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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO- MEC
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA-UFRA
CURSO DE AGRONOMIA
THAYNÁ DA CRUZ FERREIRA
RESPOSTA DE DEFESA INDUZIDAS POR PGPR´S EM PLANTAS
DE ARROZ DE TERRAS ALTAS CONTRA MANCHA PARDA
CAUSADA POR Bipolaris sp.
BELÉM
2019
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO- MEC
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA-UFRA CURSO
DE AGRONOMIA
THAYNÁ DA CRUZ FERREIRA
RESPOSTA DE DEFESA INDUZIDAS POR PGPR´S EM PLANTAS
DE ARROZ DE TERRAS ALTAS CONTRA MANCHA PARDA
CAUSADA POR Bipolaris sp.
ORIENTADORA: Dra. GISELE BARATA DA SILVA
BELÉM
2019
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Universidade Federal Rural da Amazônia como
requisito para a obtenção do grau de Bacharel
em Agronomia como parte das exigências do
Curso.
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO - MEC UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA-UFRA
CURSO DE AGRONOMIA
THAYNÁ DA CRUZ FERREIRA
Resposta de defesa induzidas por PGPR´s em plantas de arroz de terras altas contra mancha
parda causada por Bipolaris sp.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal Rural da Amazônia
como requisito para a obtenção do grau de Bacharel em Agronomia como parte das
exigências do Curso.
Aprovado em 11 de janeiro de 2019.
AGRADECIMENTOS
Á Deus, pelo dom da vida e oportunidade de realização deste trabalho.
Aos meus Pais pelo amor, educação e apoio incondicional dedicado à minha formação
intelectual.
A minha filha Valentina Baltazar, que o sentido de tudo na minha vida.
A minha Irmã, sempre presente e confiante em minha vitória.
A minha primeira orientadora Prof. Denise Castro Lustosa, pelas orientações e conselhos e
por ter me ajudado a traça a minha caminhada quando tudo se renovou em minha vida.
A minha orientadora, Prof. Gisele Barata da Silva, pela orientação, por me acolher de
braços abertos, apoio e confiança dedicados ao longo deste trabalho.
Agradeço a Drª. Marcela Rêgo, Doutoranda Gleiciane Rodrigues e ao Dr. Gledson de
Castro, por tudo o que me ensinaram e ajudaram ao longo desses anos.
Aos meus amigos e parceiros Izabely Ferreira, Itallo Leal, Rodrigo Tavares e Bruno
Maia, que foram essenciais para nossos trabalhos de turma e no meu dia-a-dia.
Agradeço aos integrantes e ex integrantes do Laboratório de Proteção de Planta, Sueyla
Malcher, Ricardo Machado, Fernando, Samanda Pereira, Ana Paula Magno, Rita de Cássia,
Amarildo Júnior, Josué Valente, João Paulo Morais que também fizeram parte dessa
caminhada.
A todos os colegas de turma, professores e demais funcionários que contribuíram direta ou
indiretamente para a realização deste trabalho.
A coordenação do curso de Engenharia Agronômica na pessoa da Profª Telma Batista, pelas
lutas travadas para o sucesso desta turma.
EPÍGRAFE
“E guardemos a certeza pelas próprias
dificuldades já superadas que não há mal que
dure para sempre." .
(Chico Xavier)
RESPOSTA DE DEFESA INDUZIDAS POR PGPR´S EM PLANTAS
DE ARROZ DE TERRAS ALTAS CONTRA MANCHA PARDA
CAUSADA POR Bipolaris sp.
RESUMO
A mancha parda é uma doença comum em arroz, com potencial para causar redução
na produtividade das lavouras na qualidade dos grãos colhidos. O objetivo foi avaliar a
eficiência das PGPR (Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 e Pseudomonas fluorescens
BRM- 32111) na supressão da mancha parda causada por Bipolaris sp. e na manutenção do
aparelho fotossintético em plantas de arroz. Sementes de arroz foram microbiolizadas com
suspensão de cada rizobactéria (BRM-32111, BRM-32113) e no controle foram submergidas
em água. O semeio foi em sete vasos por tratamento com 5 plantas, e aos 35 dias de idade, as
plantas foram inoculadas com B. oryzae. As rizobactérias BRM-32111 e BRM-32113
reduziram a severidade da mancha parda em arroz em 74 % e 67%, em média reduziram em
44% a AACPD. Por outro lado, as rizobactérias induziram nas plantas aumento em 60% a
taxa de assimilação líquida de CO2 e na transpiração, em 48% a condutância estomática e em
40% a transpiração. Para a concentração de clorofila a (Chla) o aumento foi de 38%, a
clorofila b (Chlb) o aumento foi de 32% e a clorofila total (Chl (a + b)) aumentou em 36%.
Em relação a fluorescência da clorofila a o coeficiente de extinção fotoquímica (qP) foi 3%
maior nas plantas tratadas, a eficiência quântica do fotosistema II [Y (PII)] foi de 23% e o
coeficiente de extinção não fotoquímica Y (NQP) o aumento foi de 45% em plantas tratadas
com as rizobactérias em comparação com o controle. Portanto, conclui-se que as rizobactérias
P. fluorescens BRM-32111 e B. pyrrocinia BRM-32113 reduzem a severidade da mancha
parda e atenuaram os danos da doença no aparato fotossintético e dos pigmentos
clorosplastídicos das plantas de arroz e poderão ser avaliadas em campo para posterior
inserção no manejo da cultura do arroz.
Palavras-chave; Controle biológico; Severidade; Rizobatérias; Aparato fotossintético
ABSTRACT
Brown spot is a common disease in rice, with potential to reduce crop yields in the quality of
harvested grains. The objective of this study was to evaluate the efficiency of PGPR
(Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 and Pseudomonas fluorescens BRM-32111) in the
suppression of the brown spot caused by Bipolaris sp. and in the maintenance of the
photosynthetic apparatus in rice plants. Rice seeds were microbiolized with suspension of
each rhizobacteria (BRM-32111, BRM-32113) and in the control were submerged in water.
Sowing was done in six pots per treatment with 5 plants, and at 35 days of age the plants were
inoculated with B. oryzae. The rhizobacteria BRM-32111 and BRM-32113 reduced the
severity of the brown spot in rice by 74% and 67%, on average reduced by 44% the AACPD.
On the other hand, the rhizobacteria induced in plants increased the rate of CO2 assimilation
and transpiration by 60%, in 48% the stomatal conductance and in 40% the transpiration. The
chlorophyll a (Chl) concentration increased by 38%, chlorophyll b (Chlb) increased by 32%
and total chlorophyll (Chl (a + b)) increased by 36%. The quantum efficiency of photosystem
II [Y (PII)] was 23% and the non-photochemical extinction coefficient Y (NQP) was the
highest in the treated plants. increase was 45% in plants treated with the rhizobacteria in
comparison with the control. Therefore, it is concluded that the rhizobacteria P. fluorescens
BRM-32111 and B. pyrrocinia BRM-32113 reduce the severity of the brown spot and
attenuate the damage of the disease in the photosynthetic apparatus and the chlorosplastídicos
pigments of the rice plants and can be evaluated in the field for later insertion in the rice crop
management.
Key words; Biological control; Severity; Rizobateria; Photosynthetic Apparatus.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Gráfico 1. Severidade da mancha parda (Bipolaris sp.), em plantas de arroz
inoculadas com rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-32111,
Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113, controle e desafiadas com Bipolaris
sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem. Tukey (p <
0,05)..............................................................................................................
Figura 1. Severidade da mancha parda (Bipolaris sp.) em plantas de arroz
tratadas e não tratadas com rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-
32111 (B), Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 (C), controle (A) e
desafiadas com Bipolaris sp........................................................................
Gráfico 2. Área abaixo da curva de progresso da doença de plantas de arroz
inoculadas com rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-32111,
Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113, controle e desafiadas com Bipolaris
sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem. Tukey (p <
0,05)...................................................................................................................
