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Lidia Ruiz Roldán
María Yolanda Sáenz Domínguez y Carmen Torres Manrique
Facultad de Ciencia y Tecnología
Agricultura y Alimentación
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TESIS DOCTORAL
Curso Académico
Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2018
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa, tesis doctoral de Lidia Ruiz Roldán, dirigida por María
Yolanda Sáenz Domínguez y Carmen Torres Manrique (publicada por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-
SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS Y VIRULENCIA EN CEPAS
NO-CLÍNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
ANTIMICROBIAL RESISTANCE AND VIRULENCE
IN NON-CLINICAL Pseudomonas aeruginosa STRAINSLIDIA RUIZ ROLDÁN
Tesis con Mención InternacionalLogroño, Septiembre, 2018
Departamento de Agricultura y AlimentaciónÁrea de Bioquímica y Biología Molecular
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DE LA RIOJA (CIBIR)
RiojaSaludFUNDACIÓN
Tesis Doctoral
Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas
no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa.
Antimicrobial resistance and virulence in non-clinical
Pseudomonas aeruginosa strains
Memoria presentada por LIDIA RUIZ ROLDÁN para optar al título de Doctor
con la Mención Internacional por la Universidad de La Rioja.
Logroño, septiembre de 2018
Dra. YOLANDA SÁENZ DOMÍNGUEZ, Investigador Principal del Área de
Microbiología Molecular del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja
(CIBIR)
Dra CARMEN TORRES MANRIQUE, Catedrática del Área de Bioquímica y
Biología Molecular de la Universidad de La Rioja
Por la presente declaran que,
La memoria titulada “Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-
clínicas de Pseudomonas aeruginosa”, que presenta Dña. LIDIA RUIZ ROLDÁN,
Licenciada en Biología, ha sido realizada en el Área de Microbiología Molecular
del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja, bajo su dirección, y reúne las
condiciones exigidas para optar al título de Doctor.
Lo que hacen constar en Logroño, a 3 de septiembre de 2018.
Fdo: Dra. Yolanda Sáenz Domínguez Fdo: Prof. Carmen Torres Manrique
A todos aquellos que me han acompañado en esta aventura.
AGRADECIMIENTOS
ÍNDICE
ABREVIATURAS ................................................................................................................................. i
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ vii
LISTA DE TABLAS .......................................................................................................................... xv
RESUMEN ........................................................................................................................................ xxi
ABSTRACT .................................................................................................................................... xxiii
INTRODUCCIÓN
1. El género Pseudomonas ........................................................................................................... 3
1.1 Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................................... 7
2. Resistencia a los antibióticos ................................................................................................ 9
2.1 Mecanismos de acción a los antibióticos ......................................................................... 13
2.2 Mecanismos de resistencia a los antibióticos ................................................................ 14
2.2.1 Beta-lactámicos y beta-lactamasas .............................................................................. 17
2.2.2 Carbapenémicos ................................................................................................................... 20
2.2.2.1 Carbapenemasas ........................................................................................................... 21
2.2.2.2 Alteraciones en la porina OprD .............................................................................. 25
3. Elementos genéticos de diseminación de resistencia ............................................... 27
3.1 Plásmidos ...................................................................................................................................... 28
3.2 Elementos genéticos transponibles, ICE e islas genómicas ...................................... 29
3.3 Integrones ..................................................................................................................................... 32
4. Patogenicidad .......................................................................................................................... 37
4.1 Generalidades .............................................................................................................................. 37
4.2 Sistema de Secreción de Tipo 3 (T3SS) ............................................................................ 39
4.2.1 Regulación del Sistema de Secreción de Tipo 3 ...................................................... 43
4.3 Quorum sensing (QS) ................................................................................................................ 45
4.3.1 Regulación de Quorum Sensing ...................................................................................... 48
4.4 Pigmentos ..................................................................................................................................... 50
4.4.1 Piocianina ............................................................................................................................... 51
4.4.2 Pioverdina .............................................................................................................................. 52
4.4.3 Piorrubina .............................................................................................................................. 53
4.5 Proteasas ....................................................................................................................................... 53
4.6 Biosurfactantes .......................................................................................................................... 55
4.6.1 Tipos ......................................................................................................................................... 56
4.6.2 Ramnolípidos ........................................................................................................................ 58
4.6.2.1 Síntesis ............................................................................................................................. 59
4.6.2.2 Regulación génica ........................................................................................................ 60
4.7 Biofilm ............................................................................................................................................ 62
4.7.1 Composición, formación y regulación ........................................................................ 63
4.7.2 Papel de los ramnolípidos en biofilm.......................................................................... 65
4.8 Aplicaciones biotecnológicas de Pseudomonas ............................................................. 66
OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 71
OBJECTIVES .................................................................................................................................... 73
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Muestras analizadas y aislados de Pseudomonas spp. estudiados ....................... 77
1.1 Muestras fecales de animales sanos .................................................................................. 77
1.2 Muestras fecales de niños ...................................................................................................... 78
1.3 Muestras de alimentos vegetales ........................................................................................ 78
2. Medios de cultivo y pruebas de identificación ............................................................ 79
2.1 Medios de cultivo ....................................................................................................................... 79
2.2 Pruebas bioquímicas ................................................................................................................ 80
3. Procesamiento de las muestras para el aislamiento bacteriano .......................... 81
3.1 Animales sanos ........................................................................................................................... 81
3.2 Niños ............................................................................................................................................... 82
3.3 Alimentos vegetales .................................................................................................................. 82
4. Identificación bacteriana por MALDI-TOF .................................................................... 82
5. Determinación de la sensibilidad a antibióticos ......................................................... 83
5.1 Difusión en disco ........................................................................................................................ 83
5.2 Test sinérgico de doble disco ................................................................................................ 84
6. Extracción y cuantificación de DNA ................................................................................. 85
7. Extracción y cuantificación de DNA genómico ............................................................. 86
8. Extracción y cuantificación de RNA ................................................................................. 87
9. Obtención de DNA complementario (cDNA) ................................................................. 88
10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................................... 89
10.1 Identificación de aislados mediante PCR ......................................................................... 90
10.2 Estudio de mecanismos de resistencia a carbapenémicos ....................................... 90
10.3 Estudio de integrones .............................................................................................................. 93
10.4 Estudio del transposón Tn402-like..................................................................................... 94
10.5 Estudio de factores de virulencia ........................................................................................ 95
11. PCR cuantitativa (qPCR) ..................................................................................................... 98
11.1 Cuantificación de la expresión de genes de virulencia ............................................... 98
12. Secuenciación masiva (Whole Genomen Sequencing, WGS) ................................. 100
13. Electroforesis en gel de agarosa .................................................................................... 102
14. Tipificación molecular ...................................................................................................... 102
14.1 PFGE ............................................................................................................................................. 102
14.2 Multilocus Sequence Typing (MLST) ................................................................................ 104
14.3 Serotipado.................................................................................................................................. 107
15. Secuenciación ....................................................................................................................... 107
16. Estudio de alteraciones en la porina OprD ................................................................ 108
16.1 Mutaciones en el gen oprD .................................................................................................. 108
16.2 Extracción proteica y Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con
Dodecilsulfato Sódico (SDS-PAGE) ............................................................................................... 109
17. Cuantificación de la producción de biofilm en P. aeruginosa ............................. 110
17.1 Cuantificación de la biomasa mediante Cristal Violeta ............................................ 111
17.2 Cuantificación de la actividad metabólica mediante FDA ...................................... 111
18. Producción de pigmentos y actividad elastasa en P. aeruginosa ...................... 112
19. Estudio de la producción, extracción y purificación de biosurfactantes ........ 114
19.1 Identificación de Pseudomonas spp. productoras de biosurfactantes en medio
CTAB-MB ................................................................................................................................................. 114
19.2 Fermentación ............................................................................................................................ 115
19.3 Extracción ................................................................................................................................... 116
19.4 Purificación ................................................................................................................................ 116
