpretación de espectros. Una molécula relativamente simple puede originar un espectro

muy complejo, esto puede ser ventajoso para el analista ya que cuando iguala el espectro de un compuesto desconocido a otro que corresponde a un, sustancia identificada, la correlación de pico a pico nos proporciona una excelente prueba de identificación, ya que es muy poco probable que dos compuestos, excepto en el caso de enantibmeros, proporcionen el mismo espectro infrarrojo, Por esto es considerado como las huellas digitales en la identificación de matekiales.

Entre los requisitos que deben cubrirse para la 6nterpretaciÓn adecuada de un espectro tenemos: 1) E1 espectro debe estar resuelto adecuadamente y tener una intensidad apropiada,

S!= 2) E1 compuesto debe razonablemente puro, 3 ) dl espectrofotómetro debe calibrarse de modo que sus bandas se obserteen a las frecuencias o longitudes de onda adecuadas. x

La calibración puede realizarse mediante estándares aonfiaBles como lo es una pelicula de poliestireno,

4 ) Debe especificarse el método de manejo de la muestra. Cuando se usa un solvente, 8abe indica.rse cual es, la concentración de mueg tra y el espesor de la celda.

No es posible el tratamie!?to prediso de las vibraciones de una moleeula compleja, por lo que su espectro infrarrojo debe interpre-

firrjrar las conclusiones con otros datos obtenidos con espectros de masas, ultravioleta y RMN,

La absorción infrarroja de las moléculas orgsnicas se ha-resu- mido dn una tabla de frecuencias de grupo caracteristicas, Muchas de las frecudncias de grupo var:can dentro, de un intervalo amp!l!io debido a que las bandas se originan a partir de vibraciones de in- teraccibn complejas dentro de lis molécula. Sin embargo, las bandas de absorci6n representan fundamentalmente a una forma de vibración simple. Por ejemplo, las bandas de absorción que se derivan de las formas de al?rgamiento C-H, O-H y G O permanecen dentro de regiones relativamente estreds de$ espectro, Algunos detalles importantes de la estructura pueden determinarse al conocer la posici6n exacta de una banda de absorción dentro de estas rOgiones&stre&as,

. - - . . . .

. .

6 Adjacent Hydrogens

5 Adjacent Hydrogens

o-xylene 4 Adjacent Hydrogens

m-xylene 3 Adjacent Hydrogens

p-xylene 2 Adjacent Hydrogens

Figura 9 , Identificaci6n de sustancias desconocidas, Los tipos de sustitución de compuestos aromsticos,como los metil bencenos, pue den ser determinados por la posicih del pico de absorción fuertg producido por las flexiones fuera del plano de los hiddgenos, que ocurren entre 11 y 15 micr6metros. De esta forma el infrarrojo proporciona una identificaci6n rspida y positiva de compuestos relacionados cercanamente y que de otra, forma requerirían de muchas horas de trabajo. " Ibid 9 6

LOS desplazamientos enla posiciih de absorción y los cambios del en 10s contornos de las bandas que acompaftan a los cambios del medio molecular, también pueden sugerir detalles estructurales importantes,

Las dos Breas de importancia para el examen preliminar de un espectro corresponden a las ETgiones de 4000-1300 cm (2.5 a 7.7 micrometros) y de 909-650 cm (1 11.0 -15 micrometros), La porción de longitud de onda corta del espectro se denomina región funcional Las frecuen ias de alargamiento caracterfsticas para los grupos fuq cionales d g S importancia tales como el OH, NH y G O se presentan en esta porción del eepectro, La ausencia de absorción en los intervalos definidos para los diversos grupos funcionales generalmente pus de emplearse como pruebas de la ausencia de tales grupos en la molq cula, Sin embargo debe tenerse cuidado en las interpretaciones de este tipo ya que ciertas caracterfsticas estructurales pueden originar que una banda se debilite y se vuelva extremadamente amplia como para ser notada.,,

resultan de la absorción fundamental de grupos funcionales como el S-H y el C X , son sumamente valiosas en la determinación de la estructura, Tales bandas débiles serian de poco valor en regiones mas complicadas del espectro, L,os sobretonos y los tonos de combi- nacidn de bandas de longitud de onda mayor aparecen frecuentemenkb en la regi6n de longitud de onda corta del espectro.,.

Lalfalta de bandas de absorción intensa de la región de 909- 650 cm (11.0-15.4 micrometros) generalmente indica una estructura no aromstica. Los compuestos arom6ticos y heteroaromgticos manifiestan bandas de absorción de flexiÓn anular y de f&exiÓn C-H fuera de plano en esta región que frecuentemente pueden correlacionar- se con el modelo de sustituciÓn(como se muestra en la firuta 4). La absorcibn moderadamente intensa y amplia en la región de longitud de onda larga sugiere la presencia de dimeros de &ido carboxi lico, aminas o amidas, todos los cuales muestran flexi6n fuera dezl plano en esta regi6n. Cuando la regi6n se extiende hasta 1000 cm (10.0 micrometros), quedan incluidas bandas de absorción caracteris ticas de las estructuras olefinicas.

La porción intermadia del espectro, 1300-909 cm-'( 7.7-llmicro- metros), generalmente se denomina región de la "huella digital", El modelo de absorción en esta regijn frecudntemene es.complejo, y las bandas se originan en forma de vibraciones interaccionantes. Esta porción del espectro es de suma utilidad cuando se examina con referencia a otras regiones. Por ejemplo, si la absorcicjn de alargamiento O-H alcoh6lico o fenólico aparece en la región de longitud de onda corta de espe%tro, la posición de absorción C-C-O en la re-

Las bandas débiles en la región de longitud de onda corta, que

-

gión de 1000 cm- (7.93-10,O micrometros) frecuentemente hace ar la absorción OH a los alcoholes y fenoles con estruc

turas altamente específicas, La absoeción en esta regí& intermedia probablemente resulta Única para cada espzcie molecular,

banda particular deber5 confirmarse cuando sea posible mediante el ex6men de otras porciones del es]3ectro, Por ejemplo, la asignación de una banda de un carbonilo a un aldehldo debe confirmarse por la apa~icihcde una banda o un par de bandas en la región de 2900-2685 Cm (3,45-3,71~icrómetros) del e:;pectro, 10 cual se origina de la vibración de alargamiento C-H del grupo aldehido,,,,

Cualquier conclusión a la que se llege después del examen de una

Finalmente, en- una comparaci6n de "huella digital" de espectros, o en cualquier otra situación en que las formas de los picos sean importantes, se ddbe considerar por anticipado el cambio considerable de la apariencia general del espectro al pasar de un espectro que es lineal en la escala de número de onda a uno que es lineal en la longitud de onda '(figura -10). .B

Se pueden adquirir colecciones de espectros comercialmente de fuentes como:

Catalog of Infrared Spectrograms, Sadtler Research Laboratorios, 3314-20 Spring Garden St.,Philadelphia, Penn. Espectros cbasifica- dos en índice por nombre y de acuerdo con las bandas principales en cada intervalo en micras. Nombre comercial Spec-Finder.

'Catalog of Infrared Spectrograms, Proyecto 44 del Instituto Ame-

ricano del Petróleo, Carnegie Institute of Technology, Pittsburgh, Pa. Es una excelente fuente de espectros de compuestos de alta pur= za, principalmente hidrocarburos,

ASTM-Wyandotte Index, Molecular Formula List of Compounds, Names and references to Published Infrared Spectra, Publicaciones TGcnicas Espesiales de la ASTM 631 (196í!), Philadelphia 3 , Pa, Una lista cercana a 57 000 compuestos, Plncluye espectros de infrarrojo, infrarrojo cercano e infrarrojo' 1.ejano.

Documentation of Molecular Spectroscopy (DMS), Butterworths Scientific Publications, Londres; and Verlag Chemie GMBH, Meinheim/ Bergstrasse, Alemania Occidental1 en cooperación con el comite conju; to de Datos de Absorción Infrarrojo, Londres y el Institut für Speck trochemie und Angewandte Spectroskopie, Dortmund, Los especkros se presentan en tarjetas codificadas. Estas contienen resumenes de articu'los relacionados con la espectrometría infrarroja,

Dadtler Standard Infrared Prism Spectra, 1972, 4 3 000 espectros en 43 volúmenes, Sadtler Research Laboratories, Inc.

Los espectros de infrarrojo también pueden ser usados para determinaciones cuantitativas realizando una curva estandar en que se grafique la concentración de la muestra contra su absorbancia que nos permita conociendo $a absorbancia de una muestra determinada saber la concentracihn presente en ella, La figura 11 nos ilustra e& te .:pan to.

3 Jilverstein, ob, cit., pp. 95-97

o Longitud de anda pm

6.0 7.0 ' 8.0 9.0 10 12 14 16

4000 3000 Número de anda, c m ~ '

2000 . 1500 - 1000 900 800 700

100

80 O .- :

60 'E P

f

o U

40 : o b P

20

O )

Figura 10. Poliestireno, la muestra es la misma para correr ambos espectros. a) lineal en número de onda (cm- 1; b) lineal en longi t u d de onda (micr6metros). Silverstein, ob. ci t . , p. 96

" "__"" _" . ".

* _ ..L

Fig. 11. Muestra espectros; e n l a r e g i 6 h fundamenta l 1 d e l infrarrojo. En l a par-! te s u p e r i o r se tienen dos ' pesticidas p u r o s E n d r i n y D i e l d r i n , e n l o s espectros' s i g u i e n t e s se muestran mez{ clas d e esos dos p e s t i c i d a : e n cambios de p r o p o r c i ó n c$ n o c i d o s , se m u e s t r z l l a re- g i ó n d e 820-420 cm . Nóte- se los cambios s igni f i ca t i - vos e n la l o n g i t u d de' las b a n d a s d e a b s o r c i 6 n . Con las l e c t u r a s d e a b s o r c i 6 n o b t e n i d a s se rea l iza una curva p a t r 6 n q u e n o s per- I t =

mite hacer determinaciones c u a n t i t a t i v a s d e mezclas e n p r o p o r c i ¿ n d e s c o n o c i d a basadas e n s u s b a n d a s de a b s o r c i 6 n .

Fo l le to P e r k i n - E l m e r , ob. cit . , p. 8.

APENDICE C

RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR

La espectrometría de resonancia manética nucleaf: (RHN) reprz senta b&sicamente o t ra forma de espectrometria d e absorci6n. La absorci6n es f u n c i 6 n d e c i e r t o s núcleos d e l a molécula. Una gr6 - f i c a de las intensidades de absorción en f u n c i 6 n de l a s frecuen- c i a s de radiaci6n es lo que constituye un espectro d e RYN (vea la f igura 1).

tienen núcleos con e s p i n ( g i r o ) , E l qiro de estas particulas car3 gadas -circulaci6n de carga- genera un momento magnético a lo larg go d e l e j e de g i ro , de modo q u e estos núcleos actúan como imanes de barra minÚsculos, E l moment.0 angular de l a carga de s p i n n i n g puede- descr ib i rsd en términos de los numeros d e s p i n I.

A1 igual que los electrones, se considera que c i e r t o s &tomos

Cada prot6n y neutrón t iene s u propioepin e I es l a resul ta2 te de estos movimientos deespin. Cuando l a suma de protones y neu- trones es par, I es cero ( I s 0 s e r e f i e r e a q u e no hay s p i n ) o un nfimero par (O,l ,Z, , . . ) ; s i l a suma es non, I es l a mitad de,un nú- meo entero ( 1 / 2 , 3 / 2 , 5 / 2 , . , . ) . S i tanto los protones como los ne2 trones son nfimero par, I es cero. Tanto '*C. como 16C quedan denis t ro de esta categoria y no proporcionan seAal d e RMB,

Varios núcleos ( X, F, C y 31P) tienen un namero d e e s p i n 1 19 It3

I equivalente a 1/2 y una distribuci6n de carga esfévillfa uniforme, Los núcleos con número d e espirl I equivalente a 1 o superior tienen una distribución de carga no er;f&rica. Esta asimetria est6 def in&

da por un momento cudrikpolo e lcktr ico que a l tera e l tiempo de re12 jamiento y, consecuentemente, e1 acoplamiento de los nucleos veci-

CUO

14 nos. N y 2H tienen un nfimero de espin equivalente a 1, mientras q u e "B, 3 5 C l , 3 7 C l , 79B1: y *%3r son ejemplos de núcleos con I = 3 / 2 ,

E l número d e espin I determina e l número d e orientaciones que debe adquirir e l núcleo en un campo magnético uniforme e x t e k i o r de

acuerdo con l a f6rmula 2 1 + 1, E l protón con I = 1 / 2 tiene dos o r i e c taciones e n un campo magnético uniforme aplicado: paralelo con e l campo (alineado a l campo) o antiparalelo con e l mismo (alineado en contra d e l campo). E 1 primero es un estado de baja energia y por tanto estable, mientras que e l segundo es un estado de a l t a ener-

:o

2

C

u m T;I .-

-0 C .-

E l c!