Gráfico 3: Índice relativo de clorofila (Spad) de mancha parda (Bipolaris
sp.), em plantas de arroz inoculadas com rizobactérias Pseudomonas
fluorescens (BRM 32111), Bulkholderia pyrrocinia (BRM 32113), controle e
desafiadas com Bipolaris sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem
pelo teste de
Tukey(p<0,5).....................................................................................................
Gráfico 4. Biomassa de plantas de arroz inoculadas com rizobacterias
Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113
e controle desafiadas com Bipolaris sp.. Barras seguidas da mesma letra não
diferem pelo teste de
Tukey(p<0,5)....................................................................................................
Gráfíco 5. Parâmetros fisiológicos de plantas de arroz tratadas e não tratadas
com rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia
pyrrocinia BRM-32113 e desafiadas com Bipolaris sp.. Taxa de assimilação
líquida CO2 em μmol CO2 / m2 / s (A), condutância estomática para Vapor
de água em mol H2O / m2 / s (gs), taxa de transpiração em mmol H2O / m2 /
s (E) e interna Concentração de CO2 em μmol / mol (Ci)..............
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Gráfico 6. Fluorescência na clorofila a de plantas de arroz tratadas e não
tratadas com com rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111,
Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e desafiadas com Bipolaris sp. Produção quântica de fotosistema II (Fv / Fm); E extinção fotoquímica
Coeficiente (qP). Rendimento quântico efetivo de PS II [Y (II)] e
rendimento quântico de regulação. Dissipação de energia [Y (NPQ)].
Barras seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de
Tukey(p<0,5)................................................................................................
Gráfico 7. Pigmentos clorosplastídicos de plantas de arroz tratadas e não
tratadas com com rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111,
Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e desafiadas com Bipolaris sp..
Concentração de clorofila a (Chla), clorofila b (Chlb), clorofilas totais
(Chla + b) e relação clorofila / clorofila b (Chla / Chlb) em Μg / g de
matéria fresca. Barras seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de
Tukey (p<0,5).................................................................................................
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RELAÇÃO DE TABELAS
TABELA 1. Escala de notas para avaliação visual dos sintomas de mancha-
parda (B. oryrae) em arroz, proposta pelo International Rice Research
Institute (1975) e adotada pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
(1977)ª...............................................................................................................
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27
LISTA DE ABREVEATURAS
A - Taxa de assimilação líquida de CO2
BDA- Batata dextrose e ágar
BRM-32113 -Burkholderia pyrrocinia
BRM-32111 - Pseudomonas fluorensces
Ci - Concentração intracelular de CO2
E - Taxa de transpiração
F0- Fluorescência inicial
Fm -Fluorescência máxima
Fv/Fm - Eficiência fotoquímica máxima
Fv/F0 - Atividade potencial do PSII
FSII - Fotossistema II
gs - Condutância estomática
ISR - Resistência sistêmica induzida
qp - Coeficiente de extinção fotoquímico
Y(II) - Rendimento quântico efetivo do PSII
Y(NO) - Rendimento quântico da dissipação de energia não regulada
NPQ – Coeficientes de extinção não fotoquímica
AACPD- Área abaixo da curva de progresso da doença
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1.INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 17
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................... 17
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................................ 17
3. REFERÊNCIAL TEÓRICO ............................................................................................. 18
3.1. Cultura do arroz (Oryza sativa. L) ................................................................................. 18
3.2. Mancha parda do arroz .................................................................................................. 19
3.3. Rizobactéria ..................................................................................................................... 21
3.4. Controle Biológico de doenças de plantas ..................................................................... 22
3.4.1 Antibiose ......................................................................................................................... 24
3.4.2 Competição ..................................................................................................................... 24
3.4.3 Resistência sistêmica Induzida ..................................................................................... 25
3.4.4 Resistência sistêmica adquirida induzida por patógeno (SAR) ................................ 25
3.4.5 Sinalização imunológica na rizosfera ........................................................................... 26
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 27
4.1. Preparo dos isolados B, pyrrocinia BRM-32113 e P. fluorescens BRM- 32111 .......... 27
4.2. Preparação do solo e material vegetal ........................................................................... 27
4.3. Inoculação de plantas com Bipolaris sp. ........................................................................ 27
4.4. Avaliação da severidade da doença ................................................................................ 27
4.5. Avaliação fisiológica ........................................................................................................ 28
4.6. Fluorescência da clorofila a ............................................................................................ 29
4.7. Biomassa ........................................................................................................................... 29
4.8. Quantificação de pigmentos. ........................................................................................... 30
4.9. Análises Estatísticas ......................................................................................................... 30
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 30
5.1. Severidade da doença e área abaixo da curva de progresso da doença..................... 30
5.3 Teor de clorofila (SPAD) .................................................................................................. 33
5.4. Biomassa ........................................................................................................................... 33
5.5. Trocas gasosas .................................................................................................................. 34
5.6. Fluorescência da clorofila a ............................................................................................ 37
5.7. Quantificação de pigmentos ............................................................................................ 38
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 41
15
1.INTRODUÇÃO
O arroz (Oryza sativa L.) está entre as culturas mais importantes, sendo altamente
utilizada na alimentação humana, por fornecer nutrientes essenciais buscando-se assim, um
aumento contínuo na demanda global por essa cultura (KUMAR et al., 2017). Atualmente, a
produção mundial de arroz chega a 504,6 milhões de toneladas, tendo a China, Tailândia e
Vietnã como principais países produtores, com uma produção de 145,77; 104,41 e 15,80
milhões de toneladas, respectivamente (FAO, 2018).
No Brasil, a produção em 2017/2018 foi de 12,02 milhões de toneladas, sendo
distribuídos em 10,9 milhões de toneladas para arroz irrigado e 1,3 milhões de toneladas para
arroz de sequeiro. Os principais Estados representantes na produção são Rio Grande do Sul e
Santa Catarina, com uma produção de 8,46 e 1,15 milhões toneladas, respectivamente. Os
maiores produtores de arroz sequeiro estão localizados no Centro-Oeste e no Nordeste, com
463,5 e 425,9 mil toneladas respectivamente (CONAB, 2018).
Os fatores que prejudicam a rizicultura em todas as regiões produtores são
imensuráveis, e sem dúvidas, as doenças que afetam essa cultura estão entre os principais
problemas. Dentre todas as doenças do arroz, a mancha-parda é classificada como uma das
mais importantes, sendo responsável tanto pela redução da produtividade das lavouras quanto
a qualidade dos grãos colhidos. (OU, 1985). Essa doença, que tem como agente causal o
fungo Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker, é controlada, principalmente, pela
aplicação de fungicidas, realizada através do tratamento de sementes ou durante as fases de
florescimento e de formação de grãos (BEDENDO & PRABHU, 2016)
A utilização de rizobactérias promotoras do crescimento de plantas tem sido
empregada tanto para promover o crescimento pela sua ação como biofertilizante (fixando
nitrogênio, solubilizando fosfato, ou com ação de sideróforo ou mesmo agindo na modulação
hormonal) quanto para uso no controle biológico de fitopatógenos. Estudos de modo de ação
revelaram que o controle biológico por PGPR envolve a produção de metabólitos bacterianos
que reduzem a população ou atividades de patógenos ou microflora deletéria da rizosfera
(GLICK, 1995; KLOEPPER, 1996)
O uso de PGPR como indutores de resistência sistêmica em plantas cultivadas contra
diferentes patógenos foi demonstrado em condições de campo (WEI et al., 1996). Do mesmo
modo que, o uso de cepas naturais de PGPR na defesa da linha de frente da planta pode
16
oferecer uma maneira prática de administrar a imunização. Foi descrito que PGPRs aumentam
a resistência de plantas a doenças fúngicas, bacterianas e virais (MAURHOFER et al., 1998),
insetos (ZEHNDER et al., 1997) e nematóides (SIKORA, 1992).
