Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas ... · hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular, após nove dias de déficit de . xii O2. (A e B) *P≤0,05. (C) Os

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FISIOLOGIA VEGETAL

Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de

Soja submetidas à Hipoxia

PABLO GERZSON BADINELLI

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob orientação do Prof. Luciano do Amarante, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de Mestre em Ciências (M.S).

PELOTAS

Rio Grande do Sul - Brasil

2008

PABLO GERZSON BADINELLI

Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de

Soja submetidas à Hipoxia

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob orientação do Prof. Luciano do Amarante, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de Mestre em Ciências (M.S).

APROVADA: 05 de dezembro de 2009 Banca Examinadora: ____________________________ __________________________ Prof. Dr. Nei Fernandes Lopes Prof. Dr. Antonio Costa Oliveira

____________________________ Prof. Dr. Luciano do Amarante

(Orientador)

Dados de catalogação na fonte: ( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744 )

B114r Badinelli, Pablo Gerzson

Respostas bioquímicas e fisiológicas de plantas noduladas de soja submetidas à Hipoxia / Pablo Gerzson Badinelli. - Pelotas, 2008.

100f. : graf. Dissertação ( Mestrado ) –Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal. Instituto de Biologia. Universidade Federal de Pelotas. - Pelotas, 2008, Luciano do Amarante, Orientador.

1. ADH 2. Glycine max 3. AlaAT 4. Deficiência de oxigê-

nio 5. Carboidratos 6. Aminoácidos 7. Ureídeos 8. Crescimento I Amarante, Luciano do (orientador) II .Título.

CDD 633.34

iii

Aos meus pais Guilmen Edson Gonçalves Badinelli e Nelma Rosana Gerzson

Badinelli, por seu exemplo de vida, empenho e dedicação para comigo, durante a

minha formação moral e intelectual.

A minha companheira e meu amor Lilian Madruga de Tunes, pelo seu apoio,

compreensão e por estar sempre presente nos momentos mais difíceis.

Aos meus avós Darci Carlos Ferreira Badinelli, Eunice Gonçalves Badinelli, Edgar de

Moura Gerzson e Lia Daufollo Gerzson, pelo seu exemplo de sabedoria e

humildade.

Aos poucos e verdadeiros amigos, simplesmente por sua amizade.

Dedico

iv

É melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo

expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem gozam

muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta sem conhecer o

sabor da vitória nem da derrota.

Theodore Roosevelt

v

Agradecimentos

A Deus, por ser minha fonte de inspiração e sabedoria para transpor meus

obstáculos.

À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) por proporcionar-me a obtenção do título

de mestre em Ciências.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de estudos.

À Embrapa - Terras Baixas, em especial ao pesquisador Francisco de Jesus Vernetti

Júnior, por sua colaboração durante a fase de experimentação.

Ao professor, orientador e amigo Luciano do Amarante, por me incluir na essência

de sua profissão, por acreditar no meu potencial, por sua amizade e principalmente

pela sua persistência e humildade.

Aos professores Antonio Carlos de Souza Albuquerque Barros, Antonio Costa

Oliveira, Beatriz Helena Gomes Rocha, Denise dos Santos Colares, Nei Fernandes

Lopes, Massako Takahashi Dourado e Ronaldo do Nascimento, pelo apoio e

conhecimento transmitido.

Aos amigos Géri Eduardo Meneghello, Suzi Braga, Rérinton Joabél, em especial aos

amigos Lúcio Kerber Canabarro, Simone Pohl e Vera Borges.

A todos os demais amigos e demais pessoas que acreditaram e me apoiaram

durante minha formação acadêmica e profissional.

vi

Resumo

BADINELLI, Pablo Gerzson, M.S., Universidade Federal de Pelotas, novembro de

2008. Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de Soja à

Hipoxia. Orientador: Prof. Dr. Luciano do Amarante.

A deficiência de oxigênio causada por chuvas e irrigações, pode-se tornar

freqüente em regiões de solos hidromórficos, onde a drenagem é deficiente,

limitando o cultivo de espécies economicamente importantes e em conseqüência o

desenvolvimento sócio-econômico destas regiões. A soja [Glycine max (L). Merril] é

uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China e apresenta

variabilidade genética para tolerar o excesso de umidade no solo. Quando as

plantas são submetidas à hipoxia o metabolismo fermentativo é ativado com a

finalidade de manter a produção de energia e agentes redutores, embora com menor

eficiência, até a planta retornar ao estado de normoxia. Este trabalho teve como

objetivo esclarecer algumas variações metabólicas e adaptações morfofisiológicas

em dois cultivares de soja nodulada contrastantes em relação às condições de

alagamento, durante o estado de hipoxia e pós-hipoxia dos sistemas radiculares. Os

genótipos BRS-153 (suscetível) e BRS-154 (tolerante) foram cultivados em casa de

vegetação, em vasos contendo vermiculita lavada como substrato, inoculadas com

Bradyrhizobium elkanii estirpe SEMIA 587 e nutridas com solução nutritiva

desprovida de N. O tratamentos foram dispostos em delineamento experimental

inteiramente casualizado com 4 repetições, tendo como unidade experimental duas

plantas por vaso. Aos dados quantitativos aplicou-se análise de variância e, nos

casos significativos, aplicou-se análise de regressão. Quando não houve ajuste de

curva, comparou-se as médias pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

O tratamento hipóxico foi aplicado no estádio de desenvolvimento R2, mantendo-se

as plantas inundadas por até 12 dias. As plantas foram coletadas aos 3, 6, 9 e 12

vii

dias de inundação e após 1, 2, 3 e 9 dias após drenagem dos vasos com plantas

sob nove dias de inundação. Avaliaram-se os parâmetros de crescimento: diâmetro

do caule, massa seca de raiz, caule, folhas e vagens, volume de raiz, número de

vagens e parâmetros bioquímicos: atividades das enzimas alanina aminotransferase

(AlaAT; EC 2.6.1.2) e álcool desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) e teor de metabólitos:

açúcares solúveis totais, sacarose, polissacarídeos solúveis em água, amido,

aminoácidos totais e proteínas totais em nódulos e raízes e ureídeos em seiva de

xilema. Conclui-se que houve diferença de resposta entre os dois cultivares quanto a

maioria dos parâmetros avaliados em relação aos períodos de hipoxia e pós-hipoxia.

As atividades das enzimas ADH e AlaAT elevaram-se durante o alagamento, tanto

para raízes como para nódulos e retornaram a níveis pré-hipóxicos durante o

período de recuperação. Nos nódulos as atividades das duas enzimas foram mais

expressivas do que em raízes.

Palavras-chave: deficiência de oxigênio, ADH, AlaAT, carboidratos, Glycine max,

aminoácidos, ureídeos, crescimento

viii

Abstract

BADINELLI, Pablo Gerzson, M.S., Universidade Federal de Pelotas, novembro de

2008. Biochemical and Physiological Responses of Nodulated Soybean to

Hypoxia. Orientador: Prof. Dr. Luciano do Amarante.

Oxygen deficiency caused by rains and irrigations can be frequent in

hydromorphic soils. In these areas, deficient drainage can limit growth of

economically important species and in consequence can result in areas with restrict

socioeconomic development. Soybean [Glycine max (L). Merril] is originated from the

northern chinese waterlogged areas and consequently of its genetic variability of this

specie for soil humidity excess tolerance. When plants are subjected to hypoxic

conditions, the fermentative metabolism is activated with the purpose of maintaining

the energy production and reducing agents, although of smaller efficiency, until the

plant return to the normoxia state. In this work, some metabolic variations and

morphophysiological adaptations were studied in two nodulated soybean cultivars,

contrasting for tolerance to flooding conditions, during the hypoxia and post-hypoxia

state of the root system. The genotypes BRS-153 (susceptible) and BRS-154

(tolerant) were grown under green house conditions, in pots containing washed

vermiculite, inoculated with the SEMIA 587 strain of Bradyrhizobium elkanii and N-

free nutrient solution. The experimental design was completely randomized with four

replicates, considering two plants in a pot as a repetition. Quantitative data were

subjected to an analysis of variance, and when the means were significant,

regression analysis was applied. In the cases that no adjustment was possible, the

means were compared by the Tukey’s test (P≤0,05). The hypoxic treatment was

applied at stage R2, during 12 days. Plants were collected at 3, 6, 9 and 12 days

after flooding and 1, 2, 3 and 9 days after the drainage of the pots which plants were

flooded during nine days. Morphological parameters such diameter of the stem,

dried mass of roots, leaves and green pods, root volume, green pods number and

ix

biochemical analysis as alanine aminotransferase (AlaAT; EC 2.6.1.2) and alcohol

desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) activities and total content of soluble sugars,

sucrose, water-soluble polyssacharides, starch, free amino acids and proteins in

nodules and roots and ureides in the xylem sap were analysed. Hypoxia and post-

hypoxia condictions caused different effects among the two cultivars in relation to the

most of the parameters studied. Activities of the ADH and AlaAT were stimulated by

flooding in roots and in nodules and returned to pre-hypoxic treatments during the

recovery period. In the nodules the activities of the two enzymes were more

expressive than in the roots.

Key words: deficiency of oxygen, ADH, AlaAT, carbohydrates, Glycine max, amino

acids, ureides, growth

x

Lista de Figuras Capítulo I:

Figura 1. Diâmetro do caule de cultivares de soja nodulada, e BRS-153(A e B) e

BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e

drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. *P≤0,05;

n=4........................................................................................................31

Figura 2. Volume do sistema radicular de cultivares de soja nodulados, BRS-153

(A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de inundação e

recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação.

*P≤0,05; n=4.........................................................................................32

Figura 3. Massa seca de raízes de dois cultivares de soja nodulados, submetidos

a diferentes períodos de inundação do sistema radicular (A) e dos

cultivares BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes

períodos de recuperação do sistema radicular, após nove dias de

inundação. *P≤0,05;n=.........................................................................33

Figura 4. Massa seca de folhas de cultivares de soja nodulados, BRS-153 e

BRS-154, submetidos a diferentes períodos de inundação (A) e de

recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação (B). Os

valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e

letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey

(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,

n=4........................................................................................................34

xi

Figura 5. Razão entre a massa seca da parte aérea e do sistema radicular de

dois cultivares de soja nodulados submetidos a diferentes períodos de

inundação do sistema radicular (A) e dos cultivares BRS-153 (B) e

BRS-154 (C) em diferentes períodos de recuperação do sistema

radicular após nove dias de inundação. *P≤0,05;

n=4........................................................................................................35

Figura 6. Massa seca de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e

B) e BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação

e drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. (A e C)

Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e


(P≤0,05) para período e regime hídrico respectivamente. (B e D)

*P≤0,05; n=4. .......................................................................................36

Figura 7. Número de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e


drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. *P≤0,05;

n=4.............................................................................................................38

Capítulo II:

Figura 1. Teores de ureídeos totais em seiva de xilema de genótipos de soja

nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a

diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após

nove dias de déficit de O2. *P≤0,05, n=4..............................................50

Figura 2. Teores de aminoácidos totais em raízes de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 (A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de

hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular, após nove dias de déficit de

xii

O2. (A e B) *P≤0,05. (C) Os valores de médias, seguidos da mesma

letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem

entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente; =4.............................................................................51

Figura 3. Teores de aminoácidos totais em nódulos de genótipos de soja, BRS-

153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de

hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit

de O2. Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na

linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste

de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,

n=4.....................................................................................................53

Figura 4. Teores de proteínas totais em raízes de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia do

sistema radicular. *P≤0,05, n=4............................................................54

Figura 5. Teores de proteínas totais em nódulos de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia (A)

e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2 (B).

Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e


a P≤0,05, para período e regime hídrico respectivamente. *P≤0,05,

n=4........................................................................................................55

Figura 6. Atividade da enzima alanina aminotransferase em raízes de genótipos

de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B) sob hipoxia e pós-

hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2 (C). (A e

B) *P≤0,05. (C) Valores de médias, seguidos da mesma letra

maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre

si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente; n=4...........................................................................57

xiii

Figura 7. Atividade da enzima alanina aminotransferase em nódulos de genótipos

de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B), sob hipoxia e pós-

hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2 (C).

Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e


(*P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente, n=4.

..............................................................................................................58

Capítulo III:

Figura 1. Fluxograma da extração Álcool desidrogenase e Alanina

aminotransferase...............................................................................67

Figura 2. Fluxograma da extração de metabólitos, sendo TCA (ácido tricloro

acético), MCW (metanol : clorofórmio : água), WSP (polissacarídeos

solúveis totais) e PCA (ácido perclórico)..............................................68

Figura 3. Atividade da enzima álcool desidrogenase em raízes de genótipos de

soja nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a

diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular, após

nove dias de déficit de O2. (A e C) *P≤0,05. (B e D) Os valores de

médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras

minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey

(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;

n=4........................................................................................................71

Figura 4. Atividade da enzima álcool desidrogenase em nódulos de genótipos de

soja, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes

períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias

de déficit de O2. (A e C) *P≤0,05. (B e D); Os valores de médias,

seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre

linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período

e regime hídrico respectivamente; n=4.................................................73

xiv

Figura 5. Teores de sacarose em raízes de genótipos de soja nodulada, BRS-153

(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de

hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de

O2. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da

mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não

diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime

hídrico respectivamente; n=4................................................................75

Figura 6. Teores de sacarose em nódulos de genótipos de soja, BRS-153 (A e B)

e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e e

pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2 (B e

D). Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha

e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de

Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;

n=4........................................................................................................76

Figura 7. Teores de açúcares solúveis totais em raízes de genótipos de soja

nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a


nove dias de déficit de O2. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de




n=4........................................................................................................78

Figura 8. Teores de açúcares solúveis totais em nódulos de genótipos de soja,

BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de

hipoxia (A) e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit

de O2 (B e C). Os valores de médias, seguidos da mesma letra

maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre

si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente, n=4...........................................................................79

xv

Figura 9. Teores de polissacarídeos solúveis em água de raízes de genótipos de



nove dias de déficit de O2. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de




n=4........................................................................................................81

Figura 10. Teores de polissacarídeos solúveis em água em nódulos de genótipos

de soja nodulada, BRS-153(A e B) BRS-154 (C e D), submetidos a


nove dias de déficit de O2. Os valores de médias, seguidos da mesma

letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem

entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente, n=4...........................................................................82

Figura 11. Teores de amido em nódulos de genótipos de soja nodulada, BRS-153

(A) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-

hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2 .Os valores

de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras


(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,

n=4........................................................................................................83

xvi

Índice

Resumo...................................................................................................................... vi

Abstract .....................................................................................................................viii

Lista de figuras ............................................................................................................x

Abreveaturas............................................................................................................xvii

1. Introdução geral ....................................................................................................19

2. Crescimento de cultivares de soja nodulada sob influência de diferentes períodos

de inundação e drenagem do sistema de cultivo....................................................25

2.1 Introdução........................................................................................................26

2.2 Material e métodos ..........................................................................................28

2.3 Resultados e discussão...................................................................................30

2.4 Conclusões ......................................................................................................40

3. Atividade da alanina aminotransferase e teor de compostos nitrogenados em

raízes e nódulos de genótipos de soja submetidos a diferentes periodos de hipoxia e

pós-hipoxia.................................................................................................................41

3.1 Introdução ...........................................................................................................42



3.4 Conclusão........................................................................................................59

4. Atividade da enzima álcool desidrogenase e alocação de carboidratos no sistema

radicular de soja nodulada durante período de hipoxia e retorno a

normoxia..................................................................................................................60

4.1 Introdução........................................................................................................61



4.4 Conclusões ......................................................................................................84

5. Referências bibliográficas ....................................................................................86

xvii

Abreviaturas

Ala – L-alanina

AlaAT – alanina aminotransferase

ADH – álcool desidrogenase

AST – açúcares solúveis totais

ATP – adenosina trifosfato

BSA – soroalbumina bovina / fração V

DAD – dias após a drenagem

DAE – dias após a emergência

DAI – dias após a inundação

DO – densidade óptica

DTT – Ditiotreitol

EROs – espécies reativas ao oxigênio

FAD – flavina adenosina dinucleotídeo

LDH – lactato desidrogenase

NAD+ – β-nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma oxidada

NADH – β-nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma reduzida

PCA – ácido perclórico

PDC – piruvato descarboxilase

PVPP – polivinilpolipirrolidona

TCA – ácido tri-cloro acético

WSP – polissacarídeos solúveis totais

α-KG – 2-oxoglutarato

INTRODUÇÃO GERAL

Estima-se que 6% da superfície terrestre são ocupados por áreas alagadas

ou sujeitas ao alagamento temporário (MALTBY, 1991), onde a difusão de gases da

atmosfera até o solo é fortemente afetada (ARMSTRONG et al., 1994).

No Brasil, estima-se que haja cerca de 28 milhões de hectares de solos

sujeitos ao encharcamento (solos aluviais e hidromórficos) (MAGALHÃES et al.,

2005). Grande parte dessas áreas encontram-se na região dos Cerrados e outra

parcela (6,8 milhões de ha) na região sul do Brasil, sendo que cerca de 5,4 milhões

de hectares estão no RS e poderiam ser incorporadas ao sistema de rotação de

culturas (soja-arroz-pecuária). A diversificação e ou incorporação de novas culturas

às áreas de várzea (solos hidromórficos), geralmente destinadas à produção de

arroz irrigado, é uma forma de aumentar a eficiência do sistema produtivo. Esta

prática vem sendo implementada nos EUA, na região baixa do Delta do Mississipi,

com a incorporação das culturas do milho e da soja em rotação com o arroz irrigado

(SCOTT e NORMAN, 2000).

O cultivo de arroz irrigado constitui a principal forma de exploração dos solos

de várzea na região sul do Brasil e vários trabalhos têm sido conduzidos com a

finalidade de buscar alternativas para cultivos nas várzeas arrozeiras,

proporcionando maior retorno econômico dessas áreas (BARNI et al., 1985;

GASTAL et al., 1998). O grande problema é a difícil adaptação de culturas em solos

alagados, uma vez que a maior parte das culturas produtoras de grãos são

mesófitas. Buscam-se, como alternativas, espécies que permitam a utilização da

mesma estrutura empregada no arroz, que apresentem tolerância às condições

impostas pela inundação do solo e possuam elevado potencial de rendimento.

20

A soja é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China

(EVANS, 1996), que apresenta variabilidade genética para tolerar o excesso de

umidade no solo (VAN TOAI et al., 1994; THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).

Nas condições brasileiras, a cultura da soja, principal produtora de óleo

vegetal, além do consumo alimentício é matéria prima para a produção de biodiesel,

apresenta-se como alternativa extremamente interessante e potencialmente viável

para ocupar esse segmento. Ainda, a rotação de culturas em solos de várzea é uma

prática recomendada para aumentar o rendimento de grãos de arroz, quer pelo

efeito direto de quebrar o ciclo de insetos e pragas, moléstias e de plantas daninhas

que prejudicam o desenvolvimento do arroz, ou pelo efeito indireto na melhoria das

condições químicas e físicas do solo (IRGA, 2001).

O avanço do cultivo da soja em áreas de várzea tem como conseqüência o

aumento da demanda do desenvolvimento de cultivares adaptados a esses

ambientes, impulsionado pela baixa rentabilidade do arroz nos últimos anos em

relação à soja, em vista dos menores custos de produção dessa cultura e o valor

das terras do planalto do Estado do Rio Grande do Sul, onde é cultivada, serem

muito mais elevadas que as terras de produção de arroz.

O efeito do estresse por saturação hídrica do solo sobre as plantas é

complexo e dependente do estádio de desenvolvimento da planta (VAN’T WOUT e

HAGAN, 1974; MOMEN et al., 1979; TAIZ e ZEIGER, 1991; SALISBURY e ROSS,

1992) e do período de exposição a esse estresse (BARNI e COSTA, 1975; GOMES

et al., 1992). A saturação hídrica do solo, aplicada às leguminosas, prejudica o

desenvolvimento das raízes e da parte aérea e também a fixação de nitrogênio pelo

sistema radical, em virtude de reduzir o oxigênio para os nódulos, resultando numa

redução do número de nódulos por área de raízes (BARNI e COSTA, 1975; DE WIT,

1978). A tolerância ao encharcamento para a cultura da soja foi demonstrada por

COSTA (1973), submetendo as plantas à saturação hídrica do solo por um período

de quatro meses, as quais permaneceram vivas, completaram o ciclo e produziram

grãos. Ainda, a falta de O2 no sistema radicular da planta de soja, além de inibir a

fixação simbiótica, também inibe a absorção de nitrogênio e outros minerais, inibindo

o crescimento das raízes e a nodulação (SALLAM e SCOTT, 1987). Então, o

transporte de N ou outros minerais para a parte aérea pode ser inadequado,

resultando em plantas raquíticas e cloróticas (NATHANSON et al., 1984). A

21

diminuição das taxas de assimilação líquida e expansão foliar provocam a

diminuição da taxa de crescimento da cultura da soja e, consequentemente,

proporcionam menor rendimento de grãos (LINKEMER et al., 1998).

O encharcamento modifica a atmosfera do solo, pois promove deficiência de

O2, acúmulo de CO2, metano, etileno, gás sulfídrico (H2S), hidrogênio e redução da

respiração aeróbica. O crescimento das raízes paralisa em poucos minutos, com o

limite de tolerância das raízes de soja em relação ao CO2, que é 20% na atmosfera

do solo (COSTA, 1996). Esse ambiente provoca alterações no metabolismo das

raízes, passando de aeróbico para anaeróbico devido à falta de aceptor final de

elétrons, levando a paralisação do ciclo de Krebs (KENNEDY et al., 1992). Apesar

do estresse, existem espécies que conseguem sobreviver ao alagamento, devido a

mecanismos de adaptações morfológicas, metabólicas e anatômicas

(VARTAPETIAN e JACKSON, 1997).

As leguminosas são geralmente sensíveis às inundações e o alagamento do

solo, limitando seu crescimento, pois os nódulos precisam de O2 para manter a

respiração aeróbica necessária para suprir a grande quantidade de ATP

indispensável à atividade da nitrogenase. Apesar de terem adaptações como a

proteína condutora de O2 para otimizar o suprimento de O2, a maioria das

leguminosas terrestres não é suficientemente capaz de aumentar o fornecimento de

O2 para dentro de seus nódulos enquanto inundadas (LOUREIRO et al., 1995).

Entretanto, a fixação simbiótica de N2 na soja pode se aclimatar à inundação e a

recuperação da fixação coincide com a formação de aerênquima e raízes

adventícias (BACANAMWO e PURCELL, 1999a, THOMAS et al., 2005).

O suprimento de carboidratos e a regulação do metabolismo de carboidratos

e de energia são importantes na superação do estresse hipóxico (ANDREEV et al.,

2001; SCHUSSLER et al., 2000). Porém, em aparente contradição ao aumento no

consumo de carboidratos sob hipoxia, muitas plantas acumulam açúcares

(ALBRECHT e BIEMELT, 1998), aminoácidos e reservas, como amido (BARTA,

1987), quando submetidas á deficiência de O2.

Com a inundação, o segmento submerso do caule da planta de soja

apresenta hipertrofia e formação de um tecido esponjoso na base do caule, com

rompimento da epiderme (PIRES et al., 2002). Nesse segmento, ocorre o

desenvolvimento de raízes adventícias que apresentam aerênquima lisígeno. Nas

22

raízes laterais há o desenvolvimento de aerênquima no córtex, também ocorre o

rompimento da epiderme (BACANAMWO e PURCELL, 1999a; PIRES et al., 2002).

Nos nódulos submetidos à baixa pressão parcial de O2 ou inundação, por períodos

prolongados, ocorre a hipertrofia de lenticelas com formação de aerênquima

(PANKHURST e SPRENT, 1975; DAKORA e ATKINS, 1989; PARSON e DAY, 1990;

THOMAS et al., 2005).

