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palavras-chave
Doença de Parkinson, Genética Molecular, Stresse Oxidativo, Neurodegeneração.
resumo
A Doença de Parkinson (DP) é a segunda forma de doença neurodegenerativamais frequente, embora a sua etiologia não seja plenamente conhecida. Durante muitos anos foi considerado que a DP não tinha qualquer componentegenética associada, no entanto, no final do século passado, descrições de mutações genéticas que, aparentemente causavam DP, vieram alterar esteconceito. Adicionalmente, sabe-se que na área cerebral afectada nos doentes de Parkinson (substância negra e núcleo estriado), há um aumento daagressão causada por espécies reactivas de oxigénio, o que sugeriu um papeldo stresse oxidativo na etiologia desta afecção. O objectivo deste trabalho é encontrar marcadores biológicos que permitamum diagnóstico mais precoce e correcto desta doença. Por um lado, pretendemos encontrar alterações genéticas em genes associados à DP, quepermitam auxiliar no diagnóstico. Por outro lado, pretendemos verificar se marcadores periféricos de stresse oxidativo se encontram alterados emindivíduos com DP, para que possam ser utilizados no futuro comomarcadores de progressão, ou mesmo da própria doença. Para tal, foram estudados cerca de 130 indivíduos com DP e 130 indivíduos controlo semqualquer sinal de doença neurodegenerativa. Os indivíduos com DP foramseleccionados de forma contínua pela equipa clínica dos H.U.C.. Na nossa amostra, representativa da população portuguesa, encontrámos alterações genéticas, conhecidas e não conhecidas, cujos mecanismos sãosusceptíveis de causar DP. No que diz respeito aos marcadores de stresseoxidativo, encontrámos alterações significativas principalmente no que dizrespeito ao ciclo do glutatião, tornando os seus componentes num eventual marcador periférico da DP. Embora as alterações genéticas possam ser consideradas como causa únicado desenvolvimento da doença, é possível que existam interacções entre osgenes estudados e outros factores. Esta tese evidencia o facto de que a DP é, muito provavelmente, influenciada por factores genéticos e ambientais e,eventualmente, pela interacções entre estes. Embora não tenha sido encontrado um marcador genético, parece evidenteque o diagnóstico genético poderá ser, num futuro próximo, uma ferramenta auxiliar de importância extrema no diagnóstico de algumas formas da DP. Poroutro lado, o estudo de marcadores de stresse oxidativo, em particular do ciclodo glutatião, podem auxiliar no diagnóstico da DP nesta população. São claramente necessários estudos que determinem a função das proteínasaqui descritas, e que tentem estabelecer uma relação entre os factores aquiapresentados (genéticos e de stresse oxidativo) e factores ambientais, umavez que, nesta relação poderá estar a resposta para a maioria das questõesbiológicas colocadas no âmbito da doença de Parkinson.
keywords
Parkinson’s Disease, Molecular Genetics, Oxidative Stress, Neurodegeneration.
abstract
Parkinson’s Disease (PD) is the second most common form ofneurodegenerative disease, although it’s aetiology isn’t fully understood. Formany years, it was considered that PD had no a genetic backgroud, however,late last century, reports of genetic mutations that apparently were the cause of PD in some families, deeply changed this concept. Furthermore, it is welldocumented that in the brain region affected in PD patients (substantia nigraand striatum) there’s an increase of the aggression caused by reactive oxigenspecies, what suggested a role for oxidative stress in the aetiology of thisdisease. In the work presented here, we aim, on one hand, to find genetic alterations ingenes reported to be associated with PD, which may be useful in diagnose;and, on the other hand, to determine if peripheral biomarkers of oxidative stressare altered in individuals with this disease, so that they may also be used in thefuture as an auxiliary tool for diagnosing PD. This study comprised about 130 individuals with PD and 130 healthy controls without any clear sign of neurodegenerative disease. PD patients wereselected in a consecutive manner by the clinical team in the University ofCoimbra Hospital. There was no other inclusion parameter, although onlydefinite PD patients were included. In our sample, which we consider to be representative of the portuguesepopulation, we found genetic mutations, some of them known and othersunreported so far, that may be responsible for pathogenic mechanismssusceptible to cause the onset of PD. The study of peripheral biomarkers of oxidative stress showed statistical significant differences between PD patientsand controls, mainly in the glutathione cycle, making it’s components a suitableperipheral marker of PD. Although in some of the cases presented here, genetic mutations may be considered as the only cause of the onset of the disease, it is likely that for themost part of cases, there are interactions between the genes studied and otherfactors. This work supports the knowledge that PD is, probably, influenced by genetic and environmental factors and, eventually, by interactions between these two. Although we failed to find a suitable genetic marker, it seems clear that geneticdiagnose may become, in the near future, an auxilary tool of extreme importance in PD. Furthermore, the study of biomarkers of oxidative stress,mainly glutathione cycle, may be useful in the diagnose of PD in our population.Further research is clearly needed to determine the function of the mutatedproteins reported here, and to establish a link between the factors presentedhere (genetic and oxidative stress) and environmental factors, since it is likelythat in this relationship lay most of the answers to all biological questions posednowadays in PD research.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 8 -
Índice ÍNDICE .........................................................................................................................................................- 8 -
ÍNDICE DE FIGURAS..............................................................................................................................- 10 -
ÍNDICE DE TABELAS .............................................................................................................................- 11 -
INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................................- 12 -
PERSPECTIVA HISTÓRICA DA DOENÇA DE PARKINSON ............................................................................ - 12 - PARKINSONISMO E DOENÇA DE PARKINSON............................................................................................ - 14 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E PATOLÓGICAS.......................................................................................... - 15 - EPIDEMIOLOGIA ...................................................................................................................................... - 17 - TRATAMENTO.......................................................................................................................................... - 18 - ETIOLOGIA DA DOENÇA DE PARKINSON................................................................................................... - 20 -
Factores ambientais...........................................................................................................................- 20 - Factores genéticos .............................................................................................................................- 23 -
STRESSE OXIDATIVO ............................................................................................................................... - 41 - Conceito de Stresse Oxidativo e Espécies Reactivas de Oxigénio .....................................................- 41 - Defesas anti-oxidantes enzimáticas e não-enzimáticas .....................................................................- 42 -
Defesas anti-oxidantes enzimáticas ................................................................................................................- 42 - Defesas anti-oxidantes não enzimáticas .........................................................................................................- 44 -
Doença de Parkinson e Stresse Oxidativo .........................................................................................- 45 - Metabolismo do ferro.........................................................................................................................- 47 -
OBJECTIVOS DO ESTUDO ..................................................................................................................- 49 -
MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................................- 50 -
POPULAÇÃO EM ESTUDO.......................................................................................................................... - 50 - Mecanismos Genéticos.......................................................................................................................- 50 - Mecanismos de Stresse Oxidativo......................................................................................................- 52 -
PROCEDIMENTOS NO ESTUDO DOS MECANISMOS GENÉTICOS ................................................................. - 54 - Colheita e preparação do material biológico....................................................................................- 54 - Metodologias Utilizadas no Estudo dos Mecanismos Genéticos .......................................................- 54 - Estudo molecular de genes envolvidos na DP ...................................................................................- 58 -
PROCEDIMENTOS NO ESTUDO DO STRESSE OXIDATIVO ........................................................................... - 74 - Colheita e preparação do material biológico....................................................................................- 74 - Determinação dos níveis de antioxidantes não enzimáticos ..............................................................- 75 - Determinação dos níveis de antioxidantes enzimáticos.....................................................................- 79 - Marcadores de oxidação Lipídica .....................................................................................................- 80 - Marcadores de oxidação Proteica.....................................................................................................- 81 -
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 9 -
Metabolitos do monóxido de azoto ....................................................................................................- 82 - Determinação da concentração de proteínas totais ..........................................................................- 83 - Quantificação de hemoglobina na suspensão de eritrócitos..............................................................- 83 - Análise Estatística..............................................................................................................................- 84 -
RESULTADOS .........................................................................................................................................- 85 -
MECANISMOS GENÉTICOS ....................................................................................................................... - 85 - MECANISMOS DE STRESSE OXIDATIVO ................................................................................................. - 102 -
DISCUSSÃO ...........................................................................................................................................- 118 -
CONSIDERAÇÕES METODOLÓGICAS ....................................................................................................... - 118 - MECANISMOS GENÉTICOS...................................................................................................................... - 120 - STRESSE OXIDATIVO ............................................................................................................................. - 135 -
CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................................................................- 141 -
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................................- 142 -
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 10 -
Índice de Figuras
FIG. 1 - ILUSTRAÇÃO DE UM INDIVÍDUO COM DOENÇA DE PARKINSON ......................................................... - 13 - FIG. 2 - IMAGEM DE UM CORPO DE LEWY ..................................................................................................... - 17 - FIG. 3 - ANÁLISE DE SPECT......................................................................................................................... - 17 - FIG. 4 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO METABOLISMO DO MPTP........................................................ - 21 - FIG. 5 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DE UMA SONDA.................................................... - 55 - FIG. 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CAPACIDADE EXONUCLEÁSICA DA ENZIMA. ............................ - 56 - FIG. 7 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO 256DELA................................ - 86 - FIG. 8 - CROMATOGRAMAS DO EXÃO 2 DA PARKINA.. .................................................................................. - 87 - FIG. 9 - CROMATOGRAMAS DO EXÃO 2 DA PARKINA.. .................................................................................. - 88 - FIG. 10 - RESULTADO DE ELECTROFORESE EM AGAROSE DA MUTAÇÃO 256DELA. ..................................... - 89 - FIG. 11 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 11 DA PARKINA.. ................................................................................ - 89 - FIG. 12 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO ASP394ASN.......................... - 90 - FIG. 13 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 11 DA PARKINA.. ................................................................................ - 91 - FIG. 14 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO GLU395STOP........................ - 91 - FIG. 15 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1.. ............................................................................ - 92 - FIG. 16 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1.. ............................................................................ - 93 - FIG. 17 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA COM DELECÇÃO HETEROZIGÓTICA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1. .... - 93 - FIG. 18 - ELECTROFORESE DO PRODUTO DE DIGESTÃO DO EXÃO 29 NNOS.. ................................................ - 97 - FIG. 19 - ELECTROFORESE DO PRODUTO DE DIGESTÃO DO EXÃO 22 DO GENE DA INOS................................ - 98 - FIG. 20 - RESULTADO DA ELECTROFORESE DA DIGESTÃO DA MUTAÇÃO H63D NO GENE HFE. .................... - 99 - FIG. 21 - RESULTADO DA ELECTROFORESE DA DIGESTÃO DA MUTAÇÃO C282Y NO GENE HFE. ................ - 100 - FIG. 22 - VALORES DE ÁCIDO ÚRICO OBTIDOS NOS GRUPOS DE D.P. E CONTROLO.. .................................... - 103 - FIG. 23 - VALORES DE ÁCIDO ÚRICO DE INDIVÍDUOS COM INÍCIO > 60 ANOS E DE CONTROLOS.. ................ - 104 - FIG. 24 - VALORES DE VIT. E PLASM. DE INDIVÍDUOS COM INÍCIO < 60 ANOS E INDIVÍDUOS CONTROLO.. ... - 105 - FIG. 25 - VALORES DE VIT. A PLASM. DE INDIVÍDUOS INÍCIO <60 ANOS E INDIVÍDUOS CONTROLO.. ........... - 106 - FIG. 26 - RESULTADOS OBTIDOS SIGNIFICATIVOS PARA O CICLO DO GLUTATIÃO........................................ - 108 - FIG. 27 - VALORES DE TAS NOS GRUPOS ESTUDADOS. ............................................................................... - 111 - FIG. 28 - VALORES MÉDIOS DE ACTIVIDADE DA ENZIMA REDUCTASE DO GLUTATIÃO. ............................... - 112 - FIG. 29 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE MDA ......................................................................... - 114 - FIG. 30 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE GRUPOS CARBONILO................................................... - 115 - FIG. 31 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE NITRITOS .................................................................... - 116 -
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Índice de Tabelas TABELA I - LOCI GENÉTICOS E GENES ASSOCIADOS À DOENÇA DE PARKINSON ............................................ - 24 - TABELA II - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DOS INDIVÍDUOS COM DP ESTUDADOS. ....................................... - 52 - TABELA III - CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS DOS INDIVÍDUOS COM DP E CONTROLOS.......................... - 53 - TABELA IV - SEQUÊNCIAS DE PRIMERS UTILIZADOS NO GENE DA ALFA-SINUCLEINA [92]............................ - 58 - TABELA V - PRIMERS E SONDAS PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DO GENE DA ALFA-SINUCLEÍNA . ...... - 62 - TABELA VI - PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA PARKINA......................................... - 64 - TABELA VII - PRIMERS E SONDAS UTILIZADOS NO ENSAIO DE DOSAGEM GÉNICA DO GENE DA PARKINA...... - 66 - TABELA VIII - SEQUÊNCIAS DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE PINK1. .................. - 67 - TABELA IX - SEQUÊNCIAS DOS PRIMERS E SONDAS UTILIZADOS PARA DOSAGEM GÉNICA DO GENE PINK1. - 69 - TABELA X – PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE HFE . .................................................... - 70 - TABELA XI - PRIMERS UTILIZADOS PARA O ESTUDO DO GENE DA NOS........................................................ - 72 - TABELA XII - PRIMERS UTILIZADOS NO ESTUDO DO GENE DO GLUTATIÃO S-TRANSFERASE. ...................... - 74 - TABELA XIII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 29 DO GENE DA NNOS ........................ - 95 - TABELA XIV - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 18 DO GENE DA NNOS........................ - 96 - TABELA XV - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 22 DO GENE DA INOS .......................... - 97 - TABELA XVI - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO H63D ESTUDADO NO GENE DA HFE.................................... - 99 - TABELA XVII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO C282Y ESTUDADO NO GENE DA HFE .............................. - 100 - TABELA XVIII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ILE105VAL ESTUDADO NO GENE DA GSTP.................... - 101 - TABELA XIX - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ALA114VAL ESTUDADO NO GENE DA GSTP ..................... - 102 - TABELA XX - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ÚRICO................................................................... - 104 - TABELA XXI - CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE COLESTEROL E DA RAZÃO VIT. E/COLESTEROL.............. - 105 - TABELA XXII - VALORES DE CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE VITAMINA E ............................................ - 106 - TABELA XXIII - VALORES DE CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE VITAMINA A........................................... - 107 - TABELA XXIV - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE GSH ERITROCITÁRIO .................................................. - 109 - TABELA XXV - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE GSSG ERITROCITÁRIO ................................................. - 109 - TABELA XXVI - VALORES OBTIDOS PARA A RAZÃO GSH/GSSG ERITROCITÁRIA ..................................... - 110 - TABELA XXVII - VALORES OBTIDOS PARA TAS NOS GRUPOS DE INDIVÍDUOS ESTUDADOS. ...................... - 111 - TABELA XXVIII - VALORES OBTIDOS PARA A ACTIVIDADE DA ENZIMA GLRED ........................................ - 112 - TABELA XXIX - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE MDA ERITROCITÁRIO........................... - 113 - TABELA XXX - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE MDA PLASMÁTICO ................................ - 113 - TABELA XXXI - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE GRUPOS CARBONILO ............................. - 115 - TABELA XXXII - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE NITRATOS ............................................ - 116 - TABELA XXXIII - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE NITRITOS ..................................................... - 117 -
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 12 -
Introdução
Perspectiva histórica da Doença de Parkinson
James Parkinson, médico e geólogo, publicou uma monografia, em 1817,
descrevendo a entidade patológica que mais tarde tomou o seu nome [1]. Neste trabalho
foram descritas exaustivamente as características clínicas de seis indivíduos. Um deles foi
seguido pelo médico durante um longo período de tempo; os outros cinco consistiram em
observações breves, incluindo dois indivíduos que Parkinson conheceu na rua e outro que
observou apenas à distância. Estas observações realizadas à distância sem qualquer
observação clínica demonstram como esta condição é evidente e facilmente distinguível
apenas pela observação da postura curva, tremor, e alterações do movimento apresentados
pelos doentes. A descrição inicial do trabalho de Parkinson contém a informação médica
essencial que ainda hoje em dia é considerada: “Involuntary tremulous motion, with
lessened muscular power, in parts not in action and even when supported; with a
propensity to bend the trunk forward, and to pass from a walking to a running pace: the
senses and intellects being uninjured.” [1]. Embora com um número de indivíduos
observados muito reduzido, Parkinson forneceu uma descrição muito detalhada dos
sintomas, tendo também discutido a progressiva deterioração dos doentes, numa desordem
à qual deu o nome de shaking palsy. No seu trabalho, Parkinson fez uma revisão dos
diferentes tipos de tremor conhecidos à data, tendo distinguido o tremor observado nestes
indivíduos como um tipo que ocorre apenas quando a parte do corpo se encontra em
repouso e não durante movimentos voluntários. Cerca de setenta anos mais tarde outro
médico, Charcot, defendeu que o nome atribuído por Parkinson à desordem não seria
correcto, uma vez que, o tremor não estaria necessariamente presente nos indivíduos
afectados, tendo sugerido como denominação, “Parkinson’s Disease” nome este, pelo qual
ainda hoje é conhecida esta doença. Hoje em dia, a característica descrita por Parkinson
como diminuição da força muscular, é reconhecida como uma diminuição da rapidez dos
movimentos, frequentemente descrita como acinésia, hipocinésia ou bradicinésia. Estes
três termos representam uma diminuição de movimentos na ausência de fraqueza ou
paralisia.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 13 -
Figura 1 - Ilustração de um indivíduo com doença de Parkinson demonstrando a postura curva
observada nesta condição (adaptado de Gowers, 1893, p. 639 [2])
Foi apenas vários anos após a descrição inicial da doença de Parkinson que os
gânglios basais descritos por Meynert em 1871 foram envolvidos na etiologia das doenças
dos movimentos [3]. E foi apenas em 1895 que a substância nigra foi sugerida como
estando afectada na doença de Parkinson. Esta sugestão foi feita por Brissaud [4] tendo por
base um trabalho publicado dois anos antes, no qual estava descrito o caso de um indivíduo
com um tuberculoma naquela região cerebral, que originou um tremor hemiparkinsoniano.
A importância da substância nigra foi confirmada por Tretiakoff em 1919, quando este
realizou um estudo em nove casos de doença de Parkinson, num caso de
hemiparkinsonismo e três casos de parkinsonismo pós-encefálico, tendo encontrado lesões
na região da substância nigra em todos estes casos [5]. A substância nigra, assim
denominada devido ao seu conteúdo de pigmento neuromelanina, foi encontrada, nestes
casos, com uma séria despigmentação, perda de células nervosas e gliose. Estes três factos
permaneceram como características histopatológicas da doença. Neste mesmo trabalho, o
autor confirmou a observação prévia de Lewy que tinha descrito a presença de inclusões
citoplasmáticas na doença de Parkinson, hoje em dia, largamente reconhecidas como a
maior característica histopatológica desta doença e comummente denominada de “Corpos
de Lewy” [6]. Desde então, vários trabalhos demonstraram que a substância nigra era o
alvo das mais constantes e severas lesões no cérebro de indivíduos com doença de
Parkinson, ocorrendo, no entanto, lesões também noutras áreas cerebrais [7-9].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 14 -
Antes do ano de 1957, era do conhecimento da comunidade científica que a síndrome
parkinsoniana causada pela administração de reserpina era devido à deplecção de
serotonina no cérebro. Mas nesse mesmo ano, Carlsson e colaboradores descreveram que a
L-dopa revertia o estado de parkinsonismo induzido pela reserpina em coelhos, enquanto o
precursor da serotonina não o fazia [10]. A L-dopa é o precursor da dopamina e da
norepinefrina e, naquela altura, era considerado que a única função da dopamina seria
servir de precursor para a norepinefrina. Em 1958 Carlsson determinou que a dopamina
estava presente no cérebro em condições normais [11], tendo no ano seguinte feito a
primeira sugestão de que a dopamina cerebral estaria relacionada com a doença de
Parkinson [12]. Em 1960 surgiu a primeira descrição da deficiência de dopamina a nível
cerebral em casos de parkinsonismo [13]. Iniciou-se nesta altura a era moderna de
conhecimento da síndrome de parkinsonismo e do papel da dopamina no cérebro nesta
condição. A contribuição de Carlsson para o desenvolvimento do conhecimento desta
condição, rendeu-lhe o prémio Nobel em Fisiologia e Medicina no ano de 2000.
Parkinsonismo e Doença de Parkinson
A síndrome de parkinsonismo deve ser compreendida antes da compreensão do que é
a doença de Parkinson. Actualmente o termo parkinsonismo é definido por qualquer
combinação de seis características motoras específicas: tremor em descanso, bradicinésia,
rigidez, perda de reflexos posturais, postura curva e o fenómeno de “freezing” (quando os
pés se encontram “colados” ao chão momentaneamente) [14]. Nem todos os seis sinais
cardinais precisam de estar presentes, mas pelo menos dois têm que ser visíveis para que
possa ocorrer um diagnóstico de parkinsonismo, com pelo menos um deles a ser tremor ou
bradicinésia. O parkinsonismo é classificado em quatro categorias, parkinsonismo
primário, secundário, e duas categorias nas quais estão envolvidos outras síndromes sendo
os sinais de parkinsonismo um evento secundário. O parkinsonismo secundário é devido,
na maioria dos casos, a factores ambientais, enquanto o parkinsonismo primário se refere
concretamente à doença de Parkinson, podendo ser de origem esporádica ou com etiologia
genética conhecida [15]. Esta última é a categoria mais frequente de parkinsonismo na
prática clínica corrente, sendo também a vertente na qual existe maior investigação. Uma
vez que existem diversas categorias de parkinsonismo, uma dificuldade da clínica é o
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 15 -
correcto diagnóstico de uma síndrome de Parkinson, por oposição a qualquer uma das
outras categorias. Algumas características dos indivíduos permitem, por vezes, este
diagnóstico diferencial, por exemplo, são características da doença de Parkinson uma
assimetria dos sintomas (frequentemente os sintomas iniciam-se apenas num dos lados do
corpo), a presença de tremor em descanso (embora possa estar ausente na doença de
Parkinson, está sempre ausente nas outras formas de parkinsonismo) ou boa resposta à
terapia com levodopa [15].
O erro de diagnóstico mais comum prende-se com a presença de tremor devido a uma
síndrome denominada tremor essencial, o qual pode ser unilateral, sendo, no entanto, mais
frequentemente bilateral. O que ajuda no diagnóstico nestes casos, é o facto de o tremor
associado à doença de Parkinson ser um tremor em descanso, enquanto que o tremor
essencial ocorre apenas quando há algum movimento [16].
Características clínicas e patológicas
Os sintomas da doença de Parkinson têm um início insidioso com uma gradual
degradação. O tremor em descanso, por ser tão óbvio, é normalmente o primeiro sintoma
reconhecido pelo doente, mas por vezes, a doença inicia-se com bradicinésia e, nalguns
indivíduos, nunca é observado tremor. A bradicinésia manifesta-se como uma diminuição
da velocidade de execução dos movimentos, caligrafia mais pequena, diminuição da
rotação do braço e arrastamento da perna ao andar, diminuição da expressão facial e
diminuição da amplitude de voz. O tremor pode ser intermitente no início dos sintomas,
manifestando-se apenas em situações de stresse, mas gradualmente vai-se manifestando
mais frequentemente, piorando em situações de stresse ou excitação. A pioria dos sintomas
é gradual ao longo do tempo e, na ausência de tratamento, os sintomas levam a uma total
imobilização do indivíduo. Os sintomas e sinais precoces da doença de Parkinson – tremor
em descanso, bradicinésia e rigidez – são devidos à perda de dopamina no striatum e
normalmente são corrigidos pela administração de levodopa ou agonistas da dopamina. À
medida que a doença de Parkinson progride, desenvolvem-se sintomas que não respondem
à levodopa, tal como a postura curva e a paralisia momentânea. Adicionalmente a
bradicinésia, um dos sintomas que no início tinha uma boa resposta ao tratamento, piora e
deixa gradualmente de responder à levodopa. Para além dos sintomas motores que,
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 16 -
claramente são os que dominam o fenótipo dos indivíduos, muitas vezes existem outros
sintomas não motores relatados pelos doentes, como é o caso de fadiga, depressão,
ansiedade, alterações do sono, obstipação, distúrbios autonómicos e alterações sensoriais.
Estas alterações sensoriais, que ocorrem em cerca de 40% dos doentes, incluem dor, falta
de sensibilidade, formigueiros e sensação de queimadura nos membros afectados. Também
são comuns alterações do comportamento e alterações mentais [17]. A presença de
demência é relativamente comum em indivíduos com idade de início tardia, ocorrendo em
cerca de 40% dos casos, tendo consequências ainda mais graves para o doente do que as
próprias alterações motoras. Para além disso, torna o diagnóstico diferencial mais
complexo, uma vez que os indivíduos podem ser diagnosticados com doença de Alzheimer
e alguns sinais de parkinsonismo, doença de Parkinson ou mesmo demência por corpos de
Lewy [18].
Foi descrito que apenas cerca de 75% dos casos diagnosticados com doença de
Parkinson são confirmados por características de anatomia patológica, o que se deve em
grande parte, a esta variabilidade de sintomas e sua apresentação em diferentes doenças
[19, 20]. Para aumentar a precisão do diagnóstico, foram propostos recentemente novos
critérios. Estes critérios dão ênfase ao início assimétrico dos sintomas como característica
de doença de Parkinson, e diferenciam três níveis de certeza de diagnóstico: definitivo,
provável e possível [21].
As características patológicas da doença de Parkinson são a degeneração selectiva
dos neurónios dopaminérgicos na substância nigra e a formação de inclusões
citoplasmáticas fibrilhares, denominadas corpos de Lewy, nos restantes neurónios. Para um
diagnóstico do ponto de vista da patologia, a presença dos corpos de Lewy é essencial nos
casos de características clínicas típicas [22]. A perda neuronal é já muito avançada
aquando do diagnóstico, uma vez que, está estimado que na altura do desenvolvimento dos
sintomas, os níveis de dopamina tenham diminuído por cerca de 80%.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Figura 2 - Imagem de um corpo de Lewy (Adaptado de Zarranz et al. [23])
Um método que pode ser utilizado como auxiliar no diagnóstico da doença de
Parkinson é a análise de PET ou de SPECT, análise esta que permite visualizar a
quantidade de células que se encontram a funcionar. Estudando as células dopaminérgicas,
é possível obter uma ideia da quantidade de células normais num indivíduo permitindo,
desta forma, um melhor diagnóstico diferencial [24, 25].
Figura 3 - Análise de SPECT de dois indivíduos controlo (A, B) e de um indivíduo com doença
de Parkinson (C) (Adaptado de Zarranz et. al.[23])
Epidemiologia
Actualmente a doença de Parkinson é a segunda forma de doença neurodegenerativa
mais comum, após a doença de Alzheimer. A incidência da doença de Parkinson, que nos
permite saber o número de casos de doença por ano, é de cerca de 16-19/100 000, de
acordo com dados de um estudo recente [26]. Não existem estudos epidemiológicos da
doença de Parkinson em Portugal, no entanto, existem vários realizados noutros países
europeus, ainda que, por vezes, com resultados algo contraditórios, causados
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 18 -
provavelmente pelas diferentes metodologias utilizadas. Na maioria dos estudos, o pico de
incidência da doença ocorre entre os 70 e os 79 anos de idade, tendo o início dos sintomas
uma idade média entre os 60 e os 65 anos [26]. A prevalência da doença de Parkinson
aumenta com a idade, cerca de 60 em cada 100 000 indivíduos com idades entre 65 a 69
anos apresentam doença, enquanto que considerando indivíduos com idades entre 85 a 89,
são 350 por cada por cada 100 000 indivíduos a apresentar doença de Parkinson [27]. Num
estudo recente, Elbaz e colaboradores definiram que o risco ao longo da vida de
desenvolver doença de Parkinson é 2% para indivíduos do sexo masculino e 1,3% para
indivíduos do sexo feminino [28]. A preponderância de indivíduos do sexo masculino é
também observada noutros estudos com respeito às taxas de prevalência e incidência [29-
32]. Enquanto a etiologia da doença de Parkinson não é ainda completamente conhecida e
compreendida, a explicação para um maior risco em indivíduos do sexo masculino não é
conhecida de todo.
Embora o conhecimento de diferenças étnicas e geográficas na prevalência da doença
seja ainda escasso, devido à falta de estudos epidemiológicos comparáveis, sabe-se que a
doença de Parkinson ocorre em todos os grupos étnicos em todo o mundo e mostra uma
variação geográfica na sua prevalência, sendo mais baixa na China, Japão e África [33]. A
prevalência da doença de Parkinson parece ser semelhante em todos os países da Europa
[27]. Os factores responsáveis pela variação geográfica na ocorrência da doença de
Parkinson são, ainda, desconhecidos, mas têm sido sugeridos, principalmente, factores
ambientais [33]. Uma explicação alternativa prende-se com a componente genética da
doença, uma vez que se verifica uma maior prevalência entre caucasianos e hispânicos,
quando comparados com afro-americanos e americanos [30].
Tratamento
As estratégias de tratamento melhor conhecidas para a doença de Parkinson podem
ser categorizadas como farmacológicas, cirúrgicas e de estilo de vida, como o exercício,
educação ou nutrição.
No que diz respeito ao tratamento farmacológico, a Levodopa é o fármaco mais
eficiente no tratamento da doença de Parkinson. O tratamento está associado com a
diminuição da morbilidade e da mortalidade, sendo que quase todos os doentes obtêm
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 19 -
benefícios do tratamento [34]. Actualmente a terapia com levodopa é administrada em
combinação com inibidores de descarboxilase para prevenir a conversão periférica da
levodopa em dopamina o que resulta em efeitos secundários. Após cerca de cinco anos de
terapia, 75% dos doentes desenvolvem respostas à terapêutica com complicações
(fenómeno de on-off e de wearing off) ou discinésias [35, 36]. Durante os fenómenos de
wearing off, ou de on-off há um aumento pronunciado dos sinais e sintomas da doença de
Parkinson, deixando os doentes imóveis com acinésia durante largas horas. Por vezes,
durante estes períodos acinéticos os doentes sofrem contracções muito dolorosas
denominadas distonias em off [37]. Os mecanismos por detrás destas complicações
relacionadas com a levodopa não são compreendidos, embora a curta semi-vida da
levodopa possa ser um factor importante [38]. De uma forma geral, a medicação para a
doença de Parkinson envolve o risco de desenvolvimento de sintomas mentais, como
confusão e alucinações [39].
Outro tipo de fármaco utilizado são os agonistas da dopamina, que têm a capacidade
de estimular directamente os receptores da dopamina. Sob o ponto de vista teórico,
oferecem algumas vantagens relativamente à levodopa. Primeiramente, não necessitam de
uma conversão metabólica para formar um metabolito activo e, por isso, não são
dependentes dos neurónios dopaminérgicos, ao contrário da levodopa. Em segundo lugar a
maior parte dos agonistas da dopamina têm uma duração de resposta mais prolongada,
logo, uma dose individual fornece uma estimulação dos receptores mais longa e mais
estável. Em terceiro lugar, estes agonistas não sofrem metabolismo oxidativo, e, por isso,
não geram radicais livres que podem ser citotóxicos [40].
Os inibidores da COMT, outra classe de fármacos utilizados, inibem a enzima ubíqua
catecol-Orto-metiltransferase na periferia, aumentando assim a quantidade de levodopa
disponível para atravessar a barreira hemato-encefálica. A terapêutica com inibidores da
COMT deve ser utilizada em combinação com a levodopa.