". - --- c- rhvección campo abajo

$ 1 -Ji

I Campo bajo Campo alto

Barrido del campo magnético "t

. "

i - ~-

Figura l. Espectro de resonancia magnética nuclear. Morrison T. Robert, Neilson B. Robert. dujmica Org6nica. Fondo Educativo Interamericano, u.s.A., 1976, p. 428,

High-Energy or Anti-parallel

North

t

South

Low-Energ$ or Parallel State

I

Figura 2, Representacih de un núcleo con I=1/2 como una barra magnética en sus eskados de alta energla (antiparalelo) y baja energia (paralelo). Bauer O'Reilly Christian. Instrumental Analysis, Allyn and Bacon, Inc., u.s.A., 1978 p. 327

. g í a g u e lo h a c e i n e s t a b l e , ( v e r f i g u r a 21, Los niveles de energ ia son func i6n de l a magni tud de l momento magnético nuclear/ y l a i n - t e n s i d a d d e l campo magnético e$terior ap l i cado Ho.

La energía necescrria para inver t i r e l protón, depende de la

i n t e n s i d a d d e l campo externo., c:uanto m6s i n t e n s o es e l campo, t a c to, mayor es l a t e n d e n c i a d e l p r o t ó n a permanecer al ineado a é l y t a n t o m6s e l e v a d a l a f r e c u e n c i a d e l a r a d i a c i 6 n n e c e s a r i a p a r a c o n s e g u i r l a i n v e r s i ó n , A s i tenmrnss que:

donde p = f r ecuenc ia en Hz Ho= i n t e n s i d a d d e l campo magnético

en gauss = razón g iromagnktica (es una

c o n s t a n t e n u c l e a r c a r a c t e r i s - t i ca de cada subs tanc ia par - t i cu la r ) dada por :

h= &te. de BLanIj / w = momento magnético I= número d e e s p í n

la ecuación pr imera puede reduc: irse a :

u = c o n s t a n t e x Ho

*~ . ._ ’ a l a que se conoce como ecuaci6n Larmor, que nos mgestra

que podria j ( observarse una trans ic ión nuclear haciendo permanecer e l campo magnét ico cohs tante y v a r i a n d o l a f r e c u e n c i a a p l i c a d a , o v i c e v e r s a , h a s t a q u e l a c o m b i n a c i ó n d e l a f u e r z a d e l campo magné- t ico ap l i cado y l a i r r a d i a c i b n d e f r e c u e n c i a c o i n c i d a c o n l a a b s o r c i 6 n c a r a c t e r s s t i c a d e l n u c l e o e s t u d i a d o . A e s t a c o n d i c i ó n es a l a q u e se l l a m a r e s o n a n c i a , l a f r e c u e n c i a d e r e s o n a n c i a p a r a e l p r g t6n es de 60 MHz a 14t092 gaus s , En l a p r f i c t i c a l o s e s p e c t r 6 m e t r o s pueden ser c a p a c e s d e v a r i a c i 6 n ( b a r r i d o ) t a n t o d e l a f r e c u e n c i a como d e l campo magnético, por 1.0 que son usua les términos como fre c u e n c i a d e b a r r i d o d e l e s p e c t r o , campo de barr ido de l e spectrómek tro, y e s p e c t r o d e l campo de barr ido ,

-

.-

Las magni tudes invo lucradas en l a resonanc ia son muy pequefias,

por ejemplo, la energia requerida -est& dada por A E t h L ” a 6OMHz . (60 millones de c i c l o s por segundo) s6&0 es d e 6~lO-~Kcal/mol , por

l o que las radiaciones adecuadas caen en e l rango de radiofrecuencia localizado en l a regíon del espectro electromagnético e n ener- g í a s menores (frecuencia m6s baja, longitud de onda mayor) que l a luz infrarroja. La fuehte de radiación es un transmisor d e radiofrecuencia, generalmente un c r i s ta l osc i lador .

Ahora I consider&con rna’yor deta l le l a t rans ferenc ia de ener ‘t?“ gia del campo externo Ho a l magneto nuclear vemos que sus @os oriefl taciones: paralela y antiparalela no permanecen estacionarias, s ino que tienen un momento d e precesión alrrededor del e j e del campo ma9 nético exterior (vea l a s f i g u r ’ a s 3 y 4) .

La velocidad angular precesional, wo, es igual a l producto de la relación magnetogirica,d , ‘y l a intensidad d e l campo magnético aplicado, Ho.

w =gHo O

de acuerdo con l a ecuación de RMN fundamental se tiene que:

en consecuencia; w 2fii’ O

La velocidad angular precesional es cuantificada, de modo que la d i ferenc ia entre l a s velocidades angukres e n e l estado b6sico y e l excitado cottesponde a una frecuencia precisa, de modo que s i se apl ica la f recuencia adecuada de radiación electromagnética, la energía puede absorberse dando por resultado la excitación d e l nÚe Cleo en precesi6n y e s p i n i n g hacia e l s i g u i e n t e n * l de energia m6s alto. En términos esquemgticos, e l núcleo en precesi6n ha sa l - tado o se ha desplazado rspidamente hacia u n a orientación d i s t i n - ta. La energia implicada en esta t ransic i6n es de aproximadamente loo6 Kcal/ mol para e l prot6n (o caalquier otra combinación desea da en l a misma relaci6n1, e n un campo magnético d e 94 092-goass-y 60 megahertz d e frecuencia. Cuando un protón en un campo magnético se somete a la radiación elecLromagnética, la i n t e n s i d a d del campo

-

de 14 092 gauss puede expresarse como s u equivalente, 60 MHz.

Ahora estamos en posicibn de arreglar la geometria de un expe- rimento d e resonancia magngtica nuclear. Sometemos los protones a un campo magnético uniforme y potente, Los protones quedan ahora alineados con Y contra d e l campo y se encuentra e n precesión alrg.9..

,

I 1.

6rbita precerianal ,*"+-". \ I

I I ' Oipolo magnético

nuclear, p

en spinning

F i g u r a 3. P r o t 6 n e n p r e c e s i ó n d e n t r o de un campo m a g n é t i c o Ho.

S i l v e r s t e i n , ob. c i t . , p . 1 7 2 r

N South

F i g u r a 4. R e l a c i 6 n e n t r e e l movimiento de pre- c e s i d n y la d i r e c c i 6 n del campo i n d u c i d o HZ,en p núcleo r e p r e s e n t a d o como barra d e n t r o d e un campo m a g n é t i c o aplicado Ho.

B a u e r , ob, c i t . , p. 3 2 8 ,

3

dedor de l e je d e l campo magn&i.co ap l icado, Debido a l desorden térmico, de hecho solo una pequef ia fracci6n de la poblacion tg ta l de protones queda a l ineada adecuadamente , aunque e s ta f rac- c i 6 n es s u f i c i e n t e . La f ecuenc ia e l ec t romagne f i ca se p p l i c a d e t a l modo que su componente magnético H1 queda e n dngulo recto c o n r e s p e c t o a l campo magné t i co p r inc ipa l Ho y g i r a c o n e l pro- tón en prece s ión , Una bobina de osc i lador cuyo e j e se encuen- t ra en 6ngu lo s reotos con re1ac:ibn a l campo magné t i co p r inc ipa l Ho genera un campo magn6t i co o sc i l an te HI a lo l a r g o d e l a d i - r e c c i 6 n d e l e j e d e l a b o b i n a como se m u e s t r a e n l a f i g u r a 5, E l campo m a g n é t i c o o s c i l a n t e l i n e a l p u e d e rbsoQverse en dos componentes que g i ran en d i recc iones ; opues tas , Uno de estos compo- n e n t e s g i r a e n l a misma d i recc i .6n que la Órbi ta preces ioha l de l d ipo lo magnét ico nuc lear ( e l pro t6n) ; e l componente de rotaci6n opues ta de HI se desecha, Si Ho se conserva cons tan te y se hace v a r i a r l a f r e c u e n c i a d e l o s c : i l a d o r , l a v e l o c i d a d a n g u l a r d e l componente de campo magné t i co ro ta tbr io H v a r i a r e h a s t a q u e s e a i g u a l ( e n r e s o n a n c i a con) a l a v e l o c i d l d a n g u l a r w d e l pro- t6n en preces i6n . En es te momento l a e n e r g i a se absoPbe, e l nú Cleo s a l t a a un n i v e l d e e n e r g l a s u p e r i o r y e l r e g i s t r a d o r mu- t r a un p i co . ,,

&ora que hemos descrito brevemente la forma en que un núcleo se e x c i t a a un n ivel de energfa más a l to med ian te l a ab sorcL6n de energ la , nece s i t amos cons iderar e l r e g r e s o d e l n ú c l e o a l es- t ado bds i co , En ausencia de tal . mecanismg todo e l pequeAo exceso de poblac i6n e n núcleos en e l e s t a d o d e e n e r g í a i n f e r i o r se le- v a n t a r & a l e s t a d o d e e n e r g i a s u p e r i o r y ya no se absorbe mayor cant idad de en%gia, Aforbunadamente exis te un mecanismo mediante e l c u a l e l núc leo e n e l estado de energía superior puede per- der energfia hacia el medio que lo rodea y r e g r e s a r a s u e s t a d o de energ ía inferior. Este mecanismo se denomina proceso de rela- j amien to l ong i tud ina l e i m p l i c a l a t r a n s f e r e n c i a d e e n e r g i a d e l núc leo en su e s t ado de energ fa super ior hac ia e l contorno mole- c u l a r . Su e f ic ienc ia se d e f i n e como e l tiempo TI , requer ido . para l a t r a n s f e r e n c i a , Un proceso de! r e l a j a m i e n t o e f i c i e n t e i m p l i c a un tiempo T breve y dq por resul tado e l ensanchamiento del p ico de a b s o r c i d . La a m p l i t u d d e l a l i n e a es inversamente proporcion%l a l a d u r a c i ó n d e l e s t a d o e x c i t a d o , En los liquidas, s o l u c i o n e s y ga se s puros? e l tiempo T1 t i e n e la durac i6n apropiada para pro d u c i r un p i c o d e a m p l i t u d u t i l i z a b l e , En los s6l idos ,este me- Cani-SmO no es efectivo, consecuentemente T es muy prolongado y e n a u s e n c i a d e c u a l q u i e r o t r o e f e c t o , u n s a l i d o . c r i s t a l i n o mani- f e s t a r$ l i nea s ex t remadamente e s t rechas , Ex i s t e otro efecto, de- nominado espin-espin o re l a j ami , en to t r ansver sa l , que es de espe- c i a l i m p o r t a n c i a e n e l ca so de los s ó l i d o s , Este i m p l i c a & a t r a n s f e renc ia de energ fa de un n ú c l e o d e a l t a e n e r g i a a o t r o . No ex i s - te pérd ida ne ta de energ ía , pero su d i sper s ión de l o s núc l eos i n - v o l u c r a d o s r e s u l t a como un ensaachamiento de la l ínea. De hecho este Último mecanismo origina un e n s a n c h a m i e n t o t a l d e l a l í n e a que 10s e s p e c t r o s d e RMN de l o s . l sÓl idos r e su l t a ser de poco in - terés para e l quimico orgAnico,

-

1 S i l v e r s t e i n , ’ IC&:.. cit., pp.173-174

Aparatos,- LOS espectrómetros (de resonancia magnética nuclear de alta resolución son instrumentos complejos y caros, son producidos por un pequeño número de manufectureras: Varian (E. U.), Perkin-El mer(Gran Bretaña), Bruker (Alemania) y Jeol (Jap6n).