Estudos com as PGRPs Burkholderia pyrrocinia (BRM-32113) e Pseudomonas
fluorescens (BRM-32111 ) realizados por Bueno, et al. (2017) que investigou a eficácia das
rizobactérias B. pyrrocinia (BRM-32113) e P. fluorescens (BRM-32111), combinado com
fertilização de silício (Si), para reduzir o tamanho da lesão e a área sob o progresso da doença
Curva (AACPD), bem como para minimizar os efeitos negativos na troca de gás, clorofila a
fluorescência, clorofila. Os autores obteveram resultados promissores em relação a redução
da gravidade de escaldadura de folhas, protegendo o aparelho fotossintético, representando
assim um método sustentável de redução da perda da doença causada pela escaldadura em
folhas no arroz.
Assim como, Fillipi et. al., (2011) investigando isolados de rizobactérias que
apresentam potencial para estimulação do crescimento de plantas e indução de resistência em
condições de casa de vegetação, obteve maior supressão da brusone utilizando os isolados B.
pyrrocinia (BRM-32113) e P. fluorescens (BRM-32111 )
Desse modo, as pesquisas com rizobactérias promotoras de crescimento de plantas
(PGPR) tem mostrado que as PGPRs são capazes de induzir a resistência sistêmica adquirida
(ISR) nas plantas sobre estresse que resulta na redução dos sintomas da doença, e também
pela inibição do crescimento do patógeno no hospedeiro (BERNARDES, F.S, 2010).
Diante do exposto, a hipótese é que as rizobacterias atuam na supressão da mancha
parda e na manutenção do aparelho fotossintético em plantas de arroz. Desse modo, o objetivo
foi avaliar a supressão da mancha parda pelas PGPR (Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 e
Pseudomonas fluorescens BRM- 32111) e a influencia na manutenção do aparelho
fotossintético em plantas de arroz.
17
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar a eficiência das PGPR (Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 e Pseudomonas
fluorescens BRM- 32111) na supressão da mancha parda, e o desempenho do aparelho
fotossintético em plantas de arroz.
2.2. Objetivos específicos
- Avaliar a severidade da mancha parda em plantas de arroz tratadas Burkholderia pyrrocinia
BRM-32113 e Pseudomonas fluorescens BRM- 32111 e desafiadas Bipolaris sp.
- Avaliar alterações nas trocas gasosas e fluorescência da clorofila em plantas de arroz
induzidas por Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 e Pseudomonas fluorescens BRM- 32111
e desafiadas Bipolaris sp.
- Avaliar a biomassa das plantas de arroz tratadas Burkholderia pyrrocinia BRM-32113 e
Pseudomonas fluorescens BRM- 32111 e desafiadas Bipolaris sp.
18
3. REFERÊNCIAL TEÓRICO
3.1. Cultura do arroz (Oryza sativa. L)
O arroz (Oryza sativa L.) pertence ao Domínio Eukarya, Reino Plantae, Filo
Magnoliophyta, Classe Liliopsida, Ordem Poales, família das Poaceae, do gênero Oryza, no
qual possui cerca de 20 espécies conhecidas, sendo Oryza sativa a espécie mais estudada
(JULIANO, 1993).
É uma planta anual típica de ambientes alagados, porém se desenvolve bem em solos não
alagados, é formada de raízes, caule, folhas e panícula. No seu sistema radicular, possui
basicamente raízes adventícias, na qual o diâmetro é diminuído a medida que ela se ramifica.
O caule é completamente envolvido pela bainha. A inflorescência é do tipo panícula, e fica
situada sobre o último entrenó e é composta pelo ráquis, os quais se ramificam e formam em
suas extremidades as espículas. O grão de arroz é formado basicamente de endosperma e
embrião, ou germe. O tegumento, que envolve a semente se encontra diretamente ligado ao
pericarpo, membrana que envolve o fruto. O pericarpo é envolvido pela lema e pela pálea, que
constituem a casca e são removidas durante o beneficiamento (GUIMARÃES et al., 2002).
O arroz está entre os três cereais mais produzidos e consumidos do mundo, estando
atrás apenas do trigo (Triticum spp.) e milho (Zea mays L.) (PARAGINSKI et al., 2014). Por
ser uma excelente fonte de energia, o arroz é considerado o alimento básico de mais da
metade da população mundial, principalmente devido à alta concentração de amido, também
por fornecer proteínas, vitaminas e minerais, e possuir baixo teor de lipídios, sendo estes
essenciais à nutrição (KUMAR et al., 2017).
A produção de arroz é amplamente dispersa em todo o território nacional, sendo o
arroz em algumas regiões o produto mais importante. No Brasil, o arroz é o principal cereal
consumido, sendo utilizado na alimentação o arroz branco, arroz integral e arroz parboilizado
que totaliza 25% do consumo, devido à melhor qualidade nutricional (PARAGINSKI et al.,
2014). Em 2018 a produção foi de 12,02 milhões de toneladas, sendo distribuídos em 10,9
milhões de toneladas para arroz irrigado e 1,3 milhões de toneladas para arroz de sequeiro, e
ocupa o terceiro lugar em área cultivada com culturas anuais, com uma área de
aproximadamente 1.943,8 mil hectares, estando atrás apenas para soja (Glycine max L.) e
milho (Zea mays L.) (CONAB, 2018).
19
O arroz pode ser produzido, sob cultivo irrigado e em sequeiro, sendo o arroz sequeiro
chamado de “cultivo em terras altas”, onde é adotado o plantio logo após o início das chuvas,
dependente do regime pluvial e sob cultivo irrigado (ARAÚJO, 2015), o arroz irrigado ocupa
uma área de aproximadamente 1.430,8 mil hectares e 535,9 mil hectares para arroz de
sequeiro (CONAB, 2018).
Existem diversas variedades de arroz cultivadas no mundo, no momento de escolher a
cultivar é necessário analisar suas características visando aperfeiçoar seu uso dentro do
sistema agrícola desejado. As principais características de uma cultivar de arroz são; ciclo,
altura da planta, resistência a doenças, qualidade e produtividade.
O arroz da cultivar primavera foi lançado em 1997 e é recomendada para plantios em
sistema de terras altas, também é indicado para plantios em áreas de abertura e velhas, pouco
ou moderadamente férteis, devido a sua tendência em acamamento em condições de alta
fertilidade. É uma cultivar com excelente culinária; contudo para que se obtenha uma boa
porcentagem de grãos inteiros no beneficiamento, é necessário que a colheita seja feita com a
umidade de grãos de 20% e 24%. Suas características são; comprimento de grãos longo e fino,
e moderadamente sucessível ao acamamento, alcança 67% da renda do benefício, é uma
cultura moderadamente resistente à mancha de grãos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO,2009)
Mais de 80 doenças já foram relatadas afetando o arroz nas diversas regiões
produtoras em todo o mundo (PRABHU, et al., 1999). A ocorrência dessas doenças diminui a
produtividade das lavouras orizícolas e, também, a margem de lucro dos produtores divido
aos gastos com a aplicação de fungicidas.
3.2. Mancha parda do arroz
Muitas doenças já foram relatadas afetando o arroz nas diversas regiões produtoras em
todo o mundo (PRABHU, et al., 1999). A ocorrência dessas doenças diminui a produtividade
das lavouras orizícolas e, também, a margem de lucro dos produtores divido aos gastos com a
aplicação de fungicidas.