Os fármacos mais antigos no tratamento da doença de Parkinson são os
anticolinérgicos, mas têm sido documentados vários efeitos secundários adversos, pelo
que, a sua utilização é muito limitada.
Outra classe de fármacos utilizados são os inibidores da monoamino oxidase B. Estes
protegem os neurónios motores de toxicidade em estudos in vitro e in vivo. Um estudo, no
entanto, documentou um aumento da mortalidade em indivíduos sujeitos a terapêutica com
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 20 -
um subtipo destes fármacos [41]. Posteriormente este estudo foi desacreditado devido a
falhas metodológicas e estatísticas.
Espera-se que haja uma melhoria nos fármacos utilizados, decorrente do
conhecimento de alterações genéticas existentes numa determinada percentagem de
doentes de Parkinson, aumentando assim a probabilidade de desenvolvimento de fármacos
neuroprotectores dos neurónios dopaminérgicos [42].
No que diz respeito a tratamento cirúrgico, a técnica que hoje em dia se apresenta
como mais promissora é a estimulação crónica. Esta técnica tem obtido resultados muito
positivos, sendo utilizada em Portugal apenas em doentes com determinadas formas da
doença e com um estado já muito avançado sem resposta à terapêutica farmacológica [43,
44].
Etiologia da doença de Parkinson
Factores ambientais
A procura de factores de risco ambientais para a doença de Parkinson foi
grandemente estimulada no início da década de 80, quando se verificou que vários
utilizadores de drogas intravenosas, que desenvolveram sinais e sintomas típicos de
parkinsonismo, tinham utilizado um narcótico sintético contaminado com a toxina MPTP
[45]. Ao contrário de outras toxinas que danificam várias zonas do cérebro e que estão
associadas a outros sintomas neurológicos para além do parkinsonismo, a exposição a
MPTP resulta numa degeneração selectiva dos neurónios da substância nigra e a uma
síndrome parkinsoniana pura [46]. Mais tarde, foi documentado que o metabolito que
exerce o efeito tóxico neste caso é o MPP+, produto resultante da activação pela enzima
monoamino oxidase B [47]. Outras descobertas importantes foram de que o MPTP entra
nos neurónios através do sistema de entrada da dopamina [48], onde inibe o Complexo I da
cadeia respiratória mitocondrial, resultando na depleção de ATP [49]. No seu conjunto,
todos estes factos apontam para a possibilidade de que o parkinsonismo induzido por
MPTP pode partilhar mecanismos patogénicos com a doença de Parkinson.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 21 -
Figura 4 - Representação esquemática do metabolismo do MPTP. Após administração sistémica, o MPTP atravessa a barreira hemato-encefálica. Uma vez no cérebro, o MPTP é convertido em MPDP+ pela monoamino oxidase B em células não dopaminérgicas e depois a MPP+ por um mecanismo não conhecido. Este MPP+ é concentrado nos neurónios dopaminérgicos através do tranportador da dopamina (DAT) (Adaptado de Dauer [50])
O facto de que o MPTP tem uma estrutura química semelhante ao herbicida paraquat
[51], sugeriu que este e outros pesticidas possam estar envolvidos na patogénese da doença
de Parkinson. Vários estudos tentaram examinar esta associação. Vários estudos de
associação caso-controlo descreveram risco elevado para o desenvolvimento da doença
com a exposição a pesticidas, e, mais especificamente, a exposição a insecticidas e
herbicidas. Num trabalho incluindo 19 estudos que examinaram a associação entre a
doença de Parkinson e a exposição a pesticidas, foi obtido um Odds Ratio de 1,9 [52]. Um
facto relacionado encontrado por outro grupo é de que uma exposição crónica ao pesticida
rotenona causa uma degeneração selectiva das células da substância nigra associada a
hipocinésia e rigidez em ratinhos [53, 54]. Para além da exposição a pesticidas, vários
outros aspectos associados a uma vida no campo, tal como o consumo de água de poços e a
agricultura, foram demonstrados como factores de risco para o desenvolvimento da doença
de Parkinson. No entanto, estes resultados são inconsistentes. De vinte estudos realizados
que avaliaram a vida no campo enquanto factor de risco para esta doença, sete encontraram
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 22 -
um risco aumentado, três encontraram um risco diminuído e dez não encontraram qualquer
associação [55].
O traumatismo craniano tem sido, também, apontado como um factor de risco para o
desenvolvimento da doença de Parkinson [56-58], embora vários estudos tenham falhado
em encontrar uma associação significativa [59], está descrito que os lutadores de boxe têm
maior propensão a desenvolver sintomas de parkinsonismo como resultado de
traumatismos repetidos [60].
A exposição crónica a metais tais como chumbo, mercúrio, alumínio, cobre, ferro,
zinco ou manganésio tem também recebido atenção enquanto factor de risco para a doença
de Parkinson. No entanto, várias dificuldades têm surgido na realização destes estudos,
como a dificuldade dos indivíduos em estimar quantidade e tempo de exposição. Por outro
lado, todos estes estudos têm apresentado grupos de indivíduos demasiado pequenos,
dando origem a resultados inconsistentes [59].
Têm sido realizados vários trabalhos na tentativa de encontrar factores na dieta que
sejam, de alguma forma, protectores contra a doença de Parkinson. Entre eles são de maior
importância a vitamina A, C e E e os suplementos com antioxidantes, tendo como premissa
do estudo que estes protegeriam contra a morte neuronal mediada por radicais livres. Até à
data não há evidências consistentes que factores dietéticos ou antioxidantes estejam
envolvidos na etiologia desta doença [59].
Uma evidência consistente é a de que o café parece ser um factor protector contra a
doença de Parkinson, tendo um papel mais importante em indivíduos do sexo feminino do
que em indivíduos do sexo maculino. No entanto, o mecanismo através do qual o café se
torna um factor protector é ainda desconhecido [61]. De forma idêntica, foi descrito um
efeito protector na ingestão de cerveja, embora não tenha sido encontrada qualquer
associação na ingestão de álcool de uma forma geral [62].
Um factor que tem obtido resultados muito consistentes é a relação inversa entre a
doença de Parkinson e a utilização de tabaco [63]. Na maioria dos estudos é obtida uma
redução do risco de cerca de 50%. A activação dos receptores nicotínicos também melhora
os deficits motores nos indivíduos com doença [64]. O uso de adesivos ou pastilhas de
nicotina diminuiu o tremor e/ou a bradicinésia em indivíduos com doença de Parkinson e
idade avançada [65]. Estes resultados sugerem que a nicotina ou agonistas de um subtipo
de receptores nicotínicos, por si só ou em combinação com a terapia com levodopa, têm o
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 23 -
potencial de melhorar a disfunção motora existente nestes indivíduos. Apesar da forte
associação entre o uso de tabaco e uma menor susceptibilidade para a doença de Parkinson,
vários enviesamentos de resultados podem ter acontecido nestes estudos. Muito
provavelmente a presença da doença origina que os indivíduos não fumem, e não vice-
versa, adicionalmente, se os indivíduos que têm a doença e fumam têm uma sobrevida
menor, a proporção de indivíduos com doença que fumam num qualquer ponto do tempo
será menor do que a dos indivíduos que não fumam.
Vários factores ambientais foram já associados com a doença de Parkinson. Para
alguns deles, o mecanismo patofisiológico é conhecido e compreendido, ao passo que para
outros não só não é conhecido este mecanismo, como diferentes estudos têm obtido
diferentes resultados. No entanto, parece claro que, pelo menos numa percentagem de
casos, factores ambientais estão envolvidos no desenvolvimento da doença, muito
provavelmente, em interacção com factores genéticos de cada indivíduo.
Factores genéticos
A doença de Parkinson foi considerada como o arquétipo de doença não genética até
há cerca de 7 atrás. Esta noção foi sempre suportada por evidências de estudos de gémeos
monozigóticos com doença de Parkinson. Vários destes estudos falharam em encontrar
taxas de concordância mais elevadas nestes gémeos do que em gémeos dizigóticos, o que
levava a crer que causas genéticas não seriam responsáveis pela doença. No entanto, a
doença de Parkinson tem um período de latência muito grande, podendo os sintomas surgir
muito após o início do processo de degeneração e estando, eventualmente, dependente de
contributos ambientais [66]. No entanto, nesta altura estão já descritos cerca de dez loci
genéticos associados com a doença de Parkinson, estando mesmo descritos cinco genes nos
quais, alterações causam doença de Parkinson. Assim sendo, na última década o estudo da
doença de Parkinson, mais concretamente dos aspectos genéticos desta doença, sofreu um
avanço muito considerável, estando descritas alterações que são muito comuns na
generalidade dos doentes. Foi devido a este aumento exponencial de conhecimento nesta
área que hoje em dia se realizam já testes genéticos para o diagnóstico da doença de
Parkinson, algo que seria absolutamente impensável há alguns anos atrás. A Tabela I
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 24 -
apresenta os genes e os loci identificados até hoje nesta doença, assim como o modo de
hereditariedade característico de cada uma das formas da doença [67].
Tabela I - Loci genéticos e genes associados à doença de Parkinson (adaptado de Hardy et al.[67]).
Locus Modo hereditariedade Idade Início Cromossoma Gene
PARK-1 AD ~45 4q SNCA
PARK-2 AR 7-60 6p parkina
PARK-3 AD 59 2p13 -
PARK-5 AD 30-60 4p14 UCH-L1
PARK-6 AR 36-60 1p36 PINK1
PARK-7 AR 27-40 1p36 DJ-1
PARK-8 AD 45-57 12p-q Lrrk2
PARK-9 AR 10-20 1p36 -
PARK-10 AD >60 1p36 -
PARK-11 AD 46-60 2q36-q37 -
ALFA-SINUCLEÍNA
A família das sinucleínas consiste em três genes distintos, alfa-sinucleína, beta-
sinucleína e gama-sinucleína, que até hoje foram apenas descritos em vertebrados. O gene
da alfa-sinucleína foi mapeado no cromossoma 4 humano 4q21.3-q22 [68], enquanto o
gene da beta-sinucleína foi localizado no cromossoma 5q35 [69] e o gene da gama-
sinucleína no cromossoma 10q23.2-q23.3 [70]. O gene da alfa-sinucleína está organizado
em sete exões, dos quais cinco têm informação que codifica a proteína, enquanto o gene da
beta-sinucleína contém seis exões (5 codificam proteína) e o gene da gama-sinucleína
contém cinco exões todos codificantes para a proteína [71]. Todas as sequências destas
proteínas consistem de um domínio no terminal amínico que inclui um número variável de
repetições de onze resíduos, e um domínio no terminal carboxilo menos conservado, que
inclui uma preponderância de resíduos acídicos. As únicas diferenças significativas entre
estas proteínas localizam-se no domínio que contém as repetições, no qual há uma
delecção de onze aminoácidos em todas as beta-sinucleínas e a adição de outra região de
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 25 -
repetições após o resíduo 32 nas gama-sinucleínas [72]. Uma característica da alfa-
sinucleína é a presença no terminal amínico de repetições imperfeitas da sequência de
aminoácidos KTKEGV, que se pensa estarem relacionadas com a ligação da proteína a
lípidos [73].
As alfa e beta-sinucleínas são predominantemente expressas no cérebro, em
particular no neocórtex, hipocampo, corpo estriado, tálamo e no cerebelo, encontrando-se a
imunoreactividade aumentada nos terminais pré-sinápticos [74, 75]. Embora as suas
funções fisiológicas normais não sejam ainda conhecidas, vários resultados apontam para
um papel nos processos de membrana nos terminais pré-sinápticos [72].
Em solução aquosa, no seu estado nativo a alfa-sinucleína apresenta-se numa
estrutura linear, sem um centro hidrofóbico [76, 77]. Esta estrutura é em tudo semelhante
áquela encontrada em proteínas de ligação à tunulina/actina, por exemplo a proteína tau, ou
a inibidores de fosfatase/cinase [77] e pode ser crítica nas interacções proteína-proteína. A
alfa-sinucleína liga-se exclusivamente a fosfolípidos acídicos, especialmente ao ácido
fosfatídico, e a membranas de pequeno diâmetro, o que pode significar que os alvos desta
proteína podem ser subpopulações específicas de membranas ou vesículas [78]. No
entanto, nem toda a alfa-sinucleína parece estar ligada a membranas, uma vez que, também
pode ser purificada a partir do citosol [79, 80].
Outra forma de tentar compreender a função desta proteína, passa por estudar quais
são os seus alvos, se estão envolvidos em processos de sinalização celular ou processos
regulatórios. Por outro lado, estes alvos podem, por si só, ser genes candidatos no estudo
de patologias associadas. Assim sendo, sabe-se que a alfa-sinucleína apresenta uma
elevada homologia com uma região das proteínas chaperone 14-3-3, podendo mesmo ser
considerada membro desta família [81]. Alguns dos ligandos conhecidos da alfa-sinucleína
estão envolvidos na regulação da viabilidade celular, podendo, então, a alfa-sinucleína
desempenhar um papel nestes processos de sinalização [82].
Outro ligando da alfa-sinucleína é a proteína sinfilina-1. Esta é uma proteína com
muito poucas semelhanças a outras proteínas já conhecidas. Contém, no entanto, vários
domínios de interacção proteína-proteína, podendo desempenhar um papel de adaptador,
permitindo a ligação da alfa-sinucleína a outras proteínas. Adicionalmente, a sinfilina-1
encontra-se presente nos corpos de Lewy, dos quais a alfa-sinucleína é um dos principais
componentes [83]. Foram realizados estudos para verificar se alterações no gene da
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 26 -
sinfilina-1 poderiam estar na base de algumas formas da doença de Parkinson, mas não
foram encontrados resultados positivos, pelo que, alterações neste gene não parecem
causar a doença [84].
Está também descrita a interacção da alfa-sinucleína com a proteína tau [85]. Está
descrito que a proteína tau se liga ao terminal carboxilo da alfa-sinucleína através do seu
domínio de ligação aos microtúbulos. Consequentemente, apenas a tau que não está ligada
a microtúbulos pode interagir com a alfa-sinucleína. Uma vez que a alfa-sinucleína se liga
à A-beta e a vesículas cerebrais através do seu terminal amínico, é possível que uma das
suas funções seja formar de ponte de ligação entre estes dois ligandos [86, 87]. Para além
desta função, sabe-se que a alfa-sinucleína estimula a função da proteína cinase A que
fosforila o resíduo Ser262 da tau [85]. Uma vez que a fosforilação deste resíduo impede a
tau de se ligar aos microtúbulos [88], a alfa-sinucleína pode modular a função da proteína
tau.
O papel da alfa-sinucleína nos processos de neurodegeneração foi posto em evidência
quando, em 1993 Ueda e colaboradores, ao estudarem as placas amilóides presentes nos
cérebros de doentes de Alzheimer, purificaram um pequeno péptido que era derivado de
uma proteína precursora maior [89]. Hoje sabe-se que esta proteína é idêntica à alfa-
sinucleína. Desde então, foram já encontradas várias alterações neste gene que conduzem
ao desenvolvimento da doença de Parkinson.
A análise de linkage numa família de origem Grega com doença de Parkinson de
forma autossómica dominante, revelou um locus no cromossoma 4q21, localização esta
onde se sabia estar presente o gene da alfa-sinucleína [90]. Esta foi a primeira evidência de
que este gene poderia estar envolvido na patogénese desta doença. De seguida foi feita a
análise deste gene nos indivíduos desta família, o que revelou uma mutação missense que
causava a troca de uma guanina para uma adenina na posição 209 (G209A), resultando na
troca de uma alanina por uma treonina na posição 53 da sequência aminoacídica [91]. Esta
mutação co-segregava com a doença noutras três famílias, aparentemente não relacionadas,
e não estava presente em cerca de 314 controlos.
Desta forma, a alfa-sinucleína foi considerado o primeiro gene patogénico da doença
de Parkinson, tendo revolucionado o conceito de que a doença de Parkinson não tinha uma
base genética na sua etiologia. No entanto, alguns problemas surgiram na sequência deste
achado. O primeiro foi a baixa frequência desta mutação. Após a sua descoberta vários
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 27 -
grupos tentaram replicar este resultado em famílias com formas autossómicas dominantes
da doença, inclusivamente em famílias de origem europeia, tendo falhado [92]. O que
sugeria que esta alteração era uma causa rara da doença de Parkinson. Outra dificuldade
que se apresentou foi o facto de esta mutação dar origem à sequência normal da alfa-
sinucleína presente no rato, o que levantou dúvidas quanto à sua patogenicidade [93].
No entanto, pouco tempo depois foi descrita uma outra mutação neste mesmo gene, o
que reforçou a hipótese de que estas mutações estariam envolvidas na patogénese da
doença. A segunda mutação encontrada neste gene foi descrita numa família de origem
alemã, e consistia de uma alteração de uma guanina para uma citosina na posição 88
(G88C) o que resulta na transição de uma alanina para uma prolina na posição 30 da cadeia
aminoacídica [94]. Subsequentemente, foram feitos vários estudos na procura de qualquer
uma destas mutações no gene da alfa-sinucleína em diferentes formas familiares da doença
(dominante e recessiva), esporádica e de início precoce, tendo sido obtidos resultados
semelhantes áqueles da primeira mutação descrita [95-99]. Apesar de todos estes esforços,
até à data, apenas uma dúzia de famílias autossómicas dominantes foram descritas como
possuindo mutações no gene da alfa-sinucleína em todo o mundo [100-102]. Com a
excepção de uma família, todas as outras possuíam a mutação A53T, e, de acordo com a
análise de haplótipos, provavelmente têm ascendência Grega [103]. Também foi descrita
uma reduzida penetrância da mutação nalgumas famílias [102, 104].
Foram realizados vários estudos in vitro com estas mutações na tentativa de perceber
qual a alteração que estas provocam. Está descrito que as formas mutadas da proteína têm a
sua conformação alterada [105], agregam com mais facilidade quando expostas a insultos
tóxicos [106-108], para além de serem elas próprias neurotóxicas in vivo [109].
Uma evidência interessante destas mutações prende-se com a expressão do mRNA
dos alelos mutados em indivíduos heterozigóticos. Verificou-se que em indivíduos com um
fenótipo grave da doença, e em estado já avançado, há uma diminuição da expressão do
alelo mutado quando comparado com o alelo normal, enquanto em indivíduos com um
fenótipo menos grave, a expressão destas duas formas é praticamente idêntica. Estes
resultados suportam a teoria de que o gene da alfa-sinucleína é sujeito a haploinsuficiência
na presença de uma das duas mutações pontuais descritas na doença de Parkinson. Assim
sendo, a relação entre a expressão destas formas, em indivíduos heterozigóticos para estas
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 28 -
mutações, daria um bom marcador biológico do desenvolvimento do processo
neurodegenerativo [110].
Não foram detectadas outras mutações neste gene até muito recentemente. No ano de
2003, Zarranz e colaboradores descreveram uma nova mutação pontual no gene da alfa-
sinucleína [23]. Esta mutação, que origina a troca de um ácido glutâmico por uma lisina na
posição 46, ocorre numa zona muito conservada na sequência do gene, mais concretamente
numa das repetições que se pensa terem função de ligação a vesículas lipídicas. A grande
diferença entre esta mutação e as mutações previamente descritas baseia-se no fenótipo dos
indivíduos. Ao passo que as primeiras davam origem a doença de Parkinson, esta mutação
origina não só doença de Parkinson, mas também demência com corpos de Lewy, o que
sugere um papel da alfa-sinucleína nestas duas patologias [23]. Esta mutação, até hoje, não
foi encontrada em qualquer outro indivíduo, sugerindo ser uma variante do gene ainda
mais rara do que as anteriores, e, portanto, uma causa muito rara da doença.
Outra evidência relevante no estudo da alfa-sinucleína é o facto de variabilidade na
região promotora do gene estar associada ao desenvolvimento da doença de Parkinson, tal
como descrito por Pals e colaboradores [111].
No mesmo ano foi descrita uma outra mutação neste gene. Desta feita foi descrita
uma alteração do número de cópias do gene. Mais concretamente foi descrita a triplicação
do gene da alfa-sinucleína, o que significa que em vez de estar presente apenas uma cópia
do gene num cromossoma, ela aparece três vezes [112]. Esta mutação apresenta um
resultado muito mais previsível do que as mutações anteriores, ou seja, um aumento da
quantidade da proteína, sem o consequente aumento da capacidade da sua degradação, leva
à sua deposição, formando corpos de Lewy. No ano seguinte, Miller e colaboradores
demonstraram que os indivíduos possuindo uma triplicação do gene, apresentam uma
duplicação da quantidade de proteína no soro, e um aumento da sua deposição no cérebro
[113]. No entanto, e à semelhança do que aconteceu nas mutações anteriores, também foi
demonstrado que a triplicação do gene da alfa-sinucleína é uma causa rara da doença de
Parkinson [114].
Na sequência da descoberta de alterações do número de cópias neste gene, outros
estudos foram feitos, tendo sido encontradas duplicações do gene em três famílias, nas
quais o fenótipo era de parkinsonismo idiopático sem qualquer forma de demência [115,
116].
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 29 -
No que diz respeito à forma das doenças originadas por todas as mutações
conhecidas, verifica-se que um aumento da proteína normal, tem efeitos mais graves do
que uma quantidade normal de proteína mutada [117], originando uma idade de início mais
precoce e um mais rápido desenvolvimento da doença. Por outro lado, mesmo um pequeno
aumento da proteína, devido à sua sobre-expressão, ou a uma lenta degradação, podem
constituir um factor de risco para o desenvolvimento da doença de Parkinson.
A alfa-sinucleína é o principal componente dos corpos de Lewy, característica
patológica da doença de Parkinson. No entanto, a única prova do envolvimento deste gene
no processo patológico desta doença, são algumas famílias com mutações missense neste
gene, não se conhecendo qual o efeito das mutações pontuais no processo de
neurodegeneração. Com o conhecimento actual, uma das explicações mais fáceis será de
que as mutações são tóxicas, apenas porque aceleram a agregação da proteína em
protofibrilas, fibrilas e, finalmente, a sua deposição nos corpos de Lewy. No entanto, as
mutações também podem ser tóxicas por afectar algumas das numerosas funções
potenciais atribuídas à proteína ou diminuir a sua disponibilidade por favorecer a formação
de fibrilas.
No que diz respeito às mutações por alteração do número de cópias, a explicação
parece ser mais simples, tendo um resultado aparentemente directo no aumento da
quantidade de proteína presente.
Também a sobre-expressão de formas normais e mutadas da proteína estão descritas
como conduzindo células rapidamente a apoptose [118].
Assim sendo, parece evidente que a alfa-sinucleína desempenha um papel na
patogénese da doença de Parkinson, pelo menos em alguns indivíduos com história
familiar sugestiva de forma autossómica dominante e uma idade de início da doença por
volta dos 45 anos de idade.
Nos indivíduos com estas características o estudo/diagnóstico genético por este gene
parece ser indicado.
PARKINA
O parkinsonismo juvenil autossómico recessivo (AR-JP) é caracterizado por uma
idade de início precoce, tendo início frequentemente na segunda década de vida e sempre
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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antes da quarta década. Estes doentes são caracterizados pela perda específica de uma
subpopulação de neurónios da substância nigra, os mesmos neurónios afectados na doença
de Parkinson idiopática. Assim sendo, as características patológicas do AR-JP são
indistinguíveis das características da doença de Parkinson idiopática.
Em 1998, o gene da parkina foi identificado por clonagem posicional a partir de
material genético doado por famílias de origem Japonesa, afectadas por esta forma de
doença de Parkinson [119]. Foi então demonstrado que o AR-JP tem um modo de
hereditariedade recessivo, no qual ambos os alelos necessitam de estar mutados [120]. Até
à data foram identificadas inúmeras mutações no gene da parkina relacionadas com AR-JP,
como revisto por Hedrich e colaboradores [121]. Recentemente, foi descrito que cerca de
50% das famílias europeias com formas autossómicas recessivas de parkinsonismo juvenil,
têm mutações na parkina [82, 122-124].
Esta forma de parkinsonismo, na qual a actividade da parkina é inexistente, ocorre
normalmente na ausência de corpos de Lewy [125, 126]. No entanto, em certos casos de
AR-JP verifica-se a presença de corpos de Lewy, como no caso descrito recentemente por
Farrer e colaboradores de um indivíduo que possuía um alelo com uma mutação null e
outro com uma mutação que demonstrava uma actividade parcial da parkina [127]. Em
formas autossómicas dominantes da doença de Parkinson, detecta-se imunorreactividade
para a parkina em mais de 90% dos corpos de Lewy. Assim sendo, estes resultados
sugerem uma função da parkina normal na formação dos corpos de Lewy.
O gene da parkina extende-se por 12 exões com cerca de 1.4 Mb. No que diz respeito
à estrutura da proteína parkina, esta contém 456 aminoácidos e sabe-se que no terminal
amínico apresenta um domínio ubiquitin-like, tendo no terminal carboxilo dois motivos
RING finger e um domínio IBR (In Between Ring finger) [128]. Evidências recentes
demonstraram a função de proteínas RING finger. A maioria destas proteínas parece
desempenhar um papel fundamental na mediação da ubiquitinização de proteínas
específicas, assim como delas próprias [129].
Actualmente, tem-se dado um grande ênfase ao papel do sistema proteassoma (UPS)
em vários processos, uma vez que é através deste sistema que existe um controlo apertado
de, pelo menos, 30% das proteínas sintetizadas no interior da célula [130]. Este processo
tem um papel fundamental em eventos como o ciclo celular, transdução de sinal,
metabolismo e resposta imune [131, 132].
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 31 -
O evento iniciador de todo este processo é a poliubiquitinação das proteínas substrato
[133], num processo que, no total, envolve três enzimas específicas. A ubiquitina, uma
pequena proteína muito conservada ao longo da evolução, consiste em 76 resíduos
aminoacídicos, e tem a função de marcar uma grande variedade de proteínas para
subsequente proteólise [134]. Inicialmente a ubiquitina é activada numa reacção
dependente de ATP por uma enzima E1, sendo, de seguida, transferida para uma enzima
conjugadora (E2). Nalguns casos, esta enzima transfere directamente a ubiquitina para a
proteína substrato, mas, frequentemente, necessita da participação de uma enzima E3
(enzima de ligação). Através de uma cascata de reacções enzimáticas, a ubiquitina é
covalentemente ligada, através do resíduo de glicina no seu terminal carboxilo, ao resíduo
lisina no terminal amínico da proteína-alvo. Finalmente, é formada uma cauda de
poliubiquitina através da adição sucessiva de moléculas desta proteína [135].
Actualmente sabe-se que existem menos proteínas E1 do que E2, pertencendo as
proteínas E2 a uma família de proteínas com mais de doze espécies. No entanto, no que diz
respeito às proteínas E3, sabe-se que existe uma enorme variedade de proteínas,
possivelmente na casa dos milhares [136]. O papel das proteínas E3 no UPS é
fundamental, uma vez que, cada proteína E3 normalmente se liga a uma proteína substrato
com um elevado grau de selectividade, de forma regulada no espaço e no tempo [135].
Sabe-se que a parkina faz parte da família de proteínas E3 [137], desempenhando,
por isso, um papel importante no processo de degradação pelo proteassoma e estando
envolvida na degradação das suas proteínas substrato, que podem ser desde receptores
membranares até enzimas citosólicas [129]. Assim, pensa-se que a parkina tenha uma
função de ponte entre a proteína substrato e a enzima E2 que contém ubiquitina, para que
esta molécula possa ser transferida para o substrato. Esta ubiquitinação leva à degradação
da proteína substrato através do proteassoma [137, 138]. Tem sido sugerido que uma
ausência de função da parkina (por exemplo por mutação em ambos os alelos) leva a uma
acumulação tóxica dos seus substratos ou da própria parkina.
A sobre-expressão da parkina tem demonstrado uma redução da quantidade de
proteínas ubiquitinadas [139]. Por outro lado, a sobre-expressão de formas mutadas da
proteína, causa stresse oxidativo, excesso da produção de monóxido de azoto (NO) e
consequente morte celular, provavelmente via inibição do proteassoma [139].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 32 -
Para determinar quais as proteínas que interagem com a parkina, foi sobre-expresso
um receptor transmembranar (Pael-R) tendo-se verificado que, nestas condições, este
acumulava e aumentava os níveis de stresse celular, culminando na morte da célula [140].
Posteriormente foi verificado que o Pael-R interage com a proteína parkina através do
terminal carboxilo desta. O Pael-R é expresso em todas as regiões cerebrais, mas a sua
expressão é particularmente elevada nos neurónios da substância nigra que contêm tirosina
hidroxilase [141]. A degradação deste substrato da parkina protege a célula da toxicidade
induzida pela acumulação de Pael-R.
Quanto à expressão do gene, verificou-se que há diferentes formas do gene expressas
no cérebro e nos linfócitos. Mais concretamente, foi observado que estas diferentes formas
da proteína são criadas por splicing alternativo [142]. A proteína existente no cérebro tem a
totalidade da informação contida nos 12 exões do gene, enquanto a proteína existente na
periferia não possui a informação contida nos exões 3-5. Um facto particularmente
interessante, é que a maioria das delecções conhecidas no gene da parkina ocorrem
precisamente nesta zona do gene [143, 144], a mesma zona que se encontra apagada nos
linfócitos de indivíduos normais. Este facto pode auxiliar na compreensão dos
mecanismos, através dos quais, ocorrem as delecções exónicas nas formas cerebrais do
gene em indivíduos com doença de Parkinson.
No que diz respeito a mutações no gene da parkina, há uma enorme variedade de
mutações descrita, que vão desde transições pontuais ou delecções/inserções pontuais a
delecções/inserções exónicas, estando descritas alterações em praticamente todos os exões
do gene.
A primeira mutação encontrada neste gene, tratou-se de uma delecção exónica [119],
tendo várias mutações sido descritas desde essa altura. No ano seguinte à publicação deste
trabalho pioneiro, Abbas e colaboradores descreveram um estudo com várias famílias,
onde encontraram mutações no gene da parkina em cerca de 30% dos indivíduos [122], o
que comparado com a percentagem de 0,5% obtida para o gene da alfa-sinucleína, era
claramente superior. Embora em percentagem claramente inferior, também estão descritos
casos de mutações patogénicas, tanto pontuais como exónicas no gene da parkina, em
indivíduos com formas esporádicas da doença e início precoce [144, 145].
Uma das questões quanto às mutações encontradas neste gene prende-se com o facto
de haver um grande número de indivíduos heterozigóticos. Nesta condição existe uma
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 33 -
cópia normal do gene para além de uma cópia mutada, o que pode reflectir que
haploinsuficiência neste gene é um factor de risco para a doença, e que determinadas
mutações são dominantes, conferindo um efeito dominante negativo na função da proteína,
ou um ganho de função tóxica [146]. No entanto, o cenário mais provável talvez seja, de
que os vários trabalhos apenas falharam em encontrar a outra mutação no outro alelo, a
qual pode estar situada na região promotora do gene ou mesmo nalgum intrão [147]. A
confirmar a hipótese de haploinsuficiência no gene da parkina está a descrição de uma
família, na qual a presença da mutação em estado de heterozigotia, confere uma idade de
início da doença mais tardia [148].
Assim sendo, parece evidente que alterações no gene da parkina são responsáveis por
uma elevada percentagem de casos de doença de Parkinson autossómica recessiva com
início precoce. O modo como o gene da parkina está envolvido neste processo não é ainda
totalmente conhecido, embora a sua função no processo de degradação proteica pelo
proteassoma sugira alguns mecanismos possíveis. Nesse sentido está a evidência de que a
maioria das mutações patogénicas neste gene, ocorre na região que codifica os RING
fingers, ou seja, no domínio funcional deste mecanismo.