Los modelos como Varian EM360 y Perkin-Elmer R24 disponen de magnetos permanentes con intensidades de campo aproximadamente d e

14 O 0 0 gauss y proporcionan espectros prot6nicos a GOMHz, son los mds utilizados para trabajos d e rutina en anal is is cual i tat ivos y

su precio es moderado. Los electromagnetos permiten mayor f lexi - bi l idad, d e modo que los espectros pueden obtenerse a diversas frecuencias hasta de 100 MHz(23 SOOgauss), como Varian XL 100-15 y

Bruker HX-90, que son utilizados en trabajos de investigación, siez do s u precio aproximadamente 15 veces mayor que los antes mencio- nados. En los extremos tenemos e l Varian 300 usado s610 para protones que operan a 30 MHz y es e l más económico, mientra8 que o- t r a s manufactureras ofrecen aparatos con los nuevos magnetos super- conductores ( d e helio enfriado) que aceptan frecuencias de

220-360 MHz, los cuales no son muy disponibles debido a s u a l t o costo.

Un arreglo t ipico d e un esgctrómetró es mostrado en l a f i g u -

r a 6. E l instrumento puede definirse en términos de los siguientes componentes: 1) Un magneto potente cuyo ca.mpo homogéneo puede hacerse variar

continuamente y con precis.iÓn dentro d e un intervalo relati - vamente estrecho. Esto se logra por medio de un generador de

barrido. 2) Un oscilador de radiofrecuencia 3 ) Un receptor de radiofrecuencia 4) Un registrador, calibrador e integrador. 5) Un soporte d e muestra que sitúa a és ta e n relaci6n con e l cam .-

Pa, magnético principal, la1 bobina d e l transmisor y . l a bobina del receptor. E l soporte de l a muestra también %a hace g i r a r para aumentar l a homogeneidad manifiesta d e l campo magnético. También se dispone d e u n soporte d e muestra de temperatura v= riable. Para l a obtención d e l espectro de RMN se selecciona la inten-

sidad de campo y la frecuencia deseadas, y e l generador de barrido

-' (

drbita precesional. t

oscilador

"""" , .. . I

Figura 5. E l oscilador genera un componente rotatorio del campo magnético HI . I b i d 0 9 P o 1 7 3 0

.. "

to Increase Field Homogeneity

Recorder

1 [ I I

sw=P Transrktter Receiver coil I

generator coil

I

!

í I Spectrum Resented in Abmrption Mode

Spectrum Resented in Integral Mode

\ . ._ --. .

Figura 6. Diagrama esquemetico de un espectr6metro d e resonancia magnética nuclear.

Bauer, ob. c i t . , p. 3 2 9 ,

!

recorre e l campo magnét ico dentro de un in terva lo l imi tado cerca de

l a i n t e n s i d a d d e l campo s e l e c c ~ ~ o n a d a . LOS e s p e c t r o s prOtÓniCOS .

generalmente se ob t i enen a 60 MHz 6 a l O O M H z y e l i n t e r v a l o U s u a l d e l campo barr ido es e q u i v a l e n t e a c e r c a d e l O O O H z e n e l primer

c a s o y cerca de 1700 Hz a 100Ml-I~. Mediante l a m e d i c i ó n d e l o s d e s p lazamientos dd f recuenc ia con re spec to a un marcador de referen4 c i a , se puede lograr una precis i6n de 2 1 Hz. E l r e g i s t r o se pre- s e n t a como una serie d e p i c o s , e n que l a s 6 r e a s s o n p r o p o r c i o n a l e s a l número de protones que repeesentan, Las Areas de p ico se miden

por medio de un in t egrador electrónico que traza una serie de e ta - pa s cuyas a l tu ra s son p roporc iona le s a l a s 6 r e a s d e p i c o . L o s p i c o s e scond idos ba jo o t ro s p i co s pueden de tec tar se e n e s t a f o rma , e l conteo de protones es d e u t i l i d a d p a r a d e t e r m i n a r l a p u r e z a d e l a muestra y e n e l t r a b a j o a n a l í t i c o c u a n t i t a t i v o .

Manejo d e l a m u e s t r a . - La mueatra (un l iquido o un;- s o l u t o en un so lvente adecuado) se encuentra e n un t u b o d e v i d r i o d e 5mm de d i6metro exter ior . Normalmente se emplean aproximadamente 0.4ml de l iqu ido puro o entre 10 y 50 mg de un l íquido o s 6 l i d o d i s u e l - to en 0.4 m1 de solvente. Mediante l a u t i l i z a c i 6 n d e t a p o n e s i n e f tes p a r a e l i m i n a r los e s p a c i o s rnuelrtos ( r e s t r i n g i e n d o a s í l a mues- t r a a l a r e g i ( h d e l a b o b i n a d e l r e c e p t o r ) , se pueden u t i l i z a r vo-

lumenes tan pequeños como 0.025 m l . Un microtubo (Nuclear Magnetic Resonance Special i t ies, New Ken-

S ington , Pa , ) que aons i te en un cap i l a r de pared g rue sa y q u e d i s e pone de una cavidad esfér ica de 25 m i c r o l i t r o s , p e r m i t e l a o b t e n - c i b n de espe-.ctros ú t i l e s con una proporción cercana a un miligramo de mues t ra . Para e lb iminar l a f a l t a de s en s ib i l i dad i nheren te a l a e spec t rometr i a de RMN, se puede ap l icar e l r a s t r e o r e p e t i t i v o , De este modo se pueden acumular señales y promediarse e l ru ido , pa- r a este propd’sito se t iene un aditamento formado por una pequeña computadora (computadora para transitorios promedio, CTp) a modo de aCCeSOri0. Los e s p e c t r o s de u t i l i d a d se pueden obtener con mues- t r a s d e l o r d e n d e 150 microgramos.

Un i m p o r t a n t e d e s a r r o l l o r e & n t e p a r a l a d e t e c c i 6 n d e s e f i a l e s d é b i l e s es l a RMN por Transformada de Fourier(TF), e n lugar de u@a Sefial continua se u t i l i z a una serie de p u l s o s b r e v e s d e radie f recuenc ia . E l pu l so de r a ido f recuenc ia abarca t odo e l i n t e r v a l o de f r ecuenc ia e n donde e l nucl.eo absorbe energía.

Todos 10s núcleos susceptibles; de absorción se excitan- Una vez que ha pasado el pulso de energia, el retorno del núcleo a SU est= do basico se realiza mediante el proceso de relajamiento- ~a P& dida de energía por el núcleo en relajamiento origina la sefial de transformada de Fourier. La se!Aal de salida no se parece a la se- Aal convencional de RMN, Un pulso requiere de aproximadamente un milisegundo, y varios pulsos (a intervalos adecuados) requieren tan solo de algunos minutos. Las señales de salidatrepititiva se

almacenan mediante el computac!or, Posteriormente, las seiíales se transforman en un espectro de RMN convencional por medio de un segundo computador, los espectros de utilidab pueden obtenerse con muestras del orden de 10 a SO microgramos. 2

El solvente ideal no debe contener protones en su estructura,%% de naturaleza no polar e inerte, de bajo punto de ebullici6n y

bajo costo. El tetracloruro de carbono es ideal cuando la muestra es suficientemente soluble! en 61. El solvente que se utiliza pf m6s ampliamente es el cloroformo deuterado (CDC13), el pequeAo pico prot6nico debido a la impureza presente raramente interfiere de una manera seria , El bisulfuro de carbono tarnbih es un solvente de utilidad, Casi todos los solventes comunes se encuentran disponibles en su forma deuterada con una pureza isotópica (%at6mico de deuterio) entre 98-99-8% (vea la tabla 1)-

Frecuentemente se observan bandas laterales colocadas sim& tricamente en ambos lados de un pico de absorción intensa, que son resultado de hfalta de homogeneidad del campo magnético y del tubo en que se coloca la muestaa, Se pueden reconocer con facilidad debido a su posición simétrica y debido alsu separación de 10s picos de absorci6n es proporcional a la velocidad del espinhng. Las ee

oscilaciones que frecuentemente se observan en el extremo &!cam- PO intenso de un p & ~ & agudo fuerte se denominan oscilación decreciente- Estas son frecuencias de pulsación que resultan del paso ri pido (operación normal) a tra&s de los picos de absorci6n.

J@

Trazas de impurezas ferromagnkticas pueden originar un ensaocha- miento notable de los picos de absorción, las fuentes comunes de contaminación son el agua corriente, lana de acero, nique1 Raney

Particulas de espgtula y accesorios metblicos, Estas impurezas se 9

TABLA I

posiciones de desplazamiento para protones residuafes en solventes deutercdos de disponibilidad I comercial. Los datos han sido proporcionados por Merck Sharp und D o h e of Canada, Ltd.

Pureza isotdpica, Solvente % &mico de D

~ ~~

Posición de los protones residuales

Grupo . r -~ Acido aceticod, Acetona-d, hcetonitrilo-d, Benceno-d, Cloroformo-d Ciclohexano-dl, Oxido de deuterio 1, 2-dicloroetanod, Eter dietílico-dl, Din~etilformamidad, /

Sulf6xido de dimetilod, p-Dioxanod, Alcohol etílicod, (anh.) Deuterato de hexafluoroacetona Alcohol metilicod, Metilciclohexanod,, Cloruro de metileno-d, Piridina-d, Silanare-C

Tetrahidrofurano-d, Tetrametileno-d, sulfona

(CDCI, + TMS 1 %)

:99. S - ”

99.5 98 99.5 99 .8 99 9 9 . 8 99 98 98 99 .5 98 98 99.5 99 99 99 99

99 .8 .9 8 98

metilo metilo metilo metino metino metileno hidroxilo metileno metilo metilo metilo metileno metilo hidroxilo metilo m.etilo metileno alfa

. 7.95 7.9 5 8.05 2.80 2.75 8.60 5.25.

6 .31 8.84 I

7.24 7.50 6.45 8.83

1 .o. 6.65 9.08 4.65 1.30

metilo 1 O.OOb

a-metileno . 6.40 a-metileno 7.08

Grupo T Grupo r - ___-

hidroxi?o - 1.53”

metileno . 6.64 metilo 7.06 formilo 1.95

metileno 6.41 . hidroxilo 7.40‘

hidroxilo 5.16. metileno 8.46 metino 8.35

beta 2.80 gama 2.42

metino 2.75 8-metileno 8.25 B-metileno 7.84

* Este valor puede variar notablemente dependiendo del soluto. Por definicih. Marca registrada.

Ibid 0 9 p o 180.

pueden eliminar mediante la inmersión de un magneto de barra delgada entro del tubo de RMN, por medio de CentrifUCJikCi6n O bien por filtración.

Desplazamientos qufmicos.- En principio, podriamos colocar una SUS- tancia en un campo magnético de intensidad constante para obtener un espectro en la misma forma que obtenemos uno de infrarrojo o uno de ultravioleta: hacierado pasar radiación de frecuencia que cambia constantemente por la substancia, y observando la frecuendia con que se absorbe 1.a radiación. Sin embargo, se ha encontrado en la practica, que ds más conveniente mantener constante la frecuencia de radiaci6n y variar la intensidad del campo magnético; para algh valor de intensidad del campo, coincide la energía necesaria para invertir el protón con la de .k radiae cibn, se produce la absorcihn y se observa una señal.