19.5 High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC) ........... 117
19.6 Estudio de la capacidad antimicrobiana ........................................................................ 117
19.6.1 Test de difusión por gota ............................................................................................... 117
19.6.2 Estudio de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) .................................... 118
RESUMEN GRÁFICO .................................................................................................................... 121
GRAPHIC SUMMARY .................................................................................................................. 123
RESULTADOS
1. Prevalencia de Pseudomonas spp. y Pseudomonas aeruginosa en muestras no
clínicas ........................................................................................................................................... 127
1.1 Animales sanos ......................................................................................................................... 127
1.2 Niños ............................................................................................................................................. 129
1.3 Alimentos vegetales ............................................................................................................... 129
2. Análisis de la sensibilidad a antibióticos en Pseudomonas spp. ......................... 130
3. Tipificación molecular ........................................................................................................ 133
3.1 PFGE .............................................................................................................................................. 133
3.1.1 Animales sanos .................................................................................................................. 133
3.1.2 Niños ...................................................................................................................................... 135
3.1.3 Alimentos vegetales ......................................................................................................... 136
3.1.4 Relación clonal entre P. aeruginosa de los distintos orígenes ....................... 139
3.2 MLST ............................................................................................................................................ 141
3.2.1 Animales sanos .................................................................................................................. 141
3.2.2 Niños ...................................................................................................................................... 142
3.2.3 Alimentos vegetales ......................................................................................................... 144
3.2.4 Análisis de MLST de P. aeruginosa de los tres orígenes ................................... 145
3.3 Serotipado.................................................................................................................................. 147
4. Detección de integrones..................................................................................................... 149
5. Análisis de la porina OprD en Pseudomonas aeruginosa ....................................... 150
6. Caracterización de la virulencia en Pseudomonas aeruginosa ............................ 155
6.1 Estudio de factores de virulencia (virulotipo) ............................................................ 155
6.2 Estudio de la expresión de genes de virulencia en cepas de P. aeruginosa del
linaje ST155 ........................................................................................................................................... 160
6.3 Secuenciación masiva en cepas de P. aeruginosa del linaje ST155 .................... 163
6.4 Estudio de la formación de biofilm.................................................................................. 179
6.5 Estudio de la producción de pigmentos ........................................................................ 184
6.6 Estudio de la actividad elastasa ........................................................................................ 189
7. Estudio de la producción de biosurfactantes ............................................................. 193
7.1 Identificación de cepas productoras ............................................................................... 193
7.2 Análisis de los biosurfactantes producidos ................................................................. 195
7.3 Análisis de la actividad antimicrobiana de los biosurfactantes .......................... 200
7.4 Análisis de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración
Mínima Bactericida (CMB) de los biosurfactantes ................................................................ 203
7.5 Caracterización de los genes responsables de la producción de biosurfactantes
en las cepas Ps542, Ps756 y Ps799 ............................................................................................... 204
8. COMPARATIVA: Análisis comparativo de los factores asociados con la
virulencia en las cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres orígenes ............ 205
DISCUSIÓN .................................................................................................................................... 211
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 239
CONCLUSIONS .............................................................................................................................. 243
REFERENCIAS ............................................................................................................................... 247
ANEXOS .......................................................................................................................................... 297
Anexo I: Tablas y Figuras ........................................................................................................ 299
Tabla S1. Muestras recogidas de animales sanos. .................................................................. 299
Tabla S2. Muestras de niños ............................................................................................................ 328
Tabla S3. Muestras recogidas de alimentos vegetales .......................................................... 330
Tabla S4. Caracterización de las 178 cepas de Pseudomonas spp. de los tres orígenes
estudiados ............................................................................................................................................... 337
Tabla S5. Caracterización de las 76 cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres
orígenes estudiados ............................................................................................................................ 346
Tabla S6. Caracterización del fenotipo de virulencia de las 76 cepas de Pseudomonas
aeruginosa de los tres orígenes estudiados .............................................................................. 350
Anexo II: Secuencias incluidas en la base de datos GenBank ..................................... 355
Anexo III: Biosurfactantes ...................................................................................................... 369
Tabla S7. Genes responsables de la producción de biosurfactantes, usados para la
base de datos. ........................................................................................................................................ 369
Figura S1. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante
producido por la cepa P. mendocina Ps542............................................................................... 371
Figura S2. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante
producido por la cepa P. mendocina Ps799............................................................................... 372
Anexo IV: Publicaciones científicas ..................................................................................... 373
i
ABREVIATURAS
°C Grados centígrados (Grados Celsius)
ΔQS Deficiente de Quorum Sensing
ΔlasR Deficiente de gen lasR
aa Aminoácido
AMC Amoxicilina – ácido clavulánico (antibiótico + inhibidor)
AMK Amikacina (antibiótico)
AmpC Cefalosporina de tipo AmpC
ATCC Colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection)
ATM Aztreonam (antibiótico)
BHI Infusión cerebro corazón (Brain Heart Infusion) (medio de cultivo)
BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido
BS Biosurfactante
CaCl2 Cloruro de calcio
CaCl2 · 2H2O Cloruro de calcio dihidratado
CAZ Ceftazidima (antibiótico)
CC Complejo Clonal
cDNA DNA complementario
CECT Colección española de cultivos tipo
CH3OH Metanol
CIBIR Centro de Investigación Biomédica de La Rioja
CIP Ciprofloxacino (antibiótico)
CLSI Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standars
Institute)
cm Centímetro
CMB Concentración mínima bactericida (Minimum Bactericidal Concentration)
ii
CMI Concentración mínima inhibitoria (Minimum Inhibitory Concentration)
CST Colistina (antibiótico)
CTAB-MB Bromuro de cetiltrimetilamonio-Azul de metileno
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DNasa Desoxirribonucleasa
dNTPs Desoxinucleótidos
DO Densidad óptica
DOR Doripenem (antibiótico)
DR Repeticiones directas (Direct Repeats)
ECDC Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (European Centre
for Disease Prevention and Control)
EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético
et al. Y colaboradores
EtOH Etanol
FEP Cefepime (antibiótico)
FeSO4 · 7H2O Sulfato de hierro heptahidratado
FOX Cefoxitina (antibiótico)
g Gramo
g Gravedad (centrifugación)
g/L Gramos por litro
GEN Gentamicina (antibiótico)
h Hora
HCl Ácido clorhídrico
HEPES 4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazineetanesulfónico (tampón orgánico)
I Sensibilidad intermedia
IATS Sistema Internacional de Tipado Antigénico (International Antigenic Typing
System)
iii
IREC Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos
IRL/IRR Secuencias repetidas en orden inverso (Left/Right Repeat Region)
IS Secuencia de inserción (Insertion sequence)
IPM Imipenem (antibiótico)
kB Kilo bases
kDa KiloDaltons
KH2PO4 Fosfato monopotásico
L Litro
LB Luria-Bertani (medio de cultivo)
LEV Levofloxacino (antibiótico)
M Concentración molar (mol soluto/litro disolución)
mA Miliamperios
MALDI-TOF Espectrometría de masas (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Time-Of-Flight)
MBL Metalo-beta-lactamasa
MDR Multirresistente (Multidrug-Resistant)
MEM Meropenem (antibiótico)
mg Miligramo (10-3 gramos)
mg/L Miligramo por litro
mg/mL Miligramo por mililitro
MgCl2 Cloruro de Magnesio
MgSO4 · 7H2O Sulfato de magnesio heptahidratado
MH Müeller-Hinton (medio de cultivo)
min Minuto
mL Mililitro (10-3 litros)
MLST Multilocus Sequence Typing
mm Milímetro (10-3 metros)
iv
mM Concentración milimolar (M/1000)
MnSO4 · H2O Sulfato de manganeso monohidratado
mN/m Mili Newton por metro
MOPS 3-(n-morfolino) ácido propanesulfónico (tampón)
MSM Medio de cultivo mínimo
N Normal
n° Número
NaCl Cloruro de sodio
Na2HPO4 Fosfato de disodio
NaNO3 Nitrato de sodio
NET Netilmicina (antibiótico)
NGS Secuenciación masiva (Next Generation Sequencing)
ng/µL Nanogramos por microlitro
NH4+ Amonio
(NH4)6Mo7O24 · 4H2O Molibdato de amonio tetrahidratado
nM Nanómetros (10-9 metros)
NOR Norfloxacino (antibiótico)
nt Nucleótido
OF Ofloxacino (antibiótico)
OMP Proteína de membrana externa (Outer membrane protein)
OMS/WHO Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)
O/N Toda la noche (Overnight)
orf Pauta de lectura abierta (Open reading frame)
PAβN Phenylalanine-Arginine Beta-Naphthylamide (inhibidor de bombas de expulsión
activa)
pb pares de bases
PBS Tampón fosfato salino (Phosphate buffered saline)
v
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
PDR Panrresistente (Pandrug-Resistant)
PFGE Electroforesis en campo pulsante (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
pH log 1 / (H+) = -log [H+]
PhOH Fenol
PIP Piperacilina (antibiótico)
R Resistente
RNA Ácido ribonucleico
rRNA Ácido ribonucleico ribosomal
RNasa Ribonucleasa
rpm Revoluciones por minuto
RT-qPCR Retrotranscriptasa de PCR cuantitativa a tiempo real
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (Sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
S Sensible
s Segundos
spp. Especies
ST Secuencia tipo (Sequence Type) (MLST)
SXT Trimetoprim-sulfametoxazol (antibiótico)
Tª Temperatura
TBE Tris-Bórico-EDTA (tampón para electroforesis)
TE Tris-EDTA (tampón para electroforesis)
Tn Transposón
Tnp Transposasa
TOB Tobramicina (antibiótico)
Tris Tris(hidroximetil)aminometano (solución)
TSB Caldo de soja tríptica (Tryptic Soy Broth) (medio de cultivo)
vi
TSI Agar triple azúcar y hierro (Triple sugar iron agar)
TZP Piperacilina-tazobactam (antibiótico)
U Unidades de enzima
U/mL Unidades por mililitro
UFC Unidades formadoras de colonias
UFC/mL Unidades formadoras de colonias por mililitro
UV Ultravioleta
V Voltios
V/cm Voltios por centímetro
v/v Volumen por volumen
W Vatio
XDR Extensivamente resistente (Extensively Drug-Resistant)
µg Microgramo (10-6 gramos)
µL Microlitro (10-6 litros)
vii
LISTA DE FIGURAS
INTRODUCCIÓN
Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las últimas especies del género
Pseudomonas descritas, basado en el análisis de los genes 16S rRNA, gyrB, rpoB y rpoD
(Peix et al., 2018).