Com uma percentagem de casos tão elevada, este gene deve, provavelmente no
futuro, ser utilizado como método auxiliar de diagnóstico em indivíduos com formas de
doença sugestivas.
DJ-1
O estudo do gene DJ-1 teve o seu início quando Bonifati e colaboradores
identificaram, por análise de linkage, a região PARK7 como a região responsável por
conter alterações, que dão origem à doença de Parkinson em quatro famílias com forma
autossómica recessiva de início precoce [149]. Posteriormente foi descrito que o gene
contido nesta região responsável pelo fenótipo seria o gene DJ-1 [150], tendo nesse mesmo
ano, sido descritas mutações causadoras da doença em duas famílias europeias com
história de consanguinidade.
Uma das mutações encontradas, numa família de origem belga, foi uma grande
delecção, de cerca de 14 kb, que contém os exões 1-5 do gene; a outra mutação encontrada
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 34 -
foi uma mutação missense na posição 166 da sequência aminoacídica, na qual ocorre uma
troca de uma leucina para uma prolina [151].
O gene DJ-1 está localizado no cromossoma 1p36 e consiste de oito exões, dois dos
quais não são codificantes e sofrem splicing alternativo (1A/B). Estes oito exões contêm a
informação de uma proteína com 189 aminoácidos e cerca de 20 kDa. A localização
subcelular da proteína foi demonstrada ser citoplasmática e nuclear em várias linhas
celulares [152]. A localização das formas L166P e normal, em modelos celulares, está
descrita como sendo na mitocôndria, embora não na sua totalidade [153], uma evidência
ainda não confirmada para a proteína endógena em tecido humano, ou em neurónios de
ratinho [154]. No cérebro, a marcação para DJ-1 demonstrou a sua presença em várias
regiões, com maior expressão nos neurónios [155] e nos astrócitos [154]. No entanto,
embora seja expressa nos neurónios, a proteína DJ-1 não é um constituinte dos corpos de
Lewy [154, 155].
A estrutura cristalográfica da proteína foi recentemente descrita por vários grupos
[156-158], confirmando a existência desta proteína como um homo-dímero in vitro. Em
contraste, a forma mutada L166P existe como um monómero devido à sua incapacidade
para auto-interagir. Como resultado, esta forma da proteína é muito instável, sendo
rapidamente degradada pelo proteassoma [153, 159, 160]. Assim sendo, a dimerização da
proteína parece ser fundamental para o seu funcionamento normal, sendo que a ausência
desta capacidade resulta na sua degradação, e, consequentemente, perda de função.
Os dados funcionais retirados das formas mutadas L166P e da delecção 14kb,
indicam que o mecanismo através do qual esta proteína está envolvida na doença de
Parkinson passa pela sua completa perda de função [161]. Esta proteína tem várias funções
putativas e conhecem-se várias moléculas com as quais ela interage. Sabe-se que restaura a
actividade da transcrição de gene que codifica o receptor de androgénio [162]. Assim
sendo, a proteína DJ-1 parece ter uma função como regulador positivo do receptor de
androgénio e, portanto, de todos os genes sob o seu controlo, os quais são essenciais para o
desenvolvimento e manutenção da função reprodutiva masculina. Das funções atribuídas a
esta proteína, a mais relevante para a doença de Parkinson prende-se com o seu papel na
neuroprotecção. Tem sido demonstrado que células que não expressem DJ-1 são muito
mais sensíveis à agressão oxidativa, nomeadamente ao stresse oxidativo induzido por
peróxido de hidrogénio. Situação esta que pode ser revertida pela expressão de DJ-1 wild-
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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type, mas não da sua forma mutada L166P [163]. Estes resultados, em conjunto com
aqueles que descrevem um aumento da expressão desta proteína em resposta à agressão
com peróxido de hidrogénio, sugerem que uma acção da DJ-1 é eliminar peróxido de
hidrogénio, funcionando como um potente antioxidante. A perda de DJ-1 pode, portanto,
resultar num aumento do dano atribuído aos radicais livres, produzidos como um produto
secundário do metabolismo da dopamina [164, 165].
Desde a descrição inicial de mutações no gene DJ-1, vários grupos tentaram
encontrar mutações nas suas séries de doentes de Parkinson. Todos estes estudos se
caracterizaram por encontrar uma muito baixa quantidade de mutações, embora tenham
sido feitas análises de sequência muito completas, incluindo regiões promotoras e regiões
de splice, e mesmo análises de dosagem génica. Para além da mutação L166P encontrada
na família Italiana, foi encontrada outra mutação homozigótica, M26I, descrita num
indivíduo de origem judaica com idade de início precoce [166]; o mesmo estudo relata a
existência de uma mutação missense heterozigótica D149A num indivíduo de origem
africana, também com idade de início precoce. O efeito funcional destas mutações não é
ainda conhecido. Embora a mutação M26I ocorra numa alfa-hélice da proteína, que está
envolvida na interface de dimerização, esta não altera a estrutura terciária da DJ-1 como
acontece com a mutação L166P [159].
Para além destas mutações, verificou-se a inexistência de mutações no gene DJ-1
numa série de 190 indivíduos com doença de Parkinson esporádica, o que indica que
mutações neste gene são responsáveis por uma pequena minoria dos casos esporádicos
[161].
Em 2003 Hague e colaboradores identificaram um indivíduo heterozigótico
composto, com duas novas mutações, e um indivíduo heterozigótico para uma nova
mutação numa série de doentes hispânicos com início precoce da doença [167].
No ano seguinte, Hedrich e colaboradores realizaram um estudo com 100 indivíduos
de origem europeia e idade de início precoce, para determinar a presença de mutações e
rearranjos no gene DJ-1, por uma combinação de HPLC desnaturante e PCR em tempo-
real. Encontraram duas delecções heterozigóticas: uma grande delecção contendo três
exões do gene (Ex5-7) que se prevê que afecte de forma severa a transcrição, e uma
pequena delecção de onze pares de base no intrão cinco, que se prevê que remova um local
de splice, resultando num produto de transcrição anormal [168]. Dois outros estudos foram
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 36 -
publicados nos quais não são encontradas quaisquer mutações neste gene em indivíduos
com forma familiar autossómica recessiva da doença [169, 170].
O fenótipo clínico dos doentes afectados com mutações no gene DJ-1 é em tudo
semelhante àquele descrito dos doentes com mutações na parkina. A idade de início
encontra-se na terceira década de vida, boa resposta à terapêutica com L-dopa e uma
progressão da doença lenta [161].
Mutações no gene DJ-1 são uma causa rara de parkinsonismo. Até à data foram
publicados resultados de um total de 442 indivíduos com início precoce da doença, dando
origem a um total de uma mutação homozigótica, um indivíduo heterozigótico composto, e
três heterozigóticos sem segunda mutação encontrada. A frequência de mutações neste
gene pode ser estimada em cerca de 1-2% em indivíduos com início precoce. Não existe
qualquer descrição de mutações em indivíduos com início tardio, ou com formas mais
idiopáticas da doença. Embora não sejam conhecidos os mecanismos da patogénese deste
gene, não restam dúvidas que a sua participação se dá por perda de função, com a maioria
das mutações encontradas a causarem proteínas incompletas, seja por alteração dos locais
de splice, seja por delecções.
Os resultados sugerindo que a proteína DJ-1 pode proteger células do stresse
oxidativo, funcionando como um destruidor de espécies reactivas de oxigénio livres, são
muito interessantes, uma vez que, há várias décadas que o stresse oxidativo tem sido
apontado como causa primária para a doença de Parkinson.
A baixa frequência de mutações neste gene em indivíduos com doença de Parkinson
sugere que estas não devem ser consideradas como marcadores de factor de risco para o
desenvolvimento desta doença [171, 172].
PINK1
Recentemente foi identificado o gene localizado no locus PARK6 responsável pela
doença de Parkinson associada a este local. Mutações neste gene, denominado PINK1
(PTEN Induced Kinase-1), foram descritas como sendo causadoras de doença em várias
famílias com formas recessivas e de início precoce [173]. O gene PINK1 codifica uma
proteína, com o mesmo nome, com 581 aminoácidos que possui dois domínios já
determinados: um domínio de ligação mitocondrial e um domínio de proteína cinase com
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 37 -
grande homologia com as cinases serina/treonina. Foi sugerido que formas mutadas desta
proteína poderiam danificar os neurónios por apoptose induzida por stresse e disfunção
mitocondrial [173].
A função das proteínas cinase é fosforilar proteínas alvo, que depois realizam
importantes funções celulares como, por exemplo, transdução de sinal. Tanto a forma
normal da proteína como as formas mutadas se localizam na mitocôndria, o que está de
acordo com o domínio de ligação mitocondrial apresentado pela proteína [174]. Em cultura
celular a forma wild-type da proteína parece proteger as células do stresse induzido pela
disfunção mitocondrial, assim como da apoptose induzida por stresse, um fenómeno que é
abolido com a transfecção de formas mutadas do gene PINK1 [173]. Desta forma, o gene
PINK1 estabelece uma relação molecular directa entre a mitocôndria e a doença de
Parkinson, uma relação de que se suspeitava há algum tempo [175, 176].
Uma das hipóteses para o funcionamento da proteína é ela fosforilar proteínas-alvo,
ainda não conhecidas, na mitocôndria como resposta a situações de stresse celular,
protegendo, desta forma, contra a disfunção mitocondrial.
As mutações no gene PINK1 foram inicialmente descritas em três famílias de origem
Italiana e Espanhola. Até à data, foram descritas mais de nove famílias adicionais de
origem Europeia e Asiática [177-179].
Até agora todas as mutações descritas no gene PINK1 são mutações pontuais,
sinónimas ou missense, não há qualquer descrição de rearranjos no gene [179].
Tendo por base os trabalhos publicados até agora, as características clínicas do
parkinsonismo associado a mutações no gene PINK1, parecem ser semelhantes àquelas
apresentadas pelos doentes com mutações no gene da parkina, com uma idade de início
perto dos 30 anos de idade, uma progressão lenta da doença e boa resposta à terapia com
levodopa, embora também estejam descritos alguns casos com um início precoce de
distonia, o que parece ser discrepante com os dados dos doentes com mutações na parkina
ou DJ-1 [174].
Tendo por base os poucos estudos de prevalência realizados até agora, parece que a
prevalência de mutações no gene PINK1 é inferior à prevalência das mutações no gene da
parkina [179, 180].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 38 -
UCH-L1
A proteína Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) pertence a uma
família de enzimas, que têm como função remover moléculas de ubiquitina. Há três
funções que foram atribuídas à UCH-L1: actividade de hidrolase ao reciclar ubiquitina de
cadeias de poliubiquitina, para formar monómeros após a degradação proteica no
proteassoma; actividade de ubiquitina ligase; papel na regulação da degradação de
monómeros de ubiquitina, pelo processo de degradação lisossomal [181].
No ano de 1998 Leroy e colaboradores, adoptando a metodologia do gene candidato
sequenciaram o gene UCH-L1 em 73 indivíduos com história familiar de doença de
Parkinson, tendo encontrado numa família uma mutação heterozigótica no exão 4 do gene
[182]. Esta mutação resulta na substituição de um resíduo muito conservado de isoleucina
por uma metionina na posição 93 (I93M). A família portadora desta mutação era de origem
alemã, e consistia de dois irmãos, ambos com doença de Parkinson. A mutação era
concordante com a doença nestes indivíduos, embora não tivesse sido possível estudar
qualquer outro membro da família [182]. As características clínicas apresentadas por estes
indivíduos eram idênticas às características da doença de Parkinson idiopática. O primeiro
sintoma foi tremor, tendo, ambos os indivíduos, desenvolvido acinésia, rigidez e
instabilidade postural e demonstrado uma boa resposta ao tratamento com levodopa. A
idade de início era, no entanto, inferior àquela da doença de Parkinson idiopática (49-51
anos de idade).
A razão para a escolha deste gene, ao contrário da selecção habitual por estudos de
linkage, foi principalmente porque está descrito que a proteína está presente nos corpos de
Lewy, tal como a alfa-sinucleína, e porque, tal como a parkina, a UCH-L1 faz parte do
processo de degradação proteica pelo proteassoma [182]. Se a mutação I93M é de facto
uma mutação patogénica, não é ainda conhecido, embora o facto de não ter sido encontrada
em cerca de 1340 doentes de Parkinson e 726 controlos, diminua a possibilidade de poder
ser um polimorfismo, mesmo que raro [183-185].
Estudos recentes têm sugerido mecanismos que possam explicar a patogenicidade
desta mutação. Nishikawa e colaboradoes demonstraram que a mutação I93M resulta numa
proteína com uma estrutura secundária diferente, com uma diminuição do seu conteúdo em
alfa-hélice [186]. Esta alteração de estrutura poderia conferir a tendência para a proteína
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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mutada agregar nos neurónios, no entanto são claramente necessários mais estudos nesta
área [186].
Outro estudo realizado recentemente revelou que esta proteína sofre modificações
oxidativas, mais concretamente, há cinco resíduos de metionina que são oxidados; é por
isso tentador pensar que a mutação I93M confere uma maior susceptibilidade ao stresse
oxidativo [187]. No entanto, este trabalho não clarifica qual o efeito que a oxidação tem na
função da proteína.
No ano de 2003 Osaka e colaboradores demonstraram que a UCH-L1 está envolvida
na regulação da degradação de monómeros de ubiquitina. No entanto, a mutação I93M não
afecta esta função, sugerindo que este mecanismo não media o mecanismo de onset da
doença [181].
Ao realizar o screening de mutações no gene UCH-L1, Maraganore e colaboradores
identificaram outra mutação não sinónima que se encontrava sub-representada numa série
de doentes de Parkinson de origem europeia, indicando por isso um efeito protector [183].
Em particular foi observado que os portadores desta mutação têm um risco
significativamente mais baixo de desenvolver a doença, e que o efeito protector exercido
pela mutação é dependente da dose. No entanto, desde esta observação inicial, tem havido
alguma controvérsia quanto a este resultado. No total, cinco trabalhos publicados
encontraram uma associação [183, 184, 188-190], enquanto outros seis não encontraram
qualquer associação entre esta mutação e a doença [188, 191-195].
Se qualquer uma ou ambas destas mutações e mecanismos se provarem estar
biologicamente correctos, então o gene UCH-L1, que codifica uma enzima
estrategicamente localizada no centro do processo de degradação pelo proteassoma, com
risco para a doença determinado geneticamente, será sem dúvida um alvo muito apetecível
para estratégias de tratamento e de modificação da doença no futuro [196].
LRRK2 (Dardarina)
Em 2002 por análise de linkage numa família com doença de Parkinson de origem
japonesa, foi determinada a localização do mais recente gene associado a esta doença. Os
autores deste trabalho identificaram o locus PARK-8 como se situando no cromossoma
12p11.2-q13.1 [197]. Nesta família o haplótipo associado à doença era partilhado por todos
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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os quinze membros afectados, assim como por oito membros não afectados, o que sugeriu
uma reduzida penetrância deste gene. Possivelmente existindo facores ambientais ou
outros factores genéticos envolvidos no desenvolvimento desta forma da doença [197].
Em Novembro de 2004 dois trabalhos publicados, simultaneamente, na revista
Neuron forneceram outras evidências quanto à forma da doença associada ao locus PARK-
8. Num dos trabalhos, Zimprich e colaboradores encontraram seis mutações patogénicas
num gene pertencente à família de proteínas ROCO com um domínio cinase do tipo
MAPKKK, ao qual deram o nome de Leucine Repeat Rich Kinase-2 (lrrk2) [198]. Embora
não se conheça ainda a função concreta desta proteína, os autores colocaram a hipótese de
esta fosforilar alvos como a alfa-sinucleína ou a proteína tau, podendo assim a actividade
cinase da lrrk2 ser um evento chave na agregação e deposição destas proteínas nos
neurónios degenerados [198].
No mesmo número da revista foi publicado o trabalho de Páisan-Ruíz e
colaboradores com resultados idênticos aos já referidos [199]. Foram encontradas
mutações patogénicas numa série de doentes de origem basca e britânica, todos com
características clínicas muito semelhantes. A idade de início de todos os doentes é de cerca
de 65 anos de idade, com uma evolução lenta e benigna da doença, e uma excelente
resposta à terapia com levodopa, apresentando também a maioria dos doentes tremor
unilateral e a ausência de defeito cognitivo. Para além da identificação do gene os autores
relataram também a identificação desta proteína, que denominaram dardarin (derivada da
palavra basca para tremor dardara) em vários tecidos, incluindo no cérebro [199], o que
facilita a compreensão de um eventual papel no processo neurodegenerativo.
Nesta altura vários estudos estão a ser realizados, com o objectivo de verificar se
mutações neste gene são uma causa frequente de doença de Parkinson.
Dos estudos produzidos até agora, verifica-se a preponderância de uma mutação em
particular (G2019S) nos indivíduos estudados. Esta mutação não só existe numa região
muito conservada ao longo do desenvolvimento, como faz parte de um conjunto de
tripletos existente absolutamente necessários para o funcionamento de todas as proteínas
cinases humanas [200].
Os resultados obtidos para esta mutação indicam uma prevalência bastante alta, tanto
em indivíduos com história familiar da doença, com cerca de 5 a 6,6% [200, 201], como
em indivíduos com forma esporádica, 1,6 a 6% [202, 203]. Indicando, desta forma, que
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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esta mutação é, de facto, um evento comum em doentes de Parkinson e que o gene lrrk2 e
consequentemente a proteína dardarin devem ser estudados, não só do ponto de vista de
método auxiliar de diagnóstico, mas também com o intuito de identificar novas formas
terapêuticas.
Stresse Oxidativo
Conceito de Stresse Oxidativo e Espécies Reactivas de Oxigénio
De uma forma muito genérica o stresse oxidativo está descrito como a desregulação
do equilíbrio entre a produção e a eliminação de Espécies reactivas de Oxigénio (ROS) e
Espécies Reactivas de Nitrogénio (RNS). Assim, o stresse oxidativo refere-se a um estado
no qual os radicais livres e os seus produtos se encontram em excesso quando comparados
com os níveis de defesas antioxidantes. Este desequilíbrio pode ocorrer como resultado do
aumento da produção de radicais livres ou da diminuição das defesas antioxidantes [204].
Os radicais livres definem-se como qualquer átomo ou molécula que possui um ou
mais electrões desemparelhados na sua orbital mais externa. Alguns são produtos normais
do metabolismo celular, sendo que as espécies radicalares celulares predominantes são o
anião superóxido (O2•−) e o radical hidroxilo (OH•). Outras moléculas tais como o peróxido
de hidrogénio (H2O2), apesar de não serem radicais livres, podem levar à formação destas
espécies através de várias reacções químicas [205]. Assim, a redução do oxigénio
molecular a água é a maior fonte de radicais, sendo esta produção proporcional ao
consumo de oxigénio. A etapa inicial nesta reacção envolve o radical superóxido o qual
produz peróxido de hidrogénio por adição de um electrão. A redução do peróxido de
hidrogénio leva à formação do radical hidroxilo altamente reactivo. No seu conjunto, estas
moléculas são denominadas espécies reactivas de oxigénio (ROS), que enquadram o
significado das suas capacidades de conduzir a alterações oxidativas a nível da célula
[206]. Para além destas, várias moléculas reactivas de nitrogénio, óxido nítrico (NO•) e
peroxinitrito (ONOO−) são também importantes moduladores do stresse oxidativo. O
peroxinitrito formado pela reacção do óxido nítrico com o superóxido é uma molécula
altamente reactiva que também se quebra para dar origem a OH• [207].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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O stresse oxidativo pode causar dano celular e as ROS oxidam componentes
celulares críticos como lípidos, proteínas e ácidos nucleicos alterando a sua estrutura e
função, induzindo apoptose ou necrose [208].
Vários factores contribuem para uma maior susceptibilidade do cérebro ao stresse
oxidativo. O tecido cerebral possui um elevado conteúdo em ácidos gordos
poliinsaturados, para além disso tem uma taxa de consumo de oxigénio extremamente
elevada e por último não possui defesas antioxidantes fortes [209, 210].
Defesas anti-oxidantes enzimáticas e não-enzimáticas
Com o objectivo de evitar os danos causados pelas ROS, tais como quebras nas
cadeias de DNA, peroxidação lipídica e modificações proteicas, durante a evolução têm
sido desenvolvidos mecanismos que previnem a geração de ROS ou que promovem a sua
eliminação. Por exemplo, a remoção de H2O2 e de anião superóxido previne a formação de
radicais hidroxilo altamente reactivos e citotóxicos [211].
Existe um grande número de compostos anti-oxidantes, mas apenas alguns foram
formalmente estudados em ensaios clínicos. A eficácia destes agentes pode ser melhorada
pela administração combinada com outros anti-oxidantes ou fármacos com efeitos
neuroprotectores diferentes. Por exemplo, a vitamina C pode ajudar à reposição de
vitamina E, logo estas duas vitaminas anti-oxidantes devem ser co-administradas [205].
Defesas anti-oxidantes enzimáticas
Ciclo do glutatião
O glutatião (GSH) tem funções de antioxidante, é um transporte e uma forma de
armazenamento de cisteína, é um parceiro de reacção para a destoxificação xenobiótica e é
um cofactor em reacções de isomerização.
O sistema do glutatião é especialmente importante na defesa celular contra ROS. O
GSH reage directamente com os radicais em reacções não enzimáticas e é o dador de
electrões nas reduções de peróxidos catalizadas pela glutatião peroxidase (GlPx). O
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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produto da oxidação do GSH é o glutatião dissulfido (GSSG). O GSH é regenerado a partir
do GSSG dentro das células numa reacção catalizada pela flavoenzima glutatião redutase
(GR). Esta enzima regenera o GSH através da transferência de equivalentes de redução do
NADPH para o GSSG [212].
Durante as reacções catalisadas pela GlPx e pela GR, o glutatião reduzido é
regenerado. Pelo contrário, o GSH é consumido durante a geração de glutatião-S-
conjugados pela glutatião-S-transferase ou pela libertação de glutatião das células. Ambos
os processos fazem baixar os níveis de glutatião total intracelular. Logo, para ser mantida a
concentração intracelular de GSH, o GSH consumido tem de ser reposto por síntese a
partir dos seus aminoácidos constituintes [211].
Superóxido Dismutase (SOD)
Outro mecanismo de defesa antioxidante envolve a enzima superóxido dismutase
(SOD). Esta transforma o ião superóxido, um radical livre extremamente reactivo, em
H2O2 e O2. Embora através desta reacção seja formado peróxido de hidrogénio, este é
menos citotóxico que o anião superóxido.
Existem três isoformas da SOD identificadas em mamíferos que são caracterizadas
pelo ião metálico do seu grupo prostético e pela sua localização celular. A isoenzima
expressa mais ubiquamente contém cobre e zinco (CuZnSOD ou SOD1) e é um dímero
que contém 153 aminoácidos existente no compartimento intracelular.
A isoforma indutível da SOD que contém manganésio (Mn-SOD ou SOD2) localiza-
se na mitocôndria e possui 24 kD.
A terceira isoforma possui como grupos prostéticos átomos de cobre e zinco (SOD3)
e localiza-se no compartimento extracelular.
As SOD1 e 2 estão distribuídas de formas diferentes nas células neuronais e gliais. A
SOD1 está localizada maioritariamente nos astrócitos em todo o sistema nervoso central
(SNC), mas também é detectável, em menor quantidade, em neurónios. Por outro lado, a
SOD2 localiza-se predominantemente nos neurónios cerebrais e na espinhal medula [213].
A imunoreactividade de ambas as enzimas é extremamente baixa, em condições
fisiológicas normais, nas células da microglia, oligodendrócitos e células endoteliais, o que
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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pode explicar o facto da oligodendroglia ser particularmente vulnerável ao stresse
oxidativo [214].
Ao contrário dos neurónios, os astrócitos conseguem aumentar a expressão da
glutatião peroxidase combatendo assim o dano oxidativo [215].
Estudos da actividade da SOD têm obtido resultados contraditórios. Por outro lado a
imuno-reactividade da SOD1 e da SOD2, assim como da catalase está aumentada nas
regiões de tranças neurofibrilares e placas senis [216, 217].
Catalase
A enzima catalase é outro dos componentes do mecanismo de defesa antioxidante.
Esta enzima decompõe peróxido de hidrogénio em água e oxigénio, complementando desta
forma a acção antioxidante da SOD.
É constituída por quatro sub-unidades, cada uma delas com um grupo heme no local
activo, que catalisa a reacção:
2H2O2 2H2O + O2
Compartimentada nos peroxissomas, existe em grande quantidade no fígado e
glóbulos vermelhos, mas o cérebro, coração e músculo-esquelético mostram baixa
actividade de catalase [218].
Defesas anti-oxidantes não enzimáticas
Vitamina A
A vitamina A (retinol) é um anti-oxidante lipossolúvel derivado de carotenóides
obtidos através da dieta. Em 1989, Jeandel et al. [219] descobriram que a concentração
desta vitamina no soro se encontrava abaixo dos níveis normais em doentes de Alzheimer.
Da mesma forma, outros investigadores descreveram resultados semelhantes [220, 221].
Vitamina E (α-tocoferol)
A vitamina E é um anti-oxidante lipossolúvel que se incorpora na região hidrofóbica
das biomembranas e, por cedência de átomos de hidrogénio, interrompe reacções de
Catalase
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 45 -
peroxidação lipídica, protege os neurónios da toxicidade da β-amiloide e capta radicais
livres [222, 223].
Existem algumas evidências que apontam no sentido do metabolismo da Vitamina E
se encontrar alterado em doentes de Alzheimer. No mesmo estudo anteriormente referido
[219], foram descritas concentrações séricas diminuídas de vitamina E em doentes de
Alzheimer quando comparados com indivíduos saudáveis.
Vitamina C (ácido ascórbico)
A vitamina C é um anti-oxidante hidrossolúvel, importante no processo de
regeneração da forma activa da vitamina E [224]. Para além disso, participa na remoção de
espécies reactivas como O2•−, OH• e hidroperóxidos lipídicos. Pode ainda estabilizar as
catecolaminas, impedindo a formação de ROS [225].
Ácido úrico
O ácido úrico é um produto final do metabolismo das purinas que se encontra a nível
do plasma e remove, quando em concentrações fisiológicas, radicais superóxido e
hidroxilo, reduzindo também a formação de peroxinitrito [226].
Doença de Parkinson e Stresse Oxidativo
A ocorrência de stresse oxidativo na doença de Parkinson é evidenciada por estudos
post-mortem, mas também por estudos que demonstraram a capacidade do stresse
oxidativo induzir morte celular nas células da sunstância nigra [227]. Há evidências de que
existem elevados níveis de stresse oxidativo em condições basais na substância nigra no
cérebro normal, e que estes níveis estão ainda mais elevados em indivíduos com doença de
Parkinson [228]. Para além disso, o tratamento com L-dopa pode aumentar a carga
oxidativa e desempenhar um papel na progressão da doença [229, 230]. A degradação da
dopamina pela enzima monoamino oxidase leva à produção de peróxido de hidrogénio, o
que sugere um mecanismo pelo qual pode surgir stresse oxidativo [231]. A produção de
peróxido de hidrogénio leva a um aumento da formação de glutatião oxidado, sugerindo a
diminuição da capacidade protectora do maior sistema antioxidante biológico [232].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 46 -
O aumento da degradação da dopamina pode gerar um excesso de peróxido de
hidrogénio e, subsequentemente, formação do radical hidroxilo, conduzindo à morte da
célula dopaminérgica [233]. Sabe-se que a actividade da MAO aumenta com a idade,
expondo desta forma, as células a lesões devido apenas ao normal envelhecimento dos
indivíduos [234].
As células da SN, e o Sistema Nervoso Central (SNC) de um modo geral, são muito
sensíveis ao stresse oxidativo. Uma das razões para esta sensibilidade prende-se com o seu
elevado consumo de O2: em humanos o cérebro representa uma pequena percentagem do
peso corporal, mas processa mais de 20% do consumo de O2. Este oxigénio é utilizado
pelos neurónios para, através da mitocôndria, produzirem ATP. Em condições fisiológicas
normais, cerca de 1-2% do O2 consumido pelas células é convertido em espécies reactivas
de oxigénio (ROS) [235].
Outra das razões deve-se à produção de monóxido de azoto (-NO) e a espécies
reactivas de nitrogénio (RNS). O radical livre -NO é um mensageiro biológico altamente
difusível que desempenha um papel fundamental na fisiologia do CNS. Existem três
isoformas responsáveis pela produção de -NO: NO sintetase neuronal (nNOS), NO
sintetase indutível (iNOS) e NO sintetase endotelial (eNOS). A isoforma responsável pela
maioria da actividade do NO no CNS é a nNOS. O NO, na presença de anião superóxido
(O.-2), uma espécie reactiva de oxigénio que se forma na mitocôndria, durante a respiração
celular, leva à formação de ONOO.-, uma espécie radicalar com elevada citotoxicidade
[236].
A degradação enzimática da dopamina, através da enzima monoamino oxidase que
leva à produção de peróxido de hidrogénio, explica até certo ponto os elevados níveis
basais de stresse oxidativo na SN [237].
Na doença de Parkinson tem sido descrito um deficit do complexo I da cadeia
respiratória mitocondrial, o que conduz à disfunção e aumento da produção de espécies
reactivas de oxigénio pela mitocôndria [238].
Este defeito foi observado a nível do tecido cerebral colhido em autópsia de doentes
de Parkinson e em plaquetas isoladas de sangue periférico de doentes. Estes factos vieram
reforçar a procura de marcadores periféricos para a doença, que clarifiquem o papel da
mitocôndria na morte neuronal por apoptose.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 47 -
Metabolismo do ferro
Um evento que está de acordo com a existência de stresse oxidativo na doença de
Parkinson é o metabolismo do ferro. Sofic e colaboradores demonstraram existir um
aumento da quantidade de ferro na substância nigra de doentes de Parkinson quando
comparados com controlos [239, 240]. Uma evidência que está de acordo com um papel do
ferro na patogénese desta doença é a possibilidade de, através da reacção de Fenton,
originar ião hidroxilo, ião este que é reactivo. Para além disso, o ferro promove a auto-
oxidação da dopamina, libertando peróxido de hidrogénio [241]. Adicionalmente, o ferro
promove a conversão do excesso de dopamina em neuromelanina, um pigmento insolúvel
que se acumula nos neurónios dopaminérgicos com o avançar da idade [18]. De uma forma
geral, a neuromelanina funciona como um factor protector, sequestrando espécies reactivas
no interior da célula, no entanto, uma vez ligada ao ferro torna-se pró-oxidante.
Um neurónio típico da substância nigra de um indivíduo com doença de Parkinson
contém dopamina, neuromelanina, elevados níveis de ferro e baixos níveis de GSH, sendo
assim um bom ambiente para a formação de espécies reactivas de oxigénio. Assim sendo, o
stresse oxidativo existente na doença de Parkinson é provavelmente consequência da
produção de peróxido de hidrogénio devido a uma combinação de factores, como a
oxidação da dopamina, depleção de GSH e ião Fe3+ gerado pela neuromelanina [242]. Esta
hipótese é fortalecida pela observação de que os neurónios pigmentados (devido à presença
de neuromelanina) são preferencialmente perdidos no decurso da doença de Parkinson
[243].
A hemocromatose é uma doença hereditária caracterizada pela acumulação de ferro.
A maioria dos casos deve-se a duas mutações no gene HFE [244]. A mutação C282Y é
altamente penetrante e leva ao sequestro intracelular de ferro [245]. A mutação H63D é
menos penetrante e é considerada um factor de risco para a hemocromatose [246]. Em
indivíduos com hemocromatose têm sido observadas características clínicas de
parkinsonismo, para além dos depósitos de ferro nos gânglios basais [247]. Desta forma, o
seu papel no metabolismo do ferro torna o gene HFE num gene candidato para a doença de
Parkinson. Resultados de vários estudos realizados, sobre a influência das mutações neste
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 48 -
gene com esta doença, variam desde um papel protector da heterozigotia C282Y [248] até
à ausência de qualquer efeito de qualquer uma das mutações [249].