Si la situación fuese tan simple como la hemos descrito, e2 tonces todos los protones de unla molécula org6nica absorberían 9

en exactamente la misma intensidad de campo y el espectro consi= tiria de una señal que no revelaría practicamente nada de la estructura de las moléculas. Sin embargo, la frecuencia a que absorbe el protón depende del campo magnético que el protón percibe y esta intensidad de campo efectiva no es la misma que la a- plicada. La intensidad efecgtiva en cada protón depende ddl ambiente de éste (presencia de otros pwtones cerdanos, densidad electrónica alrededor del protÓn,etc), Cada protón o conjunto d de protones equivalentes tendrán un ambiente ligeramente diferen te dd cualquier otro conjunto, por lo que aeceli;lkaf.& una intensi dad ligeramente diferente para producir la misma intensidad de e

campo efectiva,( la intensidad especifica a la que se produce absorció4 Por tanto para cierta radiofrecuencia todos los protones absorben a la misma intensidad de cQmpQ efectiva pero a diferentes intensidades aplicadas, Zsta Última es la que se mide y es la que se emplea para marcar los espectros de absorci6n.

- -

Como resultado de lo anteriormente sefíalado un espectso muestra muchos picos de absorci6n que reflejan'diferencias en el ambiente de protones, por lo que puede dar información importante acerca de la estructura molecular de la sustantia estudiada,

Tal Como el número de sefiales de un espectro de RMN nos in-

dica la cantidad de tipos de hirdrógeno que contiene una moléculai la posici6n de las sefiales nos ayuda a identifican el tipo de protones: si son arom&ticos, alifaticos, primarios, secundarios, terciarios; si son benci¿kicos, vinílicos, acetilénicos, o bien, si son adyacentes a un halógeno u otros grupos,

Cuando se ubica una molécula en un campo magnético(1o que sucedu-al realizar un espectro de RMN) sus electrones son obeiga - dos a circular,^ al circular generan campos magnéticos inducidos (campos magnéticos secundarios, H I ) .

La ciEculaciÓn de electrones en torno al protón mismo, gene ra un campo alineado de tal modo que - en el protón- se opone al campo aplicado, por lo que el campo detectado por el protón disminuye , se dice entonces que el protón est6 protegido, La cir- culación de electcenes(especificamente electronesfl’ 1 alrededor de núcleos cercanos genera un campo que puede oponerse o refor- zar el campo aplicado en el protón, lo que depende de la ubica- ción de este, Si el campo indiucido se opone al aplicado, el p ~ t 3 - t6n está protegido, si el campo inducido refuerza al aplicado, e

el campo alreddor del protón se ve aumentado, por lo que se dice que está desprotegido, esto se ilustra en las figuras#,7 J 8 9

Comparado con un protón desnudo, uno protegido requiere de una intensidad de campo aplicado mayor (y uno desprotegido una menor) para?& proporcionar la intensidad de campo efectiva e

especifica que corresponda a la. absorción, Por esto la f3eotección desplaza la absorción a campo más alto y la desprotecci6n hacia el mas bajo, A los desplazamientos de las posiciones de absorción en RMN, causadas por la protecc:i6n o desprotecci6n electrhica, se les denomina desplazamientos, qufmicos,

La unidad m f \ s conveniente para expresar un desplazamiento‘ quimico ea en partes por mill& (ppm1,del campo magnético total aplicado, Puesto que la protecc:ibn y desprotecci6n resultan de campos secundarios inducidos, la magnitud de un desplazamiento quimieo es proporcional a la intensidad del campo aplicado, o lo que es equivalente, proporcional a la radiofrecuencia que el campo debe igualar, El punto de referencia para medir los desplsza- mientos qufmices,no es,por razclnes de orden prictico, la seAal de un prot6n desnudo, sino la de un compuesto real; generalmente -

Líneas de fuerza magnética inducidas -

Figura 7. Protecci6n de los pro tones a- cetilénicos,

.. , .

Electrones circulantes ._

Líneas de fuerza magnCtica inducidas

Figura 8, Desprotección de los protonep aldehfdFcosb

..

,Figura 9, Efectos de la corriente any lar en el benceno. G.9 176.

c *

es el tetaametilsilano(s~, Si(CH 3 1 43 que ofrece las siguientes ventajas es químicamente inerte, magnéticamente isotrópico, ~016- til (p,e.27°C) y soluble en la mayor parte de los solventes or96 nicos, proporciona un pico de ZnbsorciÓn agudo simple y absorbe a un campo mayor en comparación con la mayoría de los protones orghicos, Cuando el solvente est6 formado plPr agua u Óxido de de2 terio, el tetrametil silano se puede utilizar domo referencia externa, es decir, sellado en un capilar que se sumerge en la so# luci6n.

La escala de uso más común es la escala delta ($1 en que se designa la posición de la señal del tetrametilsilano como 0,Oppm La mayoría de los desplazamientos quirjlicos tienen valores 6' entre O y 10, Un valor -j pequeño indica un pequeño desplaaarniento hacia abajo y un valor $ grande un gran desplesamiento hacia el campo bajo. A menudo se encuentra otra escala tau,r, en la que la seflal del tetrametilsilano tiene el valor de 10.0 ppm, La mayor parte de los valores de C se encuentran entre O y 10, Ambas es- calas se reaacionan por la expresión: 2 - 10 -4

. T 5

" 1 0 (escalak )

0 . 0 6 7 8 9 10 (escala 'C)

Una señal de RMN de un protón determindo aparece a una intensidad de campo difeme a l'a del jzetrametilsilano. Esta diferencia(ddsp1azamiento químicq) no se mide en gauss, sino en unidades de frecuencia equivalente y se divide por la frecuencia del espectr6metro empleado, se'ha introducido el factor de-10 :' para evitarse el manejo de números muy pequeños, as$ tendremos:

6 -

desplazamiento químico en p'pmm Desplazamiehto observado(Hz) x 106

Frecuencia del espectrómetoo I _

(Hz)

una frecuencia aplicada de 60MHz quedaria en una 8 =1 Ó lppm. Para un pico a 60 Hz ( a partir del tetrametilsilano a

4 Ó ppm = BO :x l o 6 S 1

60 x 106

I APEPJDICE D

CROMATOGRAFIA,

La técnica de cromatografia fue descrita por pimera vez en 1903 por Tswett, aunque el denominó al método cromatografía porque sus estudios tenían que ver' con la separaci6n de pigmentos vegetales (del griego cromato =: color), sugiri6 que el procedimiento b6sico podría aplicarse a todos los tipos de compuestos químicos,

Actualmente, los métodos cxomatográficos son indudablemen- te las técnicas de separación más ampliamente usadas gracias a la combinación de los siguientes factores: 1) Las técnicas cro- matogr6ficas no requieren aparatos costosos; 2 ) La mayoría de los m6todos requierew1un mínimo de habilidad técnica; 3 ) La mayo- ría de los métodos poseen un poder de reeolución muy alto Bun para mezclas formadas por compuestos muy sifiilares; 4) Existen en la actualidad una gran selecci6n de procedimientos cromatografi- cos que permite la resolución de todo tipo de compuestos bioló- gicos.

Antes de discutir las diferentes tGenicas, es necesario primero establecer el principio general de la cromatografía, S e ha dado la siguiente definici6n: Cromatografia es el proceso que se caracteriza por el paso unlforrne de una mezcla fiuida (gas o 11- quido) a través de otra sustancia relativamente inmovilizada (14- quida o sólida), la cual por diferentes medios, permite la migracibn diferencial de los componentes de la mezcla, Aunque esta de- finici6n parece no muy específica se refiere a dos caracteristicas comunes a las tknicas cromatogr6ficas: I) Son procesos din6micos que comprenden el movimiento continuo de una fase (fase móvil), la cual contenía originalmente la mezcla, con respecto a una fase inmÓbil(fase estacionaria), 11) La separaci6n se logra debido a las diferencias en el grado en el cual los componentes individuales de la fase móvil interac- tfian con la fase estacionaria. Esta interacción diferencial da cg mo resultado un movimiento diferencial, 1

1 Bohinski C. Robert, Bioquimica, Fondo Eductivo Interamerid no, U,S.A, 1978, p. 13

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. Después de h a b e r s e ñ a l a d o l a t e o r í a y a p l i c a c i o n e s d e l a

cromatografia pasaremos a descr ibir e l a r r e g l o f í s i co y los procesos que ocurren durante l a separac i6n cromatogr6f ica en una columna, La columna S e empaca corn f i b r a d e v i d r i o o algod6n para preven ir que e l & l i d o f i n a m e n t e d i v i d i d o s a l g a a l f l u i r t e l s o l - v e n t e , u n a vez hecho e s to se empaca e l s 6 l i d o q u e a c t u e c o m o f a - se e s t a c i o n a r i a h a s t a u n a a l t u r a d e 20 a 30 cm, este empaque puede hacer se s eco o suspendido en e l s o l v e n t e e l e g i d o , s i e n d o mas recomendab le e s t a f o rma ya que a l depos i t a r se e n l a columna se e l i m i n a n l a s b u r b u j a s de a fke que ser fan un fac tor de error,

Una pequefia a l i c u t a de una soluci6n concentrada de l a m u e s t r a se c o l o c a e n l o a l t o de l a columna, la muestr.a es e l u i d a d e l a p a r t e a l t a d e l a co lumna hac ia o tras capas d e l empaque mediante e l f l u j o d e l s o l v e n t e p o r l o que aparece una banda y despuds de un tiempo p o d r h o b s e r v a r s e e n c a s o d e s u s b t a n c i a s c o l o r i d a s diversas bandas que corresponden a compuestos d i ferentes ,como se m u e s t r a e n l a f i g u r a . I E l s o l v e n t e l l a m a d o e l u e n t e corre a t r a v é s de l a co lumna a una t a sa cons tan te l a vando l a mues t ra , e l solven- t e puede ser e l primero e n que se d i s o l v i d l a m u e s t r a u o t r o com- p le tamente d i f e ren te , puede ' se r un so l ven te puro o una mezcla de e l l o s .

Como e l s o l v e n t e l a v a l a laanda en que est6 a d s o r b i d a l a mues - t r a , e l compuesto más soluble se mover6 con e l e luente hac iendo c o n t a c t o c o n l a s u p e r f i c i e l i b r e q u e e n c u e n t r a h a c i a a b a j o de l a Capa que contiene a l a muestra y es adsorbida por 61, ha s ta que o t r a f r a c c i ó n n u e Q a d e s o l v e n t e l a l l e v a c o n s t g o h a c i a o t r a c a p a m& b a j a y asf r e c e t o d a l a co lumna pasando de l a fa se e s tac io- n a r i a a l s o l v e n t e , Un so lu to que es completamente insoluble e n e l eluente permanecer5 en una estrecha banda en lo a l t o d e l a co- luqrna s in moverse no importa l a . cqnt idad d e l i t r o s de s o l v e n t e que se haoan pasas a t ravé s de l a co lumna ,

Como e l s o l u t o se mueve h a d a l a p a r t e b a j a de l a columna su ve loc idad' .e s t& de terminada por e l e q u i l i b r i o entre l a a d s o r c i h y l a p a r t i c i ó n , D S uésede un corto t iempo la muestra empieza a s e g r e g a r s e e n @ a s c u a l e s un s o l u t o esta mas concentrado que en o t r a . Como l a e l u c i 6 n c o n t i n ú a e s t a s z o n a s c o n c e n t r a d a s se comportan como e n t i d a d e s e n l a s c u a l e s se tendr6 un s610 so lu to , Des-

Drur8pLI : u

pueg de un t iempo es tas zonas d e Componentes Puros se empujan unas a o t r a s h a c i a a b a j o , d e b i d o a s u s d i s t i n t a s v e l o c i d a d e s se obser- v a n z o n a s d e s o l v e n t e e n t r e e l l a s ( V e a l a fig- 4 ) m Este proceso de separac ión de componentes de l a mues tra en zonas 0 bandas de subs tanc ia pura es conocida como e l d e s a r r o l l o d e l CrOmatOgramaa Como r e s u l t a d o d e este proceso tendremos que la zona m6s débilmen te unida a l a columna sa ldr6 m6s rapidamente, pudiendo entonces r e c o l e c t a r l a y ana l i zar l a , e s t a r6 s egu ida por l a s egunda déb i lmen te unida que también se r e c o l e c t a e i d e n t i f i c a , y a s í se con t inúa has ta que todos los so lu to s han s i do r emov idos de l a co lumna . A¡

proceso de remoci6n d e l a columna y colecci6n de cada componente d e l a m u e s t r a se conoce como e:Luci¿jn. La so luc i6n que cont iene cada componente de l a m u e s t r a es l lamado eloato. Durante e l pa so de l s o l u t o d e s d e l o a l to de l a co lurnna , l a banda se incrementa desde una muy e s t r e c h a h a s t a a l c a n z a r s u máximo g r o s o s e n l a p a r t e ba- j a , este proceso es l lamado ensanchamiento de la banda.