Figura 2. Rango funcional y ambiental del género Pseudomonas spp. (Silby et al., 2011).
Figura 3. Distribución de resistencia a distintas familias de antimicrobianos en
P. aeruginosa en 2016. A, carbapenémicos; B, ceftazidima; C, piperacilina-tazobactam; D,
aminoglucósidos; E, fluoroquinolonas (ECDC, 2016).
Figura 4. Mecanismos de acción de los antibióticos en la célula bacteriana.
Figura 5. Tipos de mecanismos de resistencia en P. aeruginosa, intrínsecos, adquiridos
o adaptativos. Leyenda de símbolos: Car. (carbapenémicos); Ceph. (cefalosporinas); Pen.
(penicilinas); Ami. (aminoglucósidos); Flu. (fluoroquinolonas); Mac. (macrólidos); Pol.
(polimixinas); EPS (sustancias poliméricas extracelulares); , antibiótico (Moradali et
al., 2017).
Figura 6. Estructura química de los antibióticos beta-lactámicos (Suárez & Gudiol,
2009).
Figura 7. Estructura de la proteína OprD en la membrana externa. Los loops se nombran
del L1 al L8, mientras que las láminas beta transmembrana se muestran en un recuadro.
(adaptada de Huang et al., 1995).
Figura 8. Estructura de la proteína OprD vista de lado (foto izquierda) y desde el medio
extracelular (foto derecha). (Chevalier et al., 2017).
Figura 9. Estructura básica de los elementos genéticos transponibles. A, Secuencia de
inserción; B, Transposón. DR, repetición directa; IRR e IRL, secuencias inversas
repetidas.
Figura 10. Estructura general de las islas genómicas (Juhas et al., 2008).
Figura 11. Estructura común de los integrones.
Figura 12. Modelo de integración y escisión de casetes génicos en un integrón (adaptada
de Gillings, 2014).
viii
Figura 13. Estructura de los integrones de: A, clase 1; B, clase 2; y C, clase 3. Los genes
en azul representan hipotéticos casetes génicos. (Jones-Dias et al., 2016).
Figura 14. Modelo hipotético de evolución de los integrones de clase 1 a partir del
transposón Tn402-like (adaptada de Toleman et al., 2007).
Figura 15. Mecanismos de virulencia empleados por P. aeruginosa durante el proceso de
infección (adaptada de Lee & Zhang, 2015).
Figura 16. Sistemas de secreción descritos en P. aeruginosa (adaptada de Alhazmi,
2015).
Figura 17. Estructura del Sistema de Secreción de Tipo 3 en P. aeruginosa, junto con las
proteínas efectoras (ExoU, ExoS, ExoY y ExoT) (Naito et al., 2017).
Figura 18. Regulación del Sistema de Secreción de Tipo 3 en P. aeruginosa, en el regulón
exoenzima S mediante el activador transcripcional ExsA (Naito et al., 2017).
Figura 19. Regulación de la secreción en el Sistema de Secreción de Tipo 3 a través de
ExsA (adaptada de Hauser, 2009).
Figura 20. Red jerárquica de QS en P. aeruginosa y regulación de factores de virulencia.
En respuesta a un estímulo ambiental, cada mecanismo sintetiza su propio autoinductor
[HSL (3-oxo-C12-HSL), BHL (C4-HSL), PQS e IQS]. Simbología: AprA, proteasa alcalina;
PLC, fosfolipasa C; Tox, toxina A; LasA, elastasa; LasB, elastasa; HCN, cianuro de
hidrógeno; Pyo, piocianina; Rhld, ramnolipidos; LecA, lectina A; CM, membrana
citoplasmática; OM, membrana externa (Moradali et al., 2017).
Figura 21. Regulación de los mecanismos de Quorum Sensing y relación con las bombas
de expulsión activa, en P. aeruginosa (Alcalde-Rico et al., 2016).
Figura 22. Colonias de aislamientos hospitalarios de P. aeruginosa, donde se distinguen
los distintos pigmentos sintetizados (Merino, 2007).
Figura 23. Estructura del pigmento piocianina, producido por P. aeruginosa (Lau et al.,
2004).
Figura 24. Estructura del pigmento pioverdina, producido por P. aeruginosa (adaptada
de Cornelis, 2013).
Figura 25. Estructura química de algunos biosurfactantes lipopéptidos producidos.
ix
Figura 26. Estructura química de algunos biosurfactantes glicolípidos y biosurfactantes
poliméricos producidos.
Figura 27. Síntesis de ramnolípidos en P. aeruginosa. Las enzimas marcadas en verde
muestran la síntesis de dDTP-L-ramnosa, mientras que las marcadas en morado, son las
responsables de la síntesis de mono- y dirramnolípidos (adaptada de Zhang et al., 2012).
Figura 28. Regulación génica de la producción de ramnolípidos en P. aeruginosa. Las
líneas verdes indican activación, mientras que las líneas rojas indican represión. Los
interrogantes representan hipótesis de regulación (Reis et al., 2011).
Figura 29. Etapas de formación de biofilm en P. aeruginosa: 1, Etapa planctónica; 2,
Fijación bacteriana; 3, Adhesión a la superfície; 4, Proliferación de matriz extracelular; 5,
Maduración; 6, Dispersión del biofilm (adaptada de Karaguler et al., 2017).
Figura 30. Implicaciones de los ramnolípidos en la formación y desarrollo de biofilm en
P. aeruginosa: A, Fijación; B, adhesión; C, proliferación; y D, dispersión. Las estrellas rojas
simbolizan los ramnolípidos (Nickzad & Déziel, 2014).
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 31. Test sinérgico de doble disco positivos para la detección de: A, BLEE; B, MBL;
y C, AmpC inducible.
Figura 32. Representación gráfica del transposón Tn402-like, marcando con flechas los
cebadores utilizados para su amplificación: A, Tn402-TniA-R; B, Tn402-TniB-F; C,
Tn402-TniB-F1; D, Tn402-TniB-R; E, Tn402-TniC-F; F, Tn402-TniC-F1; G, Tn402-TniC-R.
Figura 33. Esquema descriptivo de los pasos seguidos para la obtención y análisis de la
secuenciación masiva de las cepas de Pseudomonas spp. seleccionadas.
Figura 34. Rectas de regresión empleadas para el cálculo de la cuantificación de
piocianina en las cepas de P. aeruginosa.
RESULTADOS
Figura 35. Porcentaje de resistencia a los distintos antibióticos antipseudomónicos
testados en este estudio, detectados en los 330 aislados de Pseudomonas sp. de los
distintos orígenes. Leyenda: PIP, piperacilina; TZP, piperacilina-tazobactam; ATM,
aztreonam; FEP, cefepime; CAZ, ceftazidima; IPM, imipenem; MEM, meropenem; DOR,
x
doripenem; NET, netilmicina; TOB, tobramicina; GEN, gentamicina; AMK, amikacina; CIP,
ciprofloxacino; CST, colistina.
Figura 36. Porcentaje de resistencia a los 14 antibióticos testados en los aislados de
P. aeruginosa de los distintos orígenes. La leyenda de colores es la siguiente: animales
sanos (rojo), niños (verde) y alimentos (azul). Nótese que el máximo valor del eje Y fue
10%, puesto que los porcentajes de resistencia fueron muy bajos. Leyenda: PIP,
piperacilina; TZP, piperacilina-tazobactam; ATM, aztreonam; FEP, cefepime; CAZ,
ceftazidima; IPM, imipenem; MEM, meropenem; DOR, doripenem; NET, netilmicina; TOB,
tobramicina; GEN, gentamicina; AMK, amikacina; CIP, ciprofloxacino; CST, colistina.
Figura 37. Gel de PFGE de algunos aislados de P. putida, P. aeruginosa, P. gessardii y
P. fulva de animales sanos. El recuadro marca algunos aislados que presentaron un
patrón indistinguible. M representa el marcador de peso molecular.
Figura 38. Gel de PFGE de algunos aislados de P. aeruginosa de niños. El recuadro marca
aquellos aislados que presentaron un patrón indistinguible. M representa el marcador
de peso molecular.
Figura 39. Gel de PFGE de algunos aislados de P. putida, P. mendocina y P. aeruginosa de
alimentos vegetales. El recuadro marca algunos aislados que presentaron un patrón
indistinguible. M representa el marcador de peso molecular.
Figura 40. Dendrograma de las 76 cepas de P. aeruginosa de los tres orígenes: animales
sanos, niños y alimentos vegetales.
Figura 41. Árbol filogenético de máxima verosimilitud, relacionando las 76 cepas de P.
aeruginosa de los tres orígenes.