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 49 -
Objectivos do estudo
Apesar da intensa investigação a que os factores genéticos da doença de Parkinson
têm sido sujeitos nos anos mais recentes, existem ainda algumas dúvidas no que diz
respeito ao papel da genética na etiologia da doença de Parkinson idiopática. Embora se
conheçam alguns genes associados com a doença nalgumas famílias e indivíduos com
formas esporádicas, não existem estudos de qualquer destes genes na população
portuguesa. A existência de stresse oxidativo na doença de Parkinson tem sido apontada
como um dos eventos iniciadores da doença. Neste trabalho pretendemos determinar se
existem diferenças em marcadores biológicos de stresse oxidativo entre doentes e um
grupo de indivíduos controlo. Para além disso, pretendemos verificar se polimorfismos em
enzimas associadas com estes mecanismos podem ser associadas a um maior ou menor
risco de desenvolvimento da doença. Uma vez que o metabolismo do ferro tem sido
associado com o aumento de processos de stresse oxidativo na doença de Parkinson,
pretendemos determinar se mutações no gene HFE podem ser consideradas como factor de
risco para o início da doença de Parkinson.
Objectivos específicos
1) Determinar a existência de mutações patogénicas nos genes alfa-sinucleína, parkina
e PINK1, associados a doença de Parkinson numa amostra representativa da
população portuguesa;
2) Determinar se polimorfismos nas enzimas NOS e GST, associadas aos mecanismos
de stresse oxidativo, conferem risco aumentado ou reduzido para o
desenvolvimento desta doença;
3) Determinar se mutações no gene da hemocromatose (HFE) podem ser consideradas
como factor de risco para a doença de Parkinson;
4) Determinar se os doentes de Parkinson apresentam marcadores de stresse oxidativo
periféricos alterados, em comparação com indivíduos controlo.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 50 -
Materiais e Métodos
População em estudo
Mecanismos Genéticos
A selecção e caracterização clínica dos indivíduos participantes neste estudo foram
feitas no Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (H.U.C.) por
parte da equipa médica desde Junho de 2002 a Dezembro de 2004. Todos os indivíduos
seleccionados pertencem à população da região centro de Portugal abrangida pela consulta
de doenças do movimento dos H.U.C.. Os indivíduos em estudo foram seleccionados de
forma consecutiva durante este período de tempo e não houve por parte da equipa médica
qualquer outro parâmetro de inclusão.
Os indivíduos com sinais secundários de parkinsonismo ou características atípicas,
tais como demência na fase inicial da doença, sinais piramidais ou cerebelosos foram
excluídos do estudo.
O grupo controlo é também constituído por indivíduos da região centro de Portugal.
É uma amostra aleatória de indivíduos com idades semelhantes às do grupo em estudo.
Todos os indivíduos pertencentes a este grupo foram sujeitos a observação por parte do
médico especialista, que excluiu qualquer forma de doença neurodegenerativa.
O estudo foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética dos Hospitais da
Universidade de Coimbra. Todos os participantes tomaram conhecimento do estudo e da
importância dos resultados esperados e assinaram um consentimento informado. Sendo
este estudo de cariz genético, foi mantido o sigilo de todos os dados respeitantes aos
participantes.
Devido à natureza do estudo e concretamente à sua componente genética, foi
determinado que o grupo em estudo seria subdividido num grupo de indivíduos
esporádicos e num grupo de indivíduos com história familiar. Como critério para inclusão
no grupo de indivíduos com história familiar, foi considerada a presença de doença em
pelo menos um familiar em 1º ou 2º grau.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 51 -
Sempre que possível foram observados no serviço pela equipa médica todos os
familiares afectados, como forma de confirmação da presença de Doença de Parkinson ou
exclusão por qualquer outra forma de fenótipo.
Foi diagnosticada Doença de Parkinson (DP) em 128 indivíduos, no período em que
decorreu este trabalho, os quais foram incluídos no estudo. Do grupo de 128 doentes, 28
indivíduos possuíam história familiar positiva para DP e foram colocados num subgrupo
para estudo genético mais detalhado. Foram recolhidas amostras para estudo genético
durante este período a 126 indivíduos saudáveis, com idades semelhantes aos indivíduos
em estudo constituindo assim o grupo controlo.
O grupo de doentes de Parkinson para o estudo genético é constituído por 61
indivíduos do sexo masculino (47,7%) e 67 indivíduos do sexo feminino (52,3%) com uma
média de idades de 66,9±10,4 anos. Neste grupo foram incluídos indivíduos com início
precoce da doença, mas também com início tardio. A média de idades de início da doença
neste grupo é de 56,7±11,9 anos.
Da totalidade de doentes de Parkinson estudados, foram seleccionados dois grupos:
grupo de doentes esporádicos e um grupo de doentes com história familiar positiva. O
grupo de doentes esporádicos é constituído por 100 indivíduos e apresenta uma média de
idades de 67,1±11,2 anos e uma média de idades de início de 57,5±12,6 anos. O grupo de
doentes com história familiar positiva é constituído por 28 indivíduos com uma média de
idades de 65,9±7,8 anos e uma média de idades de início de 54±10 anos.
O grupo de indivíduos controlo, com 126 indivíduos, é constituído por 40 indivíduos
do sexo masculino (31,8%) e 86 indivíduos do sexo feminino (68,2%). A média de idades
neste grupo é de 67,9±14,4 anos. (Tabela III) No que diz respeito a idades, o grupo de
indivíduos com DP não difere estatisticamente do grupo de indivíduos controlo (p=0,549).
Dos indivíduos com forma esporádica da doença, 13 (13%) apresentam demência, 16
(16%) apresentam distonia enquanto 4 (4%) apresentam tremor essencial. No grupo de
indivíduos com forma familiar 2 sujeitos apresentam demência (7,1%), outros 2
apresentam tremor essencial e 11 (39,3%) apresentam distonia (Tabela II).
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 52 -
Tabela II - Características clínicas dos indivíduos com DP estudados.
Características gerais eDP (n=100) fDP (n=28)
Distonia 16 11
Demência 13 2
Tremor essencial 4 2
Número de familiares afectados
1 22
2 4
3 1
+3
1
eDP – doença de Parkinson esporádica; fDP – doença de Parkinson familiar.
Mecanismos de Stresse Oxidativo
A selecção e caracterização clínica dos indivíduos participantes neste estudo foram
feitas no Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (H.U.C.) pela
equipa médica, desde Setembro de 2003 a Janeiro de 2005. Todos os indivíduos
seleccionados pertencem à população da região centro de Portugal abrangida pela consulta
de doenças do movimento dos H.U.C.. Os indivíduos em estudo foram seleccionados de
forma consecutiva durante este período de tempo, não houve por parte da equipa médica
qualquer outro parâmetro de inclusão.
Os indivíduos com sinais secundários de parkinsonismo ou características atípicas,
tais como demência na fase inicial da doença, sinais piramidais ou cerebelosos foram
excluídos do estudo.
O grupo controlo, constituído por indivíduos da região centro de Portugal, contém, na
sua maioria, familiares dos indivíduos afectados que os acompanharam à consulta. Todos
os indivíduos pertencentes a este grupo foram sujeitos a observação pelo neurologista, que
excluiu qualquer forma de alteração neurológica. Foram excluídos todos os familiares em
primeiro grau.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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O estudo foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética dos Hospitais da
Universidade de Coimbra. Todos os participantes tomaram conhecimento do estudo,
importância dos resultados esperados e assinaram um consentimento informado. Foi
mantido o sigilo de todos os dados respeitantes aos participantes.
Durante o período em que decorreu este estudo, foi diagnosticada Doença de
Parkinson em 130 indivíduos os quais foram incluídos no grupo de estudo. Foram
recolhidas amostras para estudo, durante este período, a 54 indivíduos saudáveis, com
idades semelhantes aos indivíduos em estudo constituindo assim o grupo controlo.
Relativamente à idade, o grupo de indivíduos com DP não difere estatisticamente do grupo
de indivíduos controlo (p>0,05).
Tabela III - Características demográficas dos indivíduos com DP e controlos.
Grupo n (% sexo masculino) Idade média ± D. P. (anos) Média Idade Início ± D. P. (anos)
Mecanismos de Stresse Oxidativo
Controlos 48 (29,2%) 62,8±13,5 (sexo masculino)
63,5±15,3 (sexo feminino)
DP 135 (43,7%) 65,9±11,1 (sexo masculino) 56,4±12,1 (sexo masculino)
65,7±11,1 (sexo feminino) 56,4±12,2 (sexo feminino)
Mecanismos Genéticos
Controlos 126 (31,8%) 70,4±12,5 (sexo masculino)
66,7±15,1 (sexo feminino)
DP 128 (47,7%) 67±12,1 (sexo masculino) 58±12 (sexo masculino)
67±8,7 (sexo feminino) 55±12 (sexo feminino)
eDP 100 (49%) 67,1±11 57,7±13
fDP 28 (42,9%) 65,9±7,8 54±10
DP – doença de Parkinson; eDP – doença de Parkinson esporádica; fDP – doença de Parkinson familiar.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Procedimentos no estudo dos Mecanismos Genéticos
Colheita e preparação do material biológico
Para o estudo genético foram colhidos a cada indivíduo 6 ml de sangue por punção
venosa para um tubo com o anticoagulante EDTA. O DNA foi extraído recorrendo a um
kit da marca Roche (DNA Isolation Kit for Mammalian Blood), que se baseia na
destruição das células nucleadas, precipitação proteica e posterior precipitação do DNA
por adição de etanol [250, 251]. Este método permitiu obter cerca de 600 ul de solução de
DNA com concentração entre 700 e 1300 ug/ul e pureza da ordem de 1,8 determinada por
método espectrofotométrico.
Metodologias Utilizadas no Estudo dos Mecanismos Genéticos
A execução do estudo dos mecanismos genéticos associados à DP foi baseada na
utilização de quatro técnicas de biologia molecular.
A técnica provavelmente mais utilizada em qualquer laboratório de biologia
molecular é a reacção em cadeia da polimerase (PCR) que tem como objectivo aumentar o
número de cópias de uma pequena região de DNA que se pretende estudar. Esta reacção
baseia-se na utilização de uma enzima (DNA polimerase) termoestável, que em condições
adequadas tem a capacidade de criar uma nova cadeia de DNA utilizando como “molde”
uma sequência de cadeia simples. Durante a PCR são utilizadas três temperaturas com
diferentes objectivos: inicialmente a reacção é levada a temperaturas da ordem dos 95ºC, a
esta temperatura a dupla cadeia de DNA é desnaturada originando duas sequências de
cadeia simples; a temperatura seguinte ocorre na casa dos 50-65ºC e tem como objectivo
permitir que pequenas sequências oligonucleotídicas (primers), criadas de forma a
flanquear a região pretendida, se liguem ao DNA original; a terceira temperatura ocorre a
cerca de 72ºC e tem como objectivo permitir que a DNA polimerase tenha actividade
máxima criando uma nova cadeia de DNA utilizando como sequência inicializadora os
primers que se ligaram anteriormente. Cada reacção de PCR contém para além do DNA
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 55 -
alvo, DNA polimerase, com o seu respectivo tampão, um par de primers que flanqueiem a
região pretendida e nucleótidos livres que a polimerase possa utilizar na criação de novas
cadeias de DNA.
Assim, a PCR é realizada por repetição deste ciclo de três temperaturas, permitindo
aumentar exponencialmente o número de cópias de uma pequena região de DNA
previamente determinada.
Outra técnica utilizada que tem por base a PCR é o PCR em Tempo-Real. O princípio
da técnica é o mesmo, sendo a única diferença a possibilidade de saber, em tempo real, se
está a ocorrer amplificação do DNA. A grande vantagem deste método é permitir a
determinação do número de cópias de um determinado gene por comparação com outro
gene conhecido e amplificado em simultâneo.
Esta metodologia permite visualizar, à medida que uma reacção de PCR decorre, a
quantidade de produto amplificado. Para além dos reagentes utilizados numa reacção de
PCR normal, é também adicionada uma sonda, complementar à região delimitada pelos
primers utilizados [252]. Esta sonda possui em cada uma das suas extremidades um grupo
repórter, que tem como objectivo emitir fluorescência, e na outra extremidade um grupo
quencher, que tem como objectivo absorver a fluorescência emitida pelo grupo repórter.
Quando ocorre a fase de extensão da polimerase e esta atinge a região onde se encontra a
sonda, faz uso da sua capacidade exonucleásica, removendo nucleótido a nucleótido toda a
sonda. Quando há a separação da sonda, o grupo repórter fica afastado do grupo quencher,
podendo assim emitir fluorescência e sendo esta detectada pelo aparelho [252].
Figura 5 - Representação esquemática da estrutura de uma sonda utilizada em PCR em tempo-real
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Figura 6 - Representação esquemática da capacidade exonucleásica da enzima utilizada no PCR em tempo-real.
Para determinação da quantidade do gene em estudo, a análise é feita por comparação
com um gene de referência. Normalmente utiliza-se um gene house-keeping que se saiba
que existe em quantidade normal na população.
Cada amostra é estudada, pelo menos, em triplicado de forma a normalizar ao
máximo a quantidade de produto PCR obtido.
A comparação entre os genes é feita com base no ciclo em que se atinge a fase de
amplificação exponencial. Se houver grande quantidade do gene em estudo, e, portanto, de
DNA, esta fase da PCR é atingida mais rapidamente do que se houver menor quantidade de
DNA. Como esta reacção de PCR é uma reacção multiplex, no mesmo tubo, a partir do
mesmo DNA, são amplificados os dois genes (alvo e referência), excluindo assim a
variável de diferentes concentrações de DNA em cada amostra. Desta forma, em cada tubo
em que esteja presente amostra serão amplificados simultaneamente os gene alvo e o gene
referência. A comparação é feita entre os valores destes dois genes obtidos para cada
amostra [253].
Para além dos métodos de normalização já referidos, é também utilizado DNA
controlo. Este DNA possui um número de cópias normal tanto de gene alvo como de
referência. Os valores obtidos para o DNA controlo são também utilizados para a
determinação do número de cópias das amostras em estudo, num método denominado
Delta Delta C(T) [253].
Outra técnica muito utilizada em laboratórios de biologia molecular é a análise por
endonucleases de restrição. Esta técnica ocorre sempre posteriormente a uma reacção de
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 57 -
PCR e baseia-se na utilização de enzimas que reconhecem pequenas sequências de DNA e,
ao reconhecerem-nas, cortam o DNA nesse local específico. Desta forma, qualquer
alteração que modifique uma sequência reconhecida por uma endonuclease de restrição, é
possível de ser estudada por este método. Após esta reacção de digestão, o produto é
separado, por electroforese, num gel de agarose, permitindo desta forma verificar se houve
corte do DNA pela enzima, concluindo assim sobre a sequência em estudo [254].
Assim, é possível distinguir, utilizando uma enzima apropriada, entre a presença de
uma mutação pontual ou a presença da sequência original.
Para a determinação de sequências de DNA foi utilizada a técnica de sequenciação de
ácidos nucleicos, baseada na tecnologia BigDye® Terminator da casa comercial Applied
Biosystems. Esta técnica baseia-se no método de sequenciação descrito por Sanger em
1977 [255]. Inicialmente é realizada uma reacção de PCR de forma a amplificar a região
do DNA pretendida. Após esta reacção e uma subsequente purificação do produto PCR, é
realizada outra amplificação do DNA, utilizando apenas um primer e, desta forma,
amplificando apenas uma das cadeias. Nesta reacção são utilizados, para além de
nucleótidos normais, dideoxinucleótidos que diferem dos anteriores por possuírem no seu
carbono 3’ um átomo de hidrogénio em vez de um grupo hidroxilo. Desta forma, não é
possível adicionar outro nucleótido ao carbono 3’ de um dideoxinucleótido, terminando
assim, nesta posição, a extensão da nova cadeia de DNA. Neste método, os
dideoxinucleótidos são também marcados com um fluorófuro, sendo que cada nucleótido
A, C, G ou T é marcado com um fluorófuro diferente. Após este PCR de sequenciação, os
produtos são separados por electroforese capilar, e, finalmente, excitados por um laser,
emitindo assim fluorescência num comprimento de onda correspondente ao nucleótido em
causa, permitindo desta forma estabelecer a sequência de nucleótidos de um fragmento de
DNA [256].
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Estudo molecular de genes envolvidos na DP
Alfa-sinucleína O gene da alfa-sinucleína foi o primeiro gene a ser relacionado com o processo de
desenvolvimento da DP, tendo sido descritas duas mutações, completamente penetrantes,
em duas famílias. Desta forma, o estudo deste gene reveste-se de grande importância.
Este gene foi estudado por três metodologias diferentes: numa primeira análise foi
realizada a pesquisa das três mutações pontuais previamente descritas na totalidade das
amostras; posteriormente foi feita a pesquisa de novas mutações pontuais nos sete exões do
gene, num grupo de 19 doentes com características e história clínica sugestivas; por final
foi feita uma pesquisa de alteração do número de cópias do gene no mesmo grupo de
indivíduos.
Pesquisa de mutações previamente descritas
Após extracção de DNA genómico, este foi sujeito a PCR utilizando os primers para
os exões 3 e 4 apresentados na Tabela IV.
Tabela IV - Sequências de primers utilizados e tamanhos dos fragmentos esperados no gene da alfa-sinucleína [92].
Primer Sequência Fragmento
esperado
1F GAGAAGGAGGAGGACTAGGACC
2R GTCTCACACTTTGGGGGTTCTC 499pb
3F CGGCGTTCTCCAGGATTTC
3R CACCTACCTACACATACCTCTGAGAG 395pb
4F GATATGTTCTTAGATGCTCAG
4R GCTAATCAGCAATTTAAGGCTAG 216pb
5F CGATGGCTAGTGGAACACG
5R CGGAGGCATTGTGGAGTTTAG 325pb
6F CCCACAGTAAGTATCTTGCTCC
6R GACTGGGCACATTGGAACTGAG 363pb
7F CCACGTAATGAGCATGTAGAGAGC
7R GCTGTCAGTGCTGATGCGTAATTG 189pb
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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De forma breve, cada um dos exões foi amplificado utilizando um programa PCR
com as seguintes características: 92 ºC 2 minutos, 30 ciclos de 92ºC 30 seg., 55ºC 30 seg.,
72ºC 30 seg. e 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. Em cada reacção foram colocados 30
ng DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 10
pmol/ul de cada primer, 2 mM dNTPs e 5U/ul Taq DNA polimerase [92].
Para a pesquisa da primeira mutação descrita no gene da alfa-sinucleína o produto
PCR obtido da amplificação do exão 4 foi sujeito a digestão com enzima de restrição. A
digestão ocorreu durante 3h a uma temperatura de 65ºC com 2U de enzima.
A enzima utilizada foi Tsp 45 I que reconhece especificamente a sequência de DNA
GTGAC. Quando ocorre a mutação G209A, que origina a transição de uma alanina para
uma treonina na posição 53 da sequência aminoacídica, a sequência wild-type GTGGC é
alterada para GTGAC sendo assim reconhecida pela endonuclease de restrição e originando
o corte no DNA [91]. A presença de uma sequência wild-type é caracterizada por um
fragmento com 216 pares de bases, enquanto a presença da mutação é caracterizada por
dois fragmentos com 128 e 88 pares de bases. Os produtos da digestão foram separados por
electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz
ultra-violeta.
A segunda mutação pontual descrita no gene que codifica a alfa-sinucleína consiste
numa transição de G para C na posição 88 traduzindo-se numa alteração de uma alanina
para uma prolina na posição 30 da sequência de aminoácidos.
O produto PCR obtido da amplificação do exão 3 foi sujeito a uma digestão por parte
da enzima Mva I a 60ºC durante 3 horas. Esta enzima reconhece a sequência mutada
cortando o DNA numa posição específica [94]. A presença da mutação origina 2
fragmentos em 136 e 56 pares de base, enquanto a ausência da mutação origina apenas o
fragmento original de 192 pares de base. Os produtos da digestão foram separados por
electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz
ultra-violeta.
A terceira mutação pontual descrita mais recentemente neste gene foi pesquisada de
forma análoga. O produto PCR obtido a partir da amplificação do exão 3 do gene foi
sujeito a digestão pela enzima de restrição Sty I. Esta mutação é caracterizada pela
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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transição de uma guanina para uma adenina na posição 188 que se traduz numa transição
de um ácido glutâmico para uma lisina na posição 46. Esta mutação abole o local de corte
da enzima de restrição [23]. Os produtos da digestão foram separados por electroforese em
gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.
Pesquisa de novas mutações
Para a pesquisa de novas mutações no gene da alfa-sinucleína foi realizada uma
análise de sequenciação de ácidos nucleicos.
Inicialmente foi realizada uma reacção de PCR como descrito anteriormente. A
amplificação e tamanho dos fragmentos foram confirmados recorrendo a uma electroforese
em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.
Após esta confirmação o produto PCR foi purificado de forma a retirar da solução
todos os reagentes da PCR e o DNA não amplificado. Esta purificação foi realizada
utilizando microplacas Millipore Montage® PCRu96. Este procedimento baseia-se numa
separação através de uma membrana, sob vácuo, dos dNTPs não incorporados, primers e
sais contaminantes do DNA alvo.
Após este passo inicial, o produto PCR purificado foi sujeito a PCR de sequenciação.
Em cada reacção PCR apenas uma das cadeias é amplificada e os nucleótidos incorporados
incluem uma marcação fluorescente. Esta reacção foi realizada recorrendo à química
BigDye® Terminator comercializada pela marca ABI. Nesta reacção de PCR para além do
DNA amplificado, foi pipetado um dos primers, correspondente ao exão amplificado,
numa concentração de 3.2 pmol, tampão de sequenciação BigDye® 5X, Mix Terminator
BigDye® e ddH2O [257]. Cada exão foi sequenciado em ambas as direcções, com os
primers descritos na Tabela IV.
Após esta reacção, aos produtos PCR foram retirados todos os nucleótidos não
incorporados utilizando o kit Dye Terminator Removal Kit da marca ABgene.
Os produtos desta reacção foram então separados num ABI 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) e analisados recorrendo ao software
Sequencher (Genecodes VA).
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 61 -
Pesquisa de alterações do número de cópias
A análise do número de cópias do gene da alfa-sinucleína presente em cada indivíduo
foi realizada recorrendo à tecnologia de PCR em Tempo-Real com química TaqMan®. O
gene utilizado neste estudo como gene de referência foi o gene da β-globina. Na realização
deste ensaio foram utilizados 5 ng/ul de DNA, 10 pmol/ul de cada primer (alvo e
referência) 5 pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix TaqMan® contendo enzima,
nucleótidos e co-factores necessários. Os primers utilizados estão descritos na Tabela V.
Esta solução foi colocada num aparelho de PCR em tempo real Applied Biosystems
7900HT e a quantificação absoluta determinada recorrendo ao software SDS 2.1 (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA).
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 62 -
Tabela V - Primers e sondas utilizados para a quantificação absoluta do gene da alfa-sinucleína [258].
Primer Sequência
1F CCTTCAAGCCTTCTGCCTTTC
2R TGAATTTGTTTTTGTAGGCTCCAA
3F AGGACTTTCAAAGGCCAAGGA
3R TCCACTGTCTTCTGGGCTACTG
4F CGAATGGCCACTCCCAGTT
4R GCTTACCTGTTGCCACACCAT
5F AAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGA
5R TCTGCCACACCCTGTTTGGT
6F TGGAACTGAGCACTTGTACAGGAT
6R TCAGCTTGGACTCCTACCTCAGA
7F TCTTTGCTCCCAGTTTCTTGAGA
7R TATGCCTGTGGATCCTGACAAT
BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG
BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA
S1 ACCCTACTGAGCGGA
S3 TGGCTGCTGCACGGA
S4 ACCTTGGAGGGAGTGGT
S5 AGCAGTCCAGACGGGT
S6 AGGCTTATGAAAACGC
S7 TGCTGACAGAACATC
SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC
Parkina
No gene que codifica a proteína parkina foi já encontrada uma enorme variedade de
mutações, estando descritas mais de 50 mutações pontuais, delecções ou multiplicações em
todos os exões [121].
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 63 -
A metodologia de estudo deste gene foi em tudo semelhante à realizada para o gene
da alfa-sinucleína: pesquisar mutações pontuais e alterações do número de cópias dos
exões do gene.
A pesquisa de mutações pontuais foi feita recorrendo ao método de sequenciação de
ácidos nucleicos, como descrito anteriormente.
Foram utilizados os primers descritos na Tabela VI.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 64 -
Tabela VI - Primers utilizados para amplificação dos 12 exões do gene da parkina e tamanhos dos fragmentos esperados [119].
Primer Sequência 5’-3’ Fragmento
esperado
1F GCGCGGCTGGCGCCGCTGTGTACG
1R GCGGCGCAGAGAGGCTGTAC 112pb
2F ATGTTGCTATCACCATTTAAGGG
2R ACATGTCACTTTTGCTTCCCT 308pb
3F AGATTGGCAGCGCAGGCGGCATG
3R AGGCCATGCTCCATGCAGACTGC 427pb
4F ACAAGCTTTTAAAGAGTTTCTTGT
4R ACATGTCTTAAGGAGTACATTT 261pb
5F AGGCAATGTGTTAGTACACA
5R TCTCTAATTTCCTGGCAAACAGTG 227pb
6F AGAGATTGTTTACTGTGGAAACA
6R TGCCTTTCCACACTGACAGGTACT 268pb
7F GAGTGATGCTATTTTTAGATCCT
7R TCTGTTCTTCATTAGCATTAGAGA 239pb
8F TGATAGTCATAACTGTGTGTAAG
8R GGGTGAAATTTGCAGTCAGT 206pb
9F ACTGTCTCATTAGCGTCTATCTT
9R ATTGCCAAATGCAACCTMTGTC 278pb
10F AATATAATCCCAGCCCATGTGCA
10R TTGGAGGAATGAGTAGGGCATT 165pb
11F ACAGGGAACATAAACTCTGATCC
11R GTTTGGGAATGCGTGTTTT 303pb
12F CAACACACCAGGCACCTTCAGA
12R AGAATTAGAAAATGAAGGTAGACA 255pb
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 65 -
Cada um dos exões foi amplificado utilizando 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM
Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2) 2 mM de cada dNTP, 0,3 uM de cada
primer e 0,35 U DNA Taq polimerase numa reacção de 10 ul.
Cada amplificação foi realizada recorrendo ao seguinte programa touchdown-PCR: 1
ciclo de 95ºC 3 min; 20 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 65-58ºC 30 segundos, 72ºC
30 segundos; 20 ciclos de 95ºC 30 segundos, 57ºC 30 segundos, 72 ºC 30 segundos; 1 ciclo
de 72ºC durante 10 minutos. A amplificação e tamanho dos fragmentos foram confirmados
recorrendo a uma electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio
(10mg/ml) e visualizado sob luz ultra-violeta.
O produto da reacção de PCR foi purificado utilizando o processo de purificação em
microplaca Millipore Montage® PCRu96.
Após purificação, os produtos PCR foram sujeitos a PCR de sequenciação,
recorrendo à química BigDye® Terminator. Nesta reacção de PCR para além do DNA
amplificado, foi pipetado um dos primers, correspondente ao exão amplificado, numa
concentração de 3.2pmol, tampão de sequenciação BigDye® 5X, Mix Terminator
BigDye® e ddH2O. Cada exão foi sequenciado em ambas as direcções. O produto desta
reacção foi purificado, retirando todos os nucleótidos não incorporados, utilizando o kit da
marca ABgene: Dye Terminator Removal Kit.
Após esta purificação final, os produtos foram sequenciados num Genetic Analyzer
3100 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), e o resultado analisado com o
auxílio do software Sequencher (GeneCodes, V.A.).
Para a realização do ensaio de dosagem génica foi utilizado o método descrito
anteriormente de PCR em Tempo-Real.
Cada amostra foi realizada em triplicado com 5 ng/ul de DNA sendo amplificado
simultaneamente o gene alvo e o gene de referência. Os primers foram desenhados tendo
por base a sequência publicada (GenBank 4758883) (ver Tabela VII). O gene utilizado
neste estudo como gene de referência foi o gene da β-globina.
Em cada reacção foram utilizadas 10 pmol/ul de cada primer (alvo e referência) 5
pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix TaqMan®. A reacção foi realizada num
aparelho de PCR em tempo real Applied Biosystems 7900HT e a quantificação absoluta
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 66 -
determinada recorrendo ao software SDS 2.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA,
USA).
Tabela VII - Primers e sondas utilizados no ensaio de dosagem génica do gene da parkina.
Primer Sequência
1F CGGCGCAGAGAGGCTGTA 1R CCACCTACCCAGTGACCATGAT 2F CCCAGTGGAGGTCGATTCTG 2R CCCCCTGTCGCTTAGCAA 3F CCCGCCGCGTTTCTG 3R CGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATG 4F TTCTTCTCCAGCAGGTAGATCAATC 4R TTTTCCCGGCTGCACTCTT 5F CCGGATGAGTGGTGAATGC 5R AGAGGAATGAATGTGACCAGGTACT 6F GCACACCCCACCTCTGACA 6R TGCAAGTGATGTTCCGACTATTTG 7F CCGCCACGTGATTTGCTTA 7R CTGCCGATCATTGAGTCTTGTC 8F GCAGCCTTTGAGATGCTCACT 8R AGAGCTCCATCACTTCAGGATTCT 9F GGACACACTCCTCTGCACCAT 9R CAATCTGCTTTTTGGGTTTTGC 10F GGAGACACTCTCTGCAGGTA 10R TGCGGAAAGGAGAAACAAAGG 11F GCTCGGCGGCTCTTTCA 11R ACGCCTTTCCTCTTTGTTTCC 12F CGAACCCACCACACCTTTGT 12R TGCGGACACTTCATGTGCAT BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA S1 CTGGCAGGTACCC S2 ACCAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGGTG S3 TCGTCGCCTCCAGTTG S4 TTTTATGTGTATTGCAAAGGCCCCTGTCA S5 CCACACTGCCCTGGGACTAGTGCA S6 AAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCA S7 CTGTTTCCACTTATACTGTG S8 ACCTGCTCTTCTCC S9 CTGCTGGTACCGGTTG S10 GGAGAAACAAAGGAGG S11 CGACTCTGTAGGCCTG S12 TTCTGCCCCCAACAGGAGGCTG SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 67 -
PINK1
O estudo do gene PINK1 incidiu na pesquisa de mutações pontuais e na procura de
alterações do número de cópias dos exões.
Para a realização da pesquisa de mutações pontuais foi utilizada uma metodologia
idêntica à descrita anteriormente – sequenciação de ácidos nucleicos.
O DNA genómico dos indivíduos foi sujeito a uma reacção de PCR com os primers
descritos na Tabela VIII. Os sete exões do gene foram amplificados utilizando 10 ng de
DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 4 mM de
cada dNTP, 0,2 uM de cada primer e 0,5 U Taq DNA polimerase. Cada amplificação
decorreu de acordo com o seguinte programa PCR: 1 ciclo de 95ºC 2 minutos; 30 ciclos de
95ºC 30 segundos, 60ºC 30 segundos e 72ºC 30 segundos. A confirmação da amplificação
e dos tamanhos dos fragmentos obtidos foi realizada após electroforese num gel de agarose
a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.
Tabela VIII - Sequências nucleotídicas dos primers utilizados para amplificação dos 7 exões do gene PINK1.