Cuando se t r a b a j a c o n s o l u t o s i n c o l o r o s l a s e p a r a c i ó n d e so lu tos en bandas y e l rnovirjliento de e s a s b a n d a s h a c i a l a p a r t e i n f e r i o r d e l a c o l u m n a no pueden observarse, por tanto para detec- t a r c a d a uno de los componentes e l l iquido que emerge de la columna ( e l o a t o ) , es co lec tado en . f r a c c i o n e s d i s c r e t a s , p o r d e c i r a lgo , de 10 m l , cada una de es t :as fracciones son anal izadas . Una grs f ica de l a concentrac ión de cada componente en e l e l o a t o como func i6n de l vo lumen de l e loa to es una suces ión de p icos como lo m u e s t r a l a f i g u r a t. La cant idad de cada componente presente dg termifla e l a r e a b a j o l a c u r v a .

- -

Las bases para l a separac ión de lbs componentes de una mez- cia p o r c r o m a t o g r a f i a s o n l a s d i f e r e n c i a s e n p r o p i e d a d e s f i s i c a s y quimicas de cada componente. Los procesos que ocurren en l a cz lumna cromatog6afica durante el. d e s a r r o l l o d e l cromatograrna son t o d o s p r o c e s o s d e e q u i l i b r i o , p e q u e f l a s d i f e r e n c i a s e n l a s p r o p i s dades de los componentes son aNq3liadas enenmemente por 10s miles d e e q u i l i b r i o s r e v e r s i b l w s q u e e f e c t ú a e l soluto cuando se mueve a 10 largo de la columna. E l conocimiento d e l o s e q u i l i b r i o s iz vo lucrados e n l a s e p a r a c i ó n y e l saber como v a r i a r l a p o s i c i ó n d e c a d a e q u i l i b r i o d a p o s i b i l i d a d a l a n a l i s t a p a r a r e a l i z a r u n a

i ' (e) - - -

Figura 1. Diagrama de una separaci6n cromatogr6fica' e n columna,

Dilts V, Robert . Analyt ical Chemistry, Van N o s t r a n d Company, New York, 1974. p. 325,

*E" G 6 .E SS E: w

C=l

O Volume of Eluate Collected' + 200ml ".

Figura 2. Relaci6n entre e l componente del e loato y s u volumen colectado,

Ibid. , p. 327.

separac i6n que de o tra forma no s e r i a p o s i b l e . D e f i c i e n c i a s en e

e l conoc imien to de l a qu imica i nvo lucrada e n l a s eparac i6n por e c r o m a t o g r a f í a i n v a l i d a s u e f e c t i v i d a d .

E l hacer m f i s l e n t o e l movimiento del soluto en comparacibn a l a v e l o c i d a d d e l f l u j o d e l s o : l v e n t e e n l a c o l u m n a es conocido como e l p r i n c i p i o d e r e t a r d a c i 6 n s e l e c t i v a . Cada s o l u t o e n l a mezcla se mueve a t r a v é s d e l a columna a una velocidad que es d g t e rminada por l a po s i c ión de equ i l i b r io entre e l s o l u t o e n e l s o l v e n t e q u e f l u y e y e l s o l u t o i n m o v i l e n l a s u p e r f i c i e s 6 l i d a d e l empaque de la columna. Esta ,s tasas de movimiento son caract= r f s t i c a s d e c a d a s o l u t o e n un ambiente part icular formado por e l empaque de l a columna y l a c o m p o s i c i ó n d e l s o l v e n t e . E l tiempo que l e toma a l s o l u t o e m e r g e r e n l a p a r t e i n f e r i o r d e l a columna es u t i l i z a d a p a r a su i d e n t i f i c a c i ó n , c a d a s o l u t o t iene su propio grado de re tardamiento o f a c t o r de re tardamiento , R f , que est6 d e f i n i d o como:

Rf = v e l o c i d a d l i n e a l d e l a b a n d a d e s o l u t o v e l o c i d a d l inea l d e f l u j o d e l solvente

d i s t a n c i a que se mueve e l s o l u t o en e l tiempo t Rfr: d i s t a n c i a q u e se mueve e l solvente en e l tiempo t

En c u a l q u i e r momento durante e l desarrol lo del cromatograma l a f r a c c i d n d e l número t o t a l d e m o l é c u l a s d e l s o l u t o d e c u a l q u i e r e s p e c i e p a r t i c u l a r q u e e s t6 e n e l d i s o l v e n t e q u e se mueve est5 dada por:

h

c a n t i d a d d e s o l u t o e n l a f a s e l i q u i d a en movimiento= c a n t i d a d t o t a l d e s o l u t o p r e s e n t e

La c a n t i d a d d e s o l u t o e n l a f a s e l i q u i d a e n c u a l q u i e r i n s t a 2 te es VsCs donde V1 e s e l volumen de l a f a s e l l q u i d a e n movimie; to y , C1 es l a c o n c e n t r a c i c h d e l s o l u t o e n ese tiempo en l a f a s e l í qu ida . Cua lqu ie r so lu to que no e s t 6 ' e n l a f a s e l í q u i d a d e b e r 5 e s t a r e s t a c i o n a r i o e n l a s u p e r f i c i e s ó l i d a , l a c e n t i d a d d e s o l u t o e s t a c i o n a r i o es VsCs, s i endo Vs di% volumen de l a f a s e e s t a c i o n a - r i a d e l s o l u t o y Cs l a c o n c e n t r a c i ó n d e l s o l u t o en f a s e e s t a c i o - n a r i a l o q u e d a l a s i g u i e n t e e c u a c i 6 n :

vlcl fracci6n en movimiento = vlcl + vscs

Como la kcción en movimiento es igual al Rf, ya que el sols to s o l o se mueve con la velocidad del solvente cuando se encujdntra en la fase rn6vi1. La fracción de las moléculas en la fase en m 2 vimiento a cualquier tiempo es una medida de la fraccibn de tiempo en que cualquier molécula permanece en esta fase en movimiento por lo que :

E

Rf= - v,c, V l + "SCS v1 + cs v V1 + K Vs

-0 r S

donde K = - = constante de equilibrio cS

Cuando la partici6n es el mecanismo de distribución, K es la kaz6n de la concentracidn del soluto en la fase liquida mbvil, esto es D, la ras6n de distribuci6n del soluto, Cuando la adsor- ci6h es el mecanismo de distrib'uci6n del soluto, K es la concen- traci6n de soltItIo adsobido dentro del solido, dividd, entre la concentracibn del soluto en la fase móvil del liquido, Esto como puede verse incluye la absortividad especifica ( A s ) , En ambos casos la relacibn entre la constante de equilibrio y el valor de Rf es idéntica.

Cada soluto mostrar6 un diferente valor de Rf en las fases estacionariac; y liquida, esto es compreesibl@ ya que la naturaleza de las fases afecta el valor de K en la ecuacibn, Los valores de Rf varian con el método de preparacibn de la superficie s6- lida, el &rea superficial, el tamaño del poro, la temperatura, a s í como la composici6n y volumen de la fase liquida lo hacen también, Debido a las variaciones del Rf con las condiciones experimentales los valores de Rf de la 1iterat.ura no pueden ser usados para pro- p6sitos de identificacibn,

Figura 3 , Fotografía de una columna tipica pa- i

ra separaci6n cromatogrdfica. El solvente elu- yente, contenido en la c6mara superior, fluye a través de la columna, Los so&utos disueltos aplicados originalmente en pequeño volumen en la parte superior del lecho s6lido. Las fracciones se recogen por goteo en la parte inferior de la columna, Como se muestra en la ilus tracibn, hay disponibles columnas de diversos- tamaños, La columna en el extremo derecho tiene l pulgada de didmetro y 3 pies de largo, Bohinski, ob. orit. p. 28,

Cromatografía en columna de intercambio iónico,

Cuando los solutos que se van a separar pueden existir como

iones cargados positiva o negativamente, el procedimiento de cro-

matografia de intercambio ibnico es una técnica muy efectiva y

con un poder resolutivo muy alto, En contraste con la cromatogrc fia en papel en donde la fase estacionaria es un líquido sobre un soporte sólido inerte, la fase estacionaria de la cromatografia de intercambio i6nico es una sustancia sólida que participa ”. real- - .

mente en el proceso intercambihndose directamente con los- compo- nentes de la mezcla, por lo que se ha llamado a estos materiales intercambiadores i6nicos.

La mayoría de los intercanbiadore i6nicos son materiales sin - téticos que se fabrican en forma de esferas muy pequeñas (véase la fig. 12, cada una de ellas est6 compuesta por cadenas polime- ricas grandes que están entrecruzadas entre si. Debido a su natg raleza polimérica se les denomiha resinas de intercambio iónico. La Capacidad de la resina de funcionar como un intercambiador 16- nico se debe a presencia de diversos grupos ionizables que se encuentran unidos a lo largo de la cadena polimérica, existihdo cientos de estos grupos en una sola esfera. La interacción rever sibfe de los iones de carga similares entre estos grupos de la resina s6lida g del liquido qué1 la rodea sirve como base para el intercambio iÓnico. Los dos tipos b&sicos de intercambiadores ihicos se encuentran disponibles segh el tipo de grupo ioniza- ble que se encuentre y por tanto e1::tipo de iones que se intercaz bian, si los grupos ionizables son &idos, la resina se denomina intercambiador cati6nic0, en este caso, los iones positivos (ca- tiones) se intercambian entre la resina y su medio ambiente, Si l o s Qrupos ionizables son bgsicos, se llama a la resina intercambiador anihica, siéndo los ionles negativos (aniones) l o s que se

intercambien entre la resina y el medio, En la figura 4 se muestran también intercambiadores cati6-

nicos dando las características estructurales de un intercambiador cati6nico fuerte (que conti.ene grupos sulfónicos fuertemente &idos, -S03H) y un intercambiador catiónico débil (que contiene

I

IC) Resina de intercambio cati6nico fuerte

S\03--H+ SOI-Na+

NCOH- " e-

1i+c1-

' Forma H+ Forma Na+

Resina de intercambio catidnico d&il

COO-H+ COO-Na+

~~

H'U-

Forma H +

(inactiva) Forma Na+

Figura 3. A ) Fotografía de pacticulas típicas de resina de intercambio i6nico. B) Ampliaci6n que muestra la for ma esférica de un intercambiador i6nico con una secci6n recortada para revelar su interior, cada gunto representa un grupo funcional (par ejemplo -SO; H 1 unido a la estructura polimérica, estos grupos se encuentran presentes en la superficie exterior así como en la matriz interior, hay miles de sitios por esfera y están ocurriendo muchos intercambios. C ) Se describe la uni6n de los grupos funcionales al esqueleto ramificado polimérico, sim- bolizados por la zona sombrea.da .esfiérica. Ibid ? P. 17.

grupos carboxilbs débilmente gcidos, -COOH). Ambos se usan en la separaci6n de solutos cargados positivamente (X+), la ekeccih del fuerte o débil est6 determinada por las propiedades intercam biadoras del soluto qu se quiere separar. Como se muestra, los grupos dcidos de los intercambiadores cati6nicos pueden conver- tirse en formas salinas por tratamiento con una base fuerte. En el caso de un intercambiadot débil, esta transforrnaci6n es necg saria pQara su uso, ya que el grupo carboxilo no esta apreciable- mente ionizado a un pH bajo, y por ello tendria el grupo funcional una capacidad intercambiadora muy baja. E l grupo &ido sulfhico est6 ionizado considerablemente aun en soluci6n &ida, y de esta forma puede usarse tanto como en su forma salina.