Figura 42. Estructura de los integrones de clase 1 detectados en las cepas de
Pseudomonas spp.: A, Pseudomonas spp. Ps656; B, P. fluorescens Ps658; C, P. fragi Ps662;
D, P. fluorescens Ps689 y Ps693.
Figura 43. Comparación entre el gen oprD completo de la cepa de referencia
P. aeruginosa PAO1 (GenBank nº AE004091) con el gen oprD truncado con la secuencia
de inserción ISPa1635 (GenBank nº: MH050332), de la cepa Ps884.
xi
Figura 44. Secuencia nucleotídica del gen oprD truncado por la secuencia de inserción
ISPa1635 de la cepa Ps884, de alimentos vegetales (GenBank nº: MH050332). En verde,
secuencia de oprD; en gris, la secuencia de inserción ISPa1635; en azul, las secuencias
repetidas (IRL, RRL); en verde, las “target site duplication”; en morado, la secuencia de
transposasa.
Figura 45. Proteínas de membrana extraídas por SDS-PAGE. El rectángulo verde marca
la proteína OprD estudiada; las flechas rojas marcan la ausencia de esta porina, tanto en
la cepa mutante como en la cepa Ps884 (patrón L). El marcador de peso molecular usado
fue de la marca Precision plus protein dual color standards (BioRad).
Figura 46. Comparación entre el gen lasR completo de la cepa de referencia P. aeruginosa
PAO1 (GenBank nº AE004091) de los genes lasR truncados por distintas secuencias de
inserción: A, Ps893 (gen truncado); B, Ps519 (IS1394); C, Ps852 (ISPa91); D, Ps796
(ISPre2); E, Ps845 (IS1411).
Figura 47. Expresión de genes de virulencia importantes en cinco cepas de P. aeruginosa
con ST155. La línea roja punteada simboliza el valor de la expresión de la cepa de
referencia P. aeruginosa PAO1 (2-ΔΔCt = 1).
Figura 48. Secuencias nucleotídicas del gen crpP en las cepas de P. aeruginosa ST155,
respecto al gen de referencia encontrado en el plásmido pUM505. En amarillo se marcan
las bases nucleotídicas idénticas al gen de referencia; en azul se marcan las bases
nucleotídicas distintas al gen de referencia.
Figura 49. Secuencias aminoacídicas de la proteína CrpP de P. aeruginosa ST155,
respecto a la proteína de referencia encontrada en el plásmido pUM505. En amarillo se
marcan los aminoácidos idénticos a la proteína de referencia; en azul y rosa se marcan
las mutaciones aminoacídicas respecto a la proteína de referencia.
Figura 50. Comparación de las cepas de P. aeruginosa ST155 con el plásmido pUM505,
marcando los genes de relevancia. Se usó el programa BLAST Ring Image Generator
(BRIG).
Figura 51. Secuencia nucleotídica del gen lasI de la cepa de referencia P. aeruginosa
PAO1 comparada con las secuencias del gen de las cepas Ps764, Ps839 y Ps892. La zona
morada marca los cebadores utilizados para amplificar este gen mediante PCR.
xii
Figura 52. Mapa de calor representando resistoma y viruloma descritos en las cepas de
P. aeruginosa ST155, obtenido por GraphPad 7.0. Los cuadrados blancos marcan la
ausencia de gen/proteína. El asterisco (*) marca las proteínas truncadas.
Figura 53. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las
9 cepas de P. aeruginosa de animales sanos. La línea roja punteada simboliza el
porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 54. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las
30 cepas de P. aeruginosa de niños. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la
cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 55. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las
37 cepas de P. aeruginosa de alimentos vegetales. La línea roja punteada simboliza el
porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 56. Niveles de producción de biomasa medidos con cristal violeta (CV), y
actividad metabólica medida con FDA (FDA), de las 76 cepas de P. aeruginosa, de los tres
orígenes. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa de referencia
P. aeruginosa PAO1 (100%).
Figura 57. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 9 cepas de
P. aeruginosa de animales sanos. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa
de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 58. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 30 cepas de
P. aeruginosa de niños. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de
referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 59. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 37 cepas de
P. aeruginosa de alimentos vegetales. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de
la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 60. Niveles de producción de piocianina y piorrubina, de las 76 cepas de
P. aeruginosa, divididos por origen. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa
de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 61. Porcentaje de actividad elastasa en las 9 cepas de P. aeruginosa de animales
sanos. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia
P. aeruginosa PAO1.
xiii
Figura 62. Porcentaje de actividad elastasa en las 30 cepas de P. aeruginosa de niños. La
línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.
Figura 63. Porcentaje de actividad elastasa en las 37 cepas de P. aeruginosa de alimentos
vegetales. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia
P. aeruginosa PAO1.
Figura 64. Niveles de actividad elastasa de las 76 cepas de P. aeruginosa de diferentes
orígenes. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa de referencia
P. aeruginosa PAO1.
Figura 65. Imágenes de halos de producción de biosurfactantes, de distintas cepas de
Pseudomonas spp., mediante el método de CTAB-MB agar.
Figura 66. Análisis de la curva de crecimiento y tensión superficial de las tres cepas de
Pseudomonas spp. seleccionadas para la producción de biosurfactantes. La línea azul
muestra la evolución de la tensión superficial (mN/m); mientras que la línea morada
indica el crecimiento bacteriano (UFC/mL).
Figura 67. Cromatogramas del biosurfactante producido por la cepa Ps799, obtenido a
partir del método HPLC-MS. Las flechas en rojo indican picos importantes de compuesto;
las flechas en verde, indican posibles congéneres de ramnolípidos.
Figura 68. Cromatogramas del biosurfactante producido por la cepa Ps542, obtenido a
partir del método HPLC-MS. Las flechas en rojo indican picos importantes de compuesto;
las flechas en verde, indican posibles congéneres de ramnolípidos.
Figura 69. Actividad antimicrobiana de los tres compuestos biosurfactantes obtenidos,
de las cepas de Pseudomonas spp. Ps542, Ps756 y Ps799. Las flechas muestran la
distancia de los halos de inhibición.
Figura 70. Árbol filogenético de máxima verosimilitud, de las 76 cepas de P. aeruginosa
de los tres orígenes. Uso de mapa de calor para mostrar los fenotipos de virulencia, como
la producción de biofilm (CV) y pigmentos, actividad elastasa y actividad metabólica en
biofilm (FDA). Realizado con los softwares IQTREE v.1.6.1 (Nguyen et al., 2015) y iTol
(Letunic & Bork, 2016).
xiv
Figura 71. Producción de biomasa (CV) y actividad metabólica (FDA) en biofilm,
comparando las 76 cepas de P. aeruginosa, clasificadas en “Humanos” (niños) y
“No-Humanos” (animales sanos y alimentos vegetales). Análisis estadístico realizado con
el software R Commander, y test de Mann-Whitney. Valores: ns, no significativo; *, p-
valor ≤ 0,05.
Figura 72. Producción de piocianina y piorrubina, y actividad elastasa, comparando las
76 cepas de P. aeruginosa, clasificadas en “Humanos” (niños) y “No-Humanos” (animales
sanos y alimentos vegetales). Análisis estadístico realizado con el software R
Commander, y test de Mann-Whitney. Valores: ns, no significativo; ***, p-valor ≤ 0,001.
ANEXOS
Figura S1. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante producido
por la cepa P. mendocina Ps542.
Figura S2. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante producido
por la cepa P. mendocina Ps799.
xv
LISTA DE TABLAS
INTRODUCCIÓN
Tabla 1. Categorías antimicrobianas y antibióticos empleados para definir los
microorganismos MDR, XDR y PDR en P. aeruginosa (Magiorakos et al., 2012).
Tabla 2. Clasificación de las beta-lactamasas (adaptado de Bush & Jacoby, 2010; Naas et
al., 2016).
Tabla 3. Perfiles de las carbapenemasas más importantes, según su perfil de hidrólisis y
su perfil de inhibición (adaptado de Queenan & Bush, 2007; Codjoe & Donkor, 2017).
Tabla 4. Variantes más frecuentes de los promotores Pc y P2, detectados en los
integrones de clase 1 (adaptada de Jové et al., 2010).
MATERIAL Y MÉTODOS
Tabla 5. Lista de alimentos vegetales recogidos, divididos según su lugar de origen.
Tabla 6. Lista de reactivos para la preparación de los medios de cultivo necesarios para
la identificación de bacterias productoras de biosurfactantes. Estas cantidades son para
1 L de medio de cultivo, ajustando el pH a 6,7.
Tabla 7. Carga de los discos de los 14 antibióticos empleados en los antibiogramas y
puntos de corte (mm) según CLSI (CLSI, 2016).
Tabla 8. Componentes empleados en la PCR y los volúmenes para preparar la mezcla de
reactivos.
Tabla 9. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para la
amplificación del fragmento 16S rRNA.
Tabla 10. Componentes de KAPABYOSISTEMS empleados para la amplificación de genes
codificantes de MBL y Carbapenemasas de Clase A.
Tabla 11. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR
multiplex de MBL.
Tabla 12. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR
multiplex de Carbapenemasas de Clase A.
xvi
Tabla 13. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para
la amplificación de las estructuras de los integrones de clase 1, 2 y 3.