Primer Sequência 5’-3’ Fragmento
esperado
1F GCCCCAAGTTTGTTGTGAC
1R CTCCGCTCGGCTTAGGAC 351pb
2F TGTTTCCCTTTTCTTGGGCC
2R TGGGCATTTTGAGAACATCTCC 401pb
3F TCGAAGGTCAGAGCCAATTCTAG
3R ACCAGGTGCTGAGGACATAAGTG303pb
4F TTGTATCTGATGCTGGCCTCAT
4R GCACATGGAGGGCAGGAA 305pb
5F TCGTCGATGTGTGGTAGCCA
5R TCTAGTGCCCCTGGAGAGCTC 251pb
6F GCTATGTCTTGCTGGTGGCTTTA
6R CAAGGCATCGAGTCTCCTGC 301pb
7F GGAAGAATTGGGTTGGGACC
7R CGAGGCCTTTTCCGGCTA 318pb
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 68 -
Os produtos PCR foram purificados recorrendo ao método de purificação em
microplaca Millipore Montage® PCRu96.
Após a purificação o DNA foi sujeito a uma segunda reacção de PCR, desta vez uma
reacção de PCR de sequenciação. Esta reacção foi realizada utilizando a química BigDye®
Terminator. Para cada amostra e para cada direcção (sense a anti-sense) foi utilizado o
DNA amplificado anteriormente, 3.2 pmol do primer correspondente, tampão de
sequenciação BigDye® 5X, Mix BigDye® Terminator e ddH2O. O produto desta reacção
foi purificado, de forma a retirar todos os nucleótidos não incorporados, utilizando o kit da
marca ABgene: Dye Terminator Removal Kit.
Após esta purificação os produtos foram separados num Genetic Analyzer 3100
(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), e o resultado analisado com o auxílio
do software Sequencher (GeneCodes, V.A.).
Para a realização do ensaio de quantificação génica foi utilizado o sistema de
quantificação absoluta por PCR em Tempo-Real.
Cada amostra foi realizada em triplicado com 5 ng/ul de DNA e amplificado
simultaneamente o gene alvo e o gene de referência. O gene utilizado neste estudo como
gene de referência foi o gene da β-globina. Em cada reacção foram utilizados 10 pmol/ul
de cada primer (alvo e referência) 5 pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix
TaqMan® (ver Tabela IX). A reacção foi realizada num aparelho de PCR em tempo real
Applied Biosystems 7900HT e a quantificação absoluta determinada recorrendo ao
software SDS 2.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA).
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 69 -
Tabela IX - Sequências nucleotídicas dos primers e sondas utilizados para os ensaios de dosagem génica do gene PINK1.
Primer Sequência
1F CCATGGTTGGCAAAAAAATATCAG
1R CACTGGTCCTGGGCAAAATC
2F GGACACGAGACGCGTTGCA
2R CCAATGGACTGCCCTATCAGA
3F GGTTCCCTTGTGGGTGTTCCA
3R TCCTGGCTCATTGTGTTCAAGA
4F CCAAGAGAGGTCCCAGCAGC
4R CGGAGAACCCGGATGATGT
5F CTGGAAGGCGTGGACCAT
5R GTTGTCGGATTTCAGGTCTCTGT
6F GCCCCTGGCTGGTGATC
6R CAACTGCAGGCCGCATGCT
7F GCCCTGAAGAATCTGAAGTTAGACA
7R GCGGCCGATTGTTGGA
BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG
BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA
S1 TTCCCTCTCGACTTCT
S2 CTTTCGGCTGGAGGAGT
S3 CCTCCAGCGAAGCC
S4 AGCCCCTCACCCC
S5 TTCAACAGGGCATCGC
S6 AGATTTTGGGCGCTGCT
S7 ATGGTTGGCTGGCTC
SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 70 -
HFE
A pesquisa das duas mutações mais frequentes no gene HFE foi feita em todos os
doentes e no grupo de indivíduos controlo. Foi feito o screening das mutações C282Y e
H63D.
A análise foi realizada por PCR seguido de digestão com enzima de restrição. De
forma breve foram utilizadas reacções de 25 ul com 0,1 ug de DNA, tampão PCR (1,5 mM
MgCl2), 10 mM dNTPs, 25 pmol de cada primer (ver Tabela X) e 0,5 U Taq DNA
polimerase. O programa PCR para a amplificação do fragmento contendo a mutação
C282Y incluiu uma desnaturação a 94ºC durante 10 minutos, 35 ciclos de 94ºC 1 minuto,
62ºC durante 1 minuto, 72ºC 1 minuto, seguidos por 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. O
programa para amplificação do fragmento contendo a mutação H63D utilizou 30 ciclos
com uma temperatura de annealing de 64ºC, sendo idêntico nas restantes temperaturas e
tempos [259]. O produto PCR da amplificação do fragmento contendo a região da mutação
C282Y foi digerido durante a noite com a enzima SnaBI. O produto desta digestão foi
separado por electroforese num gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz ultra-violeta. A presença da mutação cria um novo local de corte para a
endonuclease, resultando em dois fragmentos: 285 e 111 pares de base, a ausência da
mutação dá origem a apenas um fragmento não digerido com 396 pares de base [260]. Para
a detecção da mutação H63D o produto amplificado com 293 pares de base contendo esta
região foi digerido durante a noite com a endonuclease de restrição MboI. A ausência da
mutação origina 3 fragmentos com 138, 99 e 56 pares de base, enquanto a presença da
mutação abole um local de restrição e origina apenas dois fragmentos com 237 e 56 pares
de base. Os produtos da digestão foram separados por electroforese em gel de agarose a
2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta [259].
Tabela X - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas para amplificação dos fragmentos contendo as mutações C282Y e H63D.
Mutação Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’
C282Y ACATGGTTAAGGCCTGTGTG CTTGCTGTGGTTGTGATTTAGG
H63D TGGCAAGGGTAAACAGAAGG CTCAGGCACTCCTCTCATGG
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 71 -
Sintetase do Monóxido de Azoto (NOS)
O estudo do gene da NOS foi feito na totalidade do grupo de doentes e do grupo de
indivíduos controlo. Foram estudados dois polimorfismos no gene da isoforma neuronal
(nNOS) e um polimorfismo no gene da isoforma indutível (iNOS) pela metodologia de
PCR-RFLP.
No gene da iNOS foi estudada uma transição de uma Guanina para uma Adenina na
posição 37498 no exão 22, originando um polimorfismo sinónimo, ou seja, não se traduz
numa alteração de aminoácido. O DNA genómico foi submetido a amplificação do exão 22
do gene por PCR com as seguintes condições: 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM Tris-
HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 4 mM de cada dNTP, 0,2 uM de cada primer
e 0,5 U Taq DNA polimerase. A reacção de PCR decorreu com os seguintes ciclos de
temperatura: 1 ciclo de 95ºC durante 3 minutos; 35 ciclos de 95ºC 1 minuto, 66ºC 30
segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. A confirmação da
amplificação e do tamanho dos fragmentos obtidos foi feita por electroforese em gel de
agarose a 2%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta. Após a
confirmação da amplificação, o restante produto PCR foi digerido com a endonuclease de
restrição BtgI a 37ºC durante a noite. Após a digestão foi realizada nova electroforese de
agarose em condições idênticas às descritas anteriormente. A presença do alelo G origina
três fragmentos com 79, 24 e 23 pares de base, enquanto a presença do alelo A origina
apenas dois fragmentos com 103 e 23 pares de base [261].
No gene da nNOS um dos polimorfismos estudados ocorre no exão 29 sendo
caracterizado pela transição de uma Citosina para uma Timina. O DNA genómico foi
sujeito a PCR para amplificação da região contendo o exão 29, com as seguintes
condições: 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM
MgCl2), 10 mM de cada dNTP, 30 uM de cada primer e 1,5 U Taq DNA polimerase. O
programa PCR utilizado decorreu com as seguintes temperaturas: 1 ciclo de 95ºC durante 5
minutos, 30 ciclos de 95ºC 30 segundos, 68ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de
72ºC durante 10 minutos. Foi confirmada a correcta amplificação do fragmento pretendido
por separação das bandas em gel de electroforese a 2%, corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz ultra-violeta. Após a amplificação, o restante produto PCR foi digerido
durante a noite a 37ºC com a endonuclease de restrição NlaIII. O produto da digestão foi,
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 72 -
então, separado em gel de electroforese a 2%, sendo o alelo C definido por três fragmentos
com 102, 69 e 16 pares de base, enquanto o alelo T é definido pela presença de quatro
fragmentos com 94, 69, 16 e 8 pares de base. A visualização dos fragmentos foi feita sob
luz ultra-violeta [262].
O outro polimorfismo estudado no gene da nNOS ocorre no exão 18 e é caracterizado
por uma transição de uma Citosina para uma Timina. Para a determinação deste
polimorfismo foi desenhado um par de primers (Tabela XI) para amplificar toda a região
do exão 18. 10 ng de DNA genómico foram sujeitos a amplificação por PCR na presença
de tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 2 mM de cada
dNTP, 15 uM de cada primer e 1 U Taq DNA polimerase. A amplificação do fragmento
pretendido foi confirmada por electroforese, de 10 ul do produto PCR, em gel de agarose a
2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta. O restante produto
PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com 0,8U da enzima de restrição DraIII. O
produto desta digestão foi separado por electroforese, sendo o alelo C caracterizado pela
presença de dois fragmentos com 127 e 85 pares de base, enquanto o alelo T é
caracterizado pela presença de apenas um fragmento com 212 pares de base.
Tabela XI - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas para o estudos das isoformas indutível e neuronal do gene da NOS.
Primer Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’
iNOS 22 CTGCTGGCTTCCTGCTTCGG CTCGGGTGTGGTAGGTGTGG
nNOS 29 TTGAGTTTTCCTGCTGCGAACA GCTTGTGCCTAGTTCCTCGT
nNOS 18 AACATTCTGTCATCTCCTACT GAGATCCAGATTACCTTCTT
Glutatião-S-transferase P1 (GSTP1)
No estudo do gene da GSTP1 foram determinados dois polimorfismos, sendo um
deles (Ile105Val) responsável pela alteração da actividade da enzima e da sua
termoestabilidade [263]. O estudo destes polimorfismos foi realizado recorrendo à técnica
de PCR-RFLP.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 73 -
O polimorfismo Ile105Val, resultado de uma transição de uma Adenina para uma
Guanina na posição 313, foi determinado amplificando a região que contém o exão 5.
Foram utilizados 10 ng de DNA genómico na presença de tampão PCR (50 mM Tris-HCL,
14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 20 mM de cada dNTP, 11 uM de cada primer (ver
Tabela XII) e 0,5 U Taq DNA polimerase. A reacção PCR foi realizada recorrendo aos
seguintes ciclos de temperatura: 1 ciclo de 95ºC 5 minutos; 35 ciclos de 95ºC 30 segundos,
58ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. Foram
utilizados 10 ul do produto desta reacção para verificação da correcta amplificação,
utilizando para o efeito uma electroforese em gel de agarose a 2%. Após esta verificação, o
restante produto PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com 1U da enzima Alw26I. A
determinação do genótipo foi realizada separando o produto da digestão por electroforese
em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.
A presença do nucleótido Adenina resulta em dois fragmentos com 329 e 104 pares de
base, enquanto a presença de uma Guanina resulta em três fragmentos com 222, 107 e 104
pares de base.
O outro polimorfismo estudado neste gene foi Ala114Val, resultado de uma transição
de uma Citosina para uma Timina na posição 341, tendo sido determinado amplificando a
região do gene que contém o exão 6. Foram utilizados 10 ng de DNA genómico na
presença de tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 20 mM
de cada dNTP, 11 uM de cada primer (ver Tabela XII) e 0,5 U Taq DNA polimerase. A
reacção PCR foi realizada recorrendo aos seguintes ciclos de temperatura: 1 ciclo de 95ºC
5 minutos; 35 ciclos de 95ºC 30 segundos, 62ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de
72ºC durante 10 minutos. Foram utilizados 10 ul do produto desta reacção para verificação
da correcta amplificação, utilizando para o efeito uma electroforese em gel de agarose a
2%. Após esta verificação, o restante produto PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com
1U da enzima AciI. A determinação do genótipo foi realizada separando o produto da
digestão por electroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz ultra-violeta. A presença do nucleótido C resulta na obtenção de três
fragmentos com 247, 118 e 55 pares de base, enquanto a presença do nucleótido T resulta
em apenas dois fragmentos com 365 e 55 pares de base.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 74 -
Tabela XII - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas no estudo do gene do Glutatião S-transferase.
Primer Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’
Ile105Val GTAGTTTGCCCAAGGTCTTC AGCCACCTGAGGGGTTTC
Ala114Val GGGAGCAAGCAGAGGAGTTA CAGGTTGTAGTCAGCGAAGCTC
Procedimentos no estudo do Stresse Oxidativo
Colheita e preparação do material biológico
Para avaliação dos parâmetros de stresse oxidativo foi colhida uma amostra de 10 ml
de sangue por punção venosa, para um tubo de polipropileno contendo heparina e outra
amostra de 10 ml de sangue venoso para um tubo com ACD 3,8%.
O sangue colhido com heparina foi submetido a uma centrifugação a 1000 rpm, a 4ºC
durante 15 minutos para obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP).
A fracção de eritrócitos (sedimento da centrifugação anterior) foi lavada três vezes
com soro fisiológico (NaCl 0,9%), por centrifugação a 3500 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
O concentrado eritrocitário foi dividido em cinco alíquotas para determinação de
vitamina E, malonildialdeído (MDA), glutatião reduzido e oxidado (GSH e GSSG) e
actividades das enzimas glutatião redutase (Glred) e glutatião peroxidase (Glpx), sendo
estas alíquotas posteriormente congeladas a -70ºC.
O PRP, recolhido em tubo de plástico, foi novamente centrifugado a 1000 rpm
durante 10 min à temperatura ambiente para completa remoção de eritrócitos e leucócitos
residuais e, em seguida, centrifugado a 3000 rpm durante 15 minutos, à temperatura
ambiente para evitar agregação plaquetar. O sobrenadante obtido foi aliquotado e
congelado a -70ºC para a determinação das concentrações plasmáticas de ácido úrico,
proteínas, colesterol total, GSH e GSSG, grupos carbonilo, vitaminas A e E e capacidade
antioxidante total (TAS).
Ao sangue colhido com ACD foi feita uma centrifugação a 900 rpm durante 15
minutos à temperatura ambiente. O plasma rico em plaquetas foi recolhido, adicionaram-se
100 µl de ACD 3,8% por ml de plasma e foi feita nova centrifugação a 900 rpm, durante
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 75 -
15 minutos à temperatura ambiente. O PRP foi novamente recolhido e centrifugado a 2500
rpm, durante 15 minutos à temperatura ambiente, após o que uma amostra de 1 ml de
sobrenadante desta última centrifugação foi submetido a filtração por centrifugação a 9000
rpm, durante 1 hora a 4ºC. O filtrado resultante foi congelado a -70ºC e posteriormente
processado.
O precipitado plaquetar foi lavado duas vezes com ACD diluído ½ e ressuspenderam-
se as plaquetas em 2 ml de ACD na mesma diluição com posterior divisão em duas
fracções. Uma destas fracções (1ml) foi subtmetida a estimulação com IL (4 ng/ml) e LPS
(Lipopolissacarídeo; 200 µg/ml). De cada uma das suspensões plaquetares (com e sem
estimulação) foram separados 500 µl para determinação dos níveis de nitratos e nitritos, e
congelados a -70ºC para posterior processamento.
Determinação dos níveis de antioxidantes não enzimáticos
Ácido úrico plasmático
O método enzimático colorimétrico utilizado para a quantificação do ácido úrico no
plasma é comercializado pela Randox e baseia-se na redução do ácido úrico a alantoína por
acção da enzima uricase, com libertação de peróxido de hidrogénio. A quantidade de H2O2
formada, proporcional ao teor em ácido úrico, é então avaliada espectrofotometricamente
pela formação de um composto corado.
Assim, adicionou-se a 10 µl de plasma 1 ml de tampão fosfato contendo ácido
dimetil-amino-benzóico (DMAB) 1 mM, peroxidase ≥1000 U/ml, uricase ≥40 U/ml, 4-
aminoantipirina 0,05 mM e azida de sódio 0,1 g/L como conservante. Após
homogeneização e incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente procedeu-se à
leitura da absorvância a 550 nm, usando como branco o próprio reagente, num
espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02. Simultaneamente foi determinada a absorvância
de um padrão comercial, contendo uma concentração conhecida de ácido úrico, fornecido
com o kit, o que permitiu calcular a concentração de ácido úrico das amostras, bem como a
do controlo ensaiado em simultâneo.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Colesterol total
O colesterol total plasmático foi quantificado por um método colorimétrico
enzimático utilizando o kit comercializado pela Randox sob a designação de “Cholesterol
– enzymatic colorimetric test CHOD-PAP”.
Realizaram-se os ensaios padrão, controlo, branco e amostra, pipetando para os
respectivos tubos 10 µl de solução padrão, controlo, H2O e plasma. Adicionou-se 1 ml do
tampão que contém colesterol esterase 0,16 U/ml, colesterol oxidase 0,11 U/ml, peroxidase
5,5 U/ml, fenol 25 mM e 4-amino antitripirina 0,25 mM. Homogeneizou-se e incubou-se
durante 10 minutos à temperatura ambiente.
O colesterol e os ésteres de colesterol são libertados das lipoproteínas e, por acção da
colesterol esterase são hidrolisados. As colesterol oxidase e peroxidase contidas no
reagente vão originar a formação de peróxido de hidrogénio e do subsequente composto
corado cuja absorvância é mensurável ao comprimento de onda de 505 nm. A leitura foi
realizada num espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02 e foi calculada a concentração
plasmática de colesterol das amostras e do controlo.
Glutatião reduzido (GSH) e oxidado (GSSG)
Para a determinação dos níveis plasmáticos e eritrocitários de GSH e GSSG, foi
utilizado um método fluorimétrico que usa o o-ftladeído (OPT) como reagente fluorescente
e a N-etilmaleimida (NEM) como bloqueador da forma reduzida do glutatião, impedindo a
sua participação no ensaio enzimático [264, 265].
Assim, para a determinação de GSH, juntaram-se num tubo de ensaio 100 µl do
sobrenadante anteriormente obtido / padrão, 1,8 ml de tampão e 100 µl de OPT 1 mg/ml.
Incubaram-se as soluções à temperatura ambiente durante 15 minutos.
Para a determinação de GSSG, num tubo de ensaio juntaram-se 500 µl de
sobrenadante e 200 µl de NEM 0,04M e incubaram-se as soluções à temperatura ambiente
durante 30 minutos. No final deste tempo retiraram-se 140 µl da solução anterior/padrão e
juntaram-se 1,76 ml de hidróxido de sódio 0,1 M e 100 µl de OPT.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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A fluorescência foi medida ao comprimento de onda de 420 nm sob excitação a 350
nm, durante 5 segundos.
A incubação da GSH/GSSG com NEM (potente inibidor da glutatião redutase)
impede a formação do fluoróforo após a adição do OPT. A determinação de GSH é
efectuada a pH inferior a 8 (tampão fosfato-EDTA). Acima de pH 10 a GSH é
parcialmente oxidada, sendo a determinação de GSSG efectuada a pH 12. Aqui o valor de
pH não é tão crítico, não devendo contudo baixar de 10.
O glutatião reage especificamente com o OPT (outros aminoácidos reagem muito
pouco sob estas condições), a pH=8, formando um produto altamente fluorescente que
activado a 350 nm emite um pico a 420 nm.
A intensidade de fluorescência do produto OPT-GSH ou OPT-GSSG é directamente
proporcional às concentrações de GSH ou GSSG, sendo a correlação linear para valores
entre 10 ng - 2 µg e 5 ng – 2 µg, respectivamente.
Vitaminas A e E plasmáticas
O doseamento destas duas vitaminas foi realizado por HPLC em fase reversa pelo
método descrito por Milne em 1986 e modificado por Zaman em 1993 [266-268].
O primeiro passo desta determinação consiste na desproteinização e extração da
fracção lipídica da amostra. Para isso misturaram-se 200 µl de plasma com 200 µl de
solução I (etanol/n-hexano contendo 1,2 mg/L de δ-tocoferol como padrão interno)
fornecida pela BioRad no kit “Vitamin A/E by HPLC”. Homogeneizou-se durante um
minuto no vortex.
Para se efectuar a separação de fases foram adicionados 200 µl da solução II (sulfato
de amónio 100 mM em metanol). Após agitação durante 1 minuto em vortex, centrifugou-
se a 5000 rpm durante 3 minutos. O sobrenadante límpido foi recolhido e utilizado no
processo cromatográfico. Assim, foram injectados 20 µl de amostra no sistema HPLC
equipado com coluna analítica Spherisorb ODS 1-5 µm, 250 x 4,6 mm e detector
UV/Visível. A separação cromatográfica ocorre em sistema isocrático a 45ºC por eluição
com solução aquosa de metanol a 90%, ao fluxo de 2,5 ml/min.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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A detecção espectrofotométrica da vitamina A foi feita ao comprimento de onda de
340 nm e, decorridos 3 minutos, o selector de comprimentos de onda foi comutado para
295 nm, sendo então detectado o padrão interno e a vitamina E.
A quantificação pode então ser efectuada por avaliação da altura dos picos e a
padronização feita com soluções contendo retinol e α-tocoferol, sendo as concentrações
plasmáticas de vitamina A e E expressas em µg/dl e µM, respectivamente.
Vitamina E eritrocitária
A fracção lipídica contendo vitamina E foi obtida pelo método descrito por Burton
em 1985 [269]. A 500 µl de suspensão de eritrócitos, com concentração de hemoglobina
previamente aferida a cerca de 100 g/L, foram adicionados 1,5 ml de dodecil sulfato de
sódio (SDS) 10 mM e 2 ml de etanol absoluto. A mistura foi homogeneizada no vortex
durante 1 minuto e novamente durante mais 3 minutos após a adição de 2 ml de n-hexano.
O extracto foi então centrifugado a 2000 rpm durante 5 minutos e 1 ml da fase superior (n-
hexano) foi removido, evaporado à secura sob corrente de azoto e armazenado a -70ºC
sempre que o processamento não tenha sido imediato.
Este extracto lipídico foi retomado com 250 ml de n-hexano imediatamente antes de
ser analisado por HPLC em fase reversa. Foram injectados 20 µl de amostra, tendo o
processo ocorrido em coluna Spherisorb S10 w (250 x 4,6 mm) eluída com n-hexano
modificado com 0,9% de metanol a fluxo constante de 1,5 ml/minuto. A detecção
espectrofotométrica ocorreu na gama dos ultravioletas a 287 nm.
A quantificação baseou-se na comparação das alturas dos picos da amostra e dos
padrões obtidos com soluções de α-tocoferol em n-hexano. Os níveis de vitamina E foram
expressos em µmol/L e nmol/g hemoglobina.
Capacidade antioxidante total do plasma (TAS)
Para a avaliação da capacidade antioxidante do plasma foi utilizado um kit (Total
Antioxidant Status) comercializado pela Randox. A metodologia baseia-se na capacidade
plasmática de inibição da formação do catião radical ABTS+ (2,2’-azino-di[3-
etilbenzotiazolina sulfonato]) de cor azul-esverdeada, cuja absorvância é mensurável a 600
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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nm. Na presença de antioxidantes plasmáticos, a absorvância diminui proporcionalmente
com a capacidade antioxidante do fluido.
Foram adicionados 20 µl de plasma a 1 ml de tampão fosfato 80 mM, pH 7,4,
contendo metamioglobina 6,1 µM e ABTS 610 µM. Homogeneizou-se e mediu-se a
absorvância inicial (Ai) a 600 nm num espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis (Kontron
Instruments), termostatizado. Adicionaram-se de seguida 200 µl de substracto constituído
por H2O2 100 µM em tampão fosfato 48 mM, pH 7,4 e, após homogeneização,
monitorizou-se a variação da absorvância ocorrida a 37ºC durante 3 minutos.
Designando por Af o valor da densidade óptica ao minuto 3, a variação de
absorvância da amostra naquele período de tempo será ∆A=Af-Ai.
Foi efectuado um ensaio branco, substituindo o plasma por água ultra-pura, obtendo-
se um valor de ∆Abranco. O valor real de absorvância da amostra resulta da subtracção da
∆Abranco à ∆Aplasma.
Como padrão foi utilizada uma solução de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-
tetrametilcroman-2-carboxílixco) e os resultados expressos em unidades de actividade
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), convertidas em mmol de substâncias
antioxidantes/L, uma vez que uma unidade TEAC se define como a concentração de
Trolox com capacidade antioxidante equivalente a 0,1 mmol/L da substância solubilizada
sob investigação.
Determinação dos níveis de antioxidantes enzimáticos Peroxidase do Glutatião (GlPx)
A actividade enzimática da GlPx eritrocitária foi medida espectrofotometricamente
de acordo com o método descrito por Wendel [270].
Este método utiliza o tert-butilhidroperóxido como substracto, sendo a formação de
glutatião oxidado monitorizada por quantificação da oxidação do NADPH a NADP+ a 340
nm.
O concentrado eritrocitário (0,5 ml) foi hemolisado com 9,5 ml de água ultra-pura e
diluído na proporção 2:1 com uma solução contendo cianeto de potássio 4,5 mM,
ferrocianeto de potássio 0,45mM e dihidrogenofosfato de potássio 0,25 M.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Num banho a 37ºC foram misturados 100 µl do hemolisado (0,33 mg de proteína)
com 800 µl de mistura reaccional contendo fosfato de potássio 100 mM (pH=7,0), EDTA
0,1 mM, GSH 1 mM, 0,24 U de glutatião redutase e NADPH 0,25 mM em
hidrogenocarbonato de sódio 0,1%. A reacção foi iniciada por adição de tert-
butilhidroperóxido 1,2 mM e a variação de absorvância registada durante 5 minutos num
espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis (Kontron Instruments), termostatizado.
A actividade enzimática da GlPx foi expressa em unidades internacionais de enzima
por grama de hemoglobina (U/g Hb).
Redutase do Glutatião (Glred)
A actividade enzimática da Glred eritrocitária foi medida espectrofotometricamente
de acordo com o método descrito por Goldberg [271].
O concentrado eritrocitário (0,5 ml; Hb aferida a 100 g/L) foi hemolisado com 500 µl
de água ultra-pura. Foram diluídos 100 µl deste hemolisado com 900 µl de soro fisiológico.
Num tubo juntaram-se 2,6 ml de tampão fosfato 0,12M; pH=7,2; 0,1 ml de EDTA 15
mM; 0,1 ml de GSSG 65,3 mM e 0,1 ml de plasma ou de água destilada (ensaio/branco).
Fez-se uma incubação a 37ºC durante 5 minutos, adicionando-se, no final da incubação, 50
µl de NADPH 9,6 mM. A oxidação do NADPH foi medida durante 2 minutos, a 37ºC,
num espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis, termostatizado (Kontron Instruments) pela
variação da absorvância ao comprimento de onda de 340 nm.
Marcadores de oxidação Lipídica Malonildialdeído (MDA)
O doseamento plasmático e eritrocitário do malonildialdeído foi feito por um método
espectrofotométrico [272-275], que tem como fundamento o facto de que da hidrólise dos
lipoperóxidos a 100ºC com ácido fosfórico resulta a libertação de malonildialdeído
(MDA), que na presença de ácido tiobarbitúrico (TBA) origina complexos MDA-TBA de
cor amarela.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Assim, juntaram-se 250 µl de plasma ou suspensão eritrocitária, 250 µl de H2O, 500
µl de TBA 42 mM e 250 µl de ácido fosfórico 0,44 M. Após 1 hora em banho fervente
procedeu-se à precipitação das proteínas por adição a 500 µl da suspensão anterior, 500 µl
de metanol/NaOH 1 M (10:1). Agitou-se no vortex, centrifugou-se a 3000 rpm durante 10
minutos e, em seguida, injectaram-se 20 µl do sobrenadante em sistema isocrático HPLC
(Gilson), fluxo 1 ml/min, equipado com uma coluna analítica Spherisorb 5 µm ODS2
(4,6x250 mm), detector UV-Vis e injector automático de amostras. A fase móvel usada,
mistura de 400 ml de metanol com 600 ml de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH= 6,8,
foi previamente desgaseificada e filtrada sob vácuo através de uma membrana
Schleicher&Schuell NC-20, Ø 47 mm e dimensão de poro = 0,2 µm.
A quantificação do MDA foi feita por extrapolação da área do pico numa curva de
calibração traçada com padrões de 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) de concentrações entre
0,5 e 10 µM, sujeitos a tratamento idêntico ao das amostras.
Marcadores de oxidação Proteica
Grupos carbonilo
O doseamento dos grupos carbonilo proteicos em amostras de plasma foi feito
através de um método espectrofotométrico [276].
Foram adicionados 200 µl de plasma a dois tubos de polipropileno. Num dos tubos
juntou-se 1 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) 10 mM (ensaio) e, no outro tubo, foi
adicionado 1 ml de ácido clorídrico (HCL) 2M (ensaio branco). As misturas foram
incubadas durante 90 minutos a 37ºC. Após esta incubação procedeu-se ao arrefecimento
das soluções.
Com as soluções já à temperatura ambiente foi adicionado 1 ml de ácido
tricloroacético (TCA) 28%. Após esta adição homogeneizaram-se as soluções e
centrifugaram-se 10 minutos a 3000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi
rejeitado e ressuspendeu-se o precipitado em 1 ml de etanol/acetato de etilo (1:1) e agitou-
se a mistura. Realizou-se uma nova centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm,
rejeitando-se o sobrenadante no final da mesma. Repetiu-se o processo de lavagem e
ressuspendeu-se o precipitado em 1,5 ml de guanidina-HCL 6M. Agitou-se o tubo e
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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procedeu-se a nova centrifugação nas mesmas condições da atrás descrita. Transferiu-se o
sobrenadante do branco para uma cuvete e realizou-se a leitura espectrofotométrica num
espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis, termostatizado (Kontron Instruments) a 360 nm.
Procedeu-se da mesma forma para o ensaio respectivo.
Metabolitos do monóxido de azoto
A concentração de nitratos e nitritos presentes nas amostras em estudo foram
determinadas através de um procedimento que envolve duas fases (Reacção de Griess para
determinação de nitratos e nitritos). Os nitratos são primeiro convertidos enzimaticamente
a nitritos (usando a redutase do nitrato dependente de NADPH), seguindo-se então a
medição dos nitritos totais por uma reacção estequiométrica com um reagente de Griess
que dá origem a um azo-produto corado. A concentração original de nitritos pode ser
determinada separadamente numa amostra que não tenha sido submetida à conversão dos
nitratos, permitindo assim a quantificação dos nitratos por subtracção.
Uma modificação deste método inclui a inclusão de um sistema regenerador de
NADPH glicose-6-fosfato/glicose-6-fosfatase desidrogenase, para prevenir a possível
interferência de elevadas concentrações de NADP+ no desenvolvimento de cor pela
reacção de Griess.
Assim, para a determinação dos nitritos, pipetaram-se 100 µl de amostra (plasma
filtrado/plaquetas previamente sonicadas), padrões (nitrito de sódio 0,5; 1; 5; 10 e 25 µM)
ou branco (água), em duplicado para uma microplaca de 96 poços.
Adicionaram-se 40 µl de tampão de conversão (sem redutase do nitrato), 10 µl de
NADPH, 100 µl de reagente de Griess e foi feita uma incubação durante 15 minutos à
temperatura ambiente. A leitura da absorvância foi feita a 450 nm (filtro de referência a
620 nm) e a concentração de nitritos foi determinada por extrapolação da curva de
calibração.
