RESOLVA AGREGADOS DE PROTEÍNAS E … · Peptídeos Proteínas globulares Conjugados de proteínas e biomoléculas grandes ... 15 20 25 7, 12 5 8, 10 7 Monômero de ADC ADC agregado

Colunas Agilent BioHPLC de cromatografia por exclusão de tamanho

RESOLVA AGREGADOS DE PROTEÍNAS E DEGRADANTES COM RAPIDEZ E CONFIANÇA

Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é uma ferramenta fundamental para quantificar monômeros, dímeros, agregados e degradantes em potencial. Esses tipos de separações de proteínas exigem os mais altos níveis de precisão e velocidade.

As colunas Agilent BioHPLC para cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) oferecem desempenho rápido, confiável e preciso para a sua análise biofarmacêutica. Elas são fáceis de integrar em seu fluxo de trabalho e estão disponíveis em diversas dimensões e tamanhos de poro para colaborar com a separação perfeita.

Como fabricante líder de instrumentos e colunas SEC há mais de 30 anos, a Agilent desenvolve continuamente novos produtos que proporcionam separações mais rápidas e com resolução mais alta. Deste modo, de forma rápida e com eficácia em termos de custo, produtos significativos são entregues às mãos de quem precisa deles.

A mais recente adição à família de colunas SEC da Agilent é a AdvanceBio SEC, uma nova tecnologia e partícula, que foi quimicamente projetada e desenvolvida para a quantificação exata e precisa de proteínas e agregados de anticorpo monoclonal (mAb).

COLUNAS AGILENT BioHPLC DE CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO

OBTENHA SEPARAÇÕES RÁPIDAS E DE ALTA RESOLUÇÃO PARA A DEGRADAÇÃO E AGREGAÇÃO DE PROTEÍNAS

3

Qual coluna SEC é a indicada para sua aplicação?A ampla seleção de colunas SEC da Agilent oferece as opções que você precisa para aperfeiçoar as separações com base nos seus parâmetros do método e analitos. Este gráfico fornece uma visão geral das faixas de tamanho de poro que fornecem os melhores resultados para os tipos comuns de moléculas.

Agilent Bio SEC 100Å



100 D 1 kD 10 kD 100 kD 1.000 kD 10.000 kD

InsulinaMioglobina

Ovoalbumina

BSA IgG Tireoglobulina

ProSEC 300S

ZORBAX GF-250

ZORBAX GF-450


Peptídeos Proteínas globulares Conjugados de proteínas e biomoléculas grandes



100.000 kD

MELHOR ESCOLHA DE COLUNAS PARA ANÁLISE DE PROTEÍNA E ANTICORPOS MONOCLONAIS

Agilent AdvanceBio SEC 300Å

Agilent AdvanceBio SEC 130Å NOVO

Nova tecnologia projetada para separações de anticorpo monoclonal Colunas SEC Agilent AdvanceBio .......................................... 4

Análise de proteína usando espectrometria de massas Colunas de HPLC Agilent Bio SEC-3 ...................................... 9

Biomoléculas grandes Colunas de HPLC Agilent Bio SEC-5 .................................... 11

Proteínas globulares com uma única coluna Colunas Agilent ProSEC 300S .............................................. 12

Para protocolos de SEC que exigem designação USP L35 Colunas Agilent ZORBAX GF-250 e ZORBAX GF-450 ............................................................... 13

Descoberta, garantia de qualidade/controle de qualidade e fabricação Flexibilidade com uma única coluna .................................... 14 Purificação ............................................................................ 23 Detectores avançados .......................................................... 24

Sistemas LC para identificação de proteínas e de perfis de impurezas ....................................................... 25

Informação para pedidos ...................................................... 28

CONTEÚDO: Portfólio completo de colunas SEC BioHPLC da Agilent, abrangendo as mais recentes aplicações parabiomoléculas

Para obter mais informações sobre como executar separações rápidas e de alta resolução para degradação e agregação de proteína, acesse www.agilent.com/chem/BioHPLC

4

2 4 6 8 10 12 140

25

50

75

100

125

150

175

2 4 6 8 10 12 140

100

200

300

400

5001

2 3 4

5

mAU

mAU

min

min

1 2

3

4

5

COLUNAS SEC AGILENT ADVANCEBIO

As colunas SEC AdvanceBio oferecem quantificação exata e precisa para análise de proteína e agregação de anticorpo monoclonal por SEC. Esta nova tecnologia de SEC foi concebida e projetada para ter:

• Alta resolução para quantificação mais precisa

• Velocidade maior de análises para entregas dentro dos prazos

• Sem alterações na integridade da amostra

• Quantificação de agregados sensível, mesmo em baixos níveis

Além disso, as colunas SEC AdvanceBio melhoram a produtividade do laboratório, fornecendo métodos robustos e confiáveis que eliminam a reanálise de amostras. Também é possível transferir métodos para outros locais com facilidade, incluindo garantia de qualidade/controle de qualidade, reduzindo o risco de falhas de lotes e candidatos em estágio avançado.

Resolução ótima para quantificação precisa

Os cromatogramas à direita comparam a separação da filtração em gel BioRad alcançada com colunas SEC AdvanceBio de 300 Å e 130 Å.

Cromatogramas de cima: a coluna SEC AdvanceBio de 300 Å oferece resolução para a quantificação de proteínas grandes, incluindo anticorpo monoclonal.

Cromatogramas da base: a coluna SEC AdvanceBio de 130 Å oferece resolução para a quantificação de fragmentos de proteína, proteínas pequenas e peptídeos.

Padrões para filtração em gel BioRad #1511901

2 4 6 8 10 12 14 min

0

10

20

30

40

50

60

70

mAU

1

23

45

Separação da mistura de filtração em gel BioRad usando a SEC AdvanceBio de 300 Å e de 130 Å. A de 300 Å oferece aumento de resolução.

Separação da mistura de proteínas e peptídeos mostrando a resolução de pequenos peptídeos e proteínas, empregando a SEC AdvanceBio de 130 Å.

Coluna: SEC AdvanceBio, 7,8 x 300 mm

1. Ovoalbumina (frango)2. Mioglobina (equino)3. Aprotinina (bovino)4. Neurotensina5. Angiotensina II

1. Tireoglobulina 2. g-globulina bovina3. Ovoalbumina (frango) 4. Mioglobina (equino) 5. Vitamina B12

1. Tireoglobulina 2. g-globulina bovina3. Ovoalbumina (frango) 4. Mioglobina (equino) 5. Vitamina B12

Fase móvel: 150 mM de fosfato de sódio, pH 7,0

130 Å

130 Å

300 Å

5

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

1,50

1,60

1,70

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Fato

r de

reso

luçã

o (m

onôm

ero/

dímer

o)

Resolução de 400 injeções Sobreposições dos cromatogramas 1 e 400

Entrega no prazo: aumento da produtividade

Ao diminuir o comprimento da coluna SEC AdvanceBio de 300 mm para 150 mm e ao aumentar a vazão de 1,0 mL/min para 2,0 mL/min, o tempo de análise foi reduzido de 12 para 3 minutos. Além disso, a resolução do dímero e do monômero IgG foi suficiente para quantificação e constante para mais de 400 injeções.