Dentre as principais doenças destacam-se Brusone (Pyricularia oryzae) Mancha Parda
(Bipolaris oryzae) Podridão do Colmo (Sclerotium oryzae), Podridão do Pé (Fusarium
moniliforme) e Mancha de Grãos (Drechslera oryzae, Bipolaris spp., Pyricularia grizea,
20
Alternaria padwickii, Phoma sp., Nigrospora spp, Epicocum spp., Curvularia lunata e
Fusarium sp.) (HABIB et al., 2012). No Brasil, os fungos destacam-se como o grupo de
microrganismos fitopatogênicos que mais causam danos a esta cultura, principalmente nas
regiões de clima tropical como o Norte e o Centro Oeste do nosso país (SCHEUERMANN,
2015)
O agente causal da mancha parda é o fungo Bipolaris oryzae (Breda de Haan)
Schoemaker (sin. Helminthosporium oryzae Breda de Haan, Drechslera oryzae (Breda de
Haan) Subramanian & Jain) (Teleomorfo: Cochliobolus miyabeanus) pertence à classe
Hyphomycetes e à família Dematiaceae (BARNWAL et al., 2013; BEDENDO & PRABHU,
2016). Esse patógeno possui hifa do tipo septada e o micélio apresenta-se na forma de
aveludada e, geralmente com coloração cinza a cinza escuro; conídios retos ou raramente
curvos, cilíndricos ou largos no centro e castanhos claros a dourados. Essas células
apresentam de 1-14 núcleos e germinam frequentemente nas pelas extremidades basal e
apical; conidióforos septados, isolados ou em pequenos grupos, reto ou flexível e septados
(QUINTANA et al., 2017).
O B. oryzae é fortemente influenciado em seu desenvolvimento pelas condições de
cultivo (temperatura, pH, luz e meio de cultivo) que é exposto. Desse modo, as condições
ótimas para o crescimento desse patógeno incluem temperaturas na faixa de 27-30°C, valores
de pH entre 6,6-7,4, alternância de período claro e escuro para estimular sua esporulação e
meios de cultivo contendo peptona e sacarose como fontes de nitrogênio e carboidrato
respectivamente. Ainda assim, esse fungo apresenta elevada variabilidade de forma que as
condições ótimas de cultivo podem variar bastante de acordo com o isolado (OU,1985). No
campo, a sobrevivência do patógeno ocorre em restos culturais, hospedeiros alternativos e
sementes de arroz, sendo as sementes uma importante forma de disseminação a longas
distâncias (PRABHU et. al.,1995)
A Cultura do arroz é seriamente afetada por esses patógenos, principalmente no arroz
irrigado, estando o mesmo amplamente distribuído nas regiões orizícolas do mundo, podendo
ocorrer durante todos os estádios de desenvolvimento da planta, mais prevalece durante as
fases de florescimento, e depois na formação de grãos (KUMARI et al., 2015).Os sintomas
ocasionados pela doença vão desde manchas enferrujadas em sementes, que resultam em
perda do potencial germinativo, morte de plântula e consequentemente a redução do estande
(AMORIO & CUMAGUN, 2017), até manchas marrons escuras a avermelhada, com formato
oval e distribuídas uniformemente sobre toda a superfície foliar das plantas, com redução da
21
capacidade fotossintética associado a redução da produção (AMORIO & CUMAGUN, 2017;
QUINTANA et al., 2017).
A principal forma de disseminação e introdução do B. oryzae em novas áreas de
cultivo é através da utilização de sementes de baixa qualidade sanitária, sendo o mesmo capaz
de sobreviver por mais de quatro anos em sementes infectadas, sendo o seu principal meio de
disseminação (KUMARI et al., 2015). Além dos danos ocasionados na germinação, as
sementes infectadas podem introduzir esse patógeno em novas áreas de cultivo e servir de
fonte de inóculo para epidemias na parte aérea (AMORIO & CUMAGUN, 2017;
QUINTANA et al., 2017).
Os danos podem ser observados na produção da qualidade e produtividade dos grãos
que são colhidos (OU, 1985). De acordo com as condições edafoclimáticas locais e com a
susceptibilidade da cultivar semeada, a diminuição na produção pode ser bastante
significativa. Outros danos de ocorrência da doença podem ser observados nos estádios mais
iniciais da cultura, quando a infecção do patógeno nas sementes implica na diminuição da
germinação das mesmas e na morte de plântulas de arroz (MALAVOLTA et al.,2002). Além
disso a incidência da mancha parda sobre os grãos reduz a eficiência da etapa de
beneficiamento devido ao aumento de números de grãos quebrados durante o processo
(PRABHU et al., 1999). Ou seja, esse patógeno pode causar danos em diferentes estágios
como no armazenamento, germinação, estabelecimento de plântulas, crescimento vegetativo e
fase reprodutiva (HABIB et al., 2012).
3.3. Rizobactéria
A rizosfera é um ambiente edáfico conhecido por abrigar uma ampla variedade de
bactérias. Várias destas bactérias não só colonizam a rizosfera e o rizoplano, mas também
podem penetrar nas plantas, colonizando os tecidos internos do vegetal, estabelecendo assim,
associações benéficas e desempenhando importante papel na manutenção e/ou incremento do
crescimento vegetal, quer seja em ecossistemas naturais ou manejados (COMPANT et al.,
2010) , podendo ser utilizadas para a promoção de crescimento plantas (HALLMANN, 2001;
COMPANT et al., 2005; SESSITSCH et al., 2004; HALLMANN & BERG, 2006) para
melhoria da produção agrícola.
As investigações com rizobactérias começaram em 1885 na Rússia e na Ucrânia,
usando-se Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium e outras espécies do gênero
22
Bacillus. As pesquisas tinham o objetivo de aumentar o crescimento e o rendimento das
plantas. Contudo, somente após os trabalhos de Kloepper e Schroth, em 1978, com batata e
rabanete, em que outros autores comprovaram a capacidade das rizobactérias em promover o
crescimento e a bioproteção de plantas, que foi estabelecido o conceito de rizobactérias
promotoras do crescimento de plantas. (LUZ, 1996)
O termo rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs) foi proposto por
Kloepper e Schroth (1978) e provém da expressão “plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR)”, que é aceita pela comunidade científica internacional para expressão que designa
esse grupo. As RPCPs foram submetidas a inúmeros estudos focados em aplicações
biotecnológicas na agricultura, horticultura, silvicultura e proteção ambiental (ZAHIR et al.,
2004).
As rizobactérias promotoras do crescimento em plantas (RBPC), permitem que às
plantas apresentem um melhor desenvolvimento, por meio vários mecanismos, que pode ser
diretos, com a fixação de nitrogênio (FBN), solubilização de fosfatos, síntese de sideróforos
(CARDOSO; ANDREOTE, 2016) e acredita-se ainda que essas rizobactérias conseguem
produzir reguladores de crescimento vegetal, os fitormônios, tais como auxinas, citocininas,
giberelinas, etileno e ácido abscísico (CAMELO et al., 2011; DODD et al., 2010; SILVA et
al., 2016; VEJAN et al., 2016). E também por mecanismos indiretos, como o aumento da
resistência a estresses bióticos e abióticos, controle biológico através da produção de
antibactericidas e antifúngicos (CARDOSO; ANDREOTE, 2016).
Neste contexto, estudos tem sido dedicado sobre a organização estrutural destas
comunidades microbianas com o intuito de compreender, controlar e se beneficiar destas
expressões genéticas no cultivo de plantas comerciais, na manutenção de sistemas naturais e
na recuperação de solos explorados.
Assim, a utilização de rizobactérias como agentes de controle biológico de
fitopatógenos e como promotoras de crescimento tem se apresentado como uma alternativa
interessante. Estas bactérias podem atuar através de vários mecanismos de ação, como
antibiose, competição por ferro, indução de resistência, mineralização de fosfatos, fixação de
nitrogênio e reguladores de crescimento, além de serem capazes de inibir o crescimento de
outros organismos no solo (ROMEIRO, 2005), tanto aderidas às raízes quanto livres na
solução do solo.
3.4. Controle Biológico de doenças de plantas
23
No momento atual alternativas de controle de doenças menos prejudiciais ao meio
ambiente e ao homem tem sido buscadas, com o intuito de reduzir ou eliminar o uso de
defensivos tendo em vista a produção de alimentos saudáveis. Recentemente o mundo
ocidental tem tomado conhecimento e percebido a imensurável potencialidade do
desenvolvimento de tecnologias específicas para estimulo de mecanismos de defesa de plantas
como alternativa inteligente ao uso desordenado de defensivos (CAMPANHOLA; BETIOL,
2003).
O controle de doenças ocorrentes em áreas produtoras de arroz por meio da aplicação
de fungicidas mostra, entre outros aspectos negativos, alto custos econômico e ambiental.