De uma maneira geral, as plantas para se desenvolverem necessitam de um

ponto de equilíbrio entre a quantidade de água disponível no solo e o espaço

ocupado pelo ar no solo. O oxigênio é vital no fornecimento de energia para as vias

celulares, e sua presença ou ausência determina a atividade metabólica e produção

de energia. Ele serve como um aceptor de elétrons na fosforilação oxidativa que

regenera o ATP, principal fonte de energia para o metabolismo celular, por meio da

regeneração do NAD+, viabilizando o poder de sustentação das vias bioquímicas,

como por exemplo a glicólise (DENNIS et al., 2000). Sem O2 a respiração

mitocondrial cessa por falta de um aceptor de elétron. Isso resulta na queda de 36

para 2 mols de ATP por mol de glicose metabolizada.

As plantas respondem à deficiência de oxigênio alterando seu metabolismo

energético, de modo que a energia necessária à sua sobrevivência passa a ser

obtida, predominantemente, por meio do processo fermentativo, tanto em plantas

tolerantes como não tolerantes. Em tecidos hipóxicos/anóxicos, o conteúdo de

piruvato aumenta assim como o de enzimas glicolíticas. Sob hipoxia/anoxia as

enzimas fermentativas piruvato descarboxilase (PDC), álcool desidrogenase (ADH) e

lactato desidrogenase (LDH) são induzidas em conseqüência da necessidade em

aumentar a glicólise para compensar a baixa produção de ATP devido à inativação

da fosforilação oxidativa (SAGLIO et al., 1999; SATO et al., 2002). Os produtos da

fermentação, acetaldeído, etanol e lactato acumulam, permitindo a regeneração de

NAD+ a partir de NADH. A regeneração de NAD+ pelas enzimas fermentativas ADH

e LDH é vital para a tolerância à hipoxia/anoxia porque, na ausência de NAD+, a

glicólise cessa (ISMOND et al., 2003; KURSTEINER et al., 2003). O acúmulo

limitado de lactato e maior controle do pH citoplasmático constituem também parte

da estratégia que confere tolerância à hipoxia e anoxia. Além desses produtos pode

ocorrer o acúmulo de alanina (PUIATTI e SODEK, 1999; SOUZA e SODEK, 2003;

THOMAS et al., 2005), a qual pode ter grande importância no retorno à normoxia

23

pela conversão em piruvato por meio da reação de transaminação catalisada pela

atividade da enzima alanina aminotransferase (SOUZA e SODEK, 2003;

MIYASHITA et al. 2007).

Em plantas sob condições normais de oxigenação, essas vias estão

ausentes ou com atividade bastante reduzida, mas são rapidamente induzidas em

baixa concentração de O2, o que sugere um papel no mecanismo de sobrevivência

das plantas, embora não se conheça qual a extensão da contribuição e como elas

se relacionam em baixo teor de O2 (DENNIS et al., 2000).

A injúria e morte das raízes é atribuída ao acúmulo de metabólitos tóxicos

produzidos durante a fermentação (principalmente o etanol), a falta de substratos

para a respiração e a diminuição no metabolismo energético (DREW, 2000).

Observou-se em abóbora após 10-15 h de anoxia que a baixa carga de energia,

levou as células à morte porque ocorreu degradação da ultra-estrutura da

mitocôndria (VARTAPETIAN et al., 2003). Esse fenômeno não pode ser revertido

mesmo sendo restabelecida a aeração. A ultra-estrutura mitocondrial pode ser

preservada por intermédio da hidrólise do amido de reserva e ativação de enzimas

da fermentação que limitam esses efeitos (BAXTER-BURRELL et al., 2002).

O período de recuperação é de extrema importância, pois mesmo após a

drenagem do ambiente hipóxico, a re-oxigenação do meio pode causar uma

segunda condição estresse, causado pela formação de espécies reativas de

oxigênio e pode ser um fator limitante quanto a sobrevivência das plantas. Este

estresse é gerado nos primeiros minutos da restauração da oxigenação do meio

provocando injúrias pós-anóxicas, como a peroxidação de lipídeos em espécies

intolerantes, o que tem sido amplamente documentado (BIEMELT et al., 1998;

BLOKHINA et al., 1999; BLOKHINA et al., 2003).

A exploração de áreas alagadas com espécies de importância econômica

depende da identificação não somente de plantas que sobrevivam à inundação do

solo, mas que também possam apresentar rendimentos capazes de trazer retorno

econômico nessas condições ambientais. Para tanto, devem ser identificados os

genótipos mais tolerantes em experimentos em casa de vegetação e a campo que

reproduzam condições e períodos diferenciados de inundação. Posteriormente, as

razões que levam à melhor adaptação, no aspecto anatômico, morfológico,

metabólico e fisiológico devem ser conhecidas, possibilitando a transferência dessas

24

características para cultivares que não as possuem, por meio de técnicas de

melhoramento (PIRES et al., 2002).

Nas décadas de 70 e 80, vários cultivares de soja testadas tiveram

excelentes rendimentos de grãos em solos hidromórficos, destacando-se: Planalto,

Bragg, Ipagro-20 e BR7 (BARNI, 1980; SACCOL, 1986), porém, nos últimos anos,

esses cultivares não são mais recomendadas para o cultivo no Estado do Rio

Grande do Sul.

Os cultivares atualmente recomendados são pouco conhecidos no que tange

a adaptação ao encharcamento do solo, estabelecendo dificuldades para semea-los

nessas condições. O presente trabalho teve como objetivos avaliar respostas

bioquímicas e fisiológicas dos cultivares BRS 153 e BRS 154 frente a diferentes

períodos de hipoxia e de recuperação pós-hipoxia.

25

CAPÍTULO I

CRESCIMENTO DE CULTIVARES DE SOJA NODULADA SOB INFLUÊNCIA DE

DIFERENTES PERÍODOS DE INUNDAÇÃO E DRENAGEM DO SISTEMA DE

CULTIVO

26

INTRODUÇÃO

A soja possui grande importância na agricultura mundial, produz proteína de

alta qualidade (BALESTRASSE et al., 2001) utilizada na formulação de rações para

animais produtores de carne e seu óleo é um dos mais baratos, podendo ser

utilizado tanto para o consumo humano, quanto para produção de biodiesel ou para

a indústria química (DALL`AGNOL, 2008). Ao ser cultivada com Bradyrhizobium,

forma associações simbióticas contribuindo para o aumento da entrada de nitrogênio

combinado no solo, o que resulta numa economia superior a 3 bilhões de dólares

por safra em fertilizantes nitrogenados no país (DOBEREINER, 1997).

No Rio Grande do Sul os solos de várzea ocupam uma área de

aproximadamente 5,5 milhões de hectares (IBGE, 2007) e, dos 3,2 milhões

destinados ao cultivo do arroz irrigado, anualmente utilizam-se aproximadamente 1

milhão de hectares com a cultura. Neste contexto, a cultura da soja surge como uma

alternativa de cultivo às áreas de pousio e/ou drenagem deficiente, uma vez que

utiliza praticamente a mesma infra-estrutura da lavoura de arroz (IRGA, 2001). Desta

forma, contribuirá para o manejo adequado destas áreas, visto que a rotação de

culturas é uma prática recomendada para aumentar o rendimento de grãos de arroz,

quer pelo efeito direto de quebrar o ciclo de pragas, moléstias e plantas daninhas, ou

pelo efeito indireto na melhoria das condições químicas e físicas do solo (IRGA,

2001). Entretanto, para que se obtenham esses benefícios, é necessário estudar

espécies e cultivares que se adaptem às condições de excesso de água no solo e

que proporcionem retorno econômico ao produtor.

Durante períodos prolongados de chuva ou de intensidade pluvial elevada, é

possível que mesmo em locais bem drenados ocorra o alagamento temporário,

tornando esses ambientes hipóxicos. Sob deficiência de O2, o metabolismo aeróbico

é substituído pelo anaeróbico levando à paralisação do Ciclo de Krebs (COLLINS e

27

KENNEDY et al., 1992) e da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial

(BLOKHINA, 2000), tornando a glicólise e o metabolismo fermentativo o principal

meio de obtenção de ATP pelas células vegetais (DENNIS et al, 2000).

A deficiência de O2 causa a paralisação do crescimento dos nódulos

(SALLAM e SCOTT, 1987), das raízes em poucos minutos, limitando sua tolerância

em relação ao CO2 (COSTA, 1996) e causando, também, a diminuição das taxas de

assimilação líquida e expansão foliar, provocando a diminuição da taxa de

crescimento da cultura da soja e, consequentemente, proporcionando menor

rendimento de grãos (LINKEMER et al., 1998).

A tolerância ao estresse por alagamento em soja e outras espécies pode

envolver adaptações morfológicas, anatômicas e metabólicas (THOMAS et al., 2005;

VARTAPETIAN e JACKSON, 1997, SOUSA e SODEK, 2002; SOUSA e SODEK,

2003; BAILEY-SERRES e VOESENEK, 2008). No entanto, após o retorno das

condições normais de O2, a recuperação do estresse hipóxico é dependente da

espécie, do estádio da planta, da duração, da intensidade do estresse e do tempo de

recuperação (SCOTT et al., 1989; OOSTERHUIS et al., 1990; FUKAO e BAILEY-

SERRES, 2004). É importante considerar que a injúria pós-hipóxica pode ser mais

prejudicial à planta do que a própria hipoxia, em decorrência da geração de radicais

livres e produtos oxidativos tóxicos, como acetaldeído (VAN TOAI e BOLLES, 1991;

BIEMELT et al. 1998), o que certamente influencia na retomada do crescimento da

planta e produtividade.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar parâmetros de crescimento

em dois genótipos de soja contrastantes quanto à tolerância ao alagamento durante

diferentes períodos de inundação e drenagem do sistema de cultivo.

28

2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido em casa de vegetação da Embrapa Clima

Temperado – Estação Experimental Terras Baixas, situada no município do Capão

do Leão, RS, entre dezembro de 2006 e março de 2007. Sementes de soja [(Glycine

max (L.) Merril)] dos cultivares BRS-154 (tolerante) e BRS-153 (suscetível) foram

semeadas em vasos de polietilieno furados, de três litros (5 sementes), contendo

vermiculita como substrato. Duas inoculações das plântulas com Bradyrhizobium

elkanii, estirpe SEMIA 587, fornecida pela FEPAGRO e reproduzida no

DMP/IB/UFPel. Foram efetuadas aos 14 e 21 dias após a emergência,

respectivamente nos estádios VC e R2 da classificação de FEHR et al. (1971),

constituindo na pipetagem de 2,5mL de meio líquido de NORIS e DATE (1976) ao

redor da plântula. No estádio V0 foi efetuado o desbaste deixando duas plantas por

vaso. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as plantas

foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio mineral, na

proporção de 250 mL vaso-1, duas vezes por semana e irrigado com água sempre

que necessário.

No estádio de desenvolvimento R2 - flor no nó imediatamente abaixo do nó

mais alto com uma folha completamente desenrolada (FEHR et al.,1971) - procedeu-

se a inundação do sistema radicular, submetendo as raízes à deficiência de O2. O

tratamento foi realizado ao impedir-se a drenagem natural dos vasos por meio do

encaixe do vaso contendo as plantas em outro, de mesmo modelo e não perfurado,

aplicando-se a solução nutritiva diluída a 1/3 da concentração original, de forma a se

manter uma lâmina de 20 mm sobre a superfície do substrato. O teor de O2 foi

29

monitorado com o uso de um oxímetro (Handylab OX1), na solução nutritiva e na

solução drenada dos vasos.

Os vasos dos experimentos de inundação e de recuperação foram

inundados simultaneamente e as coletas para análise de crescimento foram

realizadas aos 3, 6, 9 e 12 dias após a inundação (DAI). Aqueles destinados à

avaliação de recuperação foram drenados no 9º DAI e as plantas foram coletadas no

1º, 2º, 3º e 9º dia após a drenagem (DAD). Para as variáveis diâmetro do caule e

altura de planta foram realizadas medidas referentes ao dia de implantação do

experimento (dia zero).