Para a determinação dos nitritos + nitratos pipetaram-se 100 µl de amostra (plasma
filtrado/plaquetas previamente sonicadas), padrões (nitrito de sódio 0,5; 1; 5; 10 e 25 µM)
ou branco (água), em duplicado para uma microplaca de 96 poços.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Adicionaram-se 40 µl de tampão de conversão (com nitrato redutase) e 10 µl de
NADPH. Agitou-se a placa e incubou-se 1 hora à temperatura ambiente para ocorrer a
conversão de nitratos em nitritos.
Juntaram-se 100 µl de reagente de Griess e foi feita uma incubação durante 15
minutos à temperatura ambiente. A leitura da absorvância foi feita a 450 nm (filtro de
referência a 620 nm) e a concentração de nitritos + nitratos foi determinada por
extrapolação da curva de calibração.
A concentração de nitratos foi determinada por subtracção da concentração de nitritos
medida na ausência de enzima à concentração de nitritos + nitratos totais determinada.
Os resultados foram representados em função da concentração de proteína presente
nas amostras e do número de plaquetas.
Determinação da concentração de proteínas totais
A determinação da concentração de proteínas totais foi realizada segundo o método
do biureto (Randox Laboratories). Neste método os iões cobre, presentes no meio alcalino,
reagem com as ligações peptídicas resultando na formação de um complexo corado. A 50
ul de soro são adicionados 2,5 ml de reagente de biureto, a mistura é homogeneizada no
vórtex e deixada a incubar à temperaura ambiente durante 30 minutos. De seguida
procedeu-se à leitura da densidade óptica num espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02,
comparando os valores com um padrão fornecido no kit. Os resultados são expressos em
g/l.
Quantificação de hemoglobina na suspensão de eritrócitos
A 20 ul da suspensão de eritrócitos, foram adicionados 5 ml de reagaente de Drabkins
(Sigma Diagnostics). Após agitação no vórtex e dez minutos de incubação à temepratura
ambiente, procedeu-se à leitura da densidade óptica num espectrofotómetro Shimadzu UV-
120-02. Por comparação com um padrão de hemoglobina 100 g/l (Sigma) calculou-se a
concentração de hemoglobina na amostra, sendo os resultados expressos em g/l.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Análise Estatística
Para a caracterização da amostra são utilizadas as medidas de tendência central e
dispersão e os resultados expressos como média e desvio padrão dos valores determinados
para cada parâmetro analisado.
As comparações de médias registadas nos diversos parâmetros analisados foram
efectuadas através do teste de t de Student.
A comparação da frequência dos genótipos estudados nos diferentes grupos foi
realizada recorrendo ao teste de Chi quadrado.
A análise estatística foi processada com Statistical Package for the Social Sciences
(SPSS) versão 10.0 Windows.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Resultados
Mecanismos Genéticos
O estudo dos mecanismos genéticos tem dois objectivos finais, por um lado realizar
análises de associação entre a amostra total de doentes e a amostra total de controlos, por
outro lado procurar alterações em genes previamente associados à doença de Parkinson
num grupo de doentes com início precoce da doença ou história familiar positiva.
Na análise das características clínicas dos grupos em estudo, verifica-se que o grupo
de indivíduos com forma esporádica da doença apresenta uma maior prevalência de
demência (13%) do que os indivíduos com história familiar positiva para D.P. (7,1%). Por
outro lado, no que diz respeito à presença de distonia, verifica-se que os indivíduos com
história familiar positiva apresentam uma prevalência superior (39,3%) àquela apresentada
pelo grupo com forma esporádica da doença (19%). Quanto às idades dos indivíduos
pertencentes a estes grupos verifica-se que o grupo de indivíduos com forma familiar da
doença apresenta uma média de idades de 65 ± 7,8 anos enquanto o grupo com forma
esporádica da doença apresenta uma média de 67,1 ± 11 anos de idade, não sendo esta
diferença entre grupos estatisticamente significativa (p=0,609). Também no que concerne
às idades de início nestes dois grupos não foi encontrada qualquer diferença significativa
(54 ± 10 vs 57,7 ± 13) (p=0,222).
O subgrupo de indivíduos sobre o qual recaiu o estudo de genes associados à D.P.
apresenta características clínicas semelhantes às já descritas para a totalidade dos doentes.
A idade média neste subgrupo é de 59,5 ± 10 anos enquanto a idade de início é de 43,5 ±
10,1 anos de idade.
No que diz respeito às idades dos indivíduos com doença e os indivíduos
pertencentes ao grupo controlo, verifica-se que os primeiros apresentam uma idade média
de 66,9 ± 10,4 anos de idade enquanto os segundos apresentam uma idade média de 67,9 ±
14,4, não sendo esta diferença estatisticamente significativa (p=0,549).
Quanto ao sexo dos indivíduos em estudo, verifica-se que no grupo dos doentes há
47,7% de indivíduos do sexo masculino e 52,3% de indivíduos do sexo feminino. Já no
grupo de indivíduos controlo a diferença é um pouco maior, existindo 31,7% de indivíduos
do sexo masculino e 68,3% de indivíduos do sexo feminino.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Alfa-sinucleína
No estudo deste gene não foram encontradas quaisquer alterações. Foi feita a
pesquisa das três mutações pontuais previamente descritas, foi feita uma pesquisa em todo
o gene para novas mutações pontuais e foi feita a pesquisa de alteração do número de
cópias dos diferentes exões e de todo o gene. Todas estas análises se revelaram negativas.
Parkina
Foi encontrada uma mutação pontual no exão dois do gene num indivíduo com
história familiar positiva para a doença de Parkinson. Esta mutação (256delA), uma
delecção de um par de bases encontrada em estado de homozigotia no indivíduo em
estudo, é uma mutação frameshift e acaba por introduzir um novo codão stop no início
deste exão a cerca de 30 pares de bases da posição da mutação.
Um dos progenitores deste indivíduo, falecido com neoplasia gástrica aos 60 anos de
idade, apresentava D.P. diagnosticada há vários anos, no entanto, não foi colhida amostra
para estudo genético. A representação da família encontra-se na Figura 7.
Figura 7 - Representação da família onde foi encontrada a mutação 256delA
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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O indivíduo I-2, embora nunca tendo sido avaliado pela equipa de especialistas do
serviço, apresenta uma história de tremor essencial tendo falecido aos 80 anos de idade. O
indivíduo I-1 não tem história de doença de Parkinson ou de qualquer forma de
parkinsonismo. O indivíduo II-1 não apresentou qualquer forma de parkinsonismo até à
data em que lhe foi administrado um antidepressivo, altura em que desenvolveu um grave
discinésia oro-mandibular. Tanto o indivíduo II-3 como o indivíduo III-1 não apresentam
história de alteração neurológica ou qualquer forma de parkinsonismo. O indivíduo IV-1
apresenta uma forma de distonia cervical desde os 14 anos, enquanto o indivíduo IV-2 não
apresenta qualquer tipo de fenótipo da doença.
A Figura 8 apresenta a sequência de uma pequena parte do exão 2 do gene da parkina
do indivíduo III-2 e de outros dois indivíduos controlo. É evidente a delecção de uma
adenina na forma homozigótica. Para confirmação de que esta mutação se encontra, de
facto, na forma homozigótica ao invés de se encontrar em apenas um dos alelos, tendo o
outro sofrido uma delecção exónica, o que daria origem a um cromatograma idêntico, foi
feito um ensaio de dosagem génica a este exão neste doente. Não foi encontrada qualquer
delecção exónica o que confirma que a mutação existe neste doente na forma
homozigótica.
Figura 8 - Cromatogramas da sequência de parte do exão 2 do gene da parkina. O segundo cromotograma refere-se ao indivíduo III-2.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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Para um estudo mais aprofundado desta mutação nesta família, foram estudados do
ponto de vista genético cinco indivíduos: II-1, II-3, III-1, IV-1 e IV-2. Com a excepção do
indivíduo III-1, todos os outros quatro indivíduos possuem esta mutação na forma
heterozigótica. A Figura 9 representa o cromatograma dos indivíduos III-3 e IV-1, sendo
idêntico para os indivíduos II-1 e IV-2, em comparação com um indivíduo sem a mutação.
Verifica-se que existindo uma delecção na forma heterozigótica a sequência de um dos
alelos “recua” uma posição, enquanto a sequência do outro alelo se mantém idêntica, o que
origina a duplicação dos picos apresentada.
Figura 9 - Cromatogramas da sequência de parte do exão 2 do gene da parkina. O primeiro cromatograma refere-se ao indivíduo III-3, o segundo ao indivíduo IV-1, os últimos dois referem-se a indivíduos com sequência sem alteração.
Como forma de confirmar estes resultados, foi desenvolvido um ensaio de screening
rápido por PCR-RFLP, utilizando os primers descritos na secção de Materiais e Métodos e
a enzima de restrição BstF5I. A presença de mutação origina dois fragmentos com 273 e
29 pares de base, enquanto a ausência de mutação origina apenas um fragmento com 302
pares de base. A Figura 10 representa o resultado da electroforese desta análise,
confirmando os resultados previamente obtidos.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Figura 10 - Resultado de electroforese em agarose do produto da digestão do exão 2 na família em estudo com enzima BstF5I. Coluna 1: marcador de peso molecular, coluna 2: indivíduo II-1, coluna 3: indivíduo II-3, coluna 4: indivíduo III-1, coluna 5: indivíduo IV-1, coluna 6: indivíduos IV-2, coluna 7: indivíduos III-2, coluna 8: marcador de peso molecular.
Ainda no estudo do gene da parkina foi encontrada outra mutação caracterizada pela
transição de uma guanina para uma adenina no exão 11, o que origina a transição de um
aspartato para uma asparagina na posição 394 da sequência de aminoácidos. Esta mutação
foi encontrada em heterozigotia como representado na Figura 11.
Figura 11 - Cromatograma da sequência de parte do exão 11 do gene da parkina. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma adenina.
200 pb 300 pb
1 2 3 4 5 6 7 8
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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O indivíduo com 57 anos apresenta doença de Parkinson desde os 45 anos de idade.
Foi considerado pela equipa médica como uma forma familiar, embora o indivíduo
afectado, um dos progenitores, nunca tenha sido observado por esta equipa de
especialistas, mas tenha uma história consistente de tremor. O indivíduo em estudo tem
uma forma de apresentação da doença tremórica, sem qualquer deterioração cognitiva ou
qualquer forma de distonia. A Figura 12 representa a família deste indivíduo.
Figura 12 - Representação da família onde foi encontrada a mutação Asp394Asn.
O indivíduo I-2 faleceu nos seus 80 anos, vítima de uma acidente vascular cerebral,
tal como o indivíduo I-1. O indivíduo II-1 faleceu aos 67 anos de idade também vítima de
um acidente vascular cerebral sem que tenha apresentado qualquer forma de fenótipo
relacionado com parkinsonismo. Os restantes indivíduos desta família não apresentam
qualquer forma de alteração neurológica ou sinal de parkinsonismo. O indivíduo em estudo
(II-4) tem dois descendentes com 29 e 35 anos, ambos saudáveis.
Ainda no exão 11 do gene da parkina foi encontrada outra mutação pontual noutro
indivíduo. Neste caso foi encontrada uma transição de um glutamato para um codão stop.
Esta mutação foi encontrada na forma de homozigotia, como pode ser visualizado na
Figura 13.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 91 -
Figura 13 - Cromatograma da sequência de parte do exão 11 do gene da parkina. O segundo cromatograma apresenta uma mutação homozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.
Este indivíduo com 68 anos de idade apresenta doença de Parkinson desde os 53
anos, com uma forma tremórica e sem deterioração cognitiva. Trata-se de um
parkinsonismo com 15 anos de evolução, lentamente progressivo. Apresenta flutuações
motoras (on-off) com off matinal. A família apresenta outros dois indivíduos com doença
de Parkinson, mas, por serem emigrantes em França, não foi possível colher amostra para
realizar estudo genético. A representação da família encontra-se na Figura 14.
Figura 14 - Representação da família onde foi encontrada a mutação Glu395Stop.
Ainda no gene da parkina foi encontrada uma duplicação heterozigótica do exão 8
por análise de dosagem génica com PCR em Tempo-Real. Este indivíduo com 42 anos de
idade não apresenta qualquer história familiar positiva para doença de Parkinson e teve o
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 92 -
início da doença aos 33 anos. Não apresenta distonia, tremor essencial ou qualquer forma
de demência.
PINK1
No estudo do gene PINK1 foi encontrado apenas um indivíduo apresentando mutação
pontual. Este, com 41 anos de idade, apresenta uma forma esporádica da doença sem
distonia, tremor essencial ou demência, tendo no entanto, uma idade de início muito baixa
de 20 anos de idade.
Neste indivíduo foram encontradas duas mutações pontuais, sendo por isso um
heterozigótico composto. As mutações encontradas foram Gly193Val e Met220Ile, ambas
no exão 1 e ilustradas nas Figuras 15 e 16.
Figura 15 - Cromatograma da sequência de parte do exão 1 do gene PINK1. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.
Embora se tenham encontrado as duas mutações, é necessário determinar se estas se
encontram em cis ou em trans, ou seja, se se encontram no mesmo alelo ou em alelos
diferentes, tendo cada uma das possibilidades consequências distintas quer a nível de
fenótipo quer a nível de mecanismos moleculares responsáveis pelo início da doença. Após
determinação por PCR-RFLP, verificou-se que as mutações se encontram em alelos
diferentes e, portanto, em trans.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 93 -
Figura 16 - Cromatograma da sequência de parte do exão 1 do gene PINK1. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.
Na análise de dosagem génica deste gene foi encontrada uma delecção heterozigótica
do exão 1 num indivíduo com 60 anos e 47 anos de idade de início. Este indivíduo
apresenta história familiar positiva para doença de Parkinson como demonstrado na Figura
17, não apresentado demência nem tremor essencial, mas com uma distonia muito dolorosa
não suportando doses elevadas de agonista dopaminérgico por desenvolver fortes
discinésias.
Figura 17 - Representação da família onde foi encontrada uma delecção heterozigótica do exão 1 do gene PINK1.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 94 -
Ainda na análise deste gene foi encontrada uma delecção de todo o exão 2 noutro
indivíduo. Este doente com 56 anos e com idade de início aos 50 anos apresenta uma
história familiar positiva para doença de Parkinson. Não apresenta tremor essencial nem
qualquer forma de demência, mas apresenta desde muito cedo distonia.
Noutro indivíduo foram encontradas delecções dos exões 1 e 2 do mesmo gene.
Neste indivíduo, que também apresenta história familiar positiva para doença de
Parkinson, a idade de início é de 54 anos tendo na altura da colheita 68 anos de idade. Não
apresenta demência, distonia ou tremor essencial.
Desta forma, foram encontradas alterações genéticas responsáveis por 8 casos de
doença de Parkinson, o que origina um total de 6,25% dos casos estudados, a serem
devidos, pelo menos em grande parte, a uma componente genética. No que diz respeito a
formas familiares, foram encontradas 6 mutações neste grupo de indivíduos o que origina
21,4% dos casos familiares estudados a apresentarem uma componente genética.
No que diz respeito ao estudo de associação entre doentes e indivíduos controlo,
foram feitas subdivisões do grupo de doentes. Determinaram-se dois subgrupos de doentes:
um deles incluindo todos os indivíduos com forma esporádica da doença de Parkinson e
outro incluindo apenas os indivíduos com forma esporádica e com idade de início superior
a 55 anos de idade. Este último grupo, embora tenha um número de indivíduos claramente
inferior ao desejável, pretende simular um grupo de doentes de Parkinson idiopáticos, com
a idade de início mais frequente e características mais comuns.
Quanto aos resultados obtidos para o polimorfismo no exão 29 do gene da nNOS,
estes estão apresentados na Tabela XIII.
Na análise da totalidade da amostra de indivíduos com D.P. não foi encontrada
nenhuma diferença estatisticamente significativa para estes polimorfismos, quer a nível de
genótipo quer a nível de frequência alélica. No entanto, a totalidade de indivíduos contém
tanto indivíduos com forma esporádica da doença, como com forma familiar, pelo que é
possível que os indivíduos com formas familiares da doença tenham a causa do
desenvolvimento da sua doença noutro tipo de alteração génica. Assim, sendo o grupo de
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 95 -
indivíduos em estudo foi dividido em doentes com forma esporádica e posteriormente em
indivíduos com forma esporádica e idade de início da doença superior a 55 anos de idade.
Tabela XIII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 29 do gene da nNOS.
Genótipo Frequência alélica Grupo
CC CT TT p C T p
Total
Doentes (n=132) 50 (0,38) 68 (0,52) 14 (0,11) 0,359 0,64 0,36 0,8088
Esporádicos Doentes (n=94) 32 (0,34) 56 (0,60) 6 (0,06) 0,0302 0,64 0,36 0,6921
Esp. >55 I. I. Doentes (n=54) 15 (0,28) 38 (0,70) 1 (0,02) 0,0016 0,63 0,37 0,9484
Controlos (n=123) 50 (0,41) 54 (0,44) 19 (0,15) 0,63 0,37
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
A Tabela XIV apresenta os resultados obtidos no estudo do polimorfismo no exão 18
do gene da nNOS. Aqui não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos
grupos estudados, sendo que, a diferença mais significativa surgiu na análise da totalidade
da amostra, como demonstrado pelo valor de significância (p=0,0773). Da mesma forma,
não foram encontradas diferenças significativas, no que diz respeito à distribuição alélica
deste polimorfismo nos grupos estudados, quando comparados com o grupo de indivíduos
controlo.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 96 -
Tabela XIV - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 18 do gene da nNOS.
Genótipo Frequência alélica Grupo
CC CT TT p C T p
Total
Doentes (n=132) 54 (0,4) 64 (0,48) 16 (0,12) 0,0773 0,64 0,36 0,1671
Esporádicos
Doentes (n=94) 41 (0,44) 45 (0,48) 8 (0,09) 0,1104 0,68 0,32 0,4390
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 23 (0,43) 27 (0,50) 4 (0,07) 0,1192 0,68 0,32 0,6625
Controlos (n=123) 65 (0,53) 42 (0,34) 16 (0,13) 0,70 0,30
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
A Tabela XV apresenta os resultados obtidos para o polimorfismo estudado no exão
22 do gene da isoforma indutível do gene da NOS. Não foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas de genótipos entre nenhum dos grupos de doentes e o grupo
de indivíduos controlo. De igual forma, as distrinuições alélicas entre estes grupos também
não apresentaram qualquer diferença significativa.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 97 -
Tabela XV - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 22 do gene da iNOS.
Genótipo Frequência alélica Grupo
AA AG GG p A G p
Total
Doentes (n=132) 20 (0,15) 67 (0,49) 49 (0,36) 0,3309 0,39 0,61 0,6697
Esporádicos
Doentes (n=94) 15 (0,16) 47 (0,50) 32 (0,34) 0,2450 0,41 0,59 0,3536
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 9 (0,17) 30 (0,56) 15 (0,28) 0,0892 0,44 0,56 0,1627
Controlos (n=123) 21 (0,17) 48 (0,39) 54 (0,44) 0,37 0,63
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
As Figuras 18 e 19 representam os resultados da electroforese após digestão com
enzima de restrição dos polimorfismos estudados no exão 29 do gene da nNOS e no exão
22 do gene da iNOS.
Figura 18 - Electroforese do produto de digestão do exão 29. Coluna 1: marcador de peso molecular; coluna 2: heterozigótico; coluna 3: heterozigótico; coluna 4: homozigótico T; coluna 5: homozigótico C; coluna 6 heterozigótico.
1 2 3 4 5 6
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 98 -
Figura 19 - Electroforese do produto de digestão do exão 22 do gene da iNOS. Coluna 1: marcador de peso molecular; coluna 2: heterozigótico; colunas 3, 4 e 5: homozigótico G; coluna 6:homozigótico A; colunas 7 e 8: heterozigótico; coluna 9: homozigótico A.
No que diz respeito a diferenças entre sexo nos indivíduos estudados, verifica-se que
não existem diferenças estatisticamente significativas. Realizando a análise no grupo de
indivíduos com forma esporádica da doença, obtemos um grupo de indivíduos do sexo
masculino com 46 indivíduos, enquanto no subgrupo de indivíduos do sexo feminino o
total é de 48 indivíduos. Os resultados do genótipo do polimorfismo estudado no exão 29
do gene da isoforma neuronal da NOS, não são estatisticamente diferentes entre estes
grupos (p=0,3347), da mesma forma não são significativas as diferenças entre alelos
(p=0,2543). No estudo do polimorfismo no exão 18 deste gene, verificou-se que os
genótipos dos indivíduos destes dois grupos não apresentam diferenças estatisticamente
significativas (p=0,7771), à semelhança do que acontece com a análise dos alelos
(p=0,5640).
Também no estudo do polimorfismo no exão 22 da isoforma indutível do mesmo
gene (Tabela XV) se verifica que os genótipos não são estatisticamente diferentes
(p=0,6816) entre estes grupos, sendo as diferenças entre alelos também idênticas
(p=0,4532).
O estudo do gene HFE foi realizado de modo idêntico, ou seja, o grupo de indivíduos
com doença de Parkinson foi dividido de forma a serem obtidos apenas os indivíduos com
forma esporádica da doença e, posteriormente, foram ainda seleccionados os indivíduos
que apresentaram idade de início da doença após os 55 anos de idade. A Tabela XVI
apresenta os resultados do estudo da mutação H63D nos diferentes grupos de indivíduos.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 99 -
Verifica-se que não existem diferenças estatisticamente significativas nos genótipos
apresentados pelos grupos de indivíduos doentes e controlos. De igual forma, a distribuição
alélica é idêntica entre os subgrupos estudados e os indivíduos controlo.
Tabela XVI - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo H63D estudado no gene da HFE no grupo de doentes e no grupo de controlos.
Genótipo Frequência alélica Grupo
CC CG GG p C G p
Total
Doentes (n=132) 88 (0,67) 39 (0,30) 5 (0,04) 0,4570 0,81 0,19 0,9680
Esporádicos
Doentes (n=94) 64 (0,68) 26 (0,28) 4 (0,04) 0,3382 0,82 0,18 0,8701
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 38 (0,70) 15 (0,28) 1 (0,02) 0,7054 0,84 0,16 0,5028
Controlos (n=123) 79 (0,64) 42 (0,34) 2 (0,02) 0,81 0,19
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
Figura 20 - Resultado da electroforese dos produtos de digestão da mutação H63D no gene HFE.
O estudo da mutação C282Y produziu os resultados apresentados na Tabela XVII,
sendo a Figura 21 o resultado da genotipagem desta mutação. Não se encontraram
quaisquer indivíduos com genótipo AA para esta mutação, o que é normal uma vez que
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 100 -
esta é uma mutação muito rara. No que diz respeito à distribuição dos genótipos, não se
verificaram diferenças significativas entre os diferentes subgrupos de indivíduos doentes e
o grupo controlo. Já no que concerne a distribuição alélica, verificaram-se diferenças
significativas em qualquer um dos dois subgrupos criados, quando comparados com o
grupo controlo, o que sugere uma sobrerepresentação de um dos alelos nestes subgrupos
quando comparado com o grupo de indivíduos controlo.
Tabela XVII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo C282Y estudado no gene da HFE no grupo de doentes e no grupo de controlos.
Genótipo Frequência alélica Grupo
GG GA AA p G A p
Total
Doentes (n=132) 120 (0,91) 12 (0,09) 0 0,1664 0,95 0,05 0,0848
Esporádicos
Doentes (n=94) 84 (0,89) 10 (0,11) 0 0,2020 0,95 0,05 0,0467
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 46 (0,85) 8 (0,15) 0 0,4190 0,93 0,07 0,0096
Controlos (n=123) 109 (0,96) 4 (0,04) 0 0,98 0,02
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
Figura 21 - Resultado da electroforese dos produtos de digestão da mutação C282Y no gene HFE.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 101 -
O estudo do polimorfismo Ile105Val no exão 5 do gene da transferase-S do glutatião
produziu os resultados apresentados na Tabela XVIII. Verificou-se existirem diferenças
estatisticamente significativas na distribuição dos genótipos, quando foram comparados a
totalidade dos doentes e o subgrupo de doentes esporádicos com o grupo de indivíduos
controlo. Não se verificaram diferenças significativas entre o subgrupo de doentes
esporádicos com idade de início superior a 55 anos e o grupo controlo. De forma idêntica,
não se verificaram quaisquer diferenças significativas na distribuição alélica entre os
grupos estudados.
Tabela XVIII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo Ile105Val estudado no gene da GSTP.
Genótipo Frequência alélica Grupo
GG GA AA p G A p
Total
Doentes (n=132) 46 (0,34) 72 (0,53) 19 (0,14) 0,0366 0,60 0,40 0,7842
Esporádicos
Doentes (n=94) 30 (0,32) 48 (0,52) 15 (0,16) 0,0327 0,58 0,42 0,9073
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 18 (0,33) 28 (0,52) 8 (0,15) 0,0969 0,59 0,41 0,9142
Controlos (n=123) 27 (0,25) 75 (0,68) 8 (0,07) 0,59 0,41
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
O estudo do polimorfismo Ala114Val no exão 6 produziu os resultados apresentados
na Tabela XIX. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em
qualquer um dos grupos estudados. No entanto, verificou-se um subrepresentação, ainda
que não significativa, do alelo T nos grupos de indivíduos doentes quando comparados
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 102 -
com o grupo controlo, diferença esta que quase atingiu valores significativos no subgrupo
de doentes eporádicos e com idade de início superior a 55 anos (p=0,0549).
Tabela XIX - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo Ala114Val estudado no gene da GSTP.
Genótipo Frequência alélica Grupo
CC CT TT p C T p
Total
Doentes (n=132) 124 (0,90) 14 (0,10) 0 0,4912 0,95 0,05 0,3986
Esporádicos
Doentes (n=94) 87 (0,93) 7 (0,07) 0 0,3604 0,96 0,04 0,1613
Esp. >55 I. I.
Doentes (n=54) 52 (0,96) 2 (0,04) 0 0,1739 0,98 0,02 0,0549
Controlos (n=123) 102 (0,87) 14 (0,12) 1 (0,01) 0,93 0,07
São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início
Mecanismos de Stresse Oxidativo
Os mecanismos de stresse oxidativo foram analisados com o objectivo de realizar
análises de associação entre a amostra de indivíduos com D.P. e a amostra de indivíduos
saudáveis. Com a realização deste objectivo pretende-se determinar se algum dos
marcadores de stresse oxidativo estudados poderá ser utilizado como biomarcador para a
D.P..
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 103 -
No que diz respeito à caracterização das amostras em estudo, verifica-se que ambos
os grupos em estudo possuem idades semelhantes, sendo a média de idades do grupo de
indivíduos com D.P. de 65,8±11,1 anos, enquanto a média de idades do grupo de
indivíduos controlo é de 63,3±15 anos de idade. Quanto à distribuição por sexo, o grupo de
indivíduos com D.P. é constituído por 43,7% de indivíduos do sexo masculino, enquanto o
grupo de indivíduos controlo contém 29,2% de indivíduos deste sexo.
Para uma melhor análise deste estudo, o grupo de indivíduos com D.P. foi
subdividido em dois grupos. O primeiro grupo de doentes apresenta idades de início da
doença inferior a 55 anos enquanto que o outro grupo apresenta idades de início acima
desta idade.
Níveis de antioxidantes não enzimáticos
A Figura 22 apresenta os resultados obtidos para a concentração de ácido úrico no
plasma do grupo de indivíduos com D.P. e indivíduos controlo.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Ác.
úric
o m
M
Doentes
Controlos
Figura 22 - Valores de ácido úrico obtidos nos grupos de indivíduos com D.P. e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Na comparação do grupo de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55
anos de idade, não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no que diz
respeito a este parâmetro. Os resultados obtidos para o grupo de indivíduos com idade de
*
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 104 -
início superior a 55 anos de idade são apresentados na Figura 19. A Tabela XX apresenta
os resultados de ácido úrico nos quatro grupos estudados.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60Á
c. ú
rico
mM
Doentes I.I.>55Controlos
Figura 23 - Valores de ácido úrico obtidos nos grupos de indivíduos com idade de início da doença superior a 55 anos de idade e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Tabela XX - Valores de concentração de ácido úrico nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (mM) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 0,31±0,16 *
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 0,28±0,15
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 0,33±0,17 *
Controlo 0,26±0,10
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Foram analisados os valores da concentração plasmática de colesterol e,
adicionalmente, da razão Vit.E/colesterol. Não foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas em nenhuma destas análises. A Tabela XXI apresenta os
valores médios e desvio padrão obtidos, assim como o valor de p.
*
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 105 -
Tabela XXI - Valores da concentração plasmática de colesterol e da razão da concentração de vitamina E e colesterol obtidos nos grupos estudados.
Colesterol Vitamina E/Colesterol
Média ± d.p. Média ± d.p.
Doentes de Parkinson 5,58±1,5 7,73±6,39
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 5,59±1,44 9,23±9,22
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 5,40±1,08 6,84±2,43
Controlo 5,25±1,00 7,26±2,26
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
A Figura 24 apresenta os valores obtidos para a concentração plasmática de vitamina
E no grupo de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55 anos e do grupo
controlo. A Tabela XXII apresenta os valores médios obtidos na totalidade dos grupos
estudados.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Con
cent
raçã
o de
Vit.
E no
pla
sma
uM
Doentes I.I.<55Controlos
Figura 24 - Valores de vitamina E plasmática obtidos nos grupos de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55 anos de idade e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
*
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 106 -
Tabela XXII - valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração plasmática de vitamina E nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (uM) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 40,68±14,64
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 45,85±15,82 *
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 37,68±11,99
Controlo 38,04±12,69
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
No que diz respeito aos valores de concentração plasmática obtidos para a vitamina
A, estes foram encontrados estatisticamente diferentes entre o grupo de indivíduos com
idade de início da doença superior a 55 anos de idade e o grupo controlo. Estes resultados
são representados na Figura 25. A Tabela XXIII apresenta os valores médios e desvio
padrão deste parâmetro na totalidade dos grupos estudados.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Con
cent
raçã
o de
vita
min
a A
pla
smát
ica
ug/d
l Doentes I.I.>55Controlos
*
Figura 25 - Valores de vitamina A plasmática nos grupos de indivíduos com idade de início da doença superior a 55 anos e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Tabela XXIII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração plasmática de vitamina A nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (ug/dl) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 1,88±1,18
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 1,87±0,61
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 1,71±0,48 *
Controlo 1,92±0,44
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Ainda sob o ponto de vista das defesas antioxidantes não enzimáticas, no que diz
respeito ao ciclo do glutatião, não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre nenhum dos grupos estudados e o grupo de indivíduos controlo, quando
foram avaliados estes parâmetros no plasma. Foram determinados os níveis de glutatião
reduzido e oxidado, assim como a razão entre estes. De forma semelhante, e ao contrário
do que acontece a nível plasmático, a concentração de vitamina E nos eritrócitos não se
demonstrou estatisticamente diferente entre os grupos estudados e o grupo de indivíduos
controlo.