I -

Después de seleccionar y convertir el intercambiador a la forma deseada, se prepara una suspensión que se vacía en una colulp na cilindrica a una altura determinada (se pueden usar diversas alturas y di6metro de columnas), Las resinas de intercambio permanecen como esferas sólidas dompactadas en la columna. Un peque- is0 volumen de la muestra que contiene solutos cargados positivamente ( X ) se aplica en la parte superior del lecho de la resina, luego se hace pasar continuamente un soluto conocido a trav&s de la columna el cual constituye la fase m6vil. A medida que los s g

lutos cargados positivamente entran en contacto con las particulas de la resina catiónica puede ocurrir una reacci6n de intercambio reversible en cualquiera de las muchos sitios funcionales sobfe o dentro de la esfera de resina, de acuerdo con los prin- cipios b6sicos de atradci6m elestrost6tica.

I

resina soluto resina con el soluto unido, cati6ni'c:o *

.. Q I

Rp= matriz polimética de lek resina en esta condicibn el sol.uto se mueve a trave8 dela columna

* en esta,forma se retarda el movimiento del soluto.

Como resu)tado de la interacci6n (intercambio i6nico) el sol; to se une a la resina. De esta manera, dado que las partículas de la resina estdn esta&narias,:el efecto del intercambio es retar-

dar el movimiehto de los solutos i6nicos a través de la columna como compuestos disueltos en la fase móvil, Durante la operaci6n de la columna los solutos se encuentran en un ciclo continuo de unión, liberacibn, uni6n, liberación, etc. Obviamente, la libera- ción a la fase móvil es importan,te para que los solutos se muevan a tra a través de la columna. El grado 'de unión ser$controlado principalmente por la magnitud de la fuerza electrostatica de atraccih entre X+ y la particula de la resina, es por ello que si en una me= cla los solutos tienen una carga neta positiva diferente, se inter- cambiaran e distintos grados con la resina. Los solutos con una mayor carga neta positiva interactúan con las particulas de la ree- sina en un mayor grado, y por tanto, son retenidos en la columna por mayor tiempo, Esta diferencia en el intercambio constituye la base de la migraci6n selectiva y diferencial a través de la columna, el elaato que sadle de la parte inferior de la columna se puede re- coger sistem6ticamente en fracciones pequeñas y la presencia del s%

luto determinarse metliante un método apropiado,

1'

Los intercambiadores aniónicos consisten en una matriz polimé- rica que contiene grupos funcionales positivamente cargados, en general grupos aminoetil sustituidos en forma de cloruros,como se muestra a continuación:

R

n El intercambiador aniónico rrhs conocido es DEAE (dietil-amino-

etil-celulosa), donde R= -CHLCH3. Es particularmente eficaz en la cromatografia de intercambio i6nico de mezclas proteicas, Con solgtos negativamente cargados ( X - ) , la reacci6n de intercambio seria as€ :

R R X - + polimero polimero CH~CH*-N.~R CI- H ~ C H ~ N + R X

i H n-1

+ c1

CEOMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La cromatografía en capa f ina no es sólo un m6todo cromato- grafito sino que representa una colecci6n de procesos que Solo

tienen en común e l a r reg lo de la fase es tac ionar ia - La caracte- r í s t i c a experimental d i s t i n t i v a ea l a delgada capa de un sólido pulverizado como fase estacionaria, sostenida sobre una hoja de metal , plsst ico o vidrio. El ] . íquid0 (fase móvil) se mueve a trs vés de l a fase estacionaria por: capilaridad. Los procdsos de e- q u i l i b r i o en que puede basarse la separación son: absorci6n, Par- t i c i b n , intercambio i6nico o f i l t r a c i ó n en g e l . Este t i p & d e cro- matografía fue originalmente desarrolado como un proceso d e equi1L b r i o d e adsorci6n y en l a mayoria de las aplicaciones éste es e l mecanismo de separación, sin embargo, e l método ha venido enr iqug ciendose por los di ferentes compuestos usados como fase es tac iona r ia . VARIABLES EXPERIMENTALES, Placas o soportes.- Las caracter ís t icas necesar ias para estos eu son que posea una moderada rigidez y una superficie l impia, su

f u n c i ó n es l a d e proveer un apoyo en l a que la fase es tac ionar ia pueda adherirse. Los soportes mas comunes son placas de vidrio de 20 x 20 cm aunque también son muy ut i l izadas l as formadas por portaobjetos de microscopio. Las placas comerdides vienen sopor- tadas en hojas d e acero inonidable, d e aluminio o p l6s t i co (Makrz lon). \

Fase estacionaria.- La fase es tac ionaria en l a crornatografia de

capa f ina cons is te & u n sólido finamente molido, E l papel d e l

polvo puede s e r de soporte de una delgada capa d e l iquido, i n - tercambiador de iones o tam12 molecular. Las res t r i cc iones sobre las part iculas sól idas para l a cromatografía d e capa f i n a son mds sev as que para l a s usadas en columnas cromatogr&ficas, Be- ben ser>puras , tener un estrecho rango en e l tamafio de particula (5-50 micras) ya que e l razgo mds importante de la fase estacionaria es e l area superficial. Las propiedades de separaci6n de los adsorbentes comerciales varia hasta en un 50% de un fabr i - cante a otro y aún e n solo productor pueden variar de uih l o t e a

?f /'

ofro, E l f l u j o d e l solvente a través de l a capa f i n a e s t 6 determinado por e l tamaño de particula y l a densidad d e empaque de d i -

cha capp, e l f l u j o es m6s lento cuando se tienen partfculas de 0.1 a 10 micras que en l a s de 10 a 40micras, Un aglutidante (plaz t i f i c a n t e de par í s , gysum, a lcohol pol ivini l ico) es usado para adherir la fase estacionaria al soporte.

La actividad d e l adsorbente, entendida como s u capacidad de retener a las especies de solutos, depende de factoren como l a fuerza y densidad de s i t i o s a c t i v o s en la super f i c ie de las part i - c u l a s , e l & r e a s u p e r f i c i a l y e l contenido de agua de esta fase estacionaria, Adem6s la actividad aparente que depende de l a f a s e mdvil, ' tal interacciones entre e l soluto y l a fase móvil pueden ser tan fuertes como las interacciones entre la fase m6vi1 y e l adsorbenta y e l grado de retención del soluto en esta separacidn cromatogf6fica puede ser ampliamente afectada por l a naturaleza de l a f a s e móvil, Como las generalizaciones no pueden hacerse con propiedad es mejor c i t a r algunos aldsorbentes individuales3

S i l i c a , - S i l i c a , s i l i c a g e l y' k i d 0 silicic0 son los nombres aplL cados a l mater ia l producido por acidif icadión de una soluci6n d e

s i l i c a t o seguida de un lavado y secado dando como resultado un g e l , El producto t iene una enorme area superf ic ia l ( aproximadamente 500

m /g) y l a s u p e r f i c i e contiene grupos d e Si-OH espaciados en intervalos de 5 8, Estos grupos son l o s s i t i o s a c t i v o s y la act ividad de un l o t e dado depende d e l número y disponibilidad d e t a l e s s i t i o s , A menos que e l agua adsorbida e n l a super f i c ie haya sido eliminada por activación de l a s i l i c a (calentando con a ire$ de 150 a 200 C), muchos de l o s s i t i o s permanecen ocupados. A temperaturas m6u a l - tas , l a ac t iv idad se pierde debido a una deshidratacih poster ior que ocurre entre los grupos hidroxilos adyacentes, este paso puede ser revers ible por exposici6n del g e l de s i l i c a a l aguat 0 vapor de agua, pero por arr iba de 4OO0C e l area superficial es-pef- s c

manentemente m a ya que se forman uniones si-o-Si como se I'nueStra en la f igura 1, y %&m actividad no puede ser recuperada por n i n g ú n grado de hidratación. Los sit ios act ivos interaetuan Con SOlUtos polares pr inc ipa lmente ig s r 'pueh te s d e Hidr6gen0, con e l soluto como donador de electrones. Dor lo aue 10s ,lauenos son

2

O

Q(Cn"4C

& c . u PC'_-,, tc,

. i r r dc?

q @ " o s , 1

I - =.- A ~~

m S fuertemente r e N d o s que :Los alcanos, Debido a l a acidez natura l d e l g e l de s i l i c a las substancias bssicas son fids fuertemen-

I

' F i g u r a 1. Mecanismo d e d e s h i d r a t a c i 6 n y conse ' c u e n t e d e s a c t i v a c i 6 n o d e l a silica a tempera- t u r a s mayores de 400 C.

- Peters, ob. cit . , p. 352 .

f F i g u r a 2. E s t r u c t u r a d e l P e r l o n (policapro lactama).

/ - Dilts, ob. c i t . , p . 4 2 3 .

O 7 O7 G.6

te retenidas (como lo son azúcares y amino6cidos). Una técnica particularmente Útil en la cromatografia de capa fina,es la de a- Aadir nitrato de plata ( 5 a 15% en peso) a la capa de silica gel, el adsorbente resultante de la mezcla muestra una fuerte selecti- vidad, reteniendo preferentemente especies que contienen dobles enlaces formando complejosfl con los iones de plata, La retenci6n reaativa depende entonces del número de dobles enhaces en cada mo- lécula. Esto es muy aplicado en la caracterizaci6n de fracciones de lípidos. I

Alumina.- En fuerte contraste con el silica gel la alÚmiha muez tra un incremento en la actividad por calentamiento arriba de 1000°C lo que hace evidente que sus sitios activos no son grupos hidroxiaos La alúmna exhibe características de retencibn que pueden ser inter pretadas en términos de tres tip3s de interacciones soluto-solvente, En el primer tipo BIP adsabato (soluto que quiere separarse) con electrones fscilmente polarizables (bases Lewis) interaccionan con el campo fuertemente positivo formado alrrededor de los iones Al+3 contenidos en la superficie de la alúmina. Las interacciones del segundo tipo resultan de la retención preferencial de solutos acidos aparentemente por la donaci6n de sitios bfisicos (iones 02-) en la superficie de la alumnia, Y finalmente,? , ciertas especies aromaticas son retenidas aparentemente por interacci6n de carga y posiblemente por transferencia de electrones al Al+3 del sitio activo. Se ha visto que esto es cierto cuando dos solutos difieren principalmente en su estructura electrónica. Así la alumhna e6

superior en la resoluci6n de compuestos aromaticos y olefínicos que otros soptortes existentes.

Una alta actitaidad de la alumkla se produce dejandola secar oarante una noche a 400°C, es común la pr6ctica de bajar su actividad redistribuyendo una cankidad conocida de agua sobre la superficie del adsorbente. La alÚmlhdra@ra cromatografia comúnmente tiene un area superficial de 150 m /g y una capa de agua de 3.5 x l oW4 ml/m , por lo que l'a adici6n de 2.5% en peso de agua a la alumina produce una fase estacionaria con una capa de agua adecuada para uso general, Los mayores efectos sobre la actividad adsorbente son encontrados en un rango de O a 6% de agua contenida, en :..> ~?.'~~:*;: E.

2 2

La alumina, particudarmente el material completamente acti- L PI-

vado cataliza mucho m8s qud 9'sílkca gel las reaccion S químicas b es al- en los solutos sometidos a cromatografia , como

calina, las moléculas lkbiles d las bases son las mas afectadas, k han sido reportadas migraciones de dobhs enlaces así como expan- ciones en anillos, es por ello que la alumhba ocupa un segundo lugar en la elección de adsorben%es. -da en la separación de mezclas de componentes débilmmte polares.