Tabla 14. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados para la amplificación y
caracterización del entorno de los integrones de clase 1.
Tabla 15. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para
la amplificación de los genes de virulencia estudiados.
Tabla 16. Componentes empleados en la qRT-PCR y los volúmenes de reactivos.
Tabla 17. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para
determinar la expresión de los genes de virulencia estudiados.
Tabla 18. Secuencia nucleotídica, tamaño de amplicón y temperatura de hibridación de
los 7 genes housekeeping usados durante la técnica de PCR.
Tabla 19. Secuencia nucleotídica y tamaño de amplicón de los 7 genes housekeeping
usados durante la técnica de secuenciación.
Tabla 20. Condiciones y polimerasas empleadas, para la amplificación de los genes
housekeeping.
Tabla 21. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR.
RESULTADOS
Tabla 22. Especies de Pseudomonas aisladas, y muestras fecales de animales sanos de
las que procedían.
Tabla 23. Especies de Pseudomonas aisladas, y alimento vegetal del que procedían.
Tabla 24. Grupos de aislados con patrón de PFGE indistinguible, y selección de la cepa a
estudiar.
Tabla 25. Grupos de aislados con patrón de PFGE indistinguible, y selección de la cepa a
estudiar.
Tabla 26. Secuencias tipo identificadas en las 9 cepas de P. aeruginosa aisladas de
animales sanos.
Tabla 27. Secuencia alélica de las secuencias tipo ST1711 y ST1732, que muestran
cuatro cepas de P. aeruginosa.
xvii
Tabla 28. Secuencias tipo identificadas en las 30 cepas de P. aeruginosa aisladas de niños
sanos.
Tabla 29. Secuencia alélica de las secuencias tipo ST560 y ST671, que muestran cuatro
cepas de P. aeruginosa.
Tabla 30. Secuencias tipo identificadas en las 37 cepas de P. aeruginosa aisladas de
alimentos vegetales.
Tabla 31. Serotipos encontrados en las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes.
Tabla 32. Alteraciones de la porina OprD encontradas en las 76 cepas de P. aeruginosa
analizadas.
Tabla 33. Patrones aminoacídicos observados en la porina OprD, y cepas de
P. aeruginosa según origen.
Tabla 34. Listado de virulotipos obtenidos en las distintas cepas de P. aeruginosa, en los
diferentes orígenes.
Tabla 35. Clasificación de las cepas de P. aeruginosa según el virulotipo identificado.
Tabla 36. Características de las cepas de P. aeruginosa ST155 seleccionadas.
Tabla 37. Valores de la cuantificación relativa (medido en cantidad relativa, 2-ΔΔCt) de
genes de virulencia importantes, en cinco cepas de P. aeruginosa con ST155, en
comparación con la cepa P. aeruginosa PAO1.
Tabla 38. Estudio de resistencia a fluoroquinolonas en las cepas de P. aeruginosa ST155.
Tabla 39. Cambios aminoacídicos en las proteínas de resistoma y viruloma de las cepas
de P. aeruginosa ST155.
Tabla 40. Cepas de Pseudomonas spp. de distintos orígenes, seleccionadas para seguir el
estudio de producción de biosurfactantes.
Tabla 41. Medida de la tensión superficial (mN/m) de los sobrenadantes diluidos en
caldo NB, de las cepas de Pseudomonas spp. seleccionadas para el estudio.
Tabla 42. Ramnolípidos producidos por la cepa P. aeruginosa Ps756, detectados en el
sobrenadante, e identificados mediante HPLC-MS.
xviii
Tabla 43. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI, mg/mL) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB, mg/mL) de los biosurfactantes estudiados, en las cepas control.
Tabla 44. Genes responsables en la síntesis de biosurfactantes identificados en el
genoma de P. mendocina.
ANEXOS
Tabla S1. Muestras recogidas de animales sanos.
Tabla S2. Muestras de niños.
Tabla S3. Muestras recogidas de alimentos vegetales.
Tabla S4. Caracterización de las 178 cepas de Pseudomonas spp. de los tres orígenes
estudiados.
Tabla S5. Caracterización de las 76 cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres
orígenes estudiados.
Tabla S6. Caracterización del fenotipo de virulencia de las 76 cepas de Pseudomonas
aeruginosa de los tres orígenes estudiados.
Tabla S7. Genes responsables de la producción de biosurfactantes, usados para la base
de datos.
RESUMEN
xxi
RESUMEN
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, con gran versatilidad
metabólica y extraordinaria habilidad para crecer en distintos nichos ecológicos.
P. aeruginosa es uno de los mayores responsables de infecciones nosocomiales,
caracterizado por su resistencia a antibióticos y su gran arsenal de factores de virulencia.
Existen múltiples estudios evaluando la relación resistencia a antibióticos-virulencia en
cepas clínicas; mientras que los trabajos realizados con Pseudomonas de muestras no-
clínicas son nulos o incompletos.
Por ello, los dos primeros objetivos de esta tesis fueron estudiar la prevalencia de
Pseudomonas en muestras fecales de animales sanos y de niños y en alimentos vegetales;
así como determinar su fenotipo de resistencia a agentes antipseudomónicos. La
prevalencia de Pseudomonas en animales (n=704) y en niños (n=477) fue de 6,5 y 6,7%,
respectivamente; mientras que en alimentos vegetales (n=145) fue de 53,1%. De los 330
aislados obtenidos, P. putida y P. aeruginosa predominaron entre las 20 especies
detectadas. El 44,8% de los aislados de Pseudomonas spp. mostró resistencia al menos a
uno de los antibióticos testados, destacando aztreonam (41,5%). El fenotipo de
multirresistencia se detectó en cuatro aislados (1,2%). P. aeruginosa se aisló en 6,3% de
las muestras de niños, en 0,8% de animales y en 17,9% de alimentos vegetales;
caracterizadas por su alto porcentaje de sensibilidad antimicrobiana (93,1%).
El tercer objetivo fue tipificar molecularmente los aislados de Pseudomonas spp.,
observándose una alta diversidad clonal mediante PFGE. No se detectaron patrones
relacionados entre cepas de distintos orígenes. En las 76 cepas de P. aeruginosa, el
serotipo O:6 fue el más frecuente (38%) y también se observó una elevada diversidad
clonal (70 patrones de PFGE). Entre las 55 secuencias tipo (ST) detectadas por MLST, 14
de ellas fueron nuevas, y algunos clones (como ST244, ST252, ST253, ST277, ST395 y
ST1033) se repitieron entre las cepas aisladas de niños y de alimentos vegetales. Destaca
la presencia de clones intercontinentales, como ST155, ST244, ST252, ST274 y ST395,
entre las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes.
El estudio de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos también fue objetivo
de esta tesis. Ningún aislado presentó un fenotipo carbapenemasa; sin embargo, las
cepas de P. aeruginosa mostraron un gran polimorfismo en la proteína OprD (13
patrones). Se detectó la secuencia de inserción ISPa1635 truncando el gen oprD
(GenBank MH050332) en una de las cepas resistentes a imipenem.
xxii
El quinto objetivo fue estudiar la presencia de factores de virulencia, la producción de
biofilm, pigmentos y la actividad elastasa en cepas de P. aeruginosa. El 80,2% de
P. aeruginosa presentó el genotipo exoU-/exoS+; mientras que el genotipo exoU+/exoS-,
asociado a una elevada citotoxicidad, se detectó en el 17,1% (9 cepas de niños y 4 de
alimentos vegetales). Seis P. aeruginosa aisladas de animales sanos carecían de los genes
codificantes de los efectores del Sistema de Secreción Tipo 3 y de los genes exoA y rhlC,
pero ninguna de estas seis cepas amplificó el gen de la exolisina ExlA, descrito
recientemente. Todas las cepas de P. aeruginosa portaban los genes lasA, lasB, aprA,
rhlAB, rhlI y rhlR. Los genes lasI y lasR no amplificaron en tres cepas que pertenecían al
clon ST155. Se detectaron secuencias de inserción (ISPre2, IS1411, ISPa91 y IS1394)
truncando el gen lasR (GenBank MH050329, MH050330, MH050331, MG815635,
respectivamente) en cuatro cepas de P. aeruginosa. La producción de biofilm, piocianina
y piorrubina, así como la actividad elastasa fue superior a la cepa de referencia PAO1 en
el 92, 64, 67 y 76% de las cepas de P. aeruginosa, respectivamente.
El sexto objetivo fue estudiar el genoma completo de las cepas de P. aeruginosa
pertenecientes al clon ST155. Se observaron distintos mecanismos de resistencia
intrínsecos y alteraciones en sus bombas de expulsión activa; así como la presencia de la
isla de patogenicidad del plásmido pUM505 que contiene el gen crpP, descrito
recientemente. Las variantes de CrpP detectadas en estas P. aeruginosa, mostraban
mutaciones en las posiciones catalíticas implicadas en la inactivación del ciprofloxacino
(identidad 94-99%) y una localización cromosómica.