As medidas de altura de planta foram obtidas por de meio de uma régua

metálica milimetrada, entre o colo da planta até a inserção da folha mais jovem,

enquanto o diâmetro do caule foi mensurado com paquímetro digital marca

Panambra, modelo Pantec: 0-150mm/6’’, em milímetros, ao nível da lâmina da

solução de inundação. Após a coleta das plantas, as raízes foram lavadas em água

corrente para a remoção das partículas de vermiculita aderidas e enroladas em

papel toalha para a retirada do excesso de umidade. Após, o volume do sistema

radical foi determinado em proveta graduada pelo deslocamento da coluna de água

devido a submersão das raízes.

A massa seca de raízes, caules, folhas e vagens foi determinada em

balança analítica após desidratação dos tecidos em estufa de ventilação forçada a

65oC até que apresentassem massa constante. Entretanto, o número de vagens por

planta foi obtido por contagem.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema

fatorial 2 x 4 x 2 (regime hídrico x dias de inundação ou de drenagem x genótipos)

com quatro repetições. As médias obtidas foram submetidas à análise de variância e

de regressão. Quando não houve adequação de curva de regressão, aplicou-se

teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade (GOMES, 1990). A análise

estatística foi realizada com auxílio do pacote estatístico SAS (SAS, 2002).

30

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O teor de oxigênio, monitorado ao longo do experimento de inundação,

variou entre 84 e 96% na solução nutritiva utilizada para inundação das plantas e

entre 7 e 13%, 24h após tratamento, variando nesse intervalo ao longo de todo o

experimento, demonstrando a condição de hipoxia do sistema utilizado.

No decorrer do experimento, a variável diâmetro do caule foi influenciada

pela interação entre os fatores regime hídrico, período de tratamento e genótipos. As

condições de hipoxia o diâmetro de ambos os cultivares logo aos três dias de

inundação (Fig. 1A e 1C), sendo este efeito mais expressivo no cultivar BRS – 154

que continuou aumentando até o nono dia de inundação, tendendo à estabilidade no

período posterior (Fig. 1C). O cultivar BRS – 153, por outro lado, respondeu de

forma diferenciada, aumentando o caule em diâmetro até o sexto dia de inundação,

tendendo à estabilidade nos demais períodos de tratamento (Fig. 1A). Em relação à

resposta dos genótipos durante o período de recuperação após nove dias de

inundação, houve um decréscimo contínuo no diâmetro da BRS - 153, com

tendência a igualar aos valores do controle (Fig. 1B). Em contrapartida, a redução no

diâmetro do caule do cultivar BRS - 154 até o terceiro dia de recuperação, ficando

estável nos demais períodos, mas sempre maior que o controle (Fig. 1 D). Pires et

al. (2002) ao estudarem adaptações morfofisiológicas de soja em solo inundado,

concluíram que o diâmetro do caule sob a lâmina de água foi a característica mais

importante na diferenciação de cultivares com vistas à tolerância à inundação, em

decorrência da formação de rachaduras na região submersa, hipertrofia e formação

de região esponjosa na base do caule, confirmando os resultados obtidos neste

experimento.

31

Figura 1- Diâmetro do caule de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e


drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo

(controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05; n=4.

O volume do sistema radical foi influenciado pela interação entre o regime

hídrico e período de tratamento, não ocorrendo diferença de resposta entre

genótipos. Os três primeiros dias de alagamento induziram o aumento do volume

das raízes, possivelmente devido a modificações morfológicas como o

desenvolvimento de raízes adventícias e formação de aerênquima. Assim, é

possível que tais alterações tenham possibilitado a reversão parcial do metabolismo

anaeróbico para aeróbico desencadeando a retomada da fixação do nitrogênio,

através da utilização do oxigênio armazenado nas câmaras aerênquimáticas,

provido da difusão do O2 da água, buscando a sobrevivência da planta por mais

tempo sob condições desfavoráveis ou até o retorno às condições de normoxia,

conforme Thomas et al., (2005). A partir daí, ocorreu um decréscimo do volume das

I = -0.0161x 2 + 0.3004x +0.3107

*R 2 = 0,75

C = -0.0034x 2 + 0.1113x + 8143

*R 2 = 0,67

2

5

8

0 3 6 9 12

Período de Inundação (Dias)

A B

Rec = -0.0066x 2 +0.0757x + 0.1012

*R 2 = 0,96

2

5

8

1 2 3 9

Período de Recuperação (Dias)

I = -0.0206x 2 + 0.4776x + 2.5686

*R 2 = 0,88

C= -0.0093x 2 + 0.1694x + 2.6321

*R 2 = 0,55

2

5

8

0 3 6 9 12


C D

Rec = -0.0039x 2 +0.0463x +0.1195

*R 2 = 0,87

2

5

8

1 2 3 9

Periodo de Recuperação (Dias)

/

/

32

raízes quando comparado com as plantas controle (Fig. 2A). Esses dados parecem

concordar com os obtidos por Fox et al., (1994) que atribuíram a paralisação de

crescimento por conta da diminuição na produção de ATP, conduzindo ao declínio

da integridade e deterioração dos tecidos radiculares.

O volume do sistema radical aumentou com o passar dos dias, após a

drenagem dos vasos, tendendo igualar-se ao das plantas controle no nono dia (Fig.

2B).

Figura 2 - Volume do sistema radicular de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A)

e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de inundação e

recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo


O regime hídrico influenciou a massa seca de raízes durante o período de

tratamento, não ocorrendo resposta diferenciada entre cultivares. Em relação ao

controle, houve grande decréscimo nos valores de massa seca de raízes a partir do

nono dia de inundação (Fig. 3A). Durante a recuperação, ambos os cultivares

apresentaram elevação de massa seca (Fig. 3B e 3C), embora BRS-154 tenha

demonstrado melhor resposta, atingindo níveis semelhantes ao do controle (Fig. 3B).

I = 0.0025x 2 -0.0720x + 1.1352

*R 2 = 0,79

4

7

10

3 6 9 12

Periodo de Inundação (Dias)

A

Rec = 0,3364x + 5.2942

*R 2 = 0,69

4

7

10

1 2 3 9

Periodo de Recueração (Dias)

//

//

B

33

Figura 3 - Massa seca de raízes de dois cultivares de soja nodulados, submetidos a

diferentes períodos de inundação do sistema radicular (A) e dos cultivares

BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de

recuperação do sistema radicular, após nove dias de inundação, sendo


Em relação à variável massa seca de folhas (Wf), não houve ajuste de curva

de regressão, tampouco diferença entre os cultivares de soja para os tratamentos de

inundação e recuperação. A comparação de médias entre os dias de inundação

demonstrou que houve redução significativa somente aos 12 DAI. Por outro lado,

aos nove e 12 DAI, os valores observados foram inferiores aos do controle,

evidenciando um efeito prejudicial da hipoxia sobre Wf (Fig. 4A). Os resultados

obtidos concordam com os trabalhos de Sá et al., (2004), que avaliaram o efeito da

velocidade de rebaixamento do nível freático no desenvolvimento e na produtividade

I = -0.039283x +0.9544

*R 2 = 0,76

0.30

0.75

1.20

3 6 9 12


A

C = 0.0279x - 0.1920

*R 2 = 0,95

REC = 0.0353x - 0.2851

*R 2 = 0,92

0.2

0.9

1.6

1 2 3 9


//

// //

B

C = 0.0456x - 0.4153

*R 2 = 0,92

REC = 0.0417x - 0.4190

*R 2 = 0,87

0.2

0.9

1.6

1 2 3 9

Periodo de Rcuperação (Dias)

// //

//

C

34

de plantas de ervilha e Costa (2004) que comparou o comportamento do capim-

angola (Brachiaria mutica) e canarana verdadeira (Echinochloa polystachya) sob

alagamento e Dias-Filho (2006), que avaliou as respostas morfológicas de Brachiaria

spp. ao alagamento do solo. Após drenagem dos vasos, houve incremento da

massa seca das folhas com o avanço do período de recuperação, equivalendo ao

controle nos primeiros dias de supressão do estresse hipóxico (Fig. 4B), mostrando

ganho de massa seca de folhas assim como Fries, (2003) observaram em plântulas

de milho.

Figura 4 – Massa seca de folhas de cultivares de soja nodulados, BRS-153 e BRS-

154, submetidos a diferentes períodos de inundação (A) e de recuperação

do sistema radicular após nove dias de inundação (B).

(controle) e (inundado ou recuperação).

*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,

não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,

n=4.

O déficit de oxigênio também influenciou a razão entre a massa seca da

parte aérea e a massa seca do sistema de raízes (PA/SR) no período de inundação,

não ocorrendo diferença de resposta entre os cultivares. O aumento da razão PA/SR

ocorreu após o terceiro dia de inundação, intensificando-se com o avanço do

período de tratamento hipóxico (Fig. 5A), o que demonstra maior efeito inibitório do

crescimento do sistema radicular em relação à parte aérea. Após a drenagem dos

vasos, houve decréscimo da razão PA/SR ao longo dos dias. O cultivar BRS – 154

teve razão PA/SR equivalente ao controle no terceiro dia de retorno à normoxia, ao

passo que BRS – 153 foi equivalente às plantas controle somente no nono dia de

1.2

1.4

1.6

1.8

3 6 9 12


Aa Aa

Aa

Aa

Aa

Ab

Bb

Aa

A

1.2

1.5

1.8

1 2 3 9


Aa Aa

Aa

Aa

Aa

Bb

//

//

Aa Aa

//

B

35

recuperação (Fig. 5B e 5C). Segundo Jackson e Drew (1984) a redução da taxa de

crescimento radicular é a primeira resposta ao estresse por excesso de água no

solo. O metabolismo das raízes é rapidamente restringido quando a concentração de

oxigênio no solo diminui a níveis críticos, o que não ocorre na parte aérea das

plantas. Na parte aérea, a assimilação e o metabolismo respondem lentamente à

inundação do solo (MUSGRAVE; VANHOY, 1989).

Figura 5 - Razão entre a massa seca da parte aérea (PA) e do sistema de raízes de

dois cultivares de soja nodulados submetidos a diferentes períodos de

inundação (A) e dos cultivares BRS-153 (B) e BRS-154 (C) em diferentes

períodos de recuperação do sistema de raízes após nove dias de

inundação, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).

*P≤0,05; n=4.

I = 0.4588x + 2.7288

*R 2 = 0,81

C = 0.2415x + 3.0888 *R 2 = 0,59

3

7

11

3 6 9 12


A

REC = -0.0271x +0.9968

*R 2 = 0,71

C = -0.0139x + 0.8917 *R 2 = 0,78

3

7

11

1 2 3 9


// //

//

B

REC = -0.0258x + 1.0112

*R 2 = 0,79

C = -0.0275x + 1.0200 *R 2 = 0,92

3

7

11

1 2 3 9


//

// //

C

36

O caráter massa seca de vagens (Wv) foi influenciado pela interação entre o

fator inundação ou drenagem, período de tratamento e cultivar. Não houve ajuste de

curva de regressão para o período de inundação, de modo que foi realizado teste de

médias para comparar, entre si, os dias de alagamento e os regimes hídricos. Aos

três e seis DAI ocorreu acréscimo em Wv das plantas inundadas em relação ao

controle para os dois genótipos. Entretanto, aos nove DAI, a Wv de BR-153 foi

inferior ao controle, o que se repetiu aos 12 DAI, ao passo que, para BR-154, essa

resposta só foi observada no período mais alto de inundação (Fig. 6A e 6C). Com a

drenagem das plantas foi pequena diminuição do acúmulo de Wv em BRS-153,

sendo este efeito mais acentuado em BRS-154 nos tempos iniciais de drenagem,

revertendo-se até o nono dia de recuperação da inundação (Fig. 6B e 6D).