Quando se trata do lado ambiental, a contaminação de recursos hídricos com agrotóxicos pode
ser citada como um dos principais impactos negativos da orizicultura sobre áreas próximas as
propriedades agrícolas, conferindo risco para a fauna e flora locais (SCORZA Jr. Et al.,2010).
A preocupação da sociedade com o impacto dos produtos químicos tem incentivado
pesquisas pela procura de produtos diferenciados, tanto por aqueles produzidos sem o uso de
agrotóxicos, como por aqueles portadores de selos que garantem que os agrotóxicos foram
utilizados corretamente (MORANDI et al., 2009). Além do mais, o incremento dos custos
com o controle químico, a perda de eficiência de alguns desses produtos (KAWUBE et al.,
2005), por causa da resistência dos organismos provenientes do uso inadequado, tem
incentivado diversas pesquisas com a utilização de produtos alternativos, entre eles, o uso de
agentes biocontroladores de doenças de plantas (LAZAROTTO et al., 2013).
O controle biológico, foi definido por Cook & Baker (1983) como, “a redução da
quantidade de inóculo ou da atividade geradora de doença de um patógeno (crescimento,
infectividade, virulência e agressividade) alcançada por através de um ou mais organismos
que não o Homem”. Esse método de controle consiste em relações antagônicas que decorrem
de diferentes populações de microrganismos presentes na natureza e que mantém o equilíbrio
ecológico entre essas comunidades em um dado hábitat (COOK & BAKER, 1983;
BEDENDO et al., 2011).
A capacidade dos agentes em interferir nos processos vitais dos patógenos são
chamados de antagonistas. Esses agentes devem está adaptados ao mesmo nicho ecológico
que os patógenos, sendo esse método capaz de integrar facilmente com métodos culturais e
melhoramento de plantas (MORANDI et al., 2009). Os mecanismos de ação dos antagonistas
24
envolvidos no controle biológico, normalmente são: antibiose (MARTINI et al., 2014);
competição (BENÍTEZ et al., 2004) e indução de resistência (ABDELRAHMAN et al., 2016).
3.4.1 Antibiose
A antibiose é certamente a mais conhecida e talvez o mecanismo mais significativo
usado pelo PGPR para diminuir a invasão de patógenos no tecido da planta. Consiste em
inibir o desenvolvimento de plantas patogênicas microorganismos através da produção de
metabólitos de baixo peso molecular, possuindo propriedades antifúngicas e / ou antibióticas.
As estirpes de Bacilos, Streptomyces e Stenotrophomonas produzem uma ampla
gama de metabólitos antifúngicos potentes, como oligomicina-A, xantobactina (COMPANT
et al., 2005), zwittermicina-A, kanosamina e lipopeptídeos do surfactinas, iturinas e família
fengicina (ONGENA & THONART, 2006). As cepas de Pseudomonas são conhecidas pela
produção de anfisina, 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG) oomicina-A, fenazina, piroluorina,
pirrolnitrina, tensinas, tropolona e os lipopeptídeos cíclicos (LOPER & GROSS, 2007). Esta
produção de metabólitos é influenciada pela produção abiótica. fatores (oxigênio, umidade,
temperatura, pH e solo azoto, micronutrientes e teor de matéria orgânica), fatores bióticos
(espécie vegetal, organismos patogênicos, microflora nativa e densidade de estirpes
produtoras metabólitos) e alguns outros. (NOUMAVO et. al.,2016)
3.4.2 Competição
Há indícios que a competição entre patógenos e PGPR podem limitar a incidência e
severidade da patologia vegetal. O que dificulta o desenvolvimento do patógeno é a rápida e
abundante colonização radicular por PGPR, que ocupa os sítios de infecção de patógenos
vegetais e utiliza a maioria dos nutrientes disponíveis. Lemanceau e Heulin (1998) afirmaram
que a biomassa microbiana alta e ativa reduz a probabilidade de patógeno para infectar a
planta. Isso faz com que a competição de nutrientes seja um meio importante de controle
biológico (BENITEZ et al., 2004). Além da capacidade intrínseca de crescimento de PGPR,
as outras propriedades que melhoram a colonização das raízes são a mobilidade (presença de
flagelo), quimiotaxia, lipopolissacarídeo (LPS), a capacidade de sintetizar vitaminas e
macromoléculas e a capacidade de usar os compostos excretados pelas raízes
(LUGTENBERG E KAMILOVA, 2009). Outra forma de competição é estabelecida entre o
patógenos e PGPR. Esta é a luta pelo ferro. De fato, o ferro é um elemento essencial para o
crescimento e sobrevivência da maioria dos fungos fitopatogênicos. Então, alguns PGPR
25
sintetiza sideróforos que quelatam o ferro no rizosfera e, assim, inibir o crescimento de
patógenos. (NOUMAVO et. al.,2016)
3.4.3 Resistência sistêmica Induzida
PGPR pode estimular o mecanismo de defesa indutível das plantas, fenotipicamente
igual à reação de defesa normal das plantas, quando atacadas por um patógeno (PIETERSE et
al., 2009). Este fenômeno que não pode ser chamado de Resistência sistêmica induzida (ISR)
pode tornar a planta muito mais forte e resistentes em combate a futuros ataques de patógenos
(VAN LOON, 2007). Quando uma rizobactéria coloniza a raiz, moléculas presentes em célula
bacteriana e por ela sintetizada atuam como eliciadores. Esses eliciadores atuam como sinais e
acionam os mecanismos de defesa, havendo, então, a resistência sistêmica induzida (VAN
LOON et al., 1998; BARBOSA, 2009). Este fenômeno de indução de resistência sistêmica por
rizobactérias é considerada uma estratégia promissora para controle biológico de doenças de
plantas (RAMOS SOLANO et al., 2008).
O ISR pode ser induzido por uma ampla gama de microrganismos incluídos
bactérias Gram-positivas, tais como B. pumilus, ou bactérias Gram-negativas pertencentes ao
gênero Pseudomonas (P. fluorescens, P. putida, P. aeruginosa) e enterobactérias como
Serratia (Serratia marcesens, Serratia plymuthica) ou Pantoea aglomerantes (JOURDAN et
al., 2009). O ISR protege o plantas contra uma grande quantidade de patógenos não só
fúngicos, bacterianos e virais, mas também contra algumas doenças causadas por insetos e
nematóides (DURRANT & DONG, 2004). Vários metabólitos bacterianos podem induzir um
IRS. Esses metabólitos incluem lipopolissacarídeos (LPS), sideróforos, lipopeptídeos cíclicos,
2,4- diacetilfloroglucinol, homoserina lactonas e compostos volatéi, tais como; acetoína e
2,3-butanodiol (DOORNBOS et al., 2012).
3.4.4 Resistência sistêmica adquirida induzida por patógeno (RSA)
A resistência sistêmica adquirida (RSA) pode ser distinguida de outros tipos de
resistência pela expressão contra um largo espectro de patógenos. Em fumo, a ativação da
RSA resultou na redução significativa de sintomas causados pelos fungos Phytophthora
parasítica, Cercospora nicotinae e Peronospora tabacina, os vírus do mosaico do fumo
(TMV) e da necrose do fumo (TNV) e as bactérias Pseudomonas syringae pv tabaci e Erwinia
carotovora (TUZUN & KUC, 1991). Os principais mecanismos de defesa envolvidos na RSA
26
são a lignificação da parede celular e produção de proteínas relacionadas com a patogênese,
como por exemplo as quitinases e β-1-3- glucanases (STICHER et al.,1997).