Los últimos objetivos fueron detectar y caracterizar los biosurfactantes producidos
por Pseudomonas spp. El 97,3% de las cepas de P. aeruginosa y el 32% de las cepas no
aeruginosa, principalmente P. putida y P. mendocina, mostraron producción de
biosurfactantes mediante el método CTAB-MB agar. Los tres biosurfactantes purificados
de dos P. mendocina y una P. aeruginosa mostraron actividad antimicrobiana frente a
S. aureus (rango CMI: 0,21-3,38 mg/mL) y P. aeruginosa (0,11-0,42 mg/mL). Los
ramnolípidos de P. aeruginosa se asociaron probablemente a la producción de RhlAB y
RhlC; mientras que queda pendiente de resolver la caracterización estructural y genética
de los biosurfactantes de P. mendocina.
Esta tesis, aporta datos de gran importancia en epidemiología, resistencia a
antibióticos y virulencia de Pseudomonas de origen no-clínico con aplicación en salud
humana, salud animal y seguridad alimentaria. Y a su vez, la detección de biosurfactantes
con actividad antimicrobiana constituye una importante herramienta biotecnológica de
aplicación industrial y medioambiental.
xxiii
ABSTRACT
Pseudomonas aeruginosa is an opportunist pathogen, with great metabolic versatility
and extraordinary ability to grow in different ecological niches. P. aeruginosa is one of
the main responsible of nosocomial infections, characterised by their antimicrobial
resistance and virulence factors. There are multiple studies evaluating the antibiotic
resistance-virulence relationship in clinical strains; whereas researches on non-clinical
Pseudomonas are scarce or incomplete.
The first two objectives of this thesis were to study the Pseudomonas prevalence in
faecal samples of healthy animals and children, and in food vegetables; and to determine
their antimicrobial resistance phenotype. The Pseudomonas prevalence in healthy
animals (n=704) and children (n=477) was 6.5 and 6.7%, respectively; whereas it was
53.1% in food vegetables (n=145). P. putida and P. aeruginosa were the most
predominant species among the 20 detected in the 330 recovered isolates. Forty-five per
cent of Pseudomonas spp. isolates were resistant to at least one of the antibiotics tested;
and the highest percentage was to aztreonam (41.5%). The multidrug-resistance
phenotype was detected in four isolates (1.2%). P. aeruginosa was isolated in 6.3% of
children samples, 0.8% of healthy animals, and 17.9% of food vegetables; characterised
by their high antimicrobial susceptibility percentage (93.1%).
The third objective was to analyze the molecular typing of Pseudomonas isolates. The
PFGE analysis showed a high clonal diversity among Pseudomonas spp. isolates. No
related patterns were detected among strains from different origins. Regarding the 76
P. aeruginosa strains, the O:6 serotype was the most predominant (38%), and a high
clonal diversity was also observed (70 PFGE patterns). Among the 55 detected sequence
types (ST), 14 of them were new ST, and some clones (such as ST244, ST252, ST253,
ST277, ST395 and ST1033) were repeated in strains from children and food vegetables.
Highlight the presence of intercontinental clones, such as ST155, ST244, ST252, ST274
and ST395, among the P. aeruginosa strains of different origins.
The study of carbapenem-resistance mechanisms was other objective of this thesis.
None of the isolates presented a carbapenemase phenotype; however, P. aeruginosa
strains showed a great polymorphism in the OprD protein (13 patterns). The insertion
sequence ISPa1635 was observed truncating the oprD gene (GenBank MH050332) in an
imipenem-resistant strain.
The fifth objective was to study the presence of virulence markers, the biofilm and
pigments production, and the elastase activity in P. aeruginosa strains. The exoU-/exoS+
xxiv
genotype was detected in 80.2% of P. aeruginosa strains, while the exoU+/exoS- genotype,
associated to high cytotoxicity, was amplified in 17.1% (9 strains from children and 4
from food vegetable). Six P. aeruginosa strains from healthy animals lacked the Type 3
Secretion System (exoU, exoS, exoY, exoT), exoA and rhlC genes; however, none of these
strains amplified the recently described ExlA exolysin gene (exlA). All P. aeruginosa
strains amplified the lasA, lasB, aprA, rhlAB, rhlI and rhlR genes. Three strains belonging
to clone ST155, lacked lasI and lasR genes. Insertion sequences (ISPre2, IS1411, ISPa91
and IS1394) were detected truncating the lasR gene (GenBank MH050329, MH050330,
MH050331, MG815635, respectively) in four P. aeruginosa strains. Biofilm, pyocyanin
and pyorubin production, and elastase activity were higher in 92, 64, 67 and 76% of
P. aeruginosa strains, respectively, than in the reference strain P. aeruginosa PAO1.
The sixth objective was to analyze the complete genome of P. aeruginosa strains
belonging to clone ST155. Different intrinsic resistance mechanisms and alterations in
the efflux pumps were detected; as well as the presence of the pUM505 pathogenicity
island, containing the crpP gene, recently described. The crpP variants showed mutations
at the catalytic positions responsible for the ciprofloxacin inactivation (94-99% of
identity), and were chromosomally located.
The last objectives were to detect and characterize the biosurfactants production in
Pseudomonas spp. Biosurfactant production was detected, by the CTAB-MB agar method,
in 97% of P. aeruginosa strains and in 32% of no-aeruginosa strains, mainly P. putida and
P. mendocina. The three biosurfactants extracted and purified from two P. mendocina and
one P. aeruginosa strains showed antimicrobial activity against S. aureus (CMI: 0.21-3.38
mg/mL) and P. aeruginosa (0.11-0.42 mg/mL). P. aeruginosa biosurfactants were
rhamnolipids, probably associated to RhlAB and RhlC rhamnosiltransferases.
P. mendocina biosurfactant structures and their genetic association remain unidentified.
This thesis provides data of great importance in epidemiology, antimicrobial
resistance and virulence in non-clinical Pseudomonas, with application in human health,
animal health and food safety. Additionally, the detection of biosurfactants with
antimicrobial activity constitutes an important biotechnological tool for industrial and
environmental application.
INTRODUCCIÓN
In t roducc ión
3
1. El género Pseudomonas
La bacteria Pseudomonas abarca un amplio género perteneciente a la clase
γ-Proteobacteria, orden Pseudomonadales y familia Pseudomonadaceae. Migula, en 1894
fue el primer investigador en proponer este nombre (Palleroni, 2010).
Etimológicamente, “Pseudomonas” significa “falsa unidad”, del griego “pseudo” que
significa “falso”, y “monas” que significa “unidad simple”. Actualmente, a este género
pertenecen unas 270 especies distintas, según el Approved Lists of Bacterial Names
(http://www.bacterio.net/pseudomonas.html), y se clasifican en 7 grupos distintos
basados en su secuencia 16S rRNA (grupo P. syringae; grupo P. chlororaphis; grupo
P. fluorescens; grupo P. putida; grupo P. stutzeri; grupo P. aeruginosa y grupo
P. pertucinogena) (Anzai et al., 2000; Peix et al., 2018) (Figura 1).
En general, las bacterias de este género son bacilos Gram negativos rectos o
ligeramente curvados, de entre 1,5 a 5 µm de longitud y un diámetro de entre 0,5 y
1,0 µm; no formadoras de esporas, no fermentadoras de azúcares, móviles gracias a los
flagelos polares, catalasa positivas y aerobias estrictas, aunque algunas veces pueden
usar los nitratos como fuente alternativa de electrones, permitiéndoles crecer en
anaerobiosis. Los aislados de Pseudomonas son oxidasa positiva, excepto las especies
P. luteola y P. oryzihabitans. Este género bacteriano suele crecer de forma rápida, y en un
amplio rango de temperatura, entre 20°C y 42°C, aunque su temperatura óptima oscila
entre los 30°C y 37°C. Son capaces de dividirse bajo distintas condiciones ambientales.
Se le considera un género ubicuo, ya que pueden encontrarse en ecosistemas tanto
acuáticos como terrestres (Silby et al., 2011), creciendo en lugares como suelos, aguas,
artículos de limpieza, combustible, alimentos, animales, plantas, etc. Eso es debido a que
presentan una importante versatilidad, tanto metabólica como fisiológica, que les lleva a
una rápida colonización y dispersión en distintos hábitats, ya sean terrestres o acuáticos
(Palleroni, 1992) (Figura 2). Además, las especies pertenecientes a este género pueden
presentar resistencia a antibióticos, desinfectantes, detergentes, metales pesados y
solventes orgánicos (Lanini et al., 2011).
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Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las últimas especies del género
Pseudomonas descritas, basado en el análisis de los genes 16S rRNA, gyrB, rpoB y rpoD
(Peix et al., 2018).