Figura 6 – Massa seca de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B)

e BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e



0.0

1.5

3.0

3 6 9 12


Bb

Bb

Ab Ab

Aa Aa

Aa

Ba

A

C = 0.1149x + 2.3649

*R 2 = 0,79

REC = 0.1402x + 2.1823

*R 2 = 0,97

0.5

2.5

4.5

1 2 3 9

Periodos de Recuperação (Dias)

//

//

//

B

0.0

1.5

3.0

3 6 9 12


Aa

Aa

Ab

Ca

Cb

Cb

Ba

Ba

C

C = 0.1472x + 1.4610

*R 2 = 0,91

REC = 0.1762x + 0.9104

*R 2 = 0,91

0.5

2.5

4.5

1 2 3 9


//

//

//

D

37

* Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,

não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05) para período e regime hídrico respectivamente. (B

e D) *P≤0,05; n=4.

A variável número de vagens por planta foi influenciada, em ambos os

experimentos, pela interação entre o fator inundação ou drenagem, período de

tratamento e genótipo. Aos três DAI, BR-153 aumentou o número de vagens em

relação ao controle, com posterior decréscimo, principalmente aos nove e 12 DAI.

Enquanto isso, BR-154 teve redução no número aos três DAI com subseqüente

incremento que permitiu alcançar valores próximos ao controle até os nove DAI,

apresentando, aos 12 DAI, severa diminuição na quantidade de vagens por planta

(Fig. 7A e 7C). No primeiro dia de recuperação pós-hipoxia, os dois cultivares

atingiram os valores do controle. Entretanto, o aumento nos dias após a drenagem

dos vasos causou redução do número de vagens, efeito intensificado no cultivar

BRS – 154 (Fig. 7B e 7D). Os resultados obtidos estão de acordo com Barni e Costa

(1975) que ao estudarem efeitos de períodos de inundação do solo sobre o

rendimento grãos de soja, perceberam que o componente de rendimento que mais

decresceu foi o número de vagens por planta e neste mesmo trabalho evidenciaram

que o período mais sensível ao alagamento foi o florescimento.

38

Figura 7 – Número de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e




Os resultados obtidos no presente trabalho revelam que dependendo do

período de exposição ao estresse hipóxico e recuperação pós-hipóxia, existe

diferenciação no comportamento das plantas, sendo influenciado pelo genótipo de

cada espécie. Em função disso, as características de crescimento como diâmetro do

caule, volume do sistema de raízes, massas secas de raiz, massa seca de folhas,

massa seca de vagens, número de vagens e razão da parte aérea e sistema radical

foram eficientes para diferenciar a adaptação dos cultivares submetidos a estas

condições desfavoráveis.

I = -0.0142x + 1.0344

*R 2 = 0,69

C = 0.0098x + 0.8406

*R 2 = 0,50

2

9

16

3 6 9 12


A

Rec = -0.0449x 2 - 0.7019x + 10.6898

*R 2 = 0,82

6

11

16

1 2 3 9


//

//

B

I = -0.0051x 2 + 0.0931x + 0.5440

*R 2 = 0,72

C = 0.0418x + 0.5982

*R 2 = 0,85

2

9

16

3 6 9 12 Periodo de Inundação (Dias)

C

C= -0.808x 2 +0.9695x + 9.6587

*R 2 = 0,66

REC = 0.0512x 2 - 0.7424x + 10.7974

*R 2 = 0,73

6

11

16

1 2 3 9

Periodo de Recuração (Dias)

//

//

//

D

39

No que concerne a influência do tratamento hipóxico sobre as diferentes

características de crescimento, as relacionadas ao sistema radical sofreram maior

inibição em relação às pertinentes à parte aérea, não ocorrendo diferença

expressiva nas respostas dos genótipos analisados frente ao tratamento hipóxico ou

período de recuperação pós-hipoxia para a maioria dessas carcterísticas.

O alagamento por sete dias no estádio R2 em dois genótipos de soja reduz

significativamente o acúmulo de massa seca durante o período de tratamento e a

retomada do crescimento das plantas após supressão da hipoxia. O efeito inibitório

desse curto período de tratamento reflete na produção de grãos, que oscila entre 40

e 52% para os genótipos testados (OOSTERHVIS et al., 1990).

O período de nove dias de inundação foi suficiente para causar redução do

crescimento dos genótipos BRS-153 e BRS-154. No entanto, o efeito inibitório sobre

as características avaliadas foi revertido após três dias de drenagem para a maioria

das variáveis. O número de vagens por planta consistiu na característica mais

influenciada negativamente, durante o período de drenagem. No entanto, não é

possível afirmar se tal influência pode refletir em diferenças de rendimento,

sobretudo em BRS-154, onde o efeito inibitório foi mais intenso. Diferentemente

deste trabalho, Scott et al., (1990) afirma que ocorreu a recuperação do crescimento

de oito genótipos de soja, após sete dias de inundação, iniciada no estádio R2,

sendo retomada após um período superior a 14 dias, resulta em grande decréscimo

da produção de grãos, inclusive quando comparado à inundação por igual período,

nos estádios V1 e V4.

40

4 CONCLUSÕES

Os resultados permitiram concluir que a recuperação do estresse hipóxico

depende do estádio de desenvolvimento em que as plantas são submetidas ao

alagamento e esta resposta é dependente do cultivar, indicando que alguns

cultivares são mais tolerantes ao alagamento do que outras quando o tratamento é

aplicado sob determinado estádio.

As características de crescimento avaliadas são influenciadas pelo

tratamento de inundação e de recuperação quando conduzidos no estádio R2 nos

cultivares BRS-153 e BRS-154.

O cultivar BRS-154 é mais eficiente na produção de estruturas adaptativas

no caule, quando comparada com o cultivar BRS–153

Ambos os genótipos tem períodos críticos para início de resposta inibitória

por inundação ou de recuperação após drenagem, seis e três dias, respectivamente.

41

CAPÍTULO II

ATIVIDADE DA ALANINA AMINOTRANSFERASE E TEOR DE

COMPOSTOS NITROGENADOS EM RAÍZES E NÓDULOS DE GENÓTIPOS DE

SOJA SUBMETIDOS A DIFERENTES PERIODOS DE HIPOXIA E PÓS-HIPOXIA

42

1 INTRODUÇÃO

A soja é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China

(EVANS, 1996) e apresenta variabilidade genética para tolerar o excesso de

umidade no solo (THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).

A deficiência de O2 no sistema radicular causa uma série de efeitos em

processos bioquímicos e fisiológicos, como inibição da fixação de N2 (AMARANTE e

SODEK, 2006), diminuição do transporte de fotoassimilados às raízes e redução da

taxa fotossintética (HSU et al., 1999) e inibição da absorção de N e outros minerais

(SALLAM e SCOTT, 1987).

As diferentes espécies vegetais podem dispor de mecanismos adaptativos

para suportar ou mesmo superar o estresse hipóxico causado pelo alagamento,

devido aos mecanismos de adaptações morfofisiológicas como formação de

aerênquima (VARTAPETIAN e JACKSON, 1997; THOMAS et al., 2005), e

adaptações metabólicas como interconversões de aminoácidos (REGGIANI et al.,

1988; SOUSA e SODEK, 2003), síntese de polipeptídeos anaeróbicos (SACHS,

1980) e regulação do metabolismo de carboidratos (BAILEY-SERRES e

VOESENEK, 2008).

O metabolismo de aminoácidos é severamente alterado durante anoxia

(RICARD et al., 1994) e a habilidade das raízes para tolerar o ambiente anaeróbio,

quando o oxigênio não pode ser transportado da atmosfera, está associada com a

capacidade de modificar seu metabolismo. Durante a hipoxia, as composições de

aminoácidos nos tecidos de raízes e em seiva do xilema de plantas de soja

mudaram substancialmente, onde a alanina foi produzida relativamente em grandes

quantias, tornando-se um dos mais abundantes aminoácidos em raízes (SOUSA e

SODEK, 2003).

43

A principal via de síntese da alanina sob hipoxia não é inteiramente

entendida. Vários estudos demonstram aumentos expressivos na atividade da

alanina aminotransferase (AlaAT; E.C 2.6.1.2) sob deficiência de oxigênio (GOOD e

CROSBY 1989; SOUSA e SODEK, 2003; MIYASHITA et al., 2007). A AlaAT catalisa

a reação reversível da interconversão do piruvato e glutamato à alanina e 2-

oxoglutarato, participando então tanto do metabolismo do carbono quanto do

metabolismo do nitrogênio (VEDAVATHI et al., 2004) sendo atribuído à esta enzima

grande importância na adaptação metabólica da planta para tolerância à deficiência

de oxigênio (RICOULT et al., 2005).

O período inicial da recuperação após o estresse por falta de oxigênio pode

ser crucial na sobrevivência das plantas. Apesar da maioria das injúrias acontecer

durante o período de estresse, danos também ocorrem no retorno das plantas às

condições normais de oxigênio (VAN TOAI e BOLLES, 1991).

O presente trabalho teve como objetivo avaliar as variações dos teores de

compostos nitrogenados e a atividade da enzima alanina aminotransferase (AlaAT)

em raízes e nódulos de genótipos de soja submetidos a diferentes períodos de

hipoxia e retorno à normoxia.

44
















que necessário.

O tratamento de inundação do sistema de raízes, foi efetuado no estádio de

desenvolvimento R2 (FEHR et al.,1971) procedeu-se à aplicação, impedindo-se a

drenagem natural dos vasos por meio do encaixe de um segundo vaso não

perfurado sob o vaso contendo as plantas e aplicando-se solução nutritiva diluída

três vezes, de forma a se manter uma lâmina de 20mm sobre a superfície do

substrato. As plantas permaneceram inundadas por 12 dias, porém, aquelas

destinadas à avaliação do período pós-hipoxia foram drenadas no nono dia após

inundação (DAI), pela retirada dos vasos não perfurados. O teor de O2 foi

monitorado na solução nutritiva e na solução drenada dos vasos, usando um

oxímetro (Handylab OX1).

45

No experimento de inundação foram coletados material para análise aos

três, seis, nove e doze dias de tratamento. No experimento de recuperação, as

coletas do material foram feitas após um, três e nove dias de tratamento.

A seiva do xilema foi coletada para a dosagem de ureídeos, após cortar o

caule da planta em forma de bisel, logo abaixo do nó cotiledonar conforme descrito

por McCLURE e ISRAEL (1979). Os exsudatos foram coletados por até uma hora,

com o uso de microcapilares de vidro, e transferidos para tubos eppendorf em banho

de gelo até o armazenamento final sob temperatura de -18ºC. Os tecidos foram

coletados do terço inferior do sistema radicular, lavados em água corrente e em

água destilada gelada, retirando-se o excesso de umidade com papel toalha.

As amostras de raízes (2g) e de nódulos (0,5g) foram armazenadas sob

temperatura de aproximadamente -86ºC, para posterior dosagem da atividade de

AlaAT e determinação da concentração de proteínas totais e aminoácidos totais.

A extração da AlaAT de amostras dos tecidos de raízes e nódulos foi

realizada a 4ºC, sendo maceradas em almofariz previamente resfriado. A maceração

de raízes foi realizada na presença de aproximadamente 100mL de N2 líquido,

utilizando PVPP a 5% p/pMF, 10mL de tampão extração (Tris-HCL 50mM, pH7,5

contendo DTT 1mM). Após serem maceradas, foram filtradas em 8 camadas de

gaze umedecidas com tampão de extração e centrifugadas a 10.000g, entre 2 e 4ºC

por 20min. Do sobrenadante centrifugado retirou-se uma alíquota de 2,5mL para

dessalinização por cromatografia de exclusão em coluna de Shephadex G-25 médio

(PD 10; Amersham Pharmacia Biotech). O extrato eluído foi utilizado para os

ensaios enzimáticos.

A atividade da enzima AlaAT (EC 2.6.1.2) foi determinada no sentido da

formação do piruvato, por meio do acoplamento de duas reações (alanina →

piruvato→lactato), utilizando cubetas descartáveis de 4mL de polimetilmetacrilato. O

meio de reação em volume final de 3mL continha: Ala 10mM; α-KG 5mM; β-NADH

0,2mM; Tris - HCL - pH7,5 - 50mM e 5 unidades da proteína LDH. As cubetas

contendo tampão de dosagem, Ala, α-KG e β-NADH, foram previamente incubadas

no sistema de aquecimento Peltier a 30 ºC. A reação era iniciada pela adição do

extrato enzimático e da LDH no meio de reação. As leituras de queda de

absorbância a 340nm foram registradas em intervalos de 10seg em

espectrofotômetro PG - Instruments.