No que diz respeito aos doseamentos a nível eritrocitário dos componentes não
enzimáticos do ciclo do glutatião, foram encontradas algumas diferenças significativas
entre os grupos estudados e o grupo controlo. Estes resultados encontram-se representados
na Figura 26. É notória uma diminuição, neste caso estatisticamente significativa, nos
valores de GSH eritrocitária nos indivíduos doentes quando comparados com os controlos,
à semelhança do que acontece com os indivíduos com forma esporádica da doença e idade
de início superior a 55 anos de idade. Verifica-se também, um aumento do glutatião
oxidado nos indivíduos esporádicos com idade de início superior a 55 anos quando
comparados com os controlos. A razão glutatião reduzido/oxidado encontra-se diminuída
neste grupo de doentes quando comparados com os controlos.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 108 -
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Con
cent
raçã
o de
GSH
gv
(nm
ol/g
Hb)
Doentes
Controlos
A
*
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Con
cent
raçã
o de
GSH
gv
(nm
ol/g
Hb)
Doentes Início<55
Controlos
B
*
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Con
cent
raçã
o de
GSS
G g
v
Doentes inicio >55
Controlos
C
*
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Raz
ão G
SH/G
SSG
gv
Doentes inicio >55
Controlos
D
*
Figura 26 - Resultados obtidos significativos para o ciclo do glutatião. A – concentração de GSH eritrocitário no grupo de doentes de Parkinson e controlos. B - concentração de GSH eritrocitário no grupo de doentes com idade de início inferior a 55 anos e controlos. C – concentração de GSSG eritrocitário no grupo de doentes com idade de início superior a 55 anos de idade e controlos. D – valores da razão GSH/GSSG no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e controlos. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Os valores médios e desvio padrão destes resultados nestes grupos de doentes
encontram-se nas Tabelas XXIV, XXV e XXVI.
Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos valores de GSH
eritrocitário quando se realizou a comparação do grupo total de doentes de Parkinson com
o grupo controlo, assim como do grupo de doentes com idade de início inferior a 55 anos
de idade quando comparados com o grupo controlo. Em ambas as situações, os valores
obtidos no grupo controlo são superiores aos grupos de doentes (Tabela XXIV).
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 109 -
Tabela XXIV - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração GSH eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (mmol/g Hb) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 3,28±1,58 *
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 3,06±1,45 *
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 3,57±1,73
Controlo 3,83±1,45
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
No que diz respeito à concentração de GSSG eritrocitário foi encontrado um aumento
estatisticamente significativo no grupo de indivíduos doentes com idade de início superior
a 55 anos de idade quando comparados com o grupo de indivíduos controlo (Tabela XXV).
Tabela XXV - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração GSSG eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.
Médias ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 0,61±0,27
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 0,60±0,23
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 0,70±0,30 *
Controlo 0,57±0,19
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
No que diz respeito à razão GSH/GSSG, verificou-se uma diminuição
estatisticamente significativa nos valores obtidos para o grupo de doentes com idade de
início inferior a 55 anos quando comparados com o grupo controlo (Tabela XXVI).
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 110 -
Tabela XXVI - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a razão GSH/GSSG eritrocitária nos grupos de indivíduos estudados.
Médias ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 6,13±3,40
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 5,72±3,60 *
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 5,96±3,41
Controlo 7,35±3,56
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
O estado antioxidante total dos indivíduos foi, também, determinado encontrando-se
os resultados obtidos representados na Figura 27 e na Tabela XXVII. Sendo evidente uma
diminuição estatisticamente significativa nos valores obtidos para o estado antioxidante
total nos indivíduos controlo, quando comparados com qualquer um dos subgrupos de
indivíduos doentes
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 111 -
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Doent es
Cont rolos
A
*
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
TAS
(mM
)
Doentes I.I.<55
Controlos
B
*
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
TAS
(mM
)
Doentes I.I.>55Controlos
C
*
Figura 27 - Valores de TAS nos grupos estudados. A – doentes vs controlos; B – doentes com idade de início inferior a 55 anos vs controlos; C - doentes com idade de início superior a 55 anos vs controlos. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Tabela XXVII - valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para TAS nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (mM) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 0,95±0,27 *
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 0,95±0,28 *
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 1,00±0,24 *
Controlo 0,85±0,28
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 112 -
Níveis de antioxidantes enzimáticos
Foram avaliadas as actividades das enzimas antioxidantes reductase do glutatião e
peroxidase do glutatião.
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
estudados no que diz respeito à enzima peroxidase do glutatião. Os resultados obtidos para
a enzima reductase do glutatião encontram-se na Figura 28 e na Tabela XXVIII, sendo
evidente uma diminuição significativa nos indivíduos com idade de início superior a 55
anos comparativamente com os controlos.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Act
ivid
ade
da e
nzim
a G
lRed
(U/g
Hb)
Doentes início >55Controlos
*
Figura 28 - Valores médios de actividade da enzima reductase do glutatião no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Tabela XXVIII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a actividade da enzima GlRed nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (U/g Hb) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 6,00±1,65
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 6,21±1,62
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 5,76±1,67 *
Controlo 6,40±1,70
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 113 -
Grau de lipoperoxidação
O grau de lipoperoxidação foi avaliado pela determinação dos níveis de concentração
plasmática e eritrocitária de malonildialdeído (MDA) nos grupos de doentes e controlos.
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na comparação dos níveis
de MDA eritrocitário entre qualquer um dos grupos de doentes com o grupo controlo, tal
como é representado na Tabela XXIX.
Tabela XXIX - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de MDA eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (nmol/g Hb) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 21,38±16,82
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 20,22±13,42
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 17,53±10,62
Controlo 22,55±20,80
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Foram, no entanto, encontradas diferenças estatisticamente significativas nos valores
de MDA plasmático entre os grupos de doentes esporádicos com idade de início superior a
55 anos e o grupo controlo.
Tabela XXX - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de MDA plasmático nos grupos de indivíduos estudados.
Médias (uM) ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 1,55±0,70
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 1,53±0,82
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 1,40±0,59 *
Controlo 1,67±0,67
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
A Figura 29 apresenta os resultados significativos para os níveis de MDA entre o
grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e indivíduos controlo. É
evidente uma diminuição, no caso, estatisticamente significativa, nos valores de MDA
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 114 -
plasmático nos indivíduos com doença esporádica e idade de início superior a 55 anos,
quando comparados com os indivíduos controlo.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Con
cent
raçã
o de
MD
A p
lasm
átic
o (u
M)
Doentes início >55Controlos
*
Figura 29 - Valores médios de concentração de MDA no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e no grupo de indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos
Grau de oxidação proteica
O grau de oxidação proteica foi determinado através do doseamento dos grupos
carbonilo nos grupos indivíduos estudados. Não foram encontradas diferenças
significativas entre os grupos de indivíduos doentes e o grupo de indivíduos controlo. Estes
resultados encontram-se representados na Figura 30.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 115 -
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
400,00
450,00
Con
cent
raçã
o do
s gr
upos
car
boni
lo
DoentesDoentes início <55Doentes início >55Controlos
Figura 30 - Valores médios de concentração de grupos carbonilo em todos os grupos de indivíduos estudados. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos
A Tabela XXXI apresenta os valores médios, desvio padrão e valores de significância
estatística da concentração de grupos carbonilo nos grupos de indivíduos estudados.
Tabela XXXI - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de grupos carbonilo nos grupos de indivíduos estudados.
Médias ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 298,30±126,27
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 283,51±134,62
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 288,35±120,76
Controlo 280,93±128,25
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Metabolitos do monóxido de azoto
Na avaliação da produção de metabolitos do monóxido de azoto foram determinados
os níveis de nitratos e nitritos no plasma. No que diz respeito aos níveis de nitratos não
foram encontradas diferenças significativas entre os grupos de indivíduos doentes e o
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 116 -
grupo de indivíduos controlo. Os resultados dos níveis de nitratos apresentam-se na Tabela
XXXII.
Tabela XXXII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de nitratos nos grupos de indivíduos estudados.
Médias ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 3,29±5,54
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 2,48±2,95
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 4,71±7,83
Controlo 1,99±1,53
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
A Figura 31 e a Tabela XXXIII apresentam os níveis médios de nitritos nos grupos
estudados. Foram encontrados valores com diferenças estatisticamente significativas entre
o grupo de indivíduos esporádicos com idade de início superior a 55 anos e o grupo
controlo.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Con
cent
raçã
o de
nitr
itos
DoentesDoentes início <55Doentes início >55Controlos
*
Figura 31 - Valores médios de concentração de nitritos em todos os grupos de indivíduos estudados. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 117 -
Tabela XXXIII - Valores médios de concentração de nitritos em todos os grupos de indivíduos estudados.
Médias ± Desv. Padrão
Doentes de Parkinson 1,05±0,81
Doentes de Parkinson Início < 55 anos 0,88±0,55
Doentes de Parkinson Início > 55 anos 1,33±0,98 *
Controlo 0,94±0,69
São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 118 -
Discussão
Considerações metodológicas
Está descrita uma enorme variedade de estudos de associação entre casos/controlos
no que diz respeito à doença de Parkinson, tanto na vertente da análise de casos familiares,
como na análise de casos esporádicos. Apesar das vantagens óbvias de um estudo que
compare parâmetros entre estes dois grupos nestas condições, existem certas questões
metodológicas que devem ser tidas em atenção, com o objectivo de obter resultados tão
verdadeiros e fiáveis quanto possível. Entre estas questões sobressaem a população em
estudo, o desenho do estudo, o diagnóstico dos casos e a recolha da informação relevante
para a determinação da história familiar.
No que diz respeito aos estudos em formas familiares da doença, muitas vezes, tal
como no trabalho aqui apresentado, os casos são seleccionados de forma consecutiva, à
medida que se vão apresentando na consulta de neurologia para serem observados pelo
médico especialista. Neste tipo de estudo, uma selecção consecutiva de casos pode levar a
um enviesamento da amostragem, uma vez que, os familiares de indivíduos com doença de
Parkinson, normalmente, procuram assistência médica para a doença com maior frequência
do que a média de indivíduos.
Neste trabalho os indivíduos controlo foram seleccionados por dois métodos, sendo o
primeiro de forma aleatória na população, enquanto indivíduos neurologicamente
saudáveis que procuravam assistência médica, e o segundo método enquanto familiares em
segundo grau de indivíduos afectados, tendo, em qualquer um dos casos, havido
observação por parte do médico especialista.
Ainda no que concerne aos indivíduos com doença de Parkinson, a nossa amostra é
representativa de toda a população da região centro de Portugal, uma vez que, o serviço de
Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra é o principal centro de estudo e
tratamento destes indivíduos nesta região do país. A grande maioria dos doentes de
Parkinson nesta região vai, em determinada altura, ser referenciado para este serviço para
se proceder a um correcto diagnóstico ou tratamento da doença. Assim sendo, este estudo
fornece, muito provavelmente, uma correcta estimativa populacional dos doentes de
Parkinson da região centro de Portugal.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 119 -
Diferenças na distribuição por sexo e idade são factores que podem, também,
complicar a análise de associação entre casos e controlos. A probabilidade de desenvolver
doença de Parkinson aumenta com a idade [277] e está descrita como sendo duas vezes
mais elevada em indivíduos do sexo masculino [278]. No presente trabalho as distribuições
por sexo e por idade em ambos os grupos estudados verificaram-se como sendo
semelhantes.
A validação da história familiar foi um aspecto considerado como muito importante
neste estudo, uma vez que, apenas com esta correcta informação se poderia inferir sobre os
eventuais efeitos de genes associados à doença. Foi verificado, após uma primeira análise
deste parâmetro, que existia um elevado número de falsos negativos através dos
testemunhos de familiares. Sempre que possível a equipa médica observou todos os
indivíduos susceptíveis de serem classificados como falsos positivos ou falsos negativos
após o relato dos familiares.
A variabilidade do diagnóstico, causada pelo facto de vários especialistas observarem
os indivíduos com doença, foi grandemente reduzida, uma vez que, todas as entrevistas e
observações foram feitas pelos mesmos médicos. Sempre que necessário foram realizadas
entrevistas telefónicas em detrimento de questionários presenciais, de forma a obter
informações mais detalhadas de familiares e também para obter uma taxa de participação
mais elevada.
A precisão do diagnóstico é também um desafio em estudos epidemiológicos da
doença de Parkinson. O Sistema de Saúde Português oferece uma vantagem neste campo,
uma vez que, o diagnóstico na maioria dos casos é feito por médicos neurologistas. Todos
os doentes incluídos neste estudo foram observados por especialistas, tendo sido incluídos
apenas os indivíduos diagnosticados como doença de Parkinson e não como outras formas
de Parkinsonismo.
A influência de factores ambientais no desenvolvimento da doença de Parkinson é,
hoje em dia, tida como muito provável. Vários trabalhos tentaram determinar quais os
factores ambientais que poderiam desempenhar um papel na etiologia da doença, mas até
agora não tem havido relatos suficientemente consistentes nesta área. Entre estes factores,
os pesticidas, traumatismos cranianos, café e o tabaco parecem ser os mais importantes,
reunindo maior consenso na comunidade científica. Não caiu no âmbito do presente
trabalho fazer um estudo dos factores ambientais eventualmente relacionados com a
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 120 -
doença de Parkinson, podendo, por isso, haver um certo enviesamento de alguns resultados
eventualmente influenciados por este tipo de factores.
O nosso estudo genético não encontrou mutações no gene da alfa-sinucleína, o
primeiro gene a ser relacionado com o desenvolvimento da doença de Parkinson. O facto
de apenas ter participado neste estudo um pequeno número de famílias com um reduzido
número de membros, não nos permite excluir o envolvimento deste gene nas formas
familiares da doença de Parkinson em Portugal. No entanto, mutações no gene da alfa-
sinucleína parecem ser uma causa rara da doença. Scott et. al. num trabalho publicado em
1999 encontrou uma única mutação no gene da alfa-sinucleína em apenas 1 de 186 famílias
afectadas com doença de Parkinson, originando uma frequência de 0,5% para esta mutação
[279]. Para encontrar um gene que desempenhe um papel importante na doença de
Parkinson seria muito vantajoso se fosse possível estudar famílias grandes com vários
indivíduos afectados, através de análises de linkage.
Uma das grandes dificuldades nos estudos de associação, mais concretamente, nos
estudos de associação genética, tem sido a utilização de diferentes análises estatísticas
[280]. Assim sendo, neste trabalho utilizámos o mínimo de testes possíveis, e apenas os
testes mais consensuais neste tipo de análises [280].
Mecanismos genéticos
Alfa-sinucleína
Não foram encontradas alterações genéticas neste gene, à semelhança de outros
trabalhos publicados até à data [281]. Este facto não significa que alterações no gene da
alfa-sinucleína não estejam envolvidas no desenvolvimento da doença de Parkinson, mas
antes, que desempenham um papel menor, uma vez que, a sua frequência é
reconhecidamente muito baixa [114, 279]. No trabalho aqui apresentado, o estudo deste
gene foi realizado de forma a procurar todas as alterações já conhecidas neste gene, assim
como procurar novas alterações ainda não descritas. Até à data estão descritas três
mutações pontuais [23, 91, 94], e a duplicação e triplicação de todo o gene [112, 116]. Os
eventuais efeitos da alteração do número de cópias são, de certa forma, relativamente
fáceis de prever, pelo menos em comparação com os eventuais efeitos das mutações
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 121 -
pontuais. A alfa-sinucleína é o principal componente dos corpos de Lewy, agregados
proteicos, principal característica patológica da doença de Parkinson [282]. Um aumento
da quantidade desta proteína, como é sugerido pelo aumento do número de cópias do gene,
é de supor que incapacite o sistema de degradação proteica envolvido na degradação desta
proteína, levando à sua rápida acumulação e eventualmente depósito nos corpos de Lewy
[115]. Os mecanismos através dos quais as mutações pontuais no gene levam à acumulação
da alfa-sinucleína não são ainda conhecidos na sua plenitude, embora estudos in vitro
tenham demonstrado que estas formas da proteína tenham maior propensão em agregar
[108, 283]. As vias de agregação são, no entanto, diferentes para as duas mutações
pontuais inicialmente descritas. A mutação A30P acelera a formação de agregados
amorfos, enquanto que a mutação A53T aumenta a formação de fibrilas [284]. A
interacção/resposta desta proteína à presença de pesticidas foi também estudada por vários
autores, tendo sido encontradas diferenças nesta resposta por parte das diferentes formas de
proteína – a forma mutada A30P é muito susceptível à presença de pesticidas, agregando
com grande rapidez [105].
O facto de não termos encontrado alterações no gene da alfa-sinucleína não significa,
de forma alguma, que esta não possa exercer um efeito na etiopatogenia da doença de
Parkinson na nossa amostra de indivíduos com a doença. As funções concretas desta
proteína não são, ainda, completamente conhecidas, embora estejam descritas várias
funções putativas. Está descrito que a alfa-sinucleína interage com a proteína tau de forma
a regular a interacção desta com os microtúbulos [285], está também descrita a interacção
com a proteína cinase c na regulação da viabilidade celular, com o ácido fosfatídico na
inibição da libertação de neurotransmissores e regulação da plasticidade sináptica, entre
outras funções [82]. Uma das primeiras moléculas a ser descrita como agente de interacção
com a alfa-sinucleína foi a sinfilina-1 [286]. Embora também neste caso não seja
conhecido o produto final desta interacção, crê-se que a sinfilina-1 sirva como ponte de
ligação entre a alfa-sinucleína e outras proteínas, uma vez que esta também é componente
dos corpos de Lewy, como demonstrado por estudos imunohistoquímicos, o que sugere
uma forte ligação entre ambas as proteínas [82, 83].
Assim sendo, e existindo uma miríade de processos nos quais a alfa-sinucleína estará
eventualmente envolvida, é de supor que alterações noutros genes que com ela interajam,
ou nas cascatas de processos nos quais ela estará envolvida, levem a alterações de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 122 -
funcionamento do gene/proteína da alfa-sinucleína, culminando em modificações
patológicas.
Embora não tenha recaído no âmbito deste trabalho o estudo aprofundado deste gene
e proteína, seus mecanismos e eventuais efeitos adversos que contribuem para a origem da
doença de Parkinson, a alfa-sinucleína não deixa de ser uma peça fundamental em todo
este processo, na qual estarão, eventualmente, uma grande parte das respostas para as
questões biológicas colocadas hoje em dia, no âmbito desta doença.
Parkina
No que diz respeito ao estudo do gene da parkina, foram encontradas algumas
alterações, incluindo alterações não descritas até à data.
Desde 1998 que se sabe que este gene é responsável por um subtipo de doença de
Parkinson, a doença de Parkinson Autossómica Recessiva Juvenil (AR-JP) [119]. O gene
da parkina é um gene relativamente extenso com 12 exões contendo cerca de 500 mil pares
de bases [128]. Este gene codifica uma proteína, com o mesmo nome, com 465
aminoácidos, caracterizada por possuir um domínio ubiquitin-like no seu terminal amínico,
dois domínios RING finger e um domínio IBR (In Between RING-finger) [287].
No final da década de 90 foi sugerido que a parkina teria uma função semelhante à
dos membros da família ubiquitina, e que uma alteração neste gene poderia interferir na
cascata proteolítica mediada pela ubiquitina, culminando na morte dos neurónios da
substância nigra [119]. Foi, no entanto, só no ano de 2000 que foi demonstrado que a
parkina está envolvida no processo de degradação proteica funcionando como uma
proteína-ubiquitina ligase em colaboração com a proteína UbcH7 [288]. O domínio RING
finger presente na parkina é conhecido em várias outras proteínas que têm função como E3
ligases no processo de degradação pelo proteassoma. Este facto desde cedo sugeriu esta
função para a proteína, mas apenas foi confirmado mais tarde [137, 288]. Formas wild-type
desta proteína rapidamente ubiquitinam as suas proteínas substrato, marcando-as para
degradação pelo proteassoma e, de forma inversa, formas mutadas da proteína não exibem
a sua actividade E3, indicando uma correlação inversa entre a actividade enzimática e o
fenótipo da doença [289]. Desta forma, um defeito genético no gene da parkina levará a
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 123 -
que o substrato desta proteína não seja degradado, acumulando-se e, eventualmente
conduzindo a doença de Parkinson [290].
Nesta altura está descrita uma enorme variedade de mutações e polimorfismos no
gene da parkina, entre delecções e inserções exónicas ou pontuais, mutações sinónimas,
missense ou nonsense [121]. Até agora a grande maioria das mutações descritas
encontram-se localizadas nos domínios RING-IBR-RING, sugerindo que esta região é uma
região chave no funcionamento desta proteína. Em dois estudos independentes realizados
por Lucking et. al. e por Abbas et. al. verificou-se que mutações na parkina são causa de
doença de Parkinson em cerca de 30% de famílias com formas autossómicas recessivas de
parkinsonismo [122, 291]. Mais recentemente foi verificado que alterações no gene da
parkina podem ser responsáveis por cerca de 50% de formas familiares e 10-20% de
formas com história familiar negativa, revelando a sua importância no que diz respeito ao
estudo desta doença [292].
No que diz respeito à correlação entre a mutação ou o tipo de mutação e
características clínicas, até agora não foi encontrada qualquer tipo de relação. Não foi
encontrada nenhuma diferença clínica entre doentes com delecções exónicas, mutações
missense ou truncating, o que sugere que as mutações pontuais afectam aminoácidos
cruciais no funcionamento e, muito provavelmente, levam à completa perda de função da
proteína [291].
Outra função relevante da proteína parkina prende-se com o seu eventual papel na
agressão oxidativa que se sabe estar acentuada na doença de Parkinson [293]. A expressão
de formas mutadas de parkina afecta a função do proteassoma, e como está descrito que a
inibição do proteassoma aumenta o nível de stresse oxidativo, é de supor que a parkina
desempenha um papel a nível do aumento da agressão oxidativa quando são expressas
formas mutadas da proteína [294].
O primeiro resultado obtido neste trabalho relativamente à parkina foi a observação
de uma mutação previamente descrita no exão 2 do gene. Esta mutação, uma delecção de
um par de bases (255delA), origina uma mutação frameshift que insere um codão Stop
prematuro a cerca de 30 pares de base [122].
Esta mutação foi encontrada sob a forma de homozigotia num indivíduo com história
familiar positiva e início precoce da doença, o que está de acordo com o fenótipo descrito
para mutações no gene da parkina [295]. O indivíduo em estudo apresenta uma idade de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 124 -
início da doença de 30 anos, tendo um dos progenitores sido diagnosticado com doença de
Parkinson e falecido posteriormente por causas não relacionadas. Nenhum outro familiar
apresenta doença de Parkinson ou qualquer outro tipo de parkinsonismo. A mutação
presente neste indivíduo é, de certa forma, explicativa do funcionamento da proteína neste
caso particular. Existindo um codão Stop no exão 2 de um gene que possui 12 exões,
significa que a maior parte da informação contida no gene não é traduzida para proteína. É
de assumir que neste indivíduo não existe proteína parkina, embora não tenham sido
efectuados ensaios de quantificação de mRNA. A idade de início da doença apresentada é
extraordinariamente precoce, o que está de acordo com uma função chave da parkina no
processo neurodegenerativo apresentado pelos doentes de Parkinson em geral, e por este
indivíduo em particular.
No que diz respeito à restante família, o progenitor afectado pela doença faleceu
antes do início deste estudo, pelo que não foi possível realizar análise genética neste
indivíduo, o que seria importante para verificar se este possuía a mutação em estado de
homo ou heterozigotia. No entanto, todos os outros membros mais próximos foram
analisados, mesmo que não tenham qualquer tipo de fenótipo associado à doença de
Parkinson. Dos indivíduos analisados fazem parte descendentes, cônjuge, progenitor e
familiar em segundo grau por parte do progenitor falecido. Os resultados obtidos são
esclarecedores quanto à importância desta proteína. Com a excepção do cônjuge, todos os
outros membros da família possuem a mutação em estado de heterozigotia, sem nunca
terem desenvolvido fenótipo de doença de Parkinson. Este facto poderia levar a considerar
que uma cópia apenas do gene seria suficiente para um normal funcionamento da proteína,
no entanto, verificou-se que quando um dos familiares foi submetido a terapêutica com
antidepressivos, este desenvolveu graves discinésias, o que leva a outra conclusão: uma só
cópia do gene da parkina não causa doença de Parkinson, mas funciona como factor de
risco para o desenvolvimento de parkinsonismo. Esta conclusão quanto ao gene da parkina
sugere que esta talvez esteja sujeita a um processo de haploinsuficiência, ou seja, a
presença de apenas uma cópia do gene não é suficiente para realizar a totalidade das
funções requeridas a essa proteína. Tal conceito foi já aplicado a outros genes envolvidos
na doença de Parkinson [110].
A história familiar desta família, após o estudo genético, sugere que nalgum ponto
tenha existido consanguinidade, uma vez que, ambos os progenitores do indivíduo em
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 125 -
estudo possuíam a mesma mutação genética, mutação esta que é rara na população [122].
Embora um dos progenitores não tenha sido estudado do ponto de vista genético, a
probabilidade é de que este possuísse a mutação em homozigotia, uma vez que, caso a
possuísse em heterozigotia, muito provavelmente não teria desenvolvido doença de
Parkinson, mas apenas um fenótipo sugestivo de parkinsonismo, e apenas se tivesse sido
sujeito a factores ambientais que o colocassem em risco para o desenvolvimento desse
mesmo fenótipo.
A não existência de parkina leva a uma alteração do sistema do proteassoma que
culmina, provavelmente, na acumulação das proteínas substrato da parkina. Embora não se
conheçam em detalhe todos os substratos da parkina [296], esta ideia está de acordo com a
acumulação proteica encontrada no tecido cerebral dos doentes de Parkinson.
No que diz respeito aos mecanismos de stresse oxidativo neste indivíduo, no qual
seria de esperar encontrar alterações dos marcadores de agressão oxidativa, tal não
acontece. O facto deste indivíduo não expressar parkina não faz aumentar os níveis dos
marcadores de agressão oxidativa estudados, nomeadamente a actividade de enzimas
antioxidantes, à semelhança do que foi já descrito [294]. Ao contrário de outros estudos
[294, 297], não foi possível encontrar alterações significativas nos níveis de GSH, ou dos
marcadores de oxidação proteica ou lipídica, ou nos níveis de nitratos e nitritos, quando
comparando este indivíduo com o restante grupo de doentes ou com o grupo de controlos.
Outro resultado deste trabalho foi a descrição de outra mutação, esta desconhecida
até à data, no exão 11 do gene da parkina. Neste caso foi encontrada a transição de um
Glutamato para um codão Stop na posição 395 da sequência aminoacídica. A consequência
directa desta mutação é o facto de o resto do exão 11 e todo o exão 12 do gene não serem
traduzidos e, portanto, não fazerem parte da proteína. A informação genética contida no
exão 11, ainda faz parte da informação necessária para codificar um RING finger, pelo que
este indivíduo não terá uma proteína completamente funcional. De acordo com o
cromatograma obtido para a sequenciação deste exão, a mutação existe em homozigotia.
No entanto, foi necessário confirmar este resultado, uma vez que podíamos estar perante
uma mutação pontual num alelo, existindo no outro alelo uma delecção exónica, o que
daria um cromatograma idêntico ao obtido, mas consequências moleculares e,
eventualmente, clínicas absolutamente distintas. Assim sendo, foi feita uma análise de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 126 -
dosagem génica ao exão 11 do gene da parkina neste indivíduo. O resultado deste ensaio
indicou que não existe alteração do número de cópias deste exão, o que confirma a
presença da mutação em homozigotia.
Este indivíduo apresenta uma idade de início de 53 anos, o que está de acordo com as
características clínicas do efeito de mutações no gene da parkina, e apresenta também uma
história familiar positiva, com dois irmãos afectados com doença de Parkinson, não
havendo relatos de fenótipo sugestivo nos progenitores. Este indivíduo apresenta uma
forma tremórica da doença sem que tenha desenvolvido demência.
No que diz respeito aos efeitos desta alteração genética nos mecanismos de stresse
oxidativo, uma vez mais não se encontram alterações significativas nos marcadores
estudados quando comparando com o restante grupo de doentes. Há, no entanto, uma
ligeira elevação nos níveis de MDA plasmático, o que sugere um aumento nos níveis de
lipoperoxidação neste indivíduo, embora não seja fácil estabelecer uma relação de
causalidade directa entre a alteração genética e este facto.
Foi ainda encontrada uma mutação polimórfica no exão 11 de outro indivíduo com
história familiar positiva. Esta mutação, que se caracteriza pela transição de um Aspartato
para uma Asparagina na posição 394 da sequência aminoacídica, dificilmente poderá ser
considerada como a causa da doença neste indivíduo, uma vez que está descrita como
existindo em cerca de 7% de indivíduos saudáveis [122, 298], embora não tenha sido
encontrada em nenhum dos indivíduos controlo da nossa amostra. Não foi encontrada
qualquer outra alteração nos genes estudados neste indivíduo.
Como resultado do estudo de dosagem génica do gene da parkina, apenas um
rearranjo foi encontrado na nossa amostra. O rearranjo encontrado foi uma duplicação
heterozigótica do exão 8 do gene em apenas 1 indivíduo. Este indivíduo apresenta uma
forma esporádica da doença, com uma idade de início de 33 anos e 9 anos de evolução.
Apresenta uma forma tremórica da doença, sem presença de demência ou distonia. Embora
estejamos perante o caso de uma alteração heterozigótica, esta reveste-se de particular
importância, uma vez que, o exão 8 do gene se encontra na região codificante do domínio
RING-IBR-RING. Mais concretamente, o exão 8 possui informação de parte do primeiro
RING finger e de toda a região que separa este domínio do domínio IBR [299]. Assim
sendo, é de esperar que uma duplicação desta região, que se sabe ser fundamental no
funcionamento da proteína, tenha consequências ao nível da sua função, causando, muito
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 127 -
provavelmente, perda de função da mesma. A mutação aqui descrita não é uma nova
mutação, tendo já sido encontrada por dois outros grupos [148, 300], num total de 10
indivíduos afectados. Na primeira descrição desta mutação, foram estudadas 47 famílias
com doença de Parkinson tendo alterações no exão 8 sido encontradas em 19 destas
famílias, ou seja, em mais de 40% dos indivíduos, o que leva a crer que este seja um local
particularmente propenso à ocorrência de mutações, especialmente a alterações do número
de cópias [148]. Nos indivíduos afectados pela duplicação heterozigótica do exão 8 do
gene, não foi encontrada qualquer outra mutação no gene da parkina, em nenhum dos
estudos realizados, incluindo no trabalho aqui apresentado. Existe, no entanto, uma enorme
variabilidade no que diz respeito às características clínicas destes indivíduos, uma vez que,
por exemplo, a idade de início da doença varia entre os 33 e os 65 anos de idade, e os casos
variam entre esporádicos e formas familiares com três ou mais indivíduos afectados por
família. Esta variabilidade sugere, provavelmente, um de dois cenários: ou existem
alterações noutros genes que não foram estudados, alterações essas responsáveis por esta
variabilidade; ou estas alterações têm consequências muito diversas dependendo de
características ambientais a que os indivíduos sejam sujeitos. Não existem, até hoje,
estudos que possam estabelecer uma relação entre factores ambientais e algumas das
mutações genéticas mais frequentes no gene da parkina, o que poderia explicar, pelo
menos parcialmente, a complexa variabilidade fenotípica apresentada pelos indivíduos
afectados por mutações neste gene [66, 301].
Várias das mutações no gene da parkina que foram descritas até à data ocorrem em
heterozigotia, o que tem causado alguma controvérsia [146, 295, 302, 303]. No entanto não
é possível, com certeza, determinar se estes indivíduos são verdadeiramente
heterozigóticos, ou se são heterozigóticos compostos, apresentando, neste caso, uma
mutação não encontrada no outro alelo. Tal evento pode suceder no trabalho aqui
apresentado sem que seja detectado, basta para isso que a mutação se encontre no promotor
ou num intrão do gene. É, por isso, possível que estes indivíduos apresentem mutações que
não tenham sido encontradas, sendo nesse caso, heterozigóticos compostos, o que facilita a
compreensão deste gene como causa da doença nestes indivíduos [300].