A indução da RSA constitui um importante método alternativo de controle de
doenças de plantas e, em face da praticidade de uso no campo, vários produtos químicos têm
sido pesquisados quanto ao efeito indutor em pulverizações foliares. No inhame, Rompf
(1999) verificou a produção de diversas quitinases utilizando elicitores bióticos (Fusarium
oxysporum autoclavado) e abióticos (etileno, quitina e quitosana) aplicados em calos de D.
alata. Em culturas de células de D. bulbifera (inhame aéreo), demonstrou a expressão de uma
PR-proteína de defesa pela elicitação com o fungo Colletotrichum gloeosporioides (ROMPF,
1999). O estudo da genética de fatores envolvidos na regulação da RSA tem possibilitado, em
alguns patossistemas, a obtenção de plantas transgênicas com acentuada expressão da RSA,
tornando bastante promissor o uso deste tipo de resistência no controle de doenças de plantas
(CAO et al.,1998).
3.4.5 Sinalização imunológica na rizosfera
Os microrganismo benéficos simbióticos e não-simbióticos são inicialmente
reconhecidos como organismos estranhos. Portanto, a interferência ativa com o sistema
imunológico da planta é fundamental para o estabelecimento de relações mutualísticas
íntimas. A sinalização imunológica nas plantas é iniciada pela percepção mediada pelo
receptor, moléculas não próprias que são frequentemente conservadas entre diferentes classes
de microrganismos, patogênicos e benéficos. Essas moléculas são chamadas de padrões
moleculares associados a microorganismos (MAMPs), e as respostas de defesa induzidas por
MAMP montadas em plantas hospedeiras são coletivamente referidas como imunidade
desencadeada por MAMP (MTI) (BOLLER & FELIX, 2009; JONES & DANGL, 2006).
Apesar do fato de que a sinalização imune inata nas folhas tem sido extensivamente estudada
nos últimos anos, muito pouco se sabe sobre o MTI nas raízes, onde reside a maioria dos
microrganismo benéficos para as plantas. Apenas recentemente, Millet et. al. (2010)
demonstraram que as raízes de Arabidopsis respondem a diferentes MAMPs de uma maneira
específica do tecido e que a sinalização imune desencadeada por MAMP nas raízes é muito
similar àquela observada nas folhas. Estabelecer uma interação mutualista com o planta, os
microrganismos benéficos precisam lidar com as respostas imunes do hospedeiro que são
acionados localmente nas raízes na percepção do MAMP.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, com sete
repetições e três tratamentos, constituídos por dois isolados de rizobactérias Burkholderia
pyrrocinia BRM-32113 e Pseudomonas fluorescens BRM- 32111 e o controle com o
patógeno (Bipolaris sp.), em condições de casa de vegetação.
Para a realização dos ensaios, foram utilizados o laboratório de proteção de plantas -
LPP e a casa de vegetação da Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA.
4.1. Preparo dos isolados B, pyrrocinia BRM-32113 e P. fluorescens BRM- 32111
As PGPRs foram cultivadas em meio K523 (KADO; HESKET, 1970) por 48 horas à
28°C, após esse período preparou-se a suspensão bacteriana ajustada em espectrofotômetro
550 nm (A550 = 0,1), as sementes de uma cultivar de arroz primavera adaptado foram
previamente desinfestadas, com álcool 70% por 15 segundos e em hipoclorito de sódio a 2%
por 15 segundos e em duas lavagens consecutivas em H2O destilada e esterilizada, e
microbiolizadas com B. pyrrocinia BRM-32113 e P. fluorescens BRM- 32111 e controle com
solução salina.
4.2. Preparação do solo e material vegetal
As sementes de arroz foram semeadas em vasos contendo 1 kg de solo adubado com
1,7g de FTE (Enxofre: 3,9% ; Boro: 1,8% ; Cobre: 0,85%; Manganês: 2,0% ;Zinco: 9,0%) e
1g ureia, as plantas foram mantidas em condições controladas de casa de vegetação.
4.3. Inoculação de plantas com Bipolaris sp.
O isolado de Bipolaris sp. compatível com a cultura de arroz foi multiplicado em meio
Batata-Dextrose-Ágar (BDA), e mantidos em câmara de crescimento à 25°C por 10 dias no
escuro, em seguida foram feitas lavagens com água destilada e estéril e os conídios removidos
com auxílio de uma alça. A suspensão de conídios foi recolhida e ajustada para concentração
de 104 conídeos.mL-1, ajustadas com o auxílio do hemacitômetro. Foi pulverizado 10ml da
suspensão de conídios + Tween (0,1%), em planta aos 35 dias de idade. Em seguida as plantas
foram mantidas em uma câmara úmida 25 ± 2 ° C, com um período inicial de 48 h no escuro.
4.4. Avaliação da severidade da doença
28
Foram realizadas sete avaliações da severidade da mancha parda, aos 37, 39,41,43, 45, 47 e
49 dias após a inoculação, nas folhas bandeira de cada perfilho com auxílio da escala de nota
com 5 graus (IRRI ,1976) (Tabela 1).
TABELA 1. Escala de notas para avaliação visual dos sintomas de mancha-parda (B. oryrae) em
arroz, proposta pelo International Rice Research Institute (1975) e adotada pela Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária - (1977)ª
R= resistente; MR= médio-resistente; I= intermediária; MS= médio-suscetível; S= suscetível.
FONTE: Adaptado de SOUSA et. al., 1986
A área abaixo da curva de progresso da doença foi calculada integrando os sete valores da
severidade utilização da equação proposta por Campbell & Madden (1990).
em que:
AACPD: Área abaixo da curva de progresso da doença;
Yi = Proporção da doença na i-ésima repetição;
Ti = Tempo em dias na i-ésima observação;
n = Número total de observações.
4.5. Avaliação fisiológica
Aos 49 dias após a inoculação foi realizada a avaliação das trocas gasosas e
fluorescência com auxilio do sistema portátil de fluxo aberto de trocas gasosas (LI-6400XT,
LI-COR, Lincoln, NE) avaliado o teor de clorofila (SPAD-520).
Nota Reaçãoª Tipo de lesão - Área foliar afetada (%)
1 R A Pequenas manchas do tamanho d cabeça de alfinete Menos de 1%
3 MR 1% a 5%
5 I Manchas típicas de coloração castanho-avermelhado 6% a 25%
7 MS 25%a50%
9 S Manchas grandes com centro claro - Mais de 60%
29
Os parâmetros de trocas gasosas foram estimados na primeira folha, do ápice para a
base, aos 49 dias após a inoculadas do patógeno em plantas de arroz. A assimilação líquida de
CO2 (A), condutância estomática ao vapor de água (gs), concentração intercelular de CO2 (Ci)
e a taxa de transpiração (E) foram estimados entre 08:00 e 10:00 horas sob uma concentração
externa de CO2 de 400 μmol mol-1 de ar e radiação fotossinteticamente ativa (PAR) artificial
de 1200 μmol de fótons m-2 s-1, em uma temperatura a ±28ºC. Este intervalo de medição
(08:00 - 10:00 h) foi ajustado de acordo os resultados obtidos com curva diurna de trocas
gasosas para a espécie de arroz (BUENO et. al.,2017), e o déficit de pressão de vapor foi
mantido em aproximadamente 1.3 kPa; a quantidade de luz azul foi ajustada para 10% da
radiação fotossinteticamente ativa para otimizar a abertura estomática.
4.6. Fluorescência da clorofila a
A fluorescência da clorofila a foi determinada simultaneamente com as trocas gasosas
utilizando-se uma câmara de fluorescência (IG 6400-40; LI-COR Inc.) integrada ao sistema
portátil de fluxo aberto de trocas gasosas. As folhas foram adaptadas no escuro durante 20
min com papel alumínio e posteriormente iluminadas com um pulso de luz fraca e modulada
(0,03 μmol m-2 s-1) para obter a fluorescência inicial (Fo). Um pulso de luz branca saturante de
6.000 μmol m-2 s-1 foi aplicado durante 0,8s para garantir a máxima emissão de fluorescência
(Fm). As amostras de folhas foram então iluminadas durante 300s com uma luz actínia (250
µmol m-2s-1) para obter o rendimento da fluorescência no estado estacionário (Fs).