46

A extração dos metabólitos de raízes e de nódulos foi realizada conforme

BIELESKI e TUNER (1966). Os tecidos das raízes (com N2 líquido) e nodulares

foram macerados em almofariz e homogeneizados com solução extratora “MCW”

(metanol: clorofórmio: água; proporção 12:5:3), empregando 10mL g-1, e transferidos

para frascos âmbar, permanecendo em repouso por 24h. Posteriormente, as

amostras foram centrifugadas a 2.000rpm por 30min. A fração do sobrenadante foi

recuperada em proveta e por 4mL, acrescentando 1,0mL de clorofórmio e 1,5mL de

água pura (Milli-Q), sendo agitadas em seguida e deixadas em repouso por 24h

para a separação das fases. A fase aquosa (superior) foi coletada e evaporada em

banho-maria a 38,8 ºC por 15h para eliminação do resíduo de clorofórmio e

concentração das amostras. A fase do clorofórmica (inferior) foi descartada. As

amostras concentradas tiveram seu volume mensurado e armazenadas em tubos

eppendorf sob temperatura de -18 ºC. O precipitado foi resuspenso em 10mL de

NaOH 0,1 N e homogeneizado em vórtex. Após 24h em repouso, estes extratos

foram centrifugados a 2.000rpm por 30min e coletado o sobrenadante contendo a

porção protéica (BUENO, 1989), sendo armazenado a -20 ºC para posterior

dosagem de proteínas.

A detrminação de proteínas totais foi realizada conforme metodologia

descrita por BRADFORD, (1976). Em nódulos as proteínas totais foram dosadas

pelo método padrão, utilizando amostras e padrão BSA (soroalbumina bovina, fração

V) em quantidades variando entre 0 e 100µg em volume de 0,1mL, acrescidos de

5,0mL de reagente de cor (Coomasie Brilliant G 250, 100mg em 50mL de etanol

95% e 100mL de H3PO4 85% p/v ). Para raízes foi utilizado o micrométodo, com o

padrão de BSA em quantidades variando de 0 a 20 µg de proteína /0,1mL, por 1mL

de reagente de cor. Após a adição do reagente de cor sobre as amostras e padrões,

os tubos foram agitados para posterior leitura das densidades ópticas (D.O.) a

595nm.

A dosagem de aminoácidos solúveis totais (AA) foi realizada pelo método de

YEMM e COCKING (1955), usando 1mL de cada amostra de raízes e nódulos e/ou

dos padrões de leucina (0-200nmol mL-1), devidamente diluídas, de um branco

(água) em tubos de ensaio, acrescentando-se 0,5mL de tampão citrato 0,2M pH5,0,

0,2mL de reativo de ninhidrina 5% em metil-celusolve, 1mL KCN-2% em metil-

celusolve e após agitação, cobrindo-se os tubos com bolas de vidro, sendo

47

incubados em banho-maria a 100 ºC por 20min e posteriormente transferidos para o

escuro até atingir temperatura ambiente. Após resfriamento foi acrescentado 1,3mL

de etanol 60% por tubo, sendo novamente agitados para posterior leitura de D.O. a

570nm.

A dosagem de ureídeos do exsudatos de xilema foi realizada pelo método

VOGELS e van der DRIFT, (1970). O volume 250µL de amostras de seiva ou dos

padrões de alantoína (0-150nmol mL-1), devidamente diluídos, um branco (água)

foram transferidos para tubos de ensaio, acrescentando-se 0,5mL de água destilada

0,25mL de NaOH 0,5N. Em seguida os tubos foram tampados com bolas de vidro e

levados ao banho-maria a 100 ºC por 8min e resfriados em água corrente,

posteriormente foi acrescentado 0,25mL de HCl 0,65N. Os tubos foram então

aquecidos a 100 ºC por 4 min e novamente resfriados para a adição de 0,25mL de

tampão fosfato (Na2HPO4-KH2PO4, 0,4M pH7,0) mais 0,25mL de fenilhidrazina

0,33%. Após repouso por 5 min, os tubos foram submetidos a banho de gelo para

adição de 1,25mL de HCl concentrado a 0 ºC, 0,25mL K3Fe(CN)6 1,65% e agitados

em vórtex. Após 15min, as amostras foram lidas em D.O de 535nm.

O delineamento adotado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2

x 2 x 4 (genótipos; regime hídrico, períodos de inundação) ou 2 x 2 x 3 (genótipos;

regime hídrico, períodos de drenagem após inundação) com quatro repetições,

sendo a unidade experimental constituída de um vaso com duas plantas. Após

análise de variância dos dados referentes ao experimento de inundação, nos casos

significativos, foram ajustadas equações de regressão e quando não houve ajuste,

as médias foram comparadas pelo teste de médias de Tukey, a 5% de probabilidade

(GOMES, 1990). A análise estatística foi realizada com auxílio do pacote estatístico

SAS (SAS, 2002). Este último procedimento foi adotado para os dados referentes ao

experimento de drenagem.

48

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O teor de oxigênio foi monitorado ao longo do experimento de inundação,

sendo obtidos valores entre 84 e 96% na solução nutritiva utilizada para inundar as

plantas, e entre 7 e 13% na solução drenada dos vasos 24h após alagamento,

permanecendo em níveis próximos durante todo o experimento, caracterizando a

condição de hipoxia no sistema em estudo.

A inundação do sistema radicular causou decréscimo do transporte de

ureídeos na seiva de xilema, mostrando efeitos distintos entre os genótipos durante

o período de alagamento e drenagem dos vasos (Fig. 1A e 1C). Aos três dias de

tratamento, houve pequena queda no transporte de ureídeos no cv. BRS 153 e

acentuada no cv. BRS 154. O efeito mostrou-se intensificado aos seis dias de

tratamento, aumentando a partir do nono dia de inundação até o último dia de

avaliação. Em soja nodulada, o transporte de N no xilema é caracterizado pelos

ureídeos, ácido alantóico e alantoína, que representam até cerca de 80% do N

translocado (McCLURE e ISRAEL, 1979), considerados produtos específicos da

fixação de N2 (McCLURE et al., 1980), sendo usados como indicadores da eficiência

da fixação de N2, sendo que altas concentrações em leguminosas estão usualmente

associadas à nodulação efetiva e elevadas taxas de fixação de N2 (BERKUM et al.,

1985; HERRIDGE et al., 1990). Os ureídeos dosados na seiva do xilema

decresceram significativamente em soja nodulada sob alagamento por um período

de cinco dias (PUIATTI e SODEK, 1999), confirmando os resultados deste

experimento. Períodos inferiores a uma hora de alagamento do sistema de raízes

foram suficientes para reduzir em mais de 90 % o teor de ureídeos totais na seiva,

mantendo estes teores durante as 96h de avaliação (AMARANTE e SODEK, 1999).

49

O grande decréscimo do transporte de ureídeos ao longo do experimento deve estar

relacionado à inibição da fixação de N2 devido à deficiência de O2 nos nódulos, uma

vez que a difusão do O2 na água é cerca de 1.000 vezes menor do que no ar

(ARMSTRONG et al., 1994) e a barreira de difusão de O2 presente no nódulo

(GUASH et al., 2001) potencializa esse efeito. Por outro lado, o pequeno aumento

nos ureídeos totais na seiva observado no nono dia de tratamento foi propiciado

possivelmente por meio da formação de aerênquimas, facilitando as trocas gasosas

e com isso a fixação de N2 (THOMAS et al., 2005), porém diferente do observado

nesse trabalho, onde a formação de aerênquima tornou possível a reversão do

processo de fixação de N2 entre sete e dez dias após inundação das plantas.

A drenagem dos vasos possibilitou a retomada da fixação de N2 em ambos

os genótipos, em níveis equivalentes ao controle, em período superior a 24h de

tratamento, demonstrando que nove dias de inundação são capazes inibir

severamente a atividade fixadora dos nódulos, não sendo entretanto, um processo

irreversível. A forma de recuperação da fixação de N2 foi diferenciada entre

genótipos, uma vez que no cv. BRS-154 as concentrações de ureídeos totais

permaneceram superiores ao controle durante todo o período de drenagem avaliado

e em BRS 153 os teores foram aquivalentes ao controle no nono dia de avaliação

(Fig. 1C e 1D).

50

Figura 1 – Teores de ureídeos totais em seiva de xilema de genótipos de soja

nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes

períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias

de déficit de O2, sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05;

n=4.

O teor de aminoácidos totais em raízes aumentou com o tratamento

hipóxico, sendo um efeito comum em ambos os genótipos, porém diferenciado ao

longo do período de inundação. No cv. BRS-153 aumentos expressivos foram

detectados no sexto dia de inundação, ao passo que em BRS-154 esse efeito foi

prolongado até nove DAI (Fig. 2A e 2B). Em raízes de plantas de arroz o aumento

dos níveis de aminoácidos totais ocorre das primeiras oito horas de exposição ao

estresse por anoxia até as 48h, caracterizando-se um mecanismo adaptativo, onde a

alanina é o aminoácido majoritário em raízes nestas condições (REGGIANI et al.,

2000).

I = 0.1851x 2 - 3.1232x + 14.0603

*R 2 = 0,82

C = 0.0455 x 2 - 0.8818x + 9.2312

*R = 0,75

-5

25

55

3 6 9 12


A I = -1.7945x

2 +19.5239x -6.5479

*R 2 = 0,78

0

23

45

1 2 3 9


//

//

B

I = 0.1150x 2 - 1.8073x + 8.0056

*R 2 = 0,75

C = 0.0539x 2 - 0.9612x + 9.1759

*R 2 = 0,90

-5

25

55

3 6 9 12


C

I = -1.4650x2 +17.7680x + 0.0231

*R 2 = 0,75

0

23

45

1 2 3 9


//

//

D

51

O acúmulo de aminoácidos totais em tecidos de plantas submetidas a

estresse por deficiência do oxigênio é descrito em vários trabalhos (STREETER e

THOMPSON, 1971; BERTANI e BRAMBILLA,1982 e REGGIANI et al., 1985).

A maioria dos estudos conduzidos com plantas nas quais as raízes são

submetidas à deficiência de O2 tem revelado aumentos nos teores e interconversão

entre os aminoácidos (FAN et al., 1997; REGGIANI et al., 2000). Entre estes a

Alanina (Ala) é fortemente acumulada em respostas à anaerobiose, alcançando 31-

32% da fração de aminoácidos solúveis em arroz, sendo o terceiro principal produto

da fermentação (REGGIANI et al., 1985) e o principal aminoácido transportado e

acumulado em raízes de soja sob deficiência de oxigênio (PUIATTI e SODEK, 1999;

SOUZA e SODEK, 2003; THOMAS et al., 2005).

A interconversão entre aminoácidos auxilia na regulação do pH celular em

órgãos de plantas sob deficiência de O2, sendo esta característica considerada

determinante na sobrevivência das espécies à anoxia (STREETER e

THOPMPSON,1972a,b; FAN et al., 1988; REGGIANI et al., 1988; CRAWGORD et

al., 1994; FAN et al., 1997 e REGGIANI, 1999).

No período de recuperação não houve diferença nos teores de aminoácidos

totais em raízes entre cultivares, nem ao longo do tempo de recuperação pós-

hipoxia nas plantas submetidas à inundação (Fig. 2C).

Figura 2 – Teores de aminoácidos totais em raízes de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 (A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de

hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical (C), após nove dias de déficit de

O2, sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05; n=4.

C = -0.0045x2 + 0.0762x + -0.3000

*R 2 = 0,91

I = -0.0041x 2 + 0.0529x -0.0808

*R 2 = 0,73

0.50

1.00

1.50

3 6 9 12

Período de Inundação (Dias

A

C = - 0.0005x2 + 0.0160x - 0.14491

*R 2 = 0,45

I = - 0.0064x 2 + 0.0935x - 0.2708

*R 2 = 0,74

0.50

1.00

1.50

3 6 9 12


B

0.80

0.90

1.00

1 3 9


Aa

Aa

Aa

Aa

Bb

ABa

C

52

*P≤0,05. (C) Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas

entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente; n=4.