No que diz respeito aos marcadores de stresse oxidativo neste indivíduo que
apresenta este rearranjo no gene da parkina, não foram encontradas diferenças
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 128 -
significativas nos marcadores estudados, quando comparado com o restante grupo de
indivíduos com doença de Parkinson.
PINK1
Este trabalho incidiu, também, no estudo do gene PINK1 (PTEN induced kinase-1).
O estudo deste gene pretendia, à semelhança do realizado para o gene da parkina, procurar
mutações pontuais e alterações do número de cópias do gene.
A função real da proteína codificada pelo gene PINK1 não é ainda conhecida [304],
mas através de informações obtidas pela localização celular e estrutura do gene, é possível
especular quanto à sua eventual função. Na primeira publicação sobre este gene, que
através de ensaios de genome wide linkage foi considerado como causa da doença de
Parkinson nos indivíduos estudados, foi também descrito que a localização celular da
proteína coincide com aquela da mitocôndria [173]. Esta foi uma descoberta relevante,
uma vez que, o papel da mitocôndria na doença de Parkinson há muito que vem sendo
debatido. Como confirmação desta co-localização celular, surgiu a descrição, pelo mesmo
grupo, que o terminal amínico da PINK1 contém um domínio de ligação mitocondrial.
Para além deste domínio, a proteína possui outro que se assemelha a um domínio de
proteína cinase [173]. Os substratos da PINK1 não são ainda conhecidos, no entanto, em
ensaios de cultura celular verificou-se que formas wild-type da PINK1 protegem as células
do stresse induzido pela disfunção mitocondrial, o que não acontece com formas mutadas
da proteína [173, 174].
São já várias as descrições de casos de doença de Parkinson causada por mutações
pontuais no gene PINK1, embora não estejam descritos, até à data, rearranjos no gene
[174, 177, 178].
Na nossa amostra encontrámos um indivíduo que possui duas mutações não descritas
neste gene. Ambas as mutações são missense, acontecendo uma na posição 193 da cadeia
aminoacídica, causando a transição de uma Glicina para uma Valina, e a outra na posição
220, originando a troca de uma Metionina por uma Isoleucina. Embora tenhamos
encontrado duas novas mutações missense no gene, faltava determinar se estaríamos
perante um indivíduo heterozigótico composto ou um indivíduo heterozigótico para ambas
as mutações, ou seja, se as mutações se encontram em trans, alelos diferentes, ou em cis,
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 129 -
mesmo alelo, o que teria consequências moleculares e, eventualmente, fenotípicas
absolutamente distintas. Após digestão do DNA com enzima de restrição e sequenciação
do fragmento não digerido, concluiu-se que as mutações se encontram em alelos diferentes,
tratando-se, por isso, de um indivíduo heterozigótico composto.
O indivíduo em causa apresenta a idade de início mais baixa de toda a nossa série de
doentes – 20 anos de idade com outros 20 de evolução da doença. A forma da doença é
esporádica, não apresentando demência ou distonia.
Ambas as mutações encontradas neste indivíduo se localizam no domínio de proteína
cinase, o que sugere, no mínimo uma alteração da função, mas muito provavelmente
ocorrerá uma perda da função da proteína codificada.
Não foram encontradas outras mutações pontuais na nossa amostra, no entanto, foram
detectados três indivíduos com rearranjos, mais concretamente com delecções
heterozigóticas de diferentes exões do gene – mutação esta não descrita até à data. Todos
estes três indivíduos apresentam características clínicas semelhantes, embora possuam
mutações distintas. A idade de início da doença é semelhante, entre 47 e 54 anos, nenhum
apresenta demência e todos apresentam história familiar positiva para doença de Parkinson.
O primeiro caso apresenta uma delecção heterozigótica do exão 1 do gene PINK1.
Este exão codifica o domínio de ligação mitocondrial da proteína, pelo que, na sua
ausência é natural admitir que a proteína não esteja presente na mitocôndria. Este indivíduo
apresenta história familiar positiva, tendo dois irmãos afectados, embora não tenha sido
possível a análise deste gene nestes indivíduos. A idade de início neste caso é de 47 anos e
a forma de apresentação da doença foi tremórica. Apresenta distonia muito dolorosa com
boa resposta a L-Dopa. Dos três indivíduos nesta família, este apresenta a forma mais
grave da doença.
O segundo caso apresenta uma delecção heterozigótica do exão 2 do gene. A
apresentação clínica da doença é em tudo semelhante ao caso anterior, sendo uma forma
familiar de início tremórico e com distonia, a idade de início é de 50 anos. Embora o exão
2 não faça parte do domínio de ligação mitocondrial, é de supor que a sua ausência tenha
algum efeito nesta ligação, uma vez que o fenótipo apresentado é semelhante ao do
indivíduo anterior.
O terceiro indivíduo afectado apresenta uma delecção heterozigótica de ambos os
exões 1 e 2. A história familiar neste indivíduo é, também, positiva tendo como idade de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 130 -
início da doença 54 anos. As características clínicas deste indivíduo são semelhantes às dos
anteriores, o que sugere que a falta de apenas um dos primeiros exões tenha o mesmo
efeito que a falta de ambos, o que pode significar que tenham funções interdependentes.
Num trabalho paralelo realizado em simultâneo pelos autores, verificou-se que o
indivíduo com a forma de doença mais grave possui, também, uma mutação no gene lrrk2
[203], gene este descrito recentemente e no qual mutações são causa frequente da doença
de Parkinson [197-199]
GST
As glutatião transferase são um grupo de enzimas destoxificantes envolvidas no
metabolismo de pesticidas e outras toxinas. Têm actividade antioxidante e estão, também,
envolvidas no metabolismo da dopamina [305]. Tem sido descrito que a actividade da
glutatião transferase é normal no cérebro de indivíduos com doença de Parkinson [306].
Embora não exista até à data qualquer associação entre esta patologia e os polimorfismos
na glutatião transferase, a distribuição do genótipo deste gene difere significativamente
entre doentes e controlos que tenham sido expostos a pesticidas [307]. Assim sendo, a
glutatião transferase, que é expressa na barreira hemato-encefálica, pode influenciar a
resposta a neurotoxinas e pode explicar a susceptibilidade de determinados indivíduos aos
efeitos de certos pesticidas [305].
Estão descritas duas alterações nucleotídicas neste gene que resultam nas trocas
aminoacídicas Ile105Val e Ala114Val [308]. O local polimórfico no resíduo 105 tem sido
associado com a estabilidade da enzima e com a sua preferência do substrato [263], pelo
contrário, o polimorfismo no local 114 não está descrito como tendo alteração na função da
enzima.
Neste trabalho foi realizada a análise de associação entre cada um destes
polimorfismo e os diferentes grupos de indivíduos estudados sob o ponto de vista genético.
Assim sendo, foi realizada a análise destes polimorfismos na totalidade da amostra de
indivíduos com doença de Parkinson, posteriormente apenas no subgrupo de indivíduos
com forma esporádica da doença e, por fim, no subgrupo de indivíduos com início
esporádico e com idade de início superior a 55 anos de idade. Este último grupo tinha
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 131 -
como objectivo estudar a forma da doença idiopática, ou seja, a forma mais comum
apresentada pelos doentes.
Desta forma, ao realizar a análise dos genótipos do polimorfismo Ile105Val na
totalidade dos indivíduos doentes, verificou-se existirem diferenças significativas entre os
grupos. Os resultados obtidos indicam uma diferença estatisticamente significativa
(p=0,0366) com o aumento do genótipo AA no grupo de indivíduos doentes. Este genótipo
codifica a enzima com actividade e especificidade de substrato alteradas. A segunda
análise foi feita no subgrupo de indivíduos com forma esporádica da doença. Esta
subdivisão do grupo de indivíduos visa subtrair os casos que sejam devidos a outras causas
genéticas, como por exemplo, a alterações em genes previamente associados à doença de
Parkinson. Neste caso foi verificada, também, uma diferença estatisticamente significativa
entre os grupos (p=0,0327), sendo inclusivamente, uma diferença mais significativa do que
no caso anterior. No entanto ao analisar os resultados do subgrupo com forma esporádica e
com idade de início superior a 55 anos, verificou-se não existirem diferenças significativas
(p>0,05). Com a análise deste conjunto de resultados, verifica-se que, nesta amostra, a
presença do genótipo que codifica uma alteração na função da enzima é um factor de risco
para o desenvolvimento da doença de Parkinson, sendo-o inclusivamente num subgrupo de
indivíduos com forma esporádica da doença. No entanto, para esta análise ser
absolutamente correcta, seria necessário realizar o estudo tendo em conta a variável
pesticidas, uma vez que, os estudos realizados nesta patologia com os polimorfismos desta
enzima apresentam resultados significativos apenas quando feita a análise de factores
ambientais [305]. Provavelmente é devido a este parâmetro que não são encontradas
diferenças significativas no último subgrupo estudado. De qualquer forma, estes resultados
permitem inferir que a presença da forma 105Val é, de facto, um factor de risco para o
desenvolvimento da doença de Parkinson em indivíduos sem qualquer história familiar
para esta patologia, e, neste contexto, deveria ser utilizado como marcador de diagnóstico e
de determinação de factor de risco para esta doença.
Ainda no gene da transferase do glutatião foi estudada a transição Ala114Val,
alteração esta que não é conhecida como causa de alteração da função da enzima, embora
seja uma mutação missense. Neste caso não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre os genótipos apresentados pelos indivíduos pertencentes aos grupos
estudados, sendo que a maior diferença existiu ao comparar o subgrupo de indivíduos com
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 132 -
forma esporádica da doença e idade de início superior a 55 anos. Da mesma forma, a
análise de alelos não revelou qualquer diferença significativa, tendo-se, no entanto, este
último subgrupo aproximado da significância estatística (p=0,05), tendo como origem uma
maior prevalência do alelo mutado nos indivíduos pertencentes ao grupo controlo. Existe,
neste caso, uma maior percentagem de indivíduos com o genótipo homozigótipo wild-type
apresentando a doença, quando comparados com os indivíduos controlo, não sendo no
entanto, uma diferença significativa. Assim sendo, a mutação Ala114Val não se apresenta
como um bom marcador de factor de risco para o desenvolvimento para a doença de
Parkinson, nem parece estar de alguma forma envolvida na patogénese desta.
NOS
A molécula de monóxido de azoto é um mensageiro biológico com uma grande
variedade de funções fisiológicas. No entanto, o NO é, também, um radical livre que se
pode combinar com aniões superóxido para formar peroxinitrito, composto citotóxico.
Estão descritas três isoformas da sintetase do monóxido de azoto (NOS): isoforma
neuronal (nNOS), isoforma endotelial (eNOS) e isoforma indutível (iNOS) [309]. Das três
isoformas, a nNOS e a iNOS são particularmente relevantes no que diz respeito a
potenciais implicações na neurodegeneração e na resposta glial que ocorre na doença de
Parkinson [310, 311]. Estão descritas várias possibilidades de envolvimento do NO e da
NOS na etiologia da doença de Parkinson, tanto em humanos como em modelos animais
da doença. Em particular, a inibição da nNOS e da iNOS, usando fármacos ou ratinhos
knock-out, previne a destruição de neurónios dopaminérgicos em modelos MPTP da
doença de Parkinson [312-314].
Assim sendo, nós pretendemos determinar se polimorfismos nos genes da nNOS e da
iNOS estão associados ao desenvolvimento de doença de Parkinson na nossa amostra de
indivíduos com a doença. Para tal, foram estudados dois polimorfismos no gene da nNOS,
um localizado no exão 18 e o outro no exão 29, e um polimorfismo no gene da iNOS,
localizado no exão 22 [261].
Quanto ao primeiro polimorfismo, localizado no exão 18 do gene da nNOS, não
foram encontradas quaisquer diferenças significativas entre os grupos de doentes e o grupo
de indivíduos controlo. À semelhança do que foi realizado no gene da GST, o grupo de
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 133 -
indivíduos com doença de Parkinson foi subdividido em mais dois grupos, um com a
totalidade de indivíduos com forma esporádica da doença, incluindo idades de início
inferior a 55 anos, e outro de indivíduos com forma esporádica mas com idades de início
da doença superior a 55 anos de idade. Em nenhum destes grupos foi encontrada diferença
significativa quando comparados com o grupo de indivíduos controlo, nem no que diz
respeito à distribuição de genótipos, nem no que diz respeito à distribuição alélica. Assim
sendo, podemos inferir destes resultados que o polimorfismo no exão 18 do gene da iNOS
não desempenha um papel no desenvolvimento da doença de Parkinson na nossa amostra
de indivíduos.
Ao observar os resultados obtidos para o exão 29 do mesmo gene, verifica-se que não
existe uma associação na distribuição dos genótipos quando se compara a totalidade do
grupo de indivíduos com a doença com o grupo de indivíduos controlo. Da mesma forma,
a distribuição alélica não apresenta diferenças entre estes dois grupos. Quando são
comparados os grupo de indivíduos com forma esporádica da doença e o grupo de
indivíduos controlo, verifica-se que existe uma diferença estatisticamente significativa na
distribuição de genótipos (p=0,03). No entanto, a distribuição alélica não difere
significativamente entre estes dois grupos. Quando a comparação de distribuição de
genótipos é feita entre o grupo de indivíduos com forma esporádica da doença e idade de
início superior a 55 anos e o grupo de indivíduos controlo, o valor de significância é, ainda,
mais pequeno indicando uma associação mais forte (p=0,0016). No entanto, ao comparar a
distribuição alélica, não são encontradas diferenças significantes.
No que diz respeito ao estudo do polimorfismo no exão 22 do gene da isoforma
iNOS, não foram encontradas diferenças significativas entre nenhum dos grupos estudados.
Uma vez que este polimorfismo é um polimorfismo silencioso, ou seja, não altera a
sequência aminoacídica, podemos concluir que esta alteração neste gene não está
relacionada com o desenvolvimento da doença de Parkinson na nossa amostra de
indivíduos.
No estudo do gene da NOS, a única associação encontrada foi ao analisar os
resultados do polimorfismo no exão 29 do gene da nNOS em indivíduos com, apenas
forma esporádica, ou mesmo com forma esporádica e com idade de início superior a 55
anos. Uma vez que a funcionalidade deste polimorfismo não é conhecida, permanece por
determinar se esta alteração é um evento inicial na susceptibilidade para a doença de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 134 -
Parkinson em indivíduos sem história familiar para esta patologia. Outra possibilidade é de
que este polimorfismo esteja em linkage disequilibrium com um outro polimorfismo
funcional ou com outro gene na sua proximidade. Este polimorfismo está localizado num
exão na região não traduzida 5’ (5’UTR) [315]. Esta região é frequentemente associada
com a regulação de transcriptos e com a estabilidade do mRNA. Assim sendo, este
polimorfismo pode mediar este efeito, tendo consequências na quantidade final de proteína
produzida [316].
De qualquer forma, os resultados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo
estudado no exão 29 do gene da nNOS é um factor de risco para o desenvolvimento da
doença de Parkinson, devendo ser realizados estudos para determinar a sua funcionalidade.
HFE
Níveis elevados de ferro têm sido encontrados nas células da substância nigra de
cérebros de indivíduos com doença de Parkinson, tanto em análises por ressonância
magnética como em análise post-mortem [317, 318]. A acumulação e deposição de ferro
no cérebro, pode causar uma superprodução de radicais livres e culminar em formas de
parkinsonismo [319]. A hemocromatose é uma desordem hereditária de acumulação de
ferro, onde a maioria dos casos se deve a duas mutações no gene HFE [244, 320]. A
mutação C282Y é muito penetrante e leva a uma rápida sequestração de ferro [245], tendo
a outra mutação uma penetrância inferior e actuando como factor de risco para o
desenvolvimento da hemocromatose. Assim sendo, o papel do gene HFE no metabolismo
do ferro, tornam-no um potencial gene candidato para o desenvolvimento da doença de
Parkinson. Resultados recentes do papel das mutações no gene HFE na D.P. variam de um
efeito protector da heterozigotia C282Y até à ausência de qualquer efeito de qualquer uma
das mutações [248, 249].
No trabalho aqui apresentado relativo à mutação C282Y, verificou-se não existir
qualquer associação entre a distribuição dos genótipos e o desenvolvimento da doença de
Parkinson, quando comparando qualquer um dos grupos de indivíduos doentes com o
grupo de indivíduos controlo. No entanto, ao realizar a análise da distribuição alélica os
resultados são distintos. Embora não tenha sido obtida uma associação significativa com a
totalidade do grupo de doentes, ao analisar os subgrupos de indivíduos com forma
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 135 -
esporádica e com idade de início superior a 55 anos verificou-se existir associação
estatisticamente significativa (p=0,0467 e p=0,0096 respectivamente). Destes resultados
pode-se concluir que o genótipo da mutação C282Y não actua como um factor de risco
nesta amostra de indivíduos, no entanto, a presença de um determinado alelo pode exercer
alguma influência na susceptibilidade destes indivíduos à doença de Parkinson, mais
concretamente de indivíduos sem história familiar para a doença e com idade de início
superior a 55 anos de idade.
No que diz respeito à mutação H63D, não foram encontradas associações
significativas em nenhum dos grupos estudados, nem no que concerne à distribuição dos
genótipos, nem no que concerne à distribuição alélica, sugerindo, por isso, que esta
mutação não desempenha um papel no desenvolvimento da doença de Parkinson.
Stresse Oxidativo
A existência de um estado persistente de stresse oxidativo em doentes de Parkinson
tem sido demonstrada desde há longos anos [217, 293]. Neste trabalho foi proposto realizar
um estudo de associação entre indivíduos com doença de Parkinson e indivíduos controlo
no que diz respeito a uma série de marcadores biológicos de stresse oxidativo.
O grupo de indivíduos com doença foi subdividido, à semelhança da subdivisão
realizada no estudo genético, com a obtenção de três grupos de indivíduos: com o total de
doentes, doentes com idade de início precoce (<55 anos de idade) e início tardio (>55 anos
de idade).
No que diz respeito às defesas antioxidantes não enzimáticas, foram encontradas
algumas alterações entre indivíduos doentes e indivíduos controlo. O ácido úrico, defesa
antioxidante, foi encontrado mais elevado em indivíduos doentes do que em indivíduos
controlo, tanto no grupo com a totalidade de indivíduos como no subgrupo de indivíduos
com início tardio da doença. Esta elevação de um antioxidante em indivíduos doentes pode
significar uma resposta adaptativa à agressão oxidativa. Por outro lado, diferenças
metabólicas e de sexo, assim como algumas condições patológicas (doença renal, doenças
metabólicas) [321, 322], dieta [321, 323] e exercício intenso [324] podem estar associadas
a um aumento da concentração plasmática de ácido úrico, introduzindo factores de
variabilidade nos resultados. Foi encontrado um aumento no TAS (estado antioxidante
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
- 136 -
total), cujo principal componente é o ácido úrico, em ratinhos aos quais tinha sido
administrada uma dieta rica em etanol. Este aumento no TAS foi explicado pelo aumento
no ácido úrico devido à degradação das purinas induzida pelo etanol [325]. Assim sendo, o
efeito tóxico do consumo crónico de etanol resultou num aumento paradoxal da capacidade
antioxidante total do plasma. Resultados idênticos foram obtidos por Mackinnon e
colaboradores em indivíduos com disfunção renal, nos quais se verificou um aumento da
concentração de ácido úrico e concomitantemente da capacidade antioxidante total [326].
Outro parâmetro estudado enquanto defesa antioxidante não enzimática foi o TAS.
Também aqui foram encontradas diferenças significativas, estando, neste caso, presentes
em todos os subgrupos. Existe um aumento do estado antioxidante total nos indivíduos
com a doença de Parkinson o que, de certa forma, é contrário ao conceito da existência de
um aumento da agressão oxidativa nestes indivíduos. Este resultado, aparentemente
paradoxal, pode ser explicado segundo diferentes perspectivas. A primeira prende-se com
o método de armazenamento da amostra antes da realização da análise. Está descrito que
após um armazenamento de apenas 4 horas se verifica uma modesta diminuição do TAS,
seguido de uma rápida e severa diminuição após três dias de armazenamento a -80ºC [327].
Assim sendo, o teste de TAS deve ser executado imediatamente após a colheita, para que
as consequências da curta semi-vida dos compostos antioxidantes não se façam sentir.
Outra explicação para este facto, quiçá a mais provável, prende-se com o facto de a
determinação do TAS no plasma ser baseada numa combinação do efeito de vários
antioxidantes, incluindo os grupos tiol de proteínas e do ácido úrico. Assim sendo,
resultados contraditórios podem ocorrer, por exemplo, sendo a concentração de ácido úrico
no plasma muito elevada, ela contribui substancialmente na determinação do TAS. Como o
ácido úrico se encontra elevado em várias condições clínicas em que existe a implicação do
stresse oxidativo (p.e. falha renal, doenças metabólicas), pode ocorrer um aumento nos
níveis de TAS, embora fosse esperado um resultado absolutamente contrário [326-328].
Como nestes indivíduos os valores da concentração de ácido úrico se encontram elevados,
é possível que ocorra este artefacto, aumentando os níveis de TAS, sem que o estado
antioxidante total seja de facto superior.
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
- 137 -
O estudo dos níveis de glutatião reduzido, um dos antioxidantes mais eficazes,
revelou diferenças estatisticamente significativas no que diz respeito à sua componente
eritrocitária. Foi encontrada uma diferença na concentração de GSH a nível dos eritrócitos
quando foi comparado a totalidade do grupo de indivíduos com doença com o grupo de
indivíduos controlo, tendo sido obtido um resultado idêntico ao realizar a comparação do
grupo de indivíduos controlo com os indivíduos com início precoce da doença. Foi
evidente uma diminuição da concentração de GSH eritrocitária nos grupos de indivíduos
com doença mencionados, o que está de acordo com o conceito da existência de uma
depleção de GSH na doença de Parkinson, o que confirma o estado persistente de stresse
oxidativo [329]. Ainda no que diz respeito ao ciclo do glutatião, foi encontrado um
aumento, a nível dos controlos, da razão GSH/GSSG quando comparados com o grupo de
indivíduos com início precoce da doença. Esta diferença é secundária, como é evidente, à
diminuição de GSH nos indivíduos com a doença. No que diz respeito à totalidade de
indivíduos com a doença, esta razão não é estatisticamente diferente, mas o seu valor
aproxima-se da significância (p=0,057). No grupo de indivíduos com início tardio da
doença verificou-se um aumento da concentração de glutatião oxidado, o que está de
acordo com um estado de stresse oxidativo que leva à oxidação do glutatião reduzido
originando este glutatião oxidado. Também neste caso há uma diminuição do valor da
razão GSH/GSSG neste grupo de indivíduos com início tardio da doença, que, embora não
atinja valores estatisticamente significativos, se aproxima (p=0,055).
No que diz respeito à vertente enzimática do ciclo do glutatião, foram estudadas duas
enzimas: a reductase do glutatião e a peroxidase do glutatião. Apenas foram encontradas
diferenças significativas no que diz respeito à Glred no grupo de indivíduos com início
tardio da doença quando comparados com o grupo de indivíduos controlo. Foi encontrada
uma diminuição da actividade desta enzima nos indivíduos com doença, sugerindo uma
falha no sistema de regeneração do glutatião, o que pode facilitar um aumento do estado
oxidativo. Nos tecidos biológicos o anião superóxido pode ser convertido em peróxido de
hidrogénio quer por meios enzimáticos, quer por meios não enzimáticos [330, 331]. O
peróxido de hidrogénio, por si só, não é um radical e, portanto, não apresenta qualquer
efeito nocivo, no entanto, na presença de metais de transição pode ser convertido na
espécie altamente reactiva – radical hidroxilo ( OH). Por outro lado, este peróxido de
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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hidrogénio pode ser convertido em água pelas enzimas catalase ou peroxidase do glutatião
[332, 333]. Nesta reacção catalisada pela peroxidase do glutatião, o glutatião reduzido é
oxidado originando GSSG. Este glutatião oxidado pode ser novamente reduzido, de forma
poder utilizado novamente nesta reacção, pela acção da enzima reductase do glutatião num
processo que utiliza NADPH [334, 335]. Existindo uma diminuição da actividade da
enzima reductase do glutatião, uma menor quantidade de glutatião oxidado é reconvertida
em glutatião reduzido e, portanto, seria de esperar uma diminuição dos níveis de GSH
nestes indivíduos. Tal não acontece, sendo uma possível causa o facto de, nestes doentes,
existir um estado persistente de stresse oxidativo, funcionando como resposta biológica o
aumento da produção de GSH. Desta forma, uma diminuição da actividade da enzima não
terá efeitos tão nefastos a nível celular.
No que diz respeito aos níveis de outro antioxidante não enzimático, a vitamina E, foi
encontrado um aumento significativo da concentração plasmática desta no grupo de
indivíduos com início precoce da doença quando comparados com o grupo controlo. No
entanto, os resultados obtidos neste parâmetro devem ser analisados, tendo em
consideração que os indivíduos não foram controlados quanto à ingestão de fontes de
vitamina E. Assim sendo, é possível que tenha existido um aumento de vitamina E devido
a factores externos, levando a este aumento da concentração desta vitamina. Os resultados
obtidos no que diz respeito a este parâmetro têm sido divergentes, apontando alguns para
um papel da vitamina E enquanto antioxidante importante na doença de Parkinson [336],
enquanto outros não lhe oferecem qualquer papel na patogénese desta doença [337].
Não foram encontradas diferenças deste parâmetro em qualquer outro dos grupos.
No entanto foi observada uma diminuição significativa de vitamina A plasmática no
grupo de indivíduos com início tardio da doença. Uma vez que esta vitamina tem função
como antioxidante, servindo de quencher a singletos de oxigénio, uma diminuição da sua
concentração indica uma menor capacidade de resposta à agressão oxidativa, o que é
contrário a estudos publicados nesta matéria [338].
No que diz respeito aos marcadores de lipoperoxidação, foi encontrada uma
diminuição dos níveis de MDA plasmático no grupo de indivíduos com início tardio da
doença. Este facto está contra o conhecimento actual de um aumento do grau de
lipoperoxidação existente em indivíduos com doença de Parkinson, tendo inclusivamente
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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os níveis de MDA sido encontrados cerca de dez vezes mais elevados na substância nigra
de indivíduos com doença de Parkinson quando comparados com controlos [339-341].
Embora existam também estudos que revelam não existir qualquer tipo de associação entre
os níveis deste marcador de lipoperoxidação e a doença de Parkinson [342]. No entanto
factores que influenciam o resultado da análise de MDA foram já descritos, em 1996 Wei
et. al. descreveram que os níveis de MDA aumentam de forma dependente da idade [343].
Por outro lado a presença de níveis de ferro elevados nos tecidos analisados pode levar a
um aumento artificial do nível de MDA [228, 340, 344]. Assim sendo, uma diminuição dos
níveis de MDA podem não significar a ausência de lipoperoxidação nos indivíduos com
doença de Parkinson.
Não foram encontradas diferenças nos níveis eritrocitários deste parâmetro, da
mesma forma que não foram encontradas diferenças em nenhum dos outros grupos
estudados neste parâmetro.
Quanto aos metabolitos do monóxido de azoto, foi encontrado um aumento
significativo dos nitritos no grupo de indivíduos com início tardio da doença. As espécies
reactivas de azoto, incluindo o monóxido de azoto, parecem desempenhar papéis de
importância crucial no cérebro. Entre estes papéis destacam-se processos fisiológicos como
a neuromodulação, neurotransmissão e plasticidade sináptica e processos patológicos como
a neurodegeneração e a neuroinflamação [345]. O monóxido de azoto pode desempenhar
diversos papéis nos processos patológicos que conduzem à neurodegeneração, no entanto,
o mecanismo através do qual o NO destrói células, particularmente neurónios, não é ainda
completamente conhecido [346]. O monóxido de azoto em si mesmo é uma molécula
relativamente não tóxica que, na ausência de anião superóxido, não causa morte celular
mesmo em concentrações extremamente altas. No entanto, na presença do anião
superóxido, o monóxido de azoto é uma potente neurotoxina. A reacção do NO com o
anião superóxido é extraordinariamente rápida, resultando na formação do potente
oxidante ONOO- (peroxinitrito) [347]. De forma análoga, o NO pode reagir com O2 para
produzir NO2, que posteriormente reage com NO para produzir N2O3 [348]. Enquanto o
peroxinitrito é comummente considerado como a espécie de nitrogénio mais reactiva, o
NO2 e o N2O3 podem também contribuir para alguma toxicidade [349, 350]. O peroxinitrito
pode exercer a sua toxicidade através de reacções químicas que levam à geração de outras
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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espécies nocivas. Ao pH fisiológico, o ONOO- existe em equilíbrio com o seu ácido
conjugado, ONOOH. Dependendo do ambiente celular, o ONOOH pode ser decomposto
em espécies citotóxicas, como por exemplo o radical hidroxilo e o dióxido de nitrogénio,
ou em espécies relativamente inertes como os nitritos e os nitratos [349, 351].
Adicionalmente, o ONOO- pode reagir com o CO2, formando ONOOCO2, uma espécie
ainda mais reactiva do que o próprio peroxinitrito [352]. Uma vez que em sistemas
aquosos o NO reage com o oxigénio para formar nitritos e posteriormente nitratos, a
determinação dos nitritos é um bom método para determinar a produção de NO [350, 351].
Na nossa amostra verificámos um aumento estatisticamente significativo da concentração
de nitritos no subgrupo de doentes com início tardio da doença, tendo, os outros grupos
demonstrado resultados superiores aos controlos, embora não tenham atingido valores de
significância estatística. Assim sendo, estes resultados demonstram um aumento da
produção de monóxido de azoto na nossa amostra de indivíduos com doença de Parkinson,
tal como havia sido já previamente descrito [353, 354].
Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
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Conclusões Gerais
• Na nossa amostra não se verificaram alterações no gene da alfa-sinucleína, o que
confirma que as formas de doença causadas por mutações neste gene são muito raras
na população portuguesa;
• Verificamos a existência de quatro mutações no gene da parkina, em indivíduos com
e sem história familiar positiva, o que confirma um papel deste gene no
desenvolvimento da doença, mesmo em formas esporádicas;
• Encontrámos quatro mutações no gene PINK1, confirmando o seu papel no processo
de desenvolvimento da doença de Parkinson, tendo mesmo encontrado alterações do
número de cópias de determinados exões do gene, algo que não está descrito até à
data;
• Na nossa amostra de doentes de Parkinson, tendo resultados apenas dos genes
estudados, que não são todos os conhecidos, verificamos que causas genéticas são
responsáveis por cerca de 6% dos casos;
• Não é possível confirmar o aumento de stresse oxidativo, pelos marcadores
estudados, nos indivíduos com mutações nos genes da parkina e PINK1, o que está
em desacordo com resultados in vitro;
• O polimorfismo estudado no exão 29 do gene da NOS verificou-se estatisticamente
diferente entre os doentes e os controlos, tornando-o um bom marcador de risco para
a doença de Parkinson;
• O polimorfismo estudado no exão 5 do gene da GST mostrou-se estatisticamente
diferente entre o grupo de doentes e o grupo de controlos, indicando actividades
distintas da enzima nestes grupos e tornando-o um bom marcador genético de risco
para o desenvolvimento da doença de Parkinson;
• A distribuição alélica do gene HFE demonstrou diferenças significativas entre
grupos, o que torna a presença de um dos alelos um factor de risco para o
desenvolvimento da doença;
• Na sua totalidade as evidências obtidas pelos marcadores estudados de stresse
oxidativo não confirmam um estado de stresse oxidativo persistente nos doentes de
Parkinson, uma vez que, apenas o glutatião reduzido nos glóbulos vermelhos se
demonstrou reduzido nos doentes quando comparado com controlos.
Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson
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