4 Q c L L

P. t5.5.

g e O T I L I Z ~ p k t u c t p A m w t k

'Celulosa.- La situación de la celuloda es compleja, se le ha considerado comunmente como un m&dfa:de partición. La estructura de la celulosa sirve principalmente para suministrar dep6sitos mi- croscbpicos de agua en los cuales se efectúa la partici6n de solutos, es indudable que la selulosa debe actuar tambfen como adsorbente en cierto grado y en cualquier razonamiento de los patrones observdos debe ser tomado en cuenta este comportamiento. 6n general la celulosa es útil en las separaciones cromatogr8ficas en las que los solutos son tan polares que no pueden escapar de la ,absorción de medios tan activos como la alumina o el silica gel. Las placas de capa fina son helchas por aspercibn de celulosa micrg cristalina (19 a 38 micras de 'di8metro) en capas que imitan las propiedades del papel y que ofrecen al mismo tiempo un incremento en la velocidad de separacibn.

A-

Vidrio Vycor.- Esta' pulveeizado en partículas entre 60-75mi- cras de diametto con Area superficial de 180- 200 m /g debido a que su structura contiene poros de aproximadamente 40 8 de difime- tro. € - O con 13% de [gyps,um)corno aglomerante para formar cap pas de 0.37% de espesor. Como la superficie de las partícula de vidrio se ensucian en el proceso de molienda deben ser lavadas escrupu~osamente antes de su ESO.

2

fe * t i b c2b c Y en)

Poliamidas.- Son compuestos como el Perlon o nylon (polihexamz tilendiamino adipato) son usades como capas finas para separar

4

. . ,

compues tos po lares , Los puentes de h idrógeno formados entre . la s largas cadenas de l po l imero (ver f i g u r a 2) l a hacen inso luble en agua y s o l v e n t e s p o l a r e s . La s u p e r f i c i e d e l p o l i m e r o , s i n embargo t iene grupos amida l ibres que pueden formar puentes de hidrógeno con f e n o l e s , Q c i d o s c a r b o % í licos, quinonas y n i t rocompues tos qu& esten d i s p o n i b l e s . Los agen te s e luyen te s u sados con l a s po l i a - midas son en orden creciente de fuerza de e lución: agua)metanol> acetona)hidrÓxido de sodio di1uido)formamida)dimetil-formamida.

cuide- 40-80 micras de dif imetro, que las hacen adecuadas para f o r m a r c a p a s f i n a s , l a s r e s i n a s se presentan generalmente en s u 4 forma7 c loraday , h idrogeneda o como de sodio. Usualmente S’ se prepara una suspención con 5g d e c e l u l o s a e n polvo con 309 de re s ina de i n t e rcambio i ón i co las cuales por aspersión forman capa s de 250 miCUa6’ de g ro sor ,

Geles.- Los g e l e s d e f i l t r a c i 6 n e n c a p a f i n a s o n p r e p a r a d o s d e Slsphadex s u p e r f i n o e l c u a l e s una dextrana especial que t iene un promedio de entrecruzamientos , ya que l a s des tranas t i e n e n nume- r o s o s g r u p o s h i d r o x i l o s s o b r e s u s u p e r f i c i e p u e d e n h i n c h a r s e a l contacto don e l agua y formar ge les . Las des tranas S r e m o j a g c+d por 72 horas e n agua an te s de u sar se , -as(por’as- p e r s i ó n ) como capas de 0.2 a 0.5 mm de e spesor . En con t ra s t e con o t ra s f o rmas de c romatogra f í a en c a p a f i n a , l a s p l a c a s permanecen s i e m p r e h h e d a s . La a c c i 6 n c a p i l a r a t r a v é s d e l g e l d e d e x t r a n a sobre l a s u p e r f i c i e d e l s o p o r t e es más lenta que en o tros adsorbentes , moviendose tan solo de 1 a 2 cm/hr y e l d e s a r r o l l o d e una cromatograf ia de este t i p o se l l e v a entre 8-10 hr en con t ra s t e * l o s 30 min usados con’ o t ro s ad sorben te s .

P m stp FPCtCA

G3 fJ

Preparaci6n de las placas.- Placas comerciales para cromatografia de capa fina estan disbonibles en tamaños de 10 x 10 cm 6 preferiblemente de 20 x 20 cm, los soportes pueden ser hojas de plastico o aluminio que presetan la ventaja de que pueden cortaL se para obtener otras m&s pequeñas para gQ uso#eac$imaras de menores dimensiones, Los adsorbentes pueden ser silica gel, alúmi- na y celulosa con indicadores fluorescentes incorporados a la capa fina. Por las ventajas que ofrecen (uniformidad de superfi tie, costo moderado y ahorro de tiempo) la mayor propdrcibn de separaciones realizadas por cromatografia de capa fina d a c -

- ru'

d; It%@ e h e w ukiaizando paacas comerciales, Hay muchas formas de cubrir las placas en laboratorio pero

las m& comunes técnicas son inmersi6n y aspersibn, La capa de absorbente ideal es la delgada, de grosor uniforjle, libre de grietas o protuberancias y adherida al soporte,

se ad Les primeras placas usadas prepargdaS. con dos pakt2

J l j [ b h l objetos cLyas superficies se sujetaron fuertemente j d s , se

sumergieron en una suspención del adsorbente y después se reti- raron lentamente permitiendo que el exceso escurrzlos porta- \ I= A ebrJ l l h l JAC f& ,

objetos fueron separados permitendo que el solvente se evapora- se de la superficie, para despues activarlos por calentamiento, Esta es la forma m6s f8cil de (cubrir los soportes pero sólo es aplicable a superficies pequeñ,as,

/

Para cubrir placas de 20x20 cm existen disponibles asper- sores en el comercio, los cuales no son muy caros y producen ex-

excelentes capas de proiedades adecuadas a esta técnica, Puede\ observarse &e+dqew .S- qalaspersor en la figura 3 , mientras que la figura 4 nos muestra la operación de redubrimiento del soporte,

Q m se l l ~ b u

Las capas de adsorben'te puro pueden tener caracterfsticas mecdnicas pobfes y ser propensas a disgregarse, para evitar este problema se agregan aglomerantes como sulfato de calcio que es &@Pd$QO al adsorbente como hemidrato, CaS04'1/2H28 (#aster de Paris),en cantidades de 5 a 28% en peso, Cuando es mezclado con agua se hidrata y forma conjuntos rigidos como dihidratos, Ca SO4- 2H20 (gypsum), El secarlo a l lO°C por 30 min es mas reco- mendable que hacerlo a temperaturas mayores, se ha visto que por

I . ..,̂ .,. .

'Figura 3. Recubridor de placas tipo Stahl. a) Sec-i ción transversal: llenado con la suspensibn de adsorbente (a la izquierda), en la posicibn para el recubrimiento, nótese que hay una e'ntrada para el aire (l),a la derecha. b1Desplazamiento sobre el soporte, la región punteada indica la capa formada al extender el adsorbente. Ibid., p. 425.

. .

\

Figura 4. Fotografía de la operaci6n de re- I

brimiento 'de una placa para cromatografia de capa fina. " Ib 9 p.426.

encima' de 13OoC la deshidrataci.6n es tan rapida que las placas pueden ser inútiles después de calentarlas por 30 minutos,

perior ya que /%&Eakas m&d durables ademas de permitir una mayor migraci6n de la fase móvil, pero presenta la desventaja de que es un material organic0 que reacciona coq muchos de los rea2 tivos utilizados en la detecci6n de las zonas cromatogr&ficas(maz chas 1 ,

El almidón com6n añadido en 5% peso) es un agldmerante su- d

Los marcadores fluorescentes pueden añadirse ebcilmente a la suspenci6n del adsorbente, en forma de soluciones cuando las placas son preparadas en el laboratorio, Un indicador fluorescente conveniente es una mezcla de silicato de zinc, que es excitado por la luz de la región de 230 a 2130 nm de longitud de onda, y el SUL furo de zinc, el cual e8 excita en la regi6n de 330 a 390 nm, Es- tos compuestos son agregados en proporcibn de 1% o menos en peso.

Fase m6vi1,- El papel desempeilado por la fase m6uil no es solo el de acarrear la muestra a través de la capa adsorbente, sino que toma también un papel activo en los pcocesos de adsorci6n, compiC&e tiendo con los compuestos de lia mezcla por los espcios en la capa fina, Si el solvente es fuertemente adsorbido sblo sera desplazado por la muestra con gran dificultad por lo que el soluto perma- necerá mayor tiempo en la fase móvil y no podr5 desplazarse a tr= vés de la fase estacionaria con rapidez, Por esto la tasa de mi- gración del soluto depende de :la fuerza con que es adsorbido el solvento y bo solo de la 3olubilidad de la muestra en la fase mbvil,

Es esencial en la cromatografia de capa fina que los solventes utilizados sean de alta pureza, pequeñas cantidades de impurezas polares pueden tener un gran efecto sobfe la interacci6n con la fase estacionatia y por ello alterar las tasas de migracibn significativamente, haciendo variar el comportamiento del soluto durante la cromatograf ía, &resultande --ttna---~w&k~-~.

La tasa de velocidad decrece cuando la viscocidad del solvente se incrementa, es decir, mientras más viscoso es el solvente, toma mds tiempo el desarrollo del cromatograma, La capacidad de eluci6n de los solventes va de menor a mayor en la serie: hexano,

cic lohexano, te tracloruoo de carbono, benceno, cloroformo, d i e t i l - eter, a c e t a t o d e e t i l o y acetona.

S&& &NLQ??W C u a n d o w p o s i b l e es mejor UF uB l iqu ido puro para e l desa-

r r o l l o d e l cromatograma que una mezcla de s o l v e n t e s . Los compone2 tes d e l a m e z c l a t i e n d e a a s eparar se duran te l a c romatogra f i a cuaz do se mueven e n l a c a p a f i n a , 'por lo que hay un continuo cambio en l a c o m p o s i c i 6 n d e l e l u e n t e en l a d i s t a n c i a r e c o r r i d a p o r l a mancha. S i n embargo, cuando no se logr ,a l a separac i6n de l a mezc la con un so lvente , debe buscarse una mezc la adecuada que , lo logre .

Una g r a n v e n t a j a &$ l a cromatogradjfa de capa f ina sobre otros mgtodos es e l poco tiempo que se requ iere en l a s eparac i6n , u sando por taob je to s de m icroscop io los cromatogramas pueden desarrollarse en 5 minutos y en p l a c a s d e 2Ox20cm e n aproximadamente 30 minutos. Por lo q u e u n a Q n v e s t i g a c i 6 n p r & c t i c a . p a r a l a s e l e c c i 6 n d e l solvente'guede * v a muy rapiIdamente s i se corren simult6neamen- te de 4 a 5 cromatogramas con diferentes solvente cada ul)a y a s í se e l $ i g e e l mejor por e l método de ensayo y:error en un mgnimo de tiempo.

u tic&&

Debe remarcarse que no puede usarse nuevamente un s o l v e n t e o una mezcla de e l los p a r a d e s a r r o l l a r o t r a p l a c a ya q u e l o s , r e s u l - tados tendrian grado de incdrtfdumbr&?"~ebida a impureza&!&'sol- c e d e " ,.. 3 9

ven te .

Ap l i cac i6n de l a mues t ra . - Para l a ap l i cac i6n de l a muestra sobre l a c a p a f i n a es n e c e s a r i a h a b i l i d a d y paciencia ya que debe cuidar- se de no todar l a capa de ad sorben te ( c p e se contamina o se producen huecos) lo que conduce a resu l tados dudosos . Durante l a es- t a n d a r i z a c i 6 n d e l a t é c n i c a se propone ap l i car l o s pun to s de l so- l u t o a 1.5 cm d e l a o r i l l a i n f e r i o r y a lcm d e l b o r d e d e l a p l a c a , como no pueden d ibu ja r se l i nea s de l dp i z para i nd i car los s i t i o s , se han e laborado gu ías que por medio de per forac iones ind ican la s pos i c i6n correc ta de ap l i cac i6n para l a s su sb s tanc ia s de sconoc i - d a s y e l e s t a n d a r , y son co locadas sobre l a p l a c a .