A condição de hipoxia causou decréscimo da concentração de aminoácidos

nos nódulos, sugerindo ser este resposta resultante da diminuição de seu

metabolismo (Fig. 3A e 3C). O nódulo é muito mais sensível à disponibilidade de

oxigênio do que as raízes, devido à presença de uma barreira variável à difusão de

oxigênio, que deixa o teor interno de oxigênio praticamente no limite para o

funcionamento eficiente da fixação de N2 (SODEK, 2001).

Os nódulos da soja podem suportar a inundação até 21 dias (PANKHURST

e SPRENT, 1975; DAKORA e ATKINS, 1989) devido também ao desenvolvimento

de aerênquima e a recuperação parcial do metabolismo do nitrogênio em nódulos do

sistema radical da soja, após um prolongado período de inundação (THOMAS et al.,

2002)

O efeito de diferentes concentrações de O2 sobre a atividade da nitrogenase

em nódulos de tremoço é atribuído à concentração interna de O2 no nódulo, sendo o

fator limitante à fixação de N2 e podendo manter sua atividade nos nódulos sob

condições hipóxicas, caso não seja muito prolongada (GUASH et al., 2001).

No período de retorno à normoxia a quantidade de aminoácidos totais em

nódulos não foram superiores ao seu controle, sugerindo rápida exportação do N

recém fixado, pois, grande parte dos aminoácidos sintetizados nos nódulos da soja

são destinados à produção de ureídeos, que correspondem à cerca de 80 % do N

exportado via xilema (McCLURE e ISRAEL, 1979, McCLURE et al., 1980) (Fig. 3B e

3D).

53

Figura 3 – Teores de aminoácidos totais em nódulos de genótipos de soja, BRS-153

(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia

e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O2,

sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05; n=4.



n=4.

A variação do teor de proteínas totais em raízes durante o período de

tratamento hipóxico foi equivalente entre os cultivares avaliados. Nos primeiros três

dias de hipoxia foi verificado um acréscimo da síntese de proteínas totais em raízes,

seguido de decréscimo aos seis e retornando a concentrações superiores ao seu

controle nos demais períodos de tratamento (Fig. 4A). No entanto, em duas

cultivares contrastantes de milho, a cultivar Saracura (tolerante) apresenta teores de

proteína total mais elevada nas raízes que seu controle por até 48h, sugerindo que

2

5

8

3 6 9


Ca

Cb

Aa

Ab

Ba

Bb

A

4

7

10

1 3 9 Período de Recuperação (Dias)

Cb

Ab

Aa Aa

Ba

Bb

//

//

//

B

2

5

8

3 6 9


Aa

Ca

Ba

Cb

Bb

Ab

B

4

7

10

1 3 9


Aa

Cb

Ba

Bb

Ba

Ab

//

//

//

D

54

algum mecanismo é acionado, favorecendo a síntese ou protegendo as proteínas da

degradação (LOPES et al., 2005).

Por outro lado, o teor de proteínas no sistema radical da soja nutrida com

nitrato aumenta significativamente após 4 dias de tratamento, tanto em normoxia

como durante a hipoxia. Porém, em condições de hipoxia o aumento é bem mais

expressivo e na recuperação, a concentração de proteínas cai para um valor

próximo aos das plantas sob normoxia (BRANDÃO, 2005).

O estresse anaeróbico induz mudanças tanto no teor quanto no padrão de

proteínas (SACHS et al., 1980). Dessa maneira, geralmente espécies tolerantes ao

déficit de oxigênio conseguem manter o nível protéico, mediante a síntese de

polipepetídeos anaeróbicos, compensando, com isso, a repressão de proteínas

aeróbicas (ZHANG et al., 1994; SACHS et al., 1996).

Figura 4 – Teores de proteínas totais em raízes de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia do

sistema radical, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).

*P≤0,05; n=4.

Em nódulos a resposta das plantas em relação ao acúmulo de proteínas foi

similar ao ocorrido em raízes, não ocorrendo diferenças entre genótipos (Fig. 5A).

Após a drenagem dos vasos, no primeiro dia, houve um decréscimo da

concentração de proteínas totais, atingindo no sexto dia concentrações equivalentes

ao seu controle (Fig. 5B).

I = 0.0131x 2 - 0.2166x + 0.6263

*R 2 = 0,93

C = -0.0097 x 2 + 0.1623x -0.7959

*R 2 = 0,68

0.0

0.8

1.5

3 6 9 12


A

55

Figura 5 – Teores de proteínas totais em nódulos de genótipos de soja nodulada,

BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia (A) e

pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O2 (B), sendo



não diferem entre si pelo teste de Tukey a P≤0,05, para período e regime hídrico respectivamente.

*P≤0,05, n=4.

A atividade da alanina aminotransferase (AlaAT) em raízes foi estimulada

pelo tratamento hipóxico, variando ao longo do período e entre os cultivares

avaliados. Nos primeiros dias de hipoxia houve incremento na atividade da AlaAT

em raízes. O cultivar BRS–153 teve ncremento da atividade no terceiro dia de

inundação, seguido de grande elevação no sexto DAI em relação às plantas sob

normoxia. No entanto, aos nove DAI a atividade decresceu a níveis equivalentes ao

seu controle. Em cevada (GOOD e CROSBY, 1989a) e soja não-nodulada (SOUSA

e SODEK, 2003), também ocorre a máxima atividade da AlaAT aos seis dias de

tratamento. Da mesma forma a atividade da AlaAT em raízes de milho, trigo e

centeio aumenta sob condição de anaerobiose (GOOD e CROSBY, 1989b). O

cultivar BRS-154 também incrementou a partir dos 3 dias DAI, porém, com menor

atividade de AlaAT que em BRS-153, atingindo elevação máxima no sexto dia de

alagamento, e pequeno decréscimo nos tempos posteriores, mas sempre superior

ao seu controle até os 12º dia de inundação (Fig. 6B). A indução de AlaAT em

resposta a condições de baixo teor de oxigênio é constatada também em plantas

milho (MUENCH et al., 1998) e Araibdopsis thaliana (MIYASHITA et al., 2007).

1.0

1.8

2.5

3 6 9


Aa

Aa

ABa

Ba

Ba

Cb

A

1.2

1.5

1.8

1 3 9


Ab

Aa

Ba

Aa

Ba

Ca

B

56

Durante o período de pós-hipoxia não houve diferença da atividade da AlaAT

entre os cultivares, mas ocorreu interação entre o tratamento de recuperação e

período, demonstrando no primeiro dia de drenagem, atividade superior ao controle

das plantas previamente submetidas à hipoxia (Fig. 6C).

A atividade da AlaAT em plantas mutantes de Arabidopsis thaliana, com o

intuito de identificar os potenciais benefícios em se alterar a expressão desta enzima

sob hipoxia através do uso de mutantes para a isoforma AlaAT1, buscaram

identificar o papel dessa enzima na produção da alanina, relacionando com a

sobrevivência das plantas ao estresse por hipoxia. Estes pesquisadores sugeriram

que a síntese de alanina independe da atividade da AlaAT, mas que sua atividade é

de extrema importância para a rápida conversão da alanina acumulada a piruvato

durante o período pós-hipóxico (MIYASHITA et al., 2007).

Em cevada a enzima AlaAT é a principal responsável pela produção de

alanina sob condições de hipoxia (MUENCH e GOOD, 1994). As raízes de plantas

de soja nutridas com nitrato, a atividade da AlaAT induzida durante a inundação não

está relacionada com o aumento da síntese de alanina, sendo foi atribuída a função

de reciclar a alanina acumulada no período de drenagem, suge que o papel principal

da enzima ocorre durante o período de recuperação (SOUSA e SODEK, 2003), o

mesmo ocorre em Arabodpsis (MIYASHITA et al., 2007).

Após o primeiro dia de recuperação ao estresse por hipoxia, ocorreu um

decréscimo, chegando ao nono dia com atividade inferior ao controle (Figura 4C).

Em plantas de soja não-noduladas ao retornarem à normoxia depois de 120h de

hipoxia reduz a atividade da AlaAT em 24h, alcançando valores de atividade a níveis

pré-hipóxicos em 96h (SOUSA e SODEK, 2003).

57

Figura 6 – Atividade da enzima alanina aminotransferase em raízes de genótipos de

soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B) sob hipoxia e pós-hipoxia do

sistema radical após nove dias de déficit de O2 (C), sendo (controle) e

(inundado ou recuperação).

*P≤0,05. (C) Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas

entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico

respectivamente; n=4.

A atividade da AlaAT em nódulos aumentou fortemente com o período de

hipoxia, sendo essa resposta diferenciada entre os genótipos. Dentre os períodos

avaliados, houve incremento na atividade em períodos superiores a três dias de

tratamento, sendo que a atividade da AlaAT no sexto dia de hipoxia foi mantida até o

nono dia de inundação para o genótipo BRS 153. No genótipo BRS 154 ocorreu um

acréscimo de atividade após seis dias de alagamento (Fig. 7A e 7B), diferente da

resposta observada em raízes durante o período de hipoxia. No entanto, no decorrer

do período pós-hipoxia a variação da atividade em nódulos foi similar ao das raízes

(Fig. 7C), não diferindo entre genótipos. A atividade da AlaAT em nódulos foi muito

superior ao encontrado nas raízes, em torno de 120 vezes mais elevadas no período

de inundação e 150 vezes superior no período de recuperação.

I = -0.0201x2 + 0.2412x -1.7850

*R 2 = 0,74

C = 0.0224x2 + 0.03321x-2.3694

*R 2 = 0,93

0.00

0.10

0.20

3 6 9 12


A

C = -0.0224x2 + 0.3311x -2.3706

*R 2 = 0.9461

I = -0.0140x2 + 0.2374x - 1.9821

*R 2 = 0,84

0.00

0.10

0.20

3 6 9 12


B

0.00

0.04

0.08

1 3 9


Bb

Ba

Aa

Aa

Ba

Cb

C

58

Figura 7 – Atividade da enzima alanina aminotransferase em nódulos de genótipos

de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B), sob hipoxia e pós-hipoxia

do sistema radical após nove dias de déficit de O2 (C), sendo (controle)

e (inundado ou recuperação).

*Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,

não diferem entre si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,

n=4.

3

9

15

3 6 9


Aa

Ab Ba Ab

Aa Aa

A

3

9

15

3 6 9


Aa

Ca Bb Bb

AaBa

B

3

6

9

1 3 9


Aa

AbBa

Ca

Ba

Ba

C

59

4 CONCLUSÕES

A fixação simbiótica de N2 é severamente inibida em plantas de soja dos

cultivares BRS-153 e BRS-154 sob alagamento, não sendo possível sua reversão

em níveis do controle via formação de aerênquima durante o período de nove dias

de tratamento, porém é plenamente restabelecida após 24h de drenagem.

A condição de hipoxia estimula fortemente o acúmulo de aminoácidos em

raízes e diminuição em nódulos.

A deficiência de oxigênio causa o aumento do teor de proteínas em raízes e

nódulos nos primeiros dias de alagamento nos genótipos BRS-153 e BRS-154, de

forma equivalente.

A atividade da enzima alanina aminotransferase é estimulada pelo

tratamento hipóxico em raízes e nódulos de soja dependendo do N fixado

simbioticamente, sendo bem mais intensa em nódulos e dependente de genótipos.