Coluna: SEC Agilent AdvanceBio de 300 Å, 7,8 x 150 mm

Fase móvel: 150 mM de fosfato de sódio, pH 7,00,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

0

10

20

30

40

50

60mAU

min

Padrões de proteína para a SEC Agilent AdvanceBio de 130 ÅUma mistura de proteínas que consiste em 5 proteínas selecionadas cuidadosamente (Ovoalbumina, Mioglobina, Aprotinina, Neurotensina, Angiotensina II) projetada para calibrar as colunas de exclusão de tamanho Agilent AdvanceBio de 130 Å. Esse padrão pode ser usado regularmente para calibrar a coluna e garantir o desempenho ideal do sistema em várias aplicações envolvendo análise e purificação de proteínas.

Padrões de proteína para a SEC Agilent AdvanceBio de 300 ÅUma mistura de proteínas que consiste em 5 proteínas selecionadas cuidadosamente (Tiroglobulina, G-Globulina, Ovoalbumina, Mioglobina, Angiotensina II) projetada para calibrar as colunas de exclusão de tamanho AdvanceBio 300 Å da Agilent. Esse padrão pode ser usado regularmente para calibrar a coluna e garantir o desempenho ideal do sistema em várias aplicações envolvendo análise e purificação de proteínas.

Sobreposição dos cromatogramas de IgG: Injeção 1, 100, 200, 300, 400

6

Sem alterações na integridade da amostra

Como parte do protocolo de instalação, as gerações mais antigas de colunas SEC para proteína tinham que ser condicionadas com BSA para bloquear os sítios ativos responsáveis por interações não específicas. A nova ligação química usada nas colunas SEC Agilent AdvanceBio elimina esse problema, fornecendo uma superfície inerte que reduz interações não específicas e mantém a integridade da amostra.

2 4 6 8 10 12 14010203040

2 4 6 8 10 12 14010203040

Corrida 1

Corrida 1300

min

min

mAU

mAU

Gráfico mostrando a resolução entre o dímero e o monômero da IgG em uma sequência de 1300 injeções.

2 4 6 8 10 12 14

-2-101234567

mAU

min

Injeções Área do pico do monômero1 50.52 49.63 50.64 50.05 50.2

Nenhum problema de recuperação de proteína observado; Integridade da amostra mantida

Coluna: SEC AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm


Cinco replicatas de injeções de BSA 0,1 mg/mL, 1 µl equivale a 0,1 µg de BSA on-column. A área do pico de BSA também é constante, mesmo com cargas on-column de 0,1 μg.

Coluna: SEC AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm


Amostra: IgG

1,70 1,80 1,90 2,00 2,10 2,20 2,30 2,40 2,50 2,60

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Fato

r de

reso

luçã

o (m

onôm

ero/

dímer

o)

Número da injeção

O perfil de uma amostra de IgG não mudou, mesmo após 1300 injeções (superior esquerdo). Os fatores de resolução e a quantificação de dímero e monômero da IgG também se mantiveram dentro da faixa de trabalho durante toda a vida útil da coluna.

7

Realize quantificação de agregados, mesmo em baixos níveis

Resolução e estabilidade da linha de base foram alcançadas com uma coluna SEC-3 AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 μm. Isso permitiu uma quantificação em níveis baixos de dímeros e agregados em amostra de conjugado de medicamento de anticorpo (ADC) e anticorpo monoclonal.

Reduza os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ)

Os LOD e LOQ foram considerados como 15 μg/mL e 31 μg/mL, respectivamente, para trastuzumabe e ADC, comprovando a sensibilidade do método.

min5 6 7 8 9 10 11 12

mAU

0

0,5

1

1,5

2

2,5DAD1 B, Sig=280, LOQ

DAD1 B, Sig=280, brancoDAD1 B, Sig=280, LOD

LOD

LOQ

Branco

Trastuzumabe

min5 6 7 8 9 10 11 12

mAU

0

0,5

1

1,5

2

2,5

DAD1 B, Sig=280, branco

DAD1 B, Sig=280, LOQDAD1 B, Sig=280, LOD

ADC

LOD

LOQ

Branco

Cromatogramas nos LOD e LOQ da trastuzumabe e ADC sobrepostos com o da amostra branco.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160DAD1 B, Sig=280

7,125

8,107

min7 7.5 8 8.5 9

mAU

0

5

10

15

20

25

7,125

8,107

Monômero de ADC

ADC agregado

Coluna: SEC-3 AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvel: Tampão (PBS), 50 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,4

Vazão: 0,8 mL/min

Instrumento: LC quaternário Agilent 1260 Infinity Bio-inert

Amostra: trastuzumabe e conjugado de medicamento de anticorpo (T-DM1)

Perfil de SEC de T-DM1 intacto (ADC).

8

AGILENT 1260 INFINITY BIO-SEC MULTI DETECTOR SUITE (MDS)

ANÁLISES DE BIOMOLÉCULAS INFINITAMENTE MELHORES

Há décadas, a SEC tem sido o principal meio na análise de biopolímeros, especialmente na detecção e quantificação de agregação de proteínas. O uso de detectores avançados pode proporcionar aumento da sensibilidade a esses parâmetros essenciais e fornecer informações adicionais para o analista, o que é especialmente importante com o aumento das normas. O Agilent 1260 Infinity Bio-SEC MDS é uma solução dedicada para a análise de biomoléculas grandes.

Detectores avançados determinam pesos moleculares, tamanho e forma precisos da biomolécula. O projeto dos componentes livres de metal no caminho da amostra

September 30, 2015

Confidentiality Label

Técnicas de detecção avançada

e a ausência de ferro e aço na entrega de solvente garantem a integridade da biomolécula, minimizando as interações de superfície indesejadas e proporcionando confiança na qualidade dos dados. Combinadas com um software intuitivo e fácil de usar, essas informações avançadas são obtidas de forma fácil e reprodutível a partir deste sistema de alto desempenho.

· Pesos moleculares precisos—determine a massa molar real em vez da relativa

· Sensível à agregação—descubra a presença de agregação em quantidades muito baixas

· Estude o tamanho molecular—determine o raio de hidratação da biomolécula

· Acesso a todos—obtenha os resultados que você precisa, não importa seu nível de experiência

· Reprodutível—aumento da reprodutibilidade da detecção avançada

· Mantenha a integridade da amostra—as superfícies em contato com a amostra são livres de metais

· Simplicidade—informações avançadas por meio de uma interface de usuário simples

A coluna SEC AdvanceBio tem a menor dispersão de partículas e, portanto, o menor ruído na linha de base.

Agilent: SEC AdvanceBio 300 Å Concorrente AConcorrente B

9

COLUNAS DE HPLC AGILENT BIO SEC-3

COMPATIBILIDADE COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PICOS

A tecnologia de partícula Bio SEC-3 é estável em eluentes comumente usados em MS, tornando as colunas SEC-3 Agilent Bio totalmente compatíveis com espectrometria de massas. Partículas robustas também asseguram a estabilidade da linha de base e diminuem a supressão de sinal no MS. Vantagens adicionais:

• Compatibilidade com fases móveis aquosas e orgânicas desnaturantes utilizadas em SEC-MS.

• Excelente estabilidade com ambas as condições de salinidade alta e baixa

• Escalabilidade da preparação analítica até a laboratorial

As colunas Agilent Bio SEC-3 usam a mesma tecnologia de partículas que as colunas Agilent SEC-5 e, portanto, oferecem uma opção de maior de eficiência quando mais resolução for necessária para as biomoléculas menores.