Posteriormente, pulsos de luz branca saturantes foram aplicados para atingir a fluorescência
máxima (Fm’). A luz actínia foi então desligada e uma iluminação vermelho-distante (2 μmol
m-2 s-1) foi aplicado para estimar a fluorescência inicial adaptada na luz (Fo’). A partir dessas
medições, os segmentes parâmetros foram calculadas: atividade potencial do PSII [Fv/Fo =
(Fm-Fo) / Fo], eficiência fotoquímica máxima do PSII [Fv/Fm = (Fm-Fo) / Fm] (Oxborough and
Baker 1997), coeficientes de dissipação fotoquímica [qp = (Fm'-Fs) / (Fm'-Fo')] e não-
fotoquimica [NPQ = (Fm/Fm') - 1] (Maxwell and Johnson 2000).
4.7. Biomassa
Aos 49 dias após a inoculação, plantas de cada parcela foram coletadas a parte aérea
individualmente, e acondicionadas em sacos de papel e colocadas em estufa de circulação
forçada de ar a 60 ºC, até o material atingir peso constante no 4º dia. Em seguida as plantas
foram pesadas para obtenção da matéria seca,
30
4.8. Quantificação de pigmentos.
As folhas lesionadas com mancha parda (de base até ápice) foram coletadas aos 14
dias após a inoculação e armazenadas a -80 ° C. Um total de 20 mg de folhas foi macerado
em 250 μL de etanol a 98% ( EtOH 98%) e incubou-se a 80°C durante 20 minutos; Estes
foram então centrifugados a 4 ° C a 14 000 rpm durante cinco minutos.
Posteriormente, o sobrenadante foi recolhido, e o sedimento (precipitado) foi
submetido a mais duas extracções; As concentrações de EtOH utilizadas foram 80% e 50%,
respectivamente. Os sobrenadantes resultantes foram recolhidos e homogeneizados. Todas
essas etapas foram realizadas em um banho de gelo e com a ausência completa de luz,
conforme descrito. O teor de clorofila foi quantificado retirando-se uma alíquota de 35 μL de
extracto de planta de etilo (obtido na extração 2.6.1) de cada amostra e adicionada em um
meio de reação com 120 μL de EtOH 98% e 15 μL de mistura etil (volume final de 170 μL
por poço / amostra). (FUCHS et. al., 1989)
Após a montagem do meio de reação, as amostras foram submetidas a uma
determinação da absorvância, estimada em comprimentos de onda de (λ) 645 nm e 665 nm.
Foi possível estimar as concentrações de clorofila a e b a partir da absorvância obtida, e o
conteúdo total foi determinado utilizando as fórmulas A e B e depois normalizado ao peso
fresco de cada amostra.
4.9. Análises Estatísticas
Os dados obtidos nos experimentos foram submetidos a análise de variância e as
medias foram comparados pelo de Tukey (p < 0.05) em programa programa R, e erro padrão
(p < 0,05). Para os dados obtidos com o IRGA a comparação foi feita utilizando um teste t
não pareado (P ≤ 0,05) utilizando o Excel.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Severidade da doença e área abaixo da curva de progresso da doença
As rizobactéria Pseudomonas fluorescens BRM-32111 e Burkholderia pyrrocinia
BRM-32113 reduziram a severidade doença em 74% e 67%, respectivamente em comparação
31
as plantas controle (Gráfico 1 e 2). A AACPD foi reduzida em 44% para os dois isolados em
comparação as plantas controle (Figura 1). A PGPR P. fluorescens (BRM-32111) e B.
pyrrocinia (BRM-32113), já foram registradas como promotoras de crescimento e supressoras
de brusone e escaldadura em arroz (FILIPPI et al., 2011; BUENO et al., 2017). As PGPR´s P.
fluorescens e B. pyrrocinia destacaram-se na redução do número de lesão e AACPD,
contribuindo como alternativas de manejo da mancha parda. Os resultados sugerem que as
PGPR ativam mecanismos de defesa latentes nas plantas, sendo expressos após exposição
sistêmica das plantas ao patógeno (VAN LOON E PIETERSE, 2006; VAN LOON, 2007).
Esses mecanismos são acionados quando as PGPR, estão presentes nas raízes das plantas e
atuam como eliciadores através de moléculas constituintes das células bacterianas por elas
sintetizadas. Esses eliciadores agem como sinais mediados pelo ácido jasmônico (AJ) e
etileno (ET), onde acionam genes codificadores de compostos de defesa, responsáveis pela
produção de antibióticos e substância com ação antifúngica, havendo assim, a indução de
resistência sistêmica (VAN LOON et al, 1998). Como obtido, principalmente, com a P.
fluorescens que reduziu em 74% o número de lesões causada pela mancha parda em relação
as plantas controle.
Gráfico 1: A- Severidade da mancha parda (Bipolaris sp.), em plantas de arroz inoculadas com
rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113, controle e
desafiadas com Bipolaris sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem. Tukey (p < 0,05).
Figura 1; Severidade da mancha parda (Bipolaris sp.) em plantas de arroz tratadas e não tratadas com
rizobactérias controle (A), Pseudomonas fluorescens BRM-32111 (B), Bulkholderia pyrrocinia BRM
32113 (C), e desafiadas com Bipolaris sp.
32
Fonte: Própria, 2018
Gráfico 2: Área abaixo da curva de progresso da doença de plantas de arroz inoculadas com
rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113, controle e
desafiadas com Bipolaris sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem. Tukey (p < 0,05).
A B C
33
5.3 Teor de clorofila (SPAD)
A rizobactéria Pseudomonas fluorescens BRM-32111 induziu aumento no teor de
clorofila. Esse incremento foi em 27% em comparação as plantas desafiadas com Bipolaris
sp., (Gráfico 3). O maior conteúdo de clorofilas (Chla e Chlb) induzido pela rizobactéria pode
ter contribuído para a maior eficiência na absorção de luz, transferência de energia,
transferência de elétrons e maior controle na dissipação do excedente de energia térmica.
(SAMANIEGO-GÃMEZ et al. 2016).
Oliveira, (2010), relatou que ao selecionar rizobactérias autóctones para promoção de
crescimento em feijão comum, elas atuaram como promotoras de crescimento de plantas,
aumentando a produtividade, o teor de clorofila, aumento da área foliar e da matéria seca de
parte aérea e de raízes.
Gráfico 3: Índice relativo de clorofila (Spad) de mancha parda (Bipolaris sp.), em plantas de arroz
inoculadas com rizobactérias Pseudomonas fluorescens (BRM 32111), Bulkholderia pyrrocinia (BRM
32113), controle e desafiadas com Bipolaris sp.. Barras seguidas da mesma letra não diferem pelo
teste de Tukey(p<0,5).
5.4. Biomassa
Em relação a biomassa das plantas de arroz desafiadas com Bipolaris sp., as
rizobactérias Pseudomonas fluorescens BRM-32111 e Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113
proporcionaram uma menor redução em plantas de 73% e 54% respectivamente em relação ao
controle (Gráfico 4). A utilização de diferentes bactérias para promover o crescimento e
aumenta a proteção contra fitopatógenos especificamente no arroz com Pseudomonas
34
fluorescens (NANDAKUMAR et al., 2000; RADJACOMMARE et al., 2004), e o Bacillus
(VASUDEVAN et al., 2002) foram relatado.
Os principais resultados obtidos em estudos com rizobactérias incluem aumento no
rendimento da planta, maior crescimento de raízes e da parte aérea. Neste trabalho, as
rizobactérias minimizaram os danos ocasionados pelo patógeno, conseguindo manter o
rendimento da planta maior em relação a planta não tratada com rizobactéria. É provável que,
indiretamente, seja por antibiose direta, ou por indução de resistência, o controle biológico
esteja ligado a estes incrementos na produção. No caso de indução de resistência a
comprovação científica da existência de indução e da não ocorrência dos mecanismos de
antibiose direta pode ser atingida pela compartimentação, a nível espacial, dos componentes
microbianos da interação, ou seja, a presença e, ou, adição de rizobactérias à rizosfera torna a
parte aérea mais resistente a patógenos, apesar de se encontrarem em espaços separados (LIU
et al., 1995c; KLOEPPER, 1996; RAUPACH et al., 1996; WEI et al., 1996).