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Es frecuente encontrar distintas especies de Pseudomonas en alimentos, tanto en
alimentos cárnicos (Estepa et al., 2015) como en vegetales (Allydice-Francis & Brown,
2012). Algunos productos frescos pueden presentar microorganismos ambientales no
patógenos (Aserse et al., 2013), pero durante su crecimiento o procesado, pueden
contaminarse con bacterias patógenas o comensales procedentes del ser humano. Esta
contaminación suele darse por el contacto directo con el suelo de cultivo, incluso con la
aplicación de biofertilizantes (Ben Said et al., 2015; Van Hoek et al., 2015). Así, las frutas
y vegetales que crecen cerca del suelo, y que no requieren proceso de preparación, son
aquellas que más posibilidades tienen de contaminación (Berger et al., 2010). Sin
embargo, también son frecuentes las contaminaciones en comercios por la incorrecta
manipulación humana (Van Hoek et al., 2015) o las contaminaciones cruzadas. En esta
línea, investigaciones del grupo de Correa (Correa et al., 1991) observaron un 19% de
prevalencia de cepas de P. aeruginosa procedentes de vegetales frescos recogidos en un
hospital oncológico, habiéndolos desinfectado previamente con hipoclorito al 1%
(Kominos et al., 1972).
Figura 2. Rango funcional y ambiental del género Pseudomonas spp. (Silby et al., 2011).
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Las especies de este género presentan la capacidad de producir colonias de distinta
morfología y/o pigmentos. Un ejemplo es el fenotipo mucoide que presentan algunas
especies, sobre todo en aislados de P. aeruginosa de muestras de pacientes con fibrosis
quística. Por otro lado, presentan la capacidad de formar biofilm tanto en superficies
biológicas como fómites, un mecanismo que les proporciona una importante ventaja
frente a la acción de los antibióticos y otras presiones medioambientales.
Algunas especies de Pseudomonas presentan la capacidad de producir pigmentos
como mecanismo de virulencia. Estos pigmentos son fluorescentes bajo luz ultravioleta
de longitud de onda baja (254 nm), sobre todo cuando crecen en medios con bajo
contenido en hierro. El pigmento fluorescente más frecuente es la pioverdina, que
proporciona un color amarillo-verdoso. La piocianina, por otro lado, es un pigmento no
fluorescente de color azul-verdoso producido por la mayoría de cepas de P. aeruginosa;
la piorrubina, de color rojo similar al óxido; la oxiclororafina, de color naranja
encontrado en P. clororaphis y la clororafina, de color verde, descrito también en
P. clororaphis. Muchos de estos pigmentos actúan como sideróforos en los sistemas
bacterianos de captación de hierro (Meyer et al., 2002).
El principal patógeno de la familia Pseudomonadaceae es P. aeruginosa, responsable
de múltiples infecciones nosocomiales graves, como neumonía, infecciones del tracto
urinario o sepsis (Lister et al., 2009; Lee et al., 2013). Aunque las especies P. putida,
P. stutzeri, P. fluorescens, P. mendocina o P. fulva también son responsables de infecciones
en humanos (Nseir et al., 2011; Liu et al., 2014; Hardjo Lugito et al., 2015; Liu et al., 2015),
pueden encontrarse en el medioambiente. Asimismo, también se han dado casos clínicos
aislados, como el caso de una sepsis causada por la especie P. oryzihabitans (Owusu et
al., 2017), especie que ha sido descrita como saprófita, aislada normalmente en cultivos
de arroz, suelos y aguas estancadas (Silva, 2015). Por otro lado, este género no solo
infecta al ser humano, sino también es capaz de producir infecciones en plantas (P.
syringae) y/o insectos (P. entomophila) (Silby et al., 2011).
Sin embargo, también existen especies con potencial biotecnológico. Es el caso de
P. putida, y sus propiedades biodegradativas. Su genoma suele ser algo más grande que
el de otras especies (6 Mb), y como su género indica, es capaz de vivir en múltiples
ambientes. Esta especie bacteriana tiene la propiedad de sintetizar y/o degradar una
amplia variedad de compuestos metabólicos que posteriormente pueden servir en el
ámbito biotecnológico o agrario (Silby et al., 2011). De igual manera ocurre con la especie
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P. fluorescens, estudiada por sus propiedades que llevan al control del crecimiento de
algunas plantas (Haas & Défago, 2005).
Los estudios de poblaciones microbianas se han centrado durante los últimos años en
comprender la evolución y epidemiología de las enfermedades infecciosas, estudiando
para ello los patógenos responsables. Sin embargo, son escasos los estudios
epidemiológicos sobre el género Pseudomonas en muestras no clínicas (Levin et al., 1999;
Spratt & Maiden 1999).
1.1 Pseudomonas aeruginosa
La especie más importante de este género bacteriano es P. aeruginosa. Esta bacteria
fue aislada por primera vez en 1872 por Schroeter, a partir de muestras ambientales
(Palleroni, 1984). Debido a que algunas de sus colonias presentan una pigmentación de
color azul-verdoso, la denominación de la especie deriva de la palabra “aerugo” que
significa “óxido de cobre” y “osus”, adjetivo que indica abundancia (Viedma et al., 2012).
P. aeruginosa es un bacilo Gram negativo aerobio, catalasa y oxidasa positiva, no
fermentadora de lactosa y glucosa y metabólicamente versátil, capaz de crecer a
temperaturas de entre 4°C y 42°C. Por otro lado, es bien conocida por presentar un
genoma adaptativo, de entre 5,5 y 7 Mb, el cual le permite colonizar una amplia variedad
de nichos ecológicos (Freschi et al., 2015), como suelos, hábitats marinos y plantas. Sin
embargo, la capacidad de crecer en lugares húmedos con nutrientes mínimos, hace que
sea un problema importante a nivel hospitalario y alimentario. Puede ser causa de
infecciones relacionadas con instrumental quirúrgico, como catéteres, estetoscopios,
drenajes, etc., al que se adhiere formando un biofilm difícil de eliminar (Lister et al.,
2009). Es capaz de migrar por el ambiente y llegar a causar infecciones tanto en el ser
humano, como en animales, ya sean salvajes o domésticos (Pirnay, 2009). En este caso,
puede causar otitis, infecciones del tracto urinario en perros, mastitis en ganado vacuno,
endometritis en caballos y neumonía hemorrágica en visones o zorros (Kidd et al., 2011;
Salomonsen et al., 2013). Además, también se puede encontrar fuera del ambiente
clínico, como en piscinas, tubos de agua caliente, líquido de lentillas o cosméticos (Lister
et al., 2009; Abidi et al., 2013). Por otro lado, esta especie bacteriana no suele encontrarse
en la microbiota de individuos sanos o animales, pero el tracto gastrointestinal es el lugar
de colonización más común, entre un 2,6 a 24% de prevalencia, seguido de la piel, faringe,
fosas nasales o axilas, con una tasa de detección que oscila entre el 2 y el 10% (Lister et
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al., 2009; Estepa et al., 2014; Valenza et al., 2015). Sin embargo, la tasa de colonización
aumenta en individuos inmunosuprimidos u hospitalizados, particularmente aquellos
que pasan largos periodos de hospitalización. Por otro lado, debemos reconocer que las
cepas no clínicas de P. aeruginosa procedentes de animales y ambiente han tenido mucha
menos atención en comparación con las clínicas, de ahí que no se hayan hecho grandes
análisis genómicos de éstas (Szmolka et al., 2012).
La colonia típica suele ser alargada y plana con el centro elevado, aunque existen
numerosas variantes morfológicas (sobre todo cuando crecen formando biofilm),
después de que dichas cepas hayan estado expuestas a estrés medioambiental, por la
presencia de antibióticos, o durante infecciones crónicas de las vías respiratorias.
Además, el cultivo presenta un olor característico a uva (Henry & Speert, 2011). Las
variantes de la morfología colonial presentan además alteraciones fenotípicas respecto
a la resistencia a antibióticos, movilidad, expresión de genes de virulencia, adherencia y
formación de biofilm. La generación de estas variantes contribuye a la persistencia y
éxito como patógeno de P. aeruginosa. Por otro lado, un fenotipo comúnmente observado
es el mucoide, como consecuencia de la sobreproducción del polisacárido alginato, sobre
todo en aislados procedentes de muestras de vías respiratorias de pacientes con fibrosis
quística, y se correlaciona con las infecciones crónicas en estos pacientes (May et al.,
1991).
P. aeruginosa presenta dos características muy importantes, que hacen de esta
bacteria un patógeno peligroso: la resistencia intrínseca a antibióticos, y la producción
de mecanismos de virulencia. Esta especie presenta una elevada resistencia intrínseca a
varias familias de antibióticos y una extraordinaria capacidad de adquirir nuevos
mecanismos de resistencia, tanto por mutaciones cromosómicas como por transferencia
horizontal. Es por esta razón que es muy complicado encontrar alternativas terapéuticas
(Juan & Oliver, 2010). Por otro lado, tiene la capacidad de expresar y producir distintos
factores de virulencia, como mecanismos asociados a células (lipopolisacáridos, pili o
flagelos) o factores de secreción (elastasas, proteasas, exotoxinas o exopolisacáridos),
entre otros. Algunos de estos mecanismos se regulan gracias a un mecanismo de
densidad celular llamado Quorum Sensing (QS), responsable de la coordinación de genes
de virulencia, entre otros numerosos genes, los cuales pueden servir como dianas para
nuevos tratamientos antibacterianos (Balasubramanian et al., 2012). Asimismo, cabe
destacar que el tipo de infección que puede causar P. aeruginosa (aguda/crónica), es
independiente de su genotipo, pero está relacionado con el huésped y el estilo que adopta
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la bacteria en el momento de la colonización. Así, en infecciones agudas predomina un
estilo planctónico, mientras que, durante las infecciones crónicas, desempeña un papel
importante el estilo de vida sésil (Valentini et al., 2018).