Fase ligada

Tamanho de poro (Å)

Tamanho de partícula (μm)

Faixa de peso molecular de proteínas (Da)

Faixa de pH Vazão (mL/min)

Pressão de operação típica (bar)

Bio SEC-3

100 3 100 a 100.000 2 a 8,5 0,1 a 1,25 (DI de 7,8 mm); 0,1 a 0,4 (DI de 4,6 mm)

103 (1500 psi)

Bio SEC-3


103 (1500 psi)

Bio SEC-3

300 3 5.000 a 1.250.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (DI de 7,8 mm); 0,1 a 0,4 (DI de 4,6 mm)

103 (1500 psi)

Especificações da coluna Bio SEC-3

Curvas de calibração de proteína com a Bio SEC-3

Coluna: Bio SEC-3 7,8 x 300 mm, 3 µm

Fase móvel: Fosfato de sódio 150 mM, pH 7,0

Vazão: 1,0 mL/min

Detector: UV

Volume de retenção

ProteínasPeso molecular (Da)

300 Å 150 Å 100 Å

Tiroglobulina 670,000 6.34 5.50 5.63

g-Globulina 150,000 8.03 6.24 5.74

BSA 67,000 8.90 7.00 6.03

Ovoalbumina 45,000 9.57 7.70 6.41

Mioglobina 17,000 10.12 8.50 7.10

Ribonuclease A 12,700 10.40 8.80 7.46

Vitamina B12 1,350 11.90 11.40 10.20

1.000.000

100.000

10.000

1.000

1004 5 6 7 8 9 10 11 12 13

300Å

150Å

100Å

Volume de retenção (mL)

Peso

mol

ecul

ar

10

3x10

00,20,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 74030.8

74193,1

74353,1 73879,3

73000 73200 73400 73600 73800 74000 74200 74400 74600 74800 75000 75200 75400

G0F

G0

G1F

G2F

3x10

00,250,5

0,751

1,251,5

1,752

2,252,5

2,753

3,253,5

3,754

4,25 46877,1

45800 46000 46200 46400 46600 46800 47000 47200 47400 47600 47800 48000

4x10

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

11,11,2

23558,7

23744,2

22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700

G0F/G0F

G0F/G1F

G1F/G1F

G1F/G2F G0/G0F

4x10

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

11,11,21,31,41,51,61,71,8 148225,8

148066,4 148387,2

147918,9

Contagens vs. Massa deconvoluída (amu)

146600 146800 147000 147200 147400 147600 147800 148000 148200 148400 148600 148800 149000 149200 149400 149600 149800

G0

G0F

G1F

G2F

N-acetilglucosamina ManoseGalactose Fucose

Contagens vs. Massa deconvoluída (amu) Contagens vs. Massa deconvoluída (amu)

Contagens vs. Massa deconvoluída (amu)

HSNH2

OH

O

A espectrometria de massas é uma técnica excelente para determinar a identidade e a estrutura do pico.

Acoplar SEC com MS pode fornecer informações adicionais não disponíveis quando um detector de arranjo de diodos ou UV são utilizados. No entanto, fases móveis típicas usadas em SEC contêm tampões e sais, tornando-as incompatíveis com MS. Ao alterar para uma fase móvel desnaturante (como acetonitrila e água misturada com ácido trifluoroacético e fórmico), a coluna SEC pode ser acoplada diretamente ao MS.

Análise por SEC-MS (anticorpo monoclonal intacto)

Coluna: Bio SEC-3 7,8 x 300 mm, 3 µm

LC: Agilent 1290 Infinity LC Quaternário Bio-Inert

MS: Agilent 6540 Q-TOF

MS

UV (214 nm )

a

b

c d

a

b

c d

Zoom

Herceptina 6

x10

1,5 1,75

2 2,25 2,5

2,75 3

3,25 3,5

3,75

2x10

0 0,2 0,4 0,6 0,8

1 1,2

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tempo de resposta vs. de aquisição (min)Fase móvel: 20% de acetonitrila, 0,1% de ácido

fórmico, 0,1% de ácido trifluoroacético

Vazão: 1 mL/min

Temperatura: 24 °C

Pico b

Pico c

Pico a

Pico d

O pico a representa o pico do monômero do anticorpo monoclonal intacto com diferentes formas glico. Os picos b, c e d são fragmentos.

11

COLUNAS DE HPLC AGILENT BIO SEC-5

EXCELENTE DESEMPENHO PARA BIOMOLÉCULAS MAIORES

Para biomoléculas grandes e amostras com componentes de vários pesos moleculares, as colunas Agilent Bio SEC-5 são a escolha ideal. Elas vêm com partículas de sílica de 5 µm revestidas com uma camada exclusiva, neutra e hidrofílica, para a obtenção de máxima eficiência e estabilidade, com seis tamanhos de poro diferentes para oferecer resolução ideal na faixa de peso molecular.

• Resolução excepcional para moléculas grandes

• Alta estabilidade e eficiência devido a uma camada hidrofílica neutra exclusiva

• Capacidade de pico e resolução aprimoradas devido à embalagem projetada especialmente para aumentar o volume de poro

• Desempenho robusto: excelentes reprodutibilidade e vida útil da coluna

• Excelente estabilidade, mesmo em condições de pH alto e alta e baixa salinidade

• Flexibilidade no desenvolvimento de métodos: : compatível com a maioria dos tampões aquosos

• • Alta aplicabilidade: tamanho de poro de até 2000 Å para vacinas e biomoléculas de alto peso molecular

Fase ligada






Bio SEC-5


103 (1500 psi)

Bio SEC-5


103 (1500 psi)

Bio SEC-5

300 5 5.000 a 1.250.000


103 (1500 psi)

Bio SEC-5

500 5 15.000 a 2.000.000


103 (1500 psi)

Bio SEC-5

1000 5 50.000 a 7.500.000


103 (1500 psi)

Bio SEC-5

2000 5 >10,000,000 2 a 8,5 0,1 a 1,25 (DI de 7,8 mm); 0,1 a 0,4 (DI de 4,6 mm)

103 (1500 psi)

Especificações da coluna Bio SEC-5

Curvas de calibração de proteína com a Bio SEC-5

Vários tamanhos de poro disponíveis para resolução ideal em diferentes faixas de peso molecular.

Volume de retenção

Proteínas Peso molecular (Da) 1.000 Å 500 Å 300 Å 150 Å 100 Å

Tiroglobulina 670,000 10.07 8.23 7.03 5.82 5.77g-Globulina 158,000 10.88 9.80 8.57 6.55 5.79BSA 67,000 11.13 10.44 9.44 7.29 6.00Ovoalbumina 45,000 11.28 10.83 9.89 7.90 6.40Mioglobina 17,000 11.44 11.28 10.42 8.66 7.05Ribonuclease A 12,700 11.52 11.41 10.58 8.93 7.32Vitamina B-12 1,350 12.00 12.59 11.78 11.49 10.30Uracila (marcador de permeação total) 112 12.08 12.68 12.21 12.13 11.41

4100

1.000

10.000

100.000

1.000.000

Peso

mol

ecul

ar

Volume de retenção (mL)5 6 7 8 9 10 11 12 13

1000Å500Å300Å150Å100Å

Coluna: Bio SEC-5, 7,8 x 300 mm, 5 µm


Vazão: 1,0 mL/min Detector UV

12

COLUNAS AGILENT PROSEC 300S

ANALISE PROTEÍNAS GLOBULARES COM UMA ÚNICA COLUNA

As colunas ProSEC 300S foram projetadas como uma solução para usar uma única coluna para a análise de proteínas globulares. A seleção e a otimização do tamanho de poro oferecem uma ampla faixa de resolução linear de modo que esta coluna possa ser usada em toda a faixa de proteínas globulares. Suas partículas robustas não se fragmentam durante o uso, o que impede a lixiviação de partículas e oferece uma linha de base excepcionalmente estável.