Gráfico 4: Biomassa de plantas de arroz inoculadas com rizobacterias Pseudomonas fluorescens
BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e controle desafiadas com Bipolaris sp.. Barras
seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de Tukey(p<0,5).
5.5. Trocas gasosas
Com relação às trocas gasosas, as plantas tratadas com as rizobactérias Pseudomonas
fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e inoculadas com Bipolaris
sp., atenuaram a redução em 63% e 68% nas taxas de assimilação de CO2 (A) e a condutância
35
estomática ao vapor (GS) de água, respectivamente, em relação às plantas de controle. A taxa
de transpiração (E) e concentração interna de CO2 (Ci) ateunaram a redução em 40% e 5%,
respectivamente, apenas a BRM-32113 teve um menor redução na concentração interna de
CO2 (Ci), a BRM-32111 na diferiu em comparação as plantas de controle (Gráfico 5).
O tratamento controle mostra os seguintes valores para A, gs, E e Ci
respectivamente: 6 mmol CO2 m-2s-1, 0,112 mmol H2O m-2s-1, 2,4 mmol H2O m-2s-1, 293
µmol CO2 mol-1. Para as plantas tratadas com BRM-32111 , os valores para A, gs, E e Ci
foram os seguintes: 16 mmol CO2 m-2s-1, 0,315 H2O m-2s-1, 4,8 mmol H2O m-2s-1 e 293 µmol
CO2 mol-1 (Figura 5). Plantas tratadas com BRM-32113 apresentaram os seguintes valores
para A, gs, E e Ci: 17 mmol CO2 m-2s-1, 0,379 H2O m-2s-1, 3,1 mmol H2O m-2s-1 e 307 µmol
CO2 mol-1 (Gráfico 5).
De acordo com os estudos de Tatagiba et al. (2014), no qual investigava a
escaldadura em folhas de arroz, observou uma redução nos valores referentes a A e gs e
aumento acentuado em Ci pela redução da penetração de CO2 devido à infecção por M.
albescens, mesmo antes que a doença produza sintomas. Nossos resultados indicam que as
plantas de controle tiveram redução significativas em A, E e gs, enquanto plantas tratadas
com BRM-32111 e BRM-32113 não mostram a mesma diminuição (Gráfico 5).
Estudos anteriores demonstraram que a opiofolina A, uma toxina produzida por B.
oryzae, pode induzir abertura estomática em baixas concentrações, enquanto em
concentrações acima de 1 mM, leva ao fechamento estomático (Nejidat 1987). O mecanismo
pelo qual a opiobolina A induz o fechamento estomático está aparentemente associado ao seu
efeito sobre a calmodulina ou através de dano direto induzido nas membranas celulares da
planta (Tipton et al. 1977; Leung et al. 1984). Assim, esta toxina induz uma perda de pressão
osmótica nas células guarda que, em última análise, leva ao fechamento dos estômatos e
diminui de gs.
A menor severidade da mancha registrada em plantas tratadas com rizobactérias
resultaram em uma preservação do funcionamento do aparelho fotossintético baseado nos
parâmetros de troca gasosas obtidos.
36
Gráfico 5; Parâmetros fisiológicos de plantas de arroz tratadas e não tratadas com rizobacterias
Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e desafiadas com
Bipolaris sp.. Taxa de assimilação líquida CO2 em μmol CO2 / m-2 / s-1 (A), condutância estomática
para Vapor de água em mol H2O / m-2 / s-1 (gs), taxa de transpiração em mmol H2O / m-2 / s-1(E) e
interna Concentração de CO2 em μmol / mol (Ci)
37
5.6. Fluorescência da clorofila a
Em relação a fluorescência da clorofila a, em plantas tratadas com rizobacterias
Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113, a relação de
eficiência fotoquímica máxima (Fv / Fm) também não diferiu das plantas tratadas em relação
ao controle. O coeficiente de extinção fotoquímica (qP) não diferiu das plantas tratadas com
as rizobactérias quando comparadas com a plantas controle. A eficiência quântica do
fotosistema II [Y (PII) foi de 23% maior em plantas tratadas com as rizobactérias em relação
ao controle. E em Y (NQP), o aumento foi de 45% em plantas tratadas com as rizobactérias
em comparação com o controle (Gráfico 6). E observado que houve um menor número de
parâmetros fisiológicos afetados negativamente por B. oryzae em folhas bandeira tratadas
com as rizobactérias.
Nesses resultados, foi demonstrado que os processos fotoquímicos, que foram
analisados através da fluorescência da clorofila a, foram comprometidos, sugerindo que várias
etapas de captura de energia foram afetados pela infecção por B. oryzae. No entanto, a
relevância dos parâmetros de fluorescência da clorofila foi apenas marginalmente afetado pelo
patógeno durante o período de tempo avaliado. (DEMMIG-ADAMS & ADAMS, 2006).
Essas pesquisas são sustentadas por trabalhos anteriores de diferentes interações
patógenos-hospedeiros, nas quais a infecção por patógenos resultou em deficiências
fisiológicas (RESENDE et al., 2012; DEBONA et al., 2014; TATAGIBA et al., 2015;
BERMÚDEZ-CARDONA et al., 2015; DOMICIANO et al., 2015)
38
Gráfico 6; Fluorescência na clorofila a de plantas de arroz tratadas e não tratadas com com
rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e
desafiadas com Bipolaris sp.. Produção quântica de fotosistema II (Fv / Fm); E extinção fotoquímica
Coeficiente (qP). Rendimento quântico efetivo de PS II [Y (II)] e rendimento quântico de regulação.
Dissipação de energia [Y (NPQ)]. Barras seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de
Tukey(p<0,5).
5.7. Quantificação de pigmentos
A concentração de clorofila a (Chla) teve um aumento de 38% nas plantas tratadas
com as rizobactérias em comparação com plantas de controle na clorofila b (Chlb), o aumento
foi de 32%. A clorofila total em plantas tratadas (Chl (a + b) foi 36% maior do que nas plantas
de controle. A proporção de clorofila a / b (Chla / Chlb) teve um aumento de 17% em plantas
tratadas com as rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia
BRM-32113 em comparação com plantas não tratadas (Gráfico 7).
39
As análises de Chla indicaram que houve menor concentração de clorofila em
plantas de arroz controle, desse modo houve maior comprometimento pela infecção por B.
Oryzae em relação as plantas inoculadas com as PGPR´s
Gráfico 7: Pigmentos clorosplastídicos de plantas de arroz tratadas e não tratadas com com
rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia pyrrocinia BRM-32113 e
desafiadas com Bipolaris sp.. Concentração de clorofila a (Chla), clorofila b (Chlb), clorofilas totais
(Chla + b) e relação clorofila / clorofila b (Chla / Chlb) em Μg / g de matéria fresca. Barras seguidas
da mesma letra não diferem pelo teste de Tukey (p<0,5).
40
6. CONCLUSÕES
Conclui-se que as rizobacterias Pseudomonas fluorescens BRM-32111, Bulkholderia
pyrrocinia BRM-32113 diminui a severidade da mancha parda quando inoculadas em plantas
de arroz, assim como, tiveram menor redução de biomassa e teor de clorofila. No entanto, o
melhor tratamento foi a Pseudomonas fluorescens BRM-32111. As rizobactérias também são
capazes de atenuar a redução de taxa de assimilação líquida CO2 (A), condutância estomática
para Vapor de água (gs), taxa de transpiração (E) e Concentração interna de CO2 (Ci) nas
plantas de arroz mesmo na presença da mancha parda, assim como provocaram menor
redução nos pigmentos clorosplastídicos e conseguiram atenuar a fluorescência da clorofila a
em presença do patógeno. Desse modo, essas rizobactérias quando inoculadas a plantas de
arroz além reduzir a severidade da mancha parda também apresentam benefícios fisiológicos,
e poderão ser avaliadas em campo para posterior inserção no manejo da cultura do arroz.
41
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