La muestra puede ser a p l i c a d a por medio de una jer inga h ipo- dermica, con una micropipeta (pipeta lambda) o con una a sa de p l a - t i n o ( q u e se hace calentando un a lambre de p la t ino de 0.4 < n u n de grueso, formando un ciculo de '1.5 mm de di6metro. Se puede ap l icar 10 microlitros de s o l u c i o n e s de 200 microgramos como maxim para

1

Figura 5. Proceso de aplicaci6n de l a muestra en l a cromatografia de capa fina. Los solutos d i s u e l tos en un soavente adecuado son aplicados sobre l a capa delgada e n pequeñas gotas con e l f i n d e q u e permanezcan inicialmente en l a zona más redu- cida posible e n e l punto de aplicación. S e aplican var ias gotas sobre e l mismo punto evaporando el solvente en cada ocasi6n con ayuda de un secador.

I

-

Peters , ob. cit . , p.350.

x - " " I

capas de 0.25mm de e spesor . No impor ta cua l s ea e l a p l i c a d o r ,

solo l a g o t a d e b e t o c a r l a s u p e r f i c i e d e l a p l aca e n forma rd- p ida y l i m p i a p a r a l o c u a l se nece s i t a una mano firme. Para p l a c a s d e s t i n a d a s a sepqrac ión se co loca l a mues t ra e n s o l u c i o n e s de 1 mg/cm en capas con l m m de e spesor de adsorbente , después de l a e l u c i 6 n s o n r a s p a d a s e n l a s z o n a s en que aparecamanchhe y l o s componentes son recuperadds por extracción l iquida del adsorbente. En l a f i g u r a 5 se muestra como es a p l i c a d a l a m u e s t r a ,

Desarro l lo de l a c romatogra f í a . - E l d e s a r r o l l o 4 de la cromatogra- f i a es e l m6s común (aunque ex i s t en t écn i ca s para e l d e s a r r o l l o del cromatograma en c6maras horizontales , son mostradas en l a f i -

g u r a S ) , d e a c u e r d o a l mktodo e s t andar i zado e l l i q u i d o s u b e p o r l a p laca co locada en l a c6mara cerrada en cuyo fondo se t i e n e n de 5 a 8 mm d e s o l v e n t e , E l d e s a r r o l l o se l l e v a a cabo a temperatura ambiente y+ YRI humedad r e l a t i v a e n e l cuar to de 40 a 65% y con l a &mara sa turada de vapore s de l so l ven te , ha s t a que e l solven te ha v ia jado duando menos durante 10 c m . Las csmaras son fabr i - cadas en v idr io para e v i t a r con taminac iones de l so l ven te y para fa- c i l i t a r l a o b s e r v a c i 6 n d e l d e s a r r o l l o d e l c r o m a t o g r a m a , se s u g i e r e forrar las paredes de la c6mara con papel mojado con e l solvente con e l f i n de que l a &mara este completamente saturada con sus v a p o r e s . E x i s t e n d o s p r & c t i c a s , l a p r i m e r a c o n s i s t e e n co locar e l s o l v e n t e c o n o s i n pape l en l a cámara an te s de su u so para que a l c o r r e r e l cromatograma es té sa turada . La segunda en co locar i n - med ia tamente an te s de l a c romatogra f í a e l solvente, E l procedimien to e s t a n d a r i z a d o i n d i c a e l uso de camaras sakuradas pero Be Zeeuw 2- ha encontrado 'que se producen mejores separaciones de barbi túr icos

usando c6maras no saturadas de cloroformo-ete.r, como eluente, que forma un grad iente de e luc i6n por mov imiento sobre e l adsorbente e n forma s imultánea que e n e l e s p a c i o l i b r e d e l a c 6 m a r a se v a

saturando con e l componente m6s v o l 6 t i 1 , e n e l frente de l so l ven - te se tiene el componente menols v o l á t i l , conforme se mueve h a c i a a r r i b a d e l a p l a c a l a v e l o c i d a d d e e v a p o r a c i 6 n d e l o s s o l v e n t e s de-

io *

(L, p c LA ;? c, ~ . . A c5

-

'5 18 U*'

,- - '

a Ibidem, p. 438 3 D i l t s , ob. c i t . , p,430,.

I n n '

a La flecha indica la direcci6n del movimiento del solvente.(l) ,Placa de cromatografia con el adsorbente en la superficie inferior (indicado por lfneas diagonales~~. (2) Varilla de vidrio o metal recubierta con papel filtro que permite que el solvente llegue hasta la capa de adsorbente. ( 4 ) solvente. ( . S ) Varilla de vidrio usa da s610 como soporte.

-

". . _ _ _ I

b) Disposici6n para el desarrollo en una c6mara' circular. (1) Loporte. (2) Capa delgada. (3)Per- foraci6n de 2 mm de dih~etro. ( 4 ) P u n t o de aplica ci6n. ( 5 ) Mecha de a&god6a*',66) Tapa de caja pe- trio ( 7 ) Solvente. ( 8 ) Almoadilla de algod6n. (9) Cubierta de vidrio.,

-

Figura 6. Desarrollo de cromatograffa de capa fina en c6maras horizontales. Ibid 0 ,p. 421

f

i F i g u r a 7. da c o n un

I b 9 p.42

Camara cromatografica frasco d e v i d r i o comfi 1.

1 i m p r o . v i s a -

n ,

1

F i g u r a 8 , En l a f i g u r a se m u e s t r a el desarro 110 de u n a c r o m a t o g r a f f a las letras i n d i c a n ? A) s o l v e n t e o: fase rnbvil- B) P u n t o d e aplica- c i 6 n d e l s o l u t o . C) Zonas d e l s o l u t o . DI F r e n - te d e l s o l v e n t e . Ib 9 p o 349

- .

crece ya que l a c6mara se ha sqturado siendo e l resultado neto un gradiente d e e yciÓn.

den u t i l izarse f rascos d e vidrio con s u respectiva tapa (figura 7 ) como c&maras cromatogr6ficas. En l a f igura 8 se muestra e& desa- r r o l l o de una cromatograffa en una csmara e s t h d a r ,

A I Aunque &&$sponihles c6maras pequeñas e n e l comercio, pue-

Detecci6n de l a s manchas,- Muchos compuestos son coloreados y p u g

den ser directamente vistos e n la placa , s in embargo l a mayoria de compuestos son incoloros y requieren d e alguna técnica de detección. Un método unive6salmente usado es rociar la placa con &ido s u l f u - rico concentrado, seguido de un1 calentamiento d 100°C, cualquier compuesto orgfinico, puede entonces verse como una zona carbonizada, (esta técnica no es aplicable a capas con aglutinante de almidón), puede afiadirse 6cido crómico o n i t r i c o para acelerar la carboniza- dión, La segunda técnica universal es l a exposición de l a placa a

uaporis5da ?jledo$-Lo cual se realiza f6cilmente colocando algunos c r i s t a l e s de yodo con la placa en una cftmara cerrada, Los vapores interactuan con los componentes; d e l a muestra ya sea por reacci6n quimica, adsorcih o solubilidad para producir un producto coloreado que puede ser visualmaate detectada. 3

Otros autores4 opinan que los vapores de yodo no reaccionan con e l compuesto orgdnico, sino q u e se condensan breferentemente en l a zona d e l soluto, aparentemente las interacciones con l a molécula son de t ipo Van def Waals, por l o que en es tas zonas aparecen manchas d e color naranja que resaltan sobre un fondo amarillo. E l

proceso es enteramente revers ib le , ya que a l remover l a placa d e l a cbmara, l a s manchas desaparecen e n unos cuantos minutos, por l o que esta técnica es Ú t i l cuando l a zona d e soluto es recuperada para anSlisis porteriores.

rG Compuestos orgbnicosTabsorben luz u l t rav io le ta a r r iba d e 230

nm pueden ser detectados usando indicadores fluorescentes. La placa entera es tratada con e l indicador y por e l l o toda l a superficie fluoresce cuando es expuesta a l a luz ultravioleta, las regig nes de los compuestos separados muestran una Bluorescencia muy dé-

b i l en r e l a c i 6 n a l r e s t o de la placa , Pueden usarse marcadores €4

3 Ibidem, p. 430 4 Ib.

I-L

fluorescentes de tipo orghico los cuales pueden rociarse sobre la placa después que se ha corrido la cromatografía y que bajo el mismo principio señalado en &a p6krafo anterior indique la loca- lizaci6n de los componentes separados.

Algunos compuestos tienen reactivos especificw,s que ayudan a su localizaci6n formando colores distintivos,como es el caso de les alfa aminoácidos con la ninhidrina, se puede mencionar tambien al &ido sulfídrico, la dithizona y al SbC13 como otros reactivos ampliamente usados como reveladores en la cromatografía de capa fina, Grtfst"+iytwa-9--g~;leR-~se---~as~ ~-ma+tehas- despugs de re- "*

Valores de Rf.- El desarrollo del cromatograma es detenido cuando la linea que marca el avanee del solvente, co~ocida como frente de¡ solvente, llega aproximadamente a 1.5 cm de la orilla superior de la placa. Después de secar y revelar la placa, las zonas individuales son localizadas y caracterizadas por su valor de Rf, (lo cual se ilustra en la figura m>, que es definido como:

Rf I distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por la fase m6vil

Los valores de Rf obtenidos en las separaciones de cromatografia de capa fina son menos reproducibles que los obtenidos en otras técnicas cromatogr&ficas ueadas, esta baja reproductibilidad H d & a que los numerosos factores que intervienen deben ser reproducidos fielmente cada uno, lo cual es imposible. Estos factores son inherentes a los 4 aspectos de la cromatograffa de capa fina (el adsorbente, el solvente, la muestra y el desarrollo).

Se b B If

Por lo anteriormente mencionado, es necesario para una identi- ficaci6n adecuada correr un estandar (sustancia conocida en naturaleza y concentraci6n) en la misma placa durante el proceso de sepa- ci6n de la muestra desconocida, aplicando en una capa de 2Ox20cm varios puntos del estandar y varios de la sustancia problema chn el fin de que al tener las mismas condiciones se puedan hader com- paraciones dlidas,

I

Figura 9. En la placa pueden observarse las manchis correspondientes a dos solutos A y B con el fin de conocer el Rf que les corresponde, se mide su distan cia a la lfnea de aplicacidn (b) y la distancia recorrida por el fcente del solvente (a), aplicando e= tonces las f6rmulas RfA =+ ’ RfB =a X

-

Ibid p o 3590 ” 9 S xs

'h [?: dfrcc 3 La cromatografia e m a pararla detecci6n y an8lisis de

sustancias como fftrmacos (antihistamihicos, analg&sicos, bac- tericidas, diurgticos, laxantes, anestésicos locales, etc.), en aditivos para alimentos ( antioxidantes, preservativos, endul- zantes artificiales, emulsificantes, etc.), materias vegetales. sales ora6nicas. deteraentes. abrillantadores ÓDticos.

T'% $ Ad PP ~ - E ~ i e ' Clínicamente h w &S en la identificacibn de azú-

car en la orina y heces, en el 'dignóstico de diabetes y otros desorddnes que afectan la e1tmi:nacibn de azúcar.

drc -a también en pruebas de funcionamiento apropiado de 6rganos, al estudiar la tasa y naturaleza de degradacibn de metabolitos. %n la detecci6n de substancias extrañas en la S

sangre, orina o linfa en el envenenamiento y su terapia, as€ como para seguir los avances en el tratamiento con metadona en programas de adicci6n de drogas,.

En la ciencia forenfe el adsorbente m6s usado en la croma- tografía,es la silica gel, para detectar venenos, iones metdlie cos, drogas tranquilizantes y otras substancias en los fluidos corporales. En la identificaci6n de trazas de aceites e inseG ticidas. La cromatografia en capa fina es capaz de identificar explosivos en los residuos # humo de una explosi6n.

S

Los químicos la utilizan también en las síntesis org6ni- cas para seguir el curso de la reacción y como un criterio de pureza (~610 se obtiene una fracción o mancha).

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