• • Desempenho estável: partículas de sílica mecanicamente robustas que não sangram durante o uso

• Fácil desenvolvimento de métodos: a ampla faixa de resolução linear elimina a necessidade de seleção de tamanho de poro; uma única coluna para analisar a maioria das proteínas globulares

• Opções que ajudam a aperfeiçoar a separação: duas identificações de coluna para atender a SEC de detecção múltipla

• Sensibilidade aumentada quando usada com detectores de espalhamento de luz, para identificar dímeros, trímeros e agregados

Fase ligada






ProSEC 300S

300 5 1.500 a 800.000 2 a 7,5 <1,5 (DI de 7,5 mm); <0,5 (DI de 4,6 mm)

250 (3700 psi)

Especificações da coluna ProSEC 300S

Calibração da coluna ProSEC 300S com proteínas globulares

Esta curva de calibração mostra uma relação linear entre o tempo de retenção e o log do peso molecular, demonstrando uma verdadeira separação por exclusão de tamanho.

Coluna: ProSEC 300S 7,5 x 300 mm, 5 µm

Fase móvel: 50 mM KH2PO4-K2HPO4 (a pH 6,8) contendo 0,3 M NaCl

Vazão: 1,0 mL/minDetecção: UV 280 nmAmostra: proteínas

5 7 9 10Tempo de retenção (min)

133

3,5

4

4,5

5

5,5

6

Log

M

Peso molecular (Da) Proteína

670,000 Tiroglobulina155,000 g-Globulina66,430 Albumina de soro bovino44,287 Ovoalbumina29,000 Anidrase carbônica16,700 Mioglobulina12,384 Citocromo c1,423 Bacitracina

Pesos moleculares das proteínas

13

0

12

3 4

5 6

1

2

3 4

56

5 10 15

0 5 10 15

0

12

3 4

5 6

1

2

3 4

56

5 10 15

0 5 10 15

COLUNAS AGILENT ZORBAX GF-250 E GF-450

PARA MÉTODOS DE SEC QUE EXIGEM DESIGNAÇÃO USP L35

As colunas de exclusão de tamanhos ZORBAX GF-250 e ZORBAX GF-450 (filtração em gel) apresentam uma fase ligada hidrofílica de diol para alta recuperação de proteína (normalmente > 90%), além de uma exclusiva modificação da sílica com zircônia para se obter uma faixa operacional de pH mais ampla.

• Análise de ponta a ponta: opções de dimensões de coluna semipreparativa e preparativa, utilizável com vazões de até 3 mL/min

• Alta recuperação: base ligada de diól hidrofílico normalmente com recuperação > 90%

• Resistência: microesferas de sílica porosa precisamente dimensionadas, de tamanho de poro e distribuição de tamanhos de partículas estreitos

• Compatível com modificadores orgânicos (<25%) e desnaturantes para minimizar interações não específicas

• Alta aplicabilidade: uma ampla faixa de pH utilizável: 3 a 8

Essa separação de proteínas mostra a relação complementar entre as colunas preparativas GF-450 e GF-250. A coluna GF-450 separou de forma confiável as biomoléculas de alto peso molecular que foram excluídas do intervalo de separação linear da coluna GF-250 (com um tamanho de poro menor).

Fase ligada




Faixa de pH

Vazão (mL/min)


ZORBAX GF-250 150 4 4.000 a 400.000 3,0 a 8,0 <3.0 350 (5.104 psi)

ZORBAX GF-450 300 6 10.000 a 900.000 3,0 a 8,0 <3.0 350 (5.104 psi)

Especificações das colunas ZORBAX GF-250 e ZORBAX GF-450

Separações de proteínas em colunas semipreparativas

Coluna: ZORBAX GF-250, 9,4 x 250 mm, 4 µm

Coluna: Agilent ZORBAX GF-450, 9,4 x 250 mm, 6 µm

Fase móvel: 0,2 M Na2HPO4, pH 7,0 Vazão: 5,0 mL/minDetecção: UV 280 nmAmostra: 200 µL

1. Tireoglobulina, 5,43 min2. Dímero BSA, 6,19 min3. Monômero BSA, 6,93 min4. Ribonuclease A, 8,74 min5. Poli-DL-alanina (1-5 kDa), 9,90 min6. Uracila, 12,13 min

ZORBAX GF-250

ZORBAX GF-450

14

DESCOBERTA, GARANTIA DE QUALIDADE/CONTROLE DE QUALIDADE E FABRICAÇÃO

FLEXIBILIDADE DE AMOSTRA COM UMA ÚNICA COLUNA SEC ADVANCEBIO

Coluna SEC AdvanceBio e método únicos utilizados para análise de vários bioterapêuticosVários tipos de amostras, anticorpos monoclonais bioterapêuticos, inovadores, biossimilares e ADC usando a mesma fase móvel aquosa.

Coluna: SEC-3 AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvel: Tampão (PBS), 50 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,4

Vazão: 0,8 mL/min Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC quaternário

Amostra: rituximabe inovador, rituximabe biossimilar, cetuximabe inovador, herceptina inovadora, ADC

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0200400600800

1000120014001600

DAD1 A, Sig=220, rituximabe inovador

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0200400600800

1000120014001600

DAD1 A, Sig=220, rituximabe inovador

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0100200300400500600700 DAD1 A, Sig=220,

cetuximabe inovador

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0250500750

1000125015001750 DAD1 A, Sig=220,

herceptina inovadora

A B

C D

Perfil de SEC de anticorpos monoclonais terapêuticos intactos, A-rituximabe inovador, B-rituximabe biossimilar, C-cetuximabe inovador e D-herceptina inovadora.

Cromatograma da SEC AdvanceBio para ADC nativo (controle; traço vermelho) sobreposto com 2 mg/mL de ADC estressado por pH/calor.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

DAD1 A, Sig=220, ADC estressado por calor/pH

6,654 7,1

41

8,067

11,58

6 12,73

7

DAD1 A, Sinal=220, ADC intacto

8,106

ADC agregado

ADC intacto

ADC degradado

Tempo de retenção Área do pico

Amostras Média (min) RSD Média (mAU/

min) RSD

Rituximabe inovador 8.28 0.04 99.33 1.21

Rituximabe biossimilar 8.29 0 100 0

Cetuximabe inovador 7.86 0 99.60 0.96

Herceptina inovadora 8.034 0 100 0

ADC 8.106 0.005 98.91 0.33

Tempo de retenção e precisão da área do pico (n=6)

15


REALIZE SEPARAÇÕES POR EXCLUSÃO DE TAMANHO EFICIENTES COM UMA GRANDE VARIEDADE DE FASES MÓVEIS

Desempenho robusto e resolução em diferentes condições de salinidadeAs colunas SEC Agilent AdvanceBio fornecem desempenho robusto em diferentes condições de salinidade e ao longo do tempo.

Seu mecanismo de separação de SEC deve ser baseado em tamanho, sem nenhuma interação secundária com a fase estacionária. A tecnologia inovadora de partículas empregada nas colunas SEC AdvanceBio elimina a necessidade de usar altas concentrações de sal para obter separações por tamanho, reduzindo interações iônicas não específicas.

100 mM de fosfato 50 mM NaCl80 mM de fosfato 70 mM NaCl60 mM de fosfato 90 mM NaCl40 mM de fosfato 110 mM NaCl20 mM de fosfato 130 mM NaCl


pH 7,5

pH 6,0

200

100

0

2 4 6 8 10

200

100

0

2 4 6 8 10



pH 7,5

pH 6,0

200

100

0

2 4 6 8 10

200

100

0

2 4 6 8 10

Picos com formato constante que não apresentam a distorção característica das interações não específicas.