2. Resistencia a los antibióticos
Un Antibiótico es una sustancia química producida por un microorganismo, que
desarrolla una actividad antimicrobiana, y puede ser natural o semisintético. Un
Antimicrobiano, es un término que abarca aquellos compuestos obtenidos de forma
natural o biosintética, así como los diseñados totalmente en el laboratorio (Paredes &
Roca, 2004). Asimismo, para aclarar conceptos, en este estudio se hablará de antibióticos
para referirse a ambos compuestos. Por otro lado, se denomina Resistencia a
Antibióticos (AMR) a la capacidad que presentan los microorganismos de resistir a la
acción de uno o más agentes antimicrobianos. El aumento de resistencia a estos
compuestos se está observando a nivel mundial.
Las enfermedades infecciosas son una importante causa de mortalidad a nivel global,
y desde que se descubrió la penicilina en 1928, se han ido descubriendo y sintetizando
nuevos antibióticos, como tratamiento para estas enfermedades. Sin embargo, el
aumento de su uso y abuso, tanto a nivel clínico como en agricultura y veterinaria, tanto
con fines terapéuticos o profilácticos, o como promotores de crecimiento (práctica
prohibida en la Unión Europea desde 2006), ha provocado que la resistencia a
antibióticos se haya convertido en un problema emergente a nivel mundial. Esta acción
es una importante amenaza para la salud pública y la seguridad del paciente, lo que
conlleva a un aumento de los costes y fallos en los tratamientos. La Organización Mundial
de la Salud (OMS), así como otras organizaciones, estimaron que las infecciones causadas
por bacterias resistentes podrían causar la muerte de cerca de 10 millones de personas
en el año 2050, superando incluso las muertes por cáncer (O’Niell, 2014. Review on
Antimicrobial Resistance, 2014).
En el entorno hospitalario, la resistencia a los antibióticos es un tema muy delicado,
sobre todo considerando las infecciones nosocomiales. Este problema puede acarrear un
aumento de la morbi- y mortalidad, diagnósticos erróneos y un incremento de los costes
terapéuticos. La Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas empezó a referirse a
aquellos patógenos responsables de enfermedades nosocomiales como patógenos
ESKAPE. Éste es un acrónimo que recoge las especies bacterianas de importancia clínica:
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Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter (Santajit & Indrawattana, 2016),
caracterizadas por poseer importantes mecanismos de resistencia. A raíz de esta
temática, años atrás, el ECDC y el Centro para la Prevención y el Control de Enfermedades
(CDC) decidieron crear una nomenclatura para estandarizar las categorías dentro del
nivel de resistencia presentado por algunas bacterias, como organismos MDR
(multirresistentes), XDR (extensivamente resistentes) y PDR (panrresistentes)
(Magiorakos et al., 2012). Los expertos decidieron aplicar estas definiciones para una
serie de bacterias concretas, S. aureus, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae,
P. aeruginosa y A. baumanii, algunas englobadas en los patógenos ESKAPE. Las
definiciones son las siguientes:
MDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a uno o más antibióticos dentro
de tres o más categorías antimicrobianas.
XDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a uno o más antibióticos en todas
excepto en dos o menos categorías antimicrobianas.
PDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a ninguno de los antibióticos
empleados.
La Tabla 1 presenta las categorías antimicrobianas descritas y los antibióticos
empleados en el tratamiento de P. aeruginosa, para llevar a cabo su clasificación.
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Tabla 1. Categorías antimicrobianas y antibióticos empleados para definir los
microorganismos MDR, XDR y PDR en P. aeruginosa (Magiorakos et al., 2012).
Categoría antimicrobiana Agente antimicrobiano
Aminoglucósidos Gentamicina
Tobramicina
Amikacina
Netilmicina
Carbapenémicos antipseudomónicos Imipenem
Meropenem
Doripenem
Cefalosporinas antipseudomónicas Ceftazidima
Cefepime
Fluoroquinolonas antipseudomónicas Ciprofloxacino
Levofloxacino
Penicilinas antipseudomónicas + inhibidores de
beta-lactamasas
Ticarcilina-ácido clavulánico
Piperacilina-tazobactam
Monobactámicos Aztreonam
Ácidos fosfónicos Fosfomicina
Polimixinas Colistina
Polimixina B
A comienzos del 2017, la OMS publicó una lista con las bacterias más prioritarias en
la búsqueda de nuevos antibióticos y tratamientos para combatirlas. Dividió la lista en
tres categorías: Prioridad 1 (crítica), 2 (elevada) y 3 (media). La bacteria P. aeruginosa
resistente a carbapenémicos figura en el apartado de Prioridad 1, por debajo de
A. baumanii (WHO, 2017). Por otro lado, el ECDC publicó los últimos datos de resistencia
a antibióticos en P. aeruginosa en Europa. El 13,7% de los aislados presentan resistencia
a al menos tres categorías antimicrobianas, mientras que el 5,5% presenta resistencia a
todos los antibióticos antipseudomónicos (ECDC, 2016). La Figura 3 muestra la
resistencia a distintas categorías antimicrobianas de P. aeruginosa en Europa en 2016.
Figura 3. Distribución de resistencia a distintas familias de antimicrobianos en P. aeruginosa en 2016. A, carbapenémicos; B, ceftazidima; C,
piperacilina-tazobactam; D, aminoglucósidos; E, fluoroquinolonas (ECDC, 2016).
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2.1 Mecanismos de acción a los antibióticos
De manera general, los antibióticos se clasificaron según el efecto que ejercían sobre
los microorganismos en bactericidas, que ejercen una acción letal para la bacteria, y
bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento bacteriano, de forma que cuando se
suspende el tratamiento, la bacteria podría volver a proliferar. Sin embargo, un
antibiótico puede llegar a tener los dos efectos, dependiendo de la concentración que se
alcance en la diana terapéutica o la afinidad que tenga hacia ésta. Así, los beta-lactámicos
y aminoglucósidos son bactericidas; macrólidos, tetraciclinas y cloranfenicol presentan
efecto bacteriostático; mientras que fluoroquinolonas y algunos aminoglucósidos son
concentración-dependiente (Paredes & Roca, 2004; Calvo & Martínez-Martínez, 2009;
Kapoor et al., 2017).
Desde el punto de vista molecular, los antibióticos ejercen su efecto y acción en las
siguientes estructuras o funciones bacterianas (Figura 4):
Figura 4. Mecanismos de acción de los antibióticos en la célula bacteriana.
Inhibición de la síntesis de pared bacteriana: la ausencia de esta estructura
condiciona la destrucción del microorganismo. Los antibióticos ejercen su acción
cuando la bacteria se encuentra en estado de crecimiento activo. La síntesis de la
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pared celular se desarrolla en tres etapas, y los compuestos pueden actuar en cada
una de ellas: etapa citoplasmática, donde se sintetizan los precursores del
peptidoglicano; el transporte a través de la membrana, y la organización final de la
estructura del peptidoglicano, que se desarrolla en la parte más externa de la pared.
Los beta-lactámicos son un ejemplo.
Alteración de la membrana citoplasmática: desempeña un papel muy importante
en la difusión y transporte activo de moléculas. Los compuestos que alteran su
estructura modifican la permeabilidad de la membrana, inhibiendo el paso de iones o
moléculas clave para el metabolismo celular. Las polimixinas son un ejemplo.
Inhibición de la síntesis proteica: ésta puede darse en las distintas fases de la
síntesis de proteínas. Estos compuestos pueden unirse a las subunidades 30S y 50S
de los ribosomas, como los aminoglucósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, macrólidos
y oxazolidinonas.
Bloqueo de la síntesis de ácidos nucleicos: podría inhibirse la replicación del DNA,
la transcripción, o la síntesis de metabolitos esenciales para este paso. Las quinolonas,
por ejemplo, inhiben la DNA girasa (topoisomerasa II) y la topoisomerasa IV. Otro
ejemplo es la rifampicina, que inhibe la transcripción.
Bloqueo de mecanismos de resistencia: son los llamados inhibidores de beta-
lactamasas. Carecen de actividad, pero se unen a estas enzimas bloqueando su acción
sobre los antibióticos. Son ejemplos el ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam.
Bloqueo de la síntesis de factores metabólicos: como las sulfamidas, que inhiben
la incorporación de ácido paraaminobenzoico (PABA), evitando así la síntesis de ácido
fólico.
Es de relevante importancia que las bacterias Gram negativas muestran una mayor
resistencia que las Gram positivas, debido a que presentan una membrana externa
rodeando la pared de peptidoglicano. Esta membrana es una importante barrera frente
a algunos antibióticos, donde además se encuentran distintas porinas que permiten la
difusión pasiva de algunas micromoléculas (Calvo &