Sem necessidade de sal: a retenção da SEC está relacionada com o tamanho molecular em solução. Pequenas variações nos tempos de eluição devem-se provavelmente ao impacto da concentração de sal e pH sobre o raio hidrodinâmico das proteínas.

Coluna: SEC-3 AdvanceBio, 300 Å, 7,8 x 300 mm Padrões para filtração em gel BioRad #1511901

16

O impacto da concentração do tampão de fosfato e do pH na quantificação de monômero e dímero.

Economize tempo e dinheiro na preparação do tampão

F+

NaCl

G+

NaCl

H+

NaCl

I+

NaCl

J+

NaCl

F G H I J

Preparação manual de tampões

Mistura dinâmica online automatizada de tampões

Ácido Base

O software Agilent Buffer Advisor ajuda a automatizar o preparo de tampões. A mistura dinâmica de apenas quatro soluções estoque elimina a necessidade de preparar e titular várias soluções-tampão. Aumente o desempenho: rápido desenvolvimento de métodos através do preparo automatizado de tampões Economize tempo: misturador quaternário permite mesclar facilmente vários tampões de diferentes concentrações de sal ou pH, para a preparação mais rápida de tampões Reduza os custos: avalie as condições para obter o eluente ideal antes de analisar amostras, para diminuir perda de amostra e tempo de análise


SOFTWARE QUE PERMITE A OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO EM UMA FRAÇÃO DO TEMPO

Órgãos regulatórios exigem que planejamentos experimentais estabeleçam o método analítico ideal, juntamente com a reprodutibilidade e a robustez do método. Fazer isso manualmente envolve a preparação de um vasto número de fases móveis e o condicionamento do LC conforme cada fase móvel é alterada, o que é um processo demorado.

O software Agilent Buffer Advisor simplifica o protocolo, permitindo o preparo de tampões no sistema a partir de apenas quatro componentes (dois tampões, além de água e uma solução salina).

Na análise à direita, a robustez da quantificação de monômero e dímero de BSA foi investigada por meio do uso de 20 fases móveis (pH 6,0 a 7,5) e concentrações de tampão que variam de 20 mM a 100 mM.

80%

82%

84%

86%

88%

90%

0 20 40 60 80 100 120Fosfato mM

Fosfato mM

Monômero %

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

Dímero %

0 20 40 60 80 100 12010%

11%

12%

13%

14%

15%

80%

82%

84%

86%

88%

90%

0 20 40 60 80 100 120Fosfato mM

Fosfato mM

Monômero %

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

Dímero %

0 20 40 60 80 100 12010%

11%

12%

13%

14%

15%

Coluna: AdvanceBio SEC, 300 Å, 7,8 x 300 mm

Amostra: BSA

17

Reprodutibilidade de lote a lote

Ao trabalhar em laboratórios credenciados e precisar entregar resultados nos prazos, ter colunas e métodos robustos é uma necessidade.

As colunas SEC AdvanceBio oferecem desempenho e reprodutibilidade por toda a vida útil da coluna. Consulte as páginas 5 e 6 para dados de coluna a coluna e de lote a lote.

De um instrumento para outro

A transferência de métodos para outros instrumentos de LC dentro do mesmo departamento ou em departamentos, locais e empresas diferentes é exigida conforme os candidatos a bioterápicos avançam no desenvolvimento para aprovação. O tamanho de partícula 2,7 µm das colunas SEC AdvanceBio oferece resolução em pressões abaixo de 200 bar. A análise pode ser feita usando sistemas de HPLC; não há necessidade de considerar a disponibilidade do instrumento durante o desenvolvimento de métodos.

2 4 6 8 10 12 140

1020304050607080

2 4 6 8 10 12 140

1020304050607080

mAU

mAU min

min

213

4

5

213

4

5

Análise de y-globulina, (IgG) usando colunas SEC AdvanceBio de 300 Å, 4,6 x 300 mm, 2,7 µm a partir de dois lotes diferentes do meio. A resolução entre os picos 3 e 4, o dímero e monômero, e as áreas percentuais dos picos mostram excelente reprodutibilidade de lote a lote

Rs (monômero/dímero) 1,94

Rs (monômero/dímero) 1,98

min0 2 4 6 8 10 12 14

AU

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Sobreposição de quatro injeções consecutivas em sistema de HPLC Waters Alliance

Sobreposição de quatro cromatogramas consecutivos de uma IgG policlonal em SEC AdvanceBio de 300 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7µm realizado em sistema de HPLC Waters Alliance.

Sistema de HPLC Alliance

Número do pico Área % Área %1 2.6 2.92 2.0 2.13 12.8 12.94 78.9 78.45 3.7 3.7

Injeções Área % #1

Área % #2

Área % #3

Área % #4

1 1.7 1.8 1.7 1.72 10.6 10.5 10.3 10.23 86.5 86.1 86.3 86.64 1.3 1.6 1.7 1.6


CONFIE NA SEC ADVANCEBIO PARA TER A MAIS ALTA PRECISÃO

18

LC Binário Agilent 1290 Infinity com DAD Agilent 1260 (G1315D) e cela de fluxo biocompatível (1200 bar). Coluna SEC AdvanceBio 4,6 x 300 mm e vazão de 0,35 mL/min.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

Métodos UHPLC para aumento da sensibilidadeOs instrumentos UHPLC oferecem a menor dispersão e alta precisão e são a opção preferida para o início do desenvolvimento. Para aplicações que exigem sensibilidade e/ou pequenas quantidades de amostra, um menor diâmetro interno (DI) de coluna é usado. Para a SEC, ele seria de 4,6 mm. Normalmente, as vazões usadas com essas colunas seriam de 0,3 a 0,7 mL/min.

LC quaternário Agilent 1260 Infinity Bio-inert (600 bar). Coluna SEC AdvanceBio 4,6 x 300 mm e vazão de 0,35 mL/min.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

200


DIFERENTES DIMENSÕES DE COLUNA, MESMO DESEMPENHO

Para comparar o desempenho da coluna em diferentes instrumentos, foram utilizados o padrão de filtração em gel BioRad #1511901 (picos azuis) e uma IgG policlonal comercialmente disponível. Os dados foram gerados em laboratórios diferentes, usando colunas diferentes e lotes diferentes de amostras de testes.

19

min0 2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Robustez nos métodos de HPLC Para métodos robustos capazes de fornecer a precisão e a reprodutibilidade necessárias para métodos de controle de qualidade, os instrumentos HPLC são, frequentemente, os sistemas preferencialmente escolhidos. Para métodos HPLC robustos, as colunas com diâmetro interno de 7,8 mm são rotineiramente usadas. As vazões ideais para esse tipo de sistema de LC são 1,0 mL/min para resolução em colunas de 300 mm de comprimento e até 2 mL/min em colunas de 150 mm de comprimento para maior produtividade analítica.

Instrumento de HPLC Agilent 1100 (400 bar). Coluna SEC AdvanceBio 7,8 x 300 mm e vazão de 1,0 mL/min.

Com as colunas SEC AdvanceBio, não há necessidade de alterar a coluna ou validar um método novo quando um candidato passar da descoberta para o desenvolvimento; na fabricação, basta alterar as dimensões da coluna SEC AdvanceBio.

As colunas SEC AdvanceBio da Agilent com tamanho de partícula otimizado de 2,7 μm oferecem excelente desempenho com pressões típicas menores que 200 bar.

Os métodos podem ser transferidos de instrumento a instrumento e de laboratório a laboratório.

Os dados de UHPLC foram gerados na Europa, em um laboratório de P&D, e os dados de HPLC em um laboratório de suporte técnico nos Estados Unidos, por cientistas diferentes usando amostras diferentes e colunas diferentes.

20

Cromatografia por exclusão de tamanho de PEG GCSF usando a coluna SEC AdvanceBio de 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 µm. A. PEG GCSF intacto, zoom mostrando os agregados. B. PEG GCSF intacto, sobreposição com amostra estressada por calor e mostrando o agregado.

PEGlação é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a proteínas ou medicamentos. As vantagens da molécula PEGlada incluem maior biodisponibilidade, aumento do tempo de meia vida do soro e diminuição da imunogenicidade.

min2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600DAD1 A, Sig=214

4,132

4,739

5,125

min4 5 6

mAU

0

10

20

30

40

4,132

4,739

5,125

min2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600DAD1 A, Sinal=214, PEG GCSF estressado por calor

4,501

5,117

DAD1 A, Sinal=214, PEG GCSF intacto

Monômero PEG GCSFAgregado PEG GCSF

Monômero PEG GCSF

A B

Coluna AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mm Instrumento: Sistema de LC quaternário Agilent 1260 Infinity Bio-InertFase móvel uma mistura de 6,8 mL de uma solução 85% v/v de ácido (conforme monografia): ortofosfórico: em 800 volumes de água, ajuste de pH para 2,5 com 10 N de hidróxido de sódio, 50 volumes de etanol e 150 volumes de água.

Análise de proteínas PEGladas


MONOGRAFIA DE MÉTODOS SEC

Vazão: 1 mL/minTemperatura: 25 °CAmostrador automático termostatizado 4 °CDetector: 214 nm (1260 DAD VL+,

cela de fluxo biocompatível G5615-60022)Volume de injeção: 3 µL

A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é o método preferencial para a identificação de impurezas de alta massa molecular de proteínas PEGladas. Abaixo, um método de SEC foi usado para identificar pegfilgrastim (PEG GCSF) conforme uma versão preliminar de monografia utilizando uma coluna SEC Agilent AdvanceBio de 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 μm.

Os resultados confirmam que a porcentagem de área do monômero e o desvio-padrão do tempo de retenção estavam dentro dos critérios aceitáveis definidos pela monografia. Além disso, as colunas SEC da Agilent separaram, detectaram e quantificaram com sucesso agregados de PEG GCSF produzidos por estudos de degradação forçada.

21

min5 10 15 20 25

0

100

200

300

400

DAD1 A, Sig=276 16,29

0

24,22

1

26,79

7

13,56

9

27,89

5

mAU

min10 12 14 16 18 20 22

0,5

1

1,5

2

2,5

13,56

9

16,29

0

mAUMonômero

HMW

Rs= 3,84

A insulina é um pequeno hormônio polipeptídeo que controla a homeostase da glicose do sangue. Empresas biofarmacêuticas usam técnicas de engenharia genética para desenvolver diversos análogos da insulina de ação prolongada.

Os dados abaixo foram produzidos através da análise de um análogo da insulina e dos seus agregados com o uso de uma versão modificada da monografia preliminar do método SEC. A coluna SEC AdvanceBio Agilent de 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 µm de tamanho de poro menor forneceu resolução superior entre monômero e agregado.

Análise de insulina

Coluna: AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mmInstrumento: sistema LC Binário Agilent 1290 InfinityFase móvel L-arginina (1,0 g/L)/ácido acético (99%)/acetonitrila; 65/15/20 (v/v/v) Vazão: 0,4 mL/minTemperatura: ambienteAmostrador automático 4 °C termostatizadoDetector: 276 nm (1260 DAD VL+, cela de fluxo biocompatível G5615-60022). Volume de injeção: 10 µL

Cadeia B30 aminoácidos

Cadeia A21 aminoácidos

Insulina humana

22


MONITORE A ESTABILIDADE DA PROTEÍNA

A coluna SEC AdvanceBio resolveu os agregados e também o trastuzumabe degradado e o ADC. Em ambos os casos, a agregação aumentou conforme as amostras foram estressadas.

A mesma fase móvel aquosa foi usada para o mAb e o ADC mais hidrofóbico.

Cromatograma de trastuzumabe nativo (traço vermelho) sobreposto com 2 mg/mL de herceptina estressada por pH/calor.

Cromatograma de ADC nativo (traço vermelho) sobreposto com 2 mg/mL de ADC com degradação de pH/calor.

Coluna: AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvel: 50 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,4

Vazão: 0,8 mL/minSistema: LC quaternário Agilent 1260

Infinity Bio-inert Amostra: trastuzumabe e conjugado

de medicamento de anticorpo (T-DM1)

As amostras estressadas foram preparadas com o ajuste do pH para 1,0, 10 e 6,0 e, em seguida, incubadas a 60 ºC por 60 minutos.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

6,610

7,033

8,049

11,58

4

12,74

0

14,46

913,11

4

DAD1 A, Sinal=220, Trastuzumabe intactoDAD1 A, Sig=220, trastuzumabe estressado por calor/pH

Fragmentos

Agregado

Trastuzumabe inato

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

DAD1 A, Sig=220, ADC estressado por calor/pH

6,654 7,1

41

8,067

11,58

6 12,73

7

DAD1 A, Sinal=220, ADC intacto

8,106

ADC agregado

ADC intacto

ADC degradado

Trastuzumabe

ADC

23


MELHORE A PRECISÃO EM APLICAÇÕES SEMIPREPARATIVAS E DE BIOPURIFICAÇÃO

As colunas Agilent BioHPLC estão disponíveis em tamanhos que suportam aplicações semipreparativas e de biopurificação confiáveis. Juntamente com o sistema de LC Agilent 1260 Infinity Bio-inert e o coletor de fração bio-inert 1260 Infinity, elas podem aumentar a exatidão da coleta de frações com base nos picos.

Esse padrão de filtração em gel contendo tiroglobulina, g-globulina, ovalbumina, mioglobina e vitamina B12 foi separado com o uso de SEC. Depois disso, as frações foram automaticamente coletadas (usando o modo de acionamento de fração com base nos picos), em posições determinadas de uma placa de poço profundo. As frações foram então reanalisadas usando uma coluna C8 de fase reversa.

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

γ-g

lobu

lina

- 158

.000

Da

Ovoa

lbum

ina

- 44.0

00 D

a

Tiro

globu

lina

- 670

.000

Da

Mio

globin

a - 1

7.000

Da

Vita

mina

B12

- 1.3

50 D

a

A reanálise das frações confirma a exatidão do processo de fracionamento usando o modo de acionamento de fração com base no pico. A válvula de 6 portas e 2 posições no compartimento da coluna habilitou a alternância de coluna automatizada.

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

200400600

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

1200

SEC

C8

1000800600400200

0

5 7,5 10 12,5 15 min

mAU P1-G-1

P1-G-2

P1-G-3

P1-G-4

P1-G-5

P1-G-6

P1-G-7

SEC e coleta de fraçõesColuna: Bio SEC-3, 300 Å,

7,8 × 300 mm, 3 μm Fase móvel: tampão A: 50 mM de tampão

de fosfato de sódio + 150 mM NaCl, pH 6,8

Vazão: 1 mL/minGradiente: isocráticoVolume de injeção: 30 μLAmostrador automáticotermostatizado e FC: 8 °CTemperatura da coluna: temperatura ambienteDAD: 280 nm/4 nm, Ref.: OFFLargura do pico: >0,05 minuto (tempo de

resposta de 1,0 segundo) (5 Hz)

Reanálise — C8 de fase reversaColuna: ZORBAX 300SB-C8,

4,6 x 50 mm, 5 µm Fases móveis: tampão B: ACN + 0,09% TFA

tampão C: H2Odd + 0,1% TFAVazão: 1 mL/minGradiente: 0 min 5 % B, 95% C

10 min 95% B, 5% C Tempo de análise: 10 min Tempo de parada: 10 min

Volume de injeção: 100, 50 e 10 μLAmostrador automáticotermostatizado e FC: 8 °CTemperatura da coluna: 70 °CDAD: 280 nm/4 nm

Ref.: OFFLargura do pico: >0,05 minuto (tempo de

resposta de 1,0 segundo) (5 Hz)

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MAIOR SENSIBILIDADE COM A DETECÇÃO POR ESPALHAMENTO DE LUZ

Combinar um detector de espalhamento de luz com um detector de concentração (como UV ou IR) pode fornecer dados de peso molecular absoluto. O espalhamento de luz fornece maior sensibilidade para os agregados em comparação com detectores de concentração, como UV e IR.

Três regiões do cromatograma são mostradas (monômero, dímero e trímero), junto com informações de peso molecular derivadas do software. Como esperado, o sinal do detector de espalhamento de luz foi visivelmente mais sensível ao material de maior peso molecular, o que melhorou a exatidão e os limites de detecção para a quantificação de agregados.

Para estudar os maiores agregados de proteínas grandes, pode ser necessário o uso de uma coluna com tamanho de poro maior, maximizando as informações obtidas.

Neste caso, uma coluna Agilent Bio SEC-5 de 500 Å foi usada para alcançar a separação em toda a faixa de agregados maiores.

Limites de detecção melhores através do espalhamento de luz

Colunas: Bio SEC-5, 500 Å, 7,8 × 300 mm, aço inoxidável Fase móvel: 50 mM de fosfato de sódio, 250 mM NaCl, pH 7,0Volume de injeção: 50 μLVazão: 1,0 mL/minTemperatura: 30 °CAmostra: g-globulina bovinaConcentração da amostra: 1,0, 2,0 e 4,0 mg/mLDetecção: UV 280 nm; LS 15° e 90°; IRInstrumento: sistema de LC quaternário Agilent 1260 Infinity Bio-Inert com Agilent 1260 Infinity

GPC/SEC Multi Detector Suite

Sinais do detector para o monômero (região 3), dímero (região 2) e trímero (região 1) de IgG bovina. O tempo de corrida foi de 20 minutos.

320300280260240220200180160140120100806040200

-20-40 1e0

1e1

1e2

1e3

1e4

1e5

Tempo (min)

Resp

osta

do

dete

ctor

(mV)

Log MW

(g/mol)

20181614121086420

Pico 1. MW 460.281 (trímero) Pico 2. MW 302.178 (dímero) Pico 3. MW 153.404 (monômero)

1 2 3

Laranja = UV 280 nmVermelho = espalhamento de luz a 90° Azul = índice refrativo

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Do sistema de entrega de solvente livre de ferro e aço aos componentes livres de metais para a trajetória do fluxo da amostra, o LC quaternário Agilent 1260 Infinity Bio-inert atinge novos padrões em desempenho e confiabilidade..Esse sistema robusto resiste às difíceis condições de solventes normalmente usadas na análise de proteínas e bioterápicos e também minimiza problemas associados às ligações não específicas. Usado em conjunto com colunas Agilent BioHPLC de troca iônica, melhores tempo de resolução são alcançados.

Caminho do fluxo da amostra 100% bioinerte

Todos os capilares e conexões no amostrador automático, no compartimento da coluna e nos detectores são completamente livres de metal, assim as biomoléculas só entram em contato com a cerâmica ou com o PEEK. Isso ajuda a evitar problemas como picos com cauda, baixa recuperação e diminuição da vida útil da coluna, por minimizar a interação secundária de proteínas e peptídeos com superfícies metálicas.

Verdadeiro desempenho de UHPLC

Faixa de potência de até 600 bar, capaz de lidar com as pressões mais elevadas exigidas pelas tecnologias emergentes de colunas com partículas menores. É a combinação perfeita para todas as colunas SEC e de troca iônica com tamanhos de partícula de até 1,7 μm.

O software Agilent Buffer Advisor oferece uma maneira simples e rápida de criar gradientes salinos ou de pH.

Para saber mais sobre o LC Agilent 1260 Infinity Bio-inert, acesse www.agilent.com/chem/1200BioLC

Tecnologia de conexões e capilares para operação robusta e segura todos os dias.Com o LC 1260 Infinity Bio-inert, a Agilent usa tecnologia de conexões e capilares que facilita a combinação única de bioinércia sem metal e operação de alta pressão. Três tipos diferentes de capilares são implementados:

• Capilares de titânio altamente resistentes à corrosão para as linhas de entrega de solvente • Capilares de PEEK revestidos em metal no compartimento da coluna e no amostrador automático • Capilares de PEEK nas regiões de baixa pressão do sistema a jusante da coluna de separação

Os capilares de PEEK revestidos em metal contam com um sistema de conexão exclusivo para que o caminho da amostra seja completamente inerte, em cada conexão. A ponta de PEEK mecanicamente intertravada é altamente resistente à tensão lateral ou de rotação, eliminando torque no capilar durante o aperto da conexão.

Para saber mais, acesse www.agilent.com/chem/LCcapillaries


LC QUATERNÁRIO AGILENT 1260 INFINITY BIO-INERT:ANÁLISE DE BIOMOLÉCULAS INFINITAMENTE MELHOR

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INSTRUMENTOS AGILENT PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS E PERFIL DE IMPUREZAS

Novo LC Agilent 1290 Infinity II: a última geração em UHPLC, maior eficiência em três dimensões

► Maximize a eficiência analítica: O desempenho incomparável de separação e detecção oferece análise de dados da mais alta qualidade

► Aumente a eficiência instrumental: maior capacidade de amostra e ciclos de injeção mais rápidos agregam novos níveis de utilização

► Aumente a eficiência do laboratório: perfeita integração na infraestrutura atual e transferência de métodos de equipamentos legados sem problemas

O LC Agilent 1290 Infinity II é disponível com bomba de alta velocidade ou bomba flexível

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Sistema LC Binário Agilent 1260 Infinity: elevando o padrão analítico em HPLC, com 600 bar, detector de 80 Hz de alta velocidade e sensibilidade até 10 vezes maior

100 % compatível com HPLC, capacidade de UHPLC, além de:► Trajetória de fluxo biologicamente inerte e resistente à corrosão► Faixa de pH mais ampla► Para bioanálise e biopurificação

Utilização em qualquer aplicação UHPLC padrão

Sistema Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC: uma solução dedicada para análise avançada reprodutível de fármacos proteicos.

Se a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) for combinada com detectores de espalhamento de luz avançados, isso permitirá que os bioquímicos determinem pesos moleculares e tamanho na solução mais exatos, além de proporcionar uma detecção mais sensível de agregação na análise de biomoléculas grandes.

► Informações de tamanho e pesos moleculares reprodutíveis e exatas.

► Detecção sensível de agregados com detecção de espalhamento de luz de baixo volume morto, líder do mercado

► Exatidão no tamanho e peso molecular devido à detecção avançada

Usados em aplicações que requerem mais sensibilidade para biomoléculas grandes

Para mais detalhes sobre esses sistemas avançados, acesse www.agilent.com/chem/BioHPLC

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INFORMAÇÃO PARA PEDIDOS

Colunas de HPLC Agilent AdvanceBio SEC A mais recente tecnologia para análise de anticorpos monoclonais, proteínas e peptídeos por SEC

Descrição 130 Å 300 Å

Colunas analíticas4,6 x 300 mm, 2,7 µm PL1580-5350 PL1580-5301

4,6 x 150 mm, 2,7 µm PL1580-3350 PL1580-3301

7,8 x 300 mm, 2,7 µm PL1180-5350 PL1180-5301

7,8 x 150 mm, 2,7 µm PL1180-3350 PL1180-3301

Colunas de guarda analíticas

4,6 x 50 mm, 2,7 µm PL1580-1350 PL1580-1301

7,8 x 50 mm, 2,7 µm PL1180-1350 PL1180-1301

Padrões de proteína Agilent SEC AdvanceBio

Descrição Tamanho Part number

130 Å Vials de 1,5 mL 5190-9416

300 Å Vials de 1,5 mL 5190-9417

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Colunas de HPLC Agilent Bio SEC-5 para biomoléculas grandes e amostras com componentes de peso molecular variados

Descrição 100 Å 150 Å 300 Å 500 Å 1.000 Å 2.000 Å

Colunas analíticas4,6 x 300 mm, 5 µm 5190-2518 5190-2523 5190-2528 5190-2533 5190-2538 5190-2543

4,6 x 150 mm, 5 µm 5190-2519 5190-2524 5190-2529 5190-2534 5190-2539 5190-2544

7,8 x 300 mm, 5 µm 5190-2516 5190-2521 5190-2526 5190-2531 5190-2536 5190-2541

7,8 x 150 mm, 5 µm 5190-2517 5190-2522 5190-2527 5190-2532 5190-2537 5190-2542


4,6 x 50 mm, 5 µm 5190-6857 5190-6858 5190-6859 5190-6860 5190-6861 5190-6862

7,8 x 50 mm, 5 µm 5190-2520 5190-2525 5190-2530 5190-2535 5190-2540 5190-2545

Colunas de guarda preparativas21,2 x 300 mm, 5 µm 5190-6863 5190-6864 5190-6865 5190-6866 5190-6867 5190-6868

Guardas preparativas

21,2 x 50 mm, 5 µm 5190-6869 5190-6870 5190-6871 5190-6872 5190-6873 5190-6874

Colunas de HPLC Agilent Bio SEC-3 para análise de proteínas com detecção por MS

Descrição 100 Å 150 Å 300 Å

Colunas analíticas4,6 x 300 mm, 3 µm 5190-2503 5190-2508 5190-2513

4,6 x 150 mm, 3 µm 5190-2504 5190-2509 5190-2514

7,8 x 300 mm, 3 µm 5190-2501 5190-2506 5190-2511

7,8 x 150 mm, 3 µm 5190-2502 5190-2507 5190-2512


4,6 x 50 mm, 3 µm 5190-6846 5190-6847 5190-6848

7,8 x 50 mm, 3 µm 5190-2505 5190-2510 5190-2515

Colunas de guarda preparativas21,2 x 300 mm, 3 µm 5190-6850 5190-6851 5190-6852

Guardas preparativas

21,2 x 50 mm, 3 µm 5190-6854 5190-6855 5190-6856

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Colunas Agilent ProSEC 300S para proteínas globulares (USP L33)

Descrição 100 Å

Colunas analíticas4,6 x 250 mm, 5 µm PL1547-5501

7,5 x 300 mm, 5 µm PL1147-6501

7,5 x 600 mm, 5 µm PL1147-8501

Colunas de guarda analíticas4,6 x 50 mm, 5 µm PL1547-1501

7,5 x 50 mm, 5 µm PL1147-1501

Colunas de filtração em gel ZORBAX GF-250 e GF-450 para protocolos de análise que requerem o uso da designação USP L35

Descrição Tamanho Part number

Colunas analíticasGF-250, 150 Å 4,6 x 250 mm, 4 µm 884973-701

GF-250, 150 Å 9,4 x 250 mm, 4 µm 884973-901

GF-450, 300 Å 9,4 x 250 mm, 6 µm 884973-902

Kits e colunas de guarda analíticas

Cartucho de guarda ZORBAX Diol, 4/pcte 4,6 x 12,5 mm, 6 µm 820950-911

Cartucho de guarda ZORBAX Diol, 2/pcte 9,4 x 15 mm, 6 µm 820675-111

Kit de hardware de guarda para DI de 4,6 mm 820999-901

Kit de hardware de guarda para DI de 9,4 mm 840140-901

Colunas PrepHTPrepHT GF-250, 150 Å 21,2 x 250 mm, 6 µm 877974-901

PrepHT GF-450, 300 Å 21,2 x 250 mm, 6 µm 877974-910

Kits e guardas PrepHT

Cartucho de guarda ZORBAX Diol PrepHT, 2/pcte 17 x 7,5 mm, 5 µm 820212-911

Kit de hardware de cartucho de guarda para DI de 21,2 mm 820444-901

Adaptadores de extremidade PrepHT, 2/pcte 820400-901

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TRADIÇÃO DE INOVAÇÃO AGILENT

A Agilent continua a inovar com a família AdanceBio de colunas para atender aos requisitos para a caracterização de proteínas e anticorpos monoclonais. As colunas Agilent AdvanceBio são projetadas para promover precisão e velocidade em caracterizações, análises de agregação usando SEC, variantes de carga por IEX, massa intacta, estrutura primária e perfil de impurezas por fase reversa, glicanos clivados por interação hidrofílica e determinação do título de anticorpos monoclonais por cromatografia de afinidade.

Colunas Agilent BioHPLC

AfinidadeDeterminação de título e purificação

Bio-Monolith Protein A AdvanceBio RP-mAb Mapeamento de glicanos AdvanceBio SEC AdvanceBio, 2,7 µm

Bio-Monolith Protein G Mapeamento de peptídeos AdvanceBio ZORBAX RRHD 300 Å, 1,8 µm Bio SEC-3

ZORBAX RRHD 300 Å, 1,8 µm Bio SEC-5

Poroshell 300 ProSEC 300S

PLRP-S ZORBAX GF-450 ZORBAX GF-250

ZORBAX 300SB

ZORBAX Análise de aminoácidos

Fase reversaIdentificação de proteínas

e perfil de impurezas

HILICAnálise de glicanos

Exclusão de tamanhoAnálise de agregação

Bio-Monolith (QA, DEAE, SO3)

Bio mAb

Bio IEX (SAX, SCX, WAX, WCX)

PL-SAX

PL-SCX

Troca iônicaAnálise de variantes de carga

Elimine obstáculos para a caracterização bem-sucedida de proteínas e anticorpos monoclonais. Acesse www.agilent.com/chem/BioHPLC

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Os produtos Agilent são exclusivos para pesquisas.Não devem ser usados em procedimentos de diagnóstico.As informações, descrições e especificações presentes nestapublicação estão sujeitas a mudanças sem aviso prévio.

© Agilent Technologies, Inc. 2015 Impresso nos EUA, 16 de dezembro de 2015 5991-2898PTBR

Saiba mais sobre Colunas SEC Agilent BioHPLC, www.agilent.com/chem/BioHPLC

Encontre um centro de atendimento ao cliente Agilent em seu país www.agilent.com/chem/contactus

Brasil 0800 7281405 [email protected]

Europa [email protected]

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