60

CAPÍTULO III

ATIVIDADE DA ENZIMA ÁLCOOL DESIDROGENASE E ALOCAÇÃO DE

CARBOIDRATOS NAS RAÍZES DE SOJA NODULADA DURANTE PERÍODO DE

HIPOXIA E RETORNO À NORMOXIA

61

1 INTRODUÇÃO

Na natureza as plantas são constantemente expostas a condições

ambientais desfavoráveis ao seu desenvolvimento. A deficiência de oxigênio

ocasionada por inundações temporárias devido a chuvas e irrigações pode-se tornar

freqüente em regiões de solos hidromórficos, também conhecidos como solos de

várzea, onde a drenagem é deficiente. Sua principal característica é o relevo

predominantemente plano e com freqüência associado a um perfil de camada

superficial pouco profunda e seguida de uma praticamente impermeável (PINTO et

al., 1999). A condição de hipoxia nesses ambientes impõe severas restrições ao

cultivo de espécies de importância econômica, uma vez que a maioria daquelas que

produzem grãos são mesófitas (PIRES et al., 2002). Neste contexto, enquadra-se a

cultura da soja, que, embora introduzida e melhorada para áreas bem drenadas no

Brasil, é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China (EVANS,

1996), porém com variabilidade genética para tolerar o excesso de umidade no solo

(VAN TOAI et al., 1994; THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).

O déficit de O2 causado pelo excesso hídrico causa a repressão da síntese

de polipeptídios aeróbicos e a indução da síntese de polipeptídios anaeróbicos

(SACHS et al., 1980), sendo a maioria desses polipeptídios identificada como

enzimas envolvidas na fermentação e metabolismo de açúcares-fosfatados, cuja

síntese é regulada em nível de transcrição e de pós-transcrição (DREW, 1997). O

oxigênio serve como aceptor de elétrons na fosforilação oxidativa que regenera o

ATP, principal fonte de energia para o metabolismo aeróbico celular e na sua

ausência, o metabolismo fermentativo é ativado com o propósito de manter a

produção de energia e agentes redutores através da regeneração do NAD+ (DENNIS

62

et al, 2000), que junto à alocação de açúcares tem função crucial na sobrevivência

de plantas sob anoxia (BOUNY e SAGLIO, 1996; DREW, 1997).

Durante o alagamento, a enzima lactato desidrogenase (LDH;EC) é ativada

produzindo lactato. Em estudos com ressonância magnética foi mostrado que o pH

citosólico acidifica-se durante o alagamento em raízes de milho (FOX et al, 1995). O

acúmulo do piruvato que iria ser metabolizada no ciclo de Krebs, induz a ativação da

lactato desidrogenase (LDH) produzindo lactato e o seu acúmulo vai reduzir o pH do

citossol de 7,2 a 6,8 e com o citossol mais ácido, a LDH é inibida e a enzima

piruvato descarboxilase (PDC) ativada produzindo acetaldeído que por sua vez é

extremamente reativo a membranas, sendo convertido pela álcool desidrogenase

(ADH) em etanol, principal produto da fermentação (DREW, 1997; HOLE et al.,1992;

SERRES, 2008 e TADEGE et al., 1999). Plantas que são mais tolerantes ao

alagamento têm a via de fermentação alcoólica mais ativa (DREW, 1997).

A enzima álcool desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) é uma das principais

enzimas fermentativas, que converte o acetaldeído em etanol, considerado menos

tóxico à planta por não causar danos à bicamada lipídica das membranas celulares

e por ser permeável, sendo translocado para fora da célula até a rizosfera. A

adaptação às condições de falta de oxigênio não requer somente um rápido

aumento nos níveis de enzimas da rota fermentativa, uma vez que a tolerância está

relacionada à capacidade de sustentar a fermentação sob períodos prolongados de

escassez de O2 (BOUNY e SAGLIO, 1996; CHANG et al., 2000).

Embora a maioria dos estudos são focados sobre os efeitos bioquímicos e

fisiológicos da hipoxia em relação à recuperação pós-hipoxia, o entendimento de

como os tecidos vegetais recuperam-se da deficiência de O2 é igualmente

importante para o entendimento da tolerância ao alagamento (FAN et al., 1988).

O objetivo deste trabalho foi analisar a alocação de carboidratos, junto à

atividade da enzima álcool desidrogenase no sistema de raízes de genótipos de soja

nodulada em condições de déficit de O2 e retorno às condições normais de

disponibilidade de O2.

63
















que necessário. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as

plantas foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio

mineral, na proporção de 250 mL vaso-1, duas vezes por semana.

No estádio de desenvolvimento R2 - flor no nó imediatamente abaixo do nó

mais alto com uma folha completamente desenrolada (FEHR et al.,1971) – foi

efetuada a inundação do sistema radical, submetendo as raízes à deficiência de O2.

Para tal a drenagem natural dos vasos por meio do encaixe do vaso contendo as

plantas em um outro, de mesmo modelo e não perfurado e irrigando com uma

solução nutritiva Hoagland diluída a 1/3 da concentração original, de forma a se

manter uma lâmina de 20mm sobre a superfície do substrato. O teor de O2 foi

64

monitorado na solução nutritiva e na solução drenada dos vasos por meio de um

oxímetro (Handylab OX1).

Os vasos dos experimentos de inundação e de recuperação foram

inundados simultaneamente e as coletas de raízes e nódulos para determinações

analíticas foram realizadas aos 3, 6, 9 e 12 dias após a inundação (DAI). Aqueles

destinados à avaliação de recuperação foram drenados no 9º DAI e o material

vegetal foi coletado no 1º, 2º, 3º e 9º dia após a drenagem (DAD).

As amostras foram coletadas do terço inferior do sistema radical, duas

amostras de 2g de raízes e duas amostras de nódulos, uma de 1g e outra de 0,5g e

foram lavadas com água destilada gelada para diminuir a atividade do metabolismo

do tecido. Após retirar o excesso de água com papel toalha, foram armazenadas sob

temperatura de aproximadamente -86 ºC, para posterior determinação da atividade

de ADH e das concentrações de sacarose, açúcares solúveis totais, polissacarídeos

solúveis em água e amido.

A extração da ADH foi realizada conforme descrito por Good e Crosby

(1989), com algumas modificações, e a dosagem com base na metodologia de Kato-

Noguchi e Watada (1997). A extração de ADH a partir de tecidos de raízes e nódulos

realizada a temperatura de 4 ºC, iniciada com a maceração das amostras em

almofariz e pistilo previamente resfriados. Foi adicionado cerca de 100mL de

nitrogênio (N2) líquido apenas nas amostras de raízes para facilitar a maceração,

seguido de PVPP (5% MF) e 5mL de tampão extração tris-HCl 50mM – pH 7,5,

contendo DTT 1mM para nódulos (0,5 g) e 10mL, do mesmo tampão para raízes

(2g). Após homogeneização, as amostras foram filtradas em 8 camadas de gaze

umedecidas com tampão de extração e centrifugadas a 10.000g, sob temperatura

oscilando entre 2 e 4 ºC por 20min. Do sobrenadante centrifugado foi retirado uma

alíquota de 2,5mL para dessalinização por cromatografia de exclusão em coluna de

sephadex G-25 M (PD-10), conforme instruções do fabricante (Amersham

Pharmacia Biotech) (Fig. 1).

Os tecidos destinados à extração de metabólitos foram inicialmente imersos

em N2 líquido, macerados em almofariz com auxílio de pistilo e em seguida

transferidos para vidros âmbar, onde foi adicionado 20mL de MCW

(metanol:clorofórmio:água; proporção de 12:5:3) em cada frasco (BIELESKI e

TUNER, 1966) e homogeneizados, permanecendo em repouso por 24h. Decorrido

65

esse tempo, as amostras foram centrifugadas a 2000rpm por 30min. A fração do

sobrenadante foi recuperada em proveta e para cada 4mL, acrescentou-se 1,0mL de

clorofórmio e 1,5mL de água Milli-Q, seguido de agitação e posterior repouso por

mais 24h para a separação das fases. A fase aquosa (superior) foi coletada e

evaporada em banho-maria a 38,8ºC por 15h para eliminação do resíduo de

clorofórmio e concentração das amostras. A fase clorofórmica (inferior) foi

descartada. As amostras concentradas foram armazenadas em tubos de Eppendorf

sob temperatura de - 18ºC até a dosagem de sacarose e açúcares solúveis em

água. Os precipitados foram resuspensos em 10mL de ácido tricloroacético (TCA)

10% (p/v) e após, homogeneizados em vórtex e deixados em repouso por 24h. Após

esse período, foram centrifugados a 2000rpm por 30min. Os sobrenadantes foram

coletados e armazenados a - 20ºC para posterior dosagem de polissacarídeos

solúveis em água. Os precipitados obtidos desta centrifugação foram destinados à

extração do amido. Cada pélete foi ressuspenso em 10mL de ácido perclórico (PCA)

30%(v/v) e deixado sob agitação contínua por 30min em agitador orbital, para

digestão do amido, com posterior centrifugação a 2000rpm por 30min (Fig. 2).

A dosagem da atividade da enzima ADH (EC 1.1.1.1) foi realizada no sentido

da formação do etanol (acetaldeído → ADH→ Etanol), no qual o meio de reação

com volume final de 3000µL, foi composto pelo extrato enzimático previamente

dessalinizado em coluna sephadex G-25 M, β-NADH (0,2mM), tampão de dosagem

(Tris-HCl 50mM pH 7,5) e acetaldeído ( 5mM). Os ensaios foram conduzidos em

cubetas descartáveis de 4mL de metil-metacrilato. As cubetas contendo o meio de

reação sem acetaldeído foram previamente incubadas no sistema de aquecimento

Peltier, sob 30ºC. A reação era iniciada pela adição de extrato dessalinizado e de

acetaldeído ao meio de reação, a qual foi registrada pela queda de absorbância a

340nm, correspondendo à oxidação de NADH. As leituras foram registradas em

intervalos de 30s, por um período de 10min, conforme previamente estabelecido em

ensaios para a determinação do intervalo de tempo e volume de extrato necessários

à linearidade da reação (BADINELLI et al., 2006).

Os teores de sacarose foram determinados de acordo com o método

proposto por Handel (1986). Alíquotas de 100µL de amostras, padrões (20-150µg de

sacarose) e branco foram pipetadas em tubos de ensaio e em seguida adicionado

100µL de KOH 30%, em solução aquosa por tubo. Os tubos foram tapados com

66

bolas de vidro e incubados em banho-maria sob temperatura de 100 ºC/10min. Após

atingirem temperatura ambiente, foi adicionado 3mL do reagente de antrona

(antrona 0,15% em H2SO4 70%) por tubo, sendo agitados e novamente incubados

em banho-maria a 40 ºC/15min. Após alcançar temperatura ambiente foram

registradas as densidades ópticas a 620nm, das amostras contra o branco.

As dosagens dos teores de açúcares solúveis totais (AST), de

polissacarídeos solúveis totais (WSP) e de amido foram realizadas com base na

metodologia descrita por Grahmam e Smydzuk (1965). Alíquotas de 1mL de cada

amostra, devidamente diluídas, e de um branco e padrões (15-200µg de glicose/mL),

foram pipetadas em tubos de ensaio previamente aclimatados em banho de gelo.

Em seguida, foi adicionado 3mL de solução de antrona resfriada (0,15% em H2SO4

70%) por tubo. Os tubos foram imediatamente tapados com bolas de vidro e, após

15min de incubação, agitados e levados a banho-maria a temperatura de 90

ºC/20min. Posteriormente foram transferidos para ambiente sem luz até atingirem

temperatura ambiente, quando foram agitados e então, realizadas as leituras da

densidade óptica (D.O.) a 620nm, contra um branco. Os teores de amido foram

determinados multiplicando os valores obtidos pelo fator de correção 0,9

(McCREADY et al., 1960).

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema

fatorial 2 x 2 x 4 para experimento com inundação (genótipos x tratamento hipóxico x

tempo) e 2 x 2 x 3 para experimento com recuperação (genótipos x tratamento pós-

hipoxia x tempo), com quatro repetições. A unidade experimental composta por duas

plantas por vaso, após análise de variância foi ajustado equações de regressão para

os dados provenientes do experimento de inundação. Quando não houve ajuste, as

médias foram comparadas pelo teste de médias de Tukey, a 5% de probabilidade.

Este procedimento foi adotado para análise das médias obtidas no experimento de

recuperação.

67

Figura 1 - Fluxograma da extração Álcool desidrogenase e Alanina

aminotransferase.

68

Figura 2 – Fluxograma da extração de metabólitos, sendo TCA (ácido tricloro

acético), MCW (metanol : clorofórmio : água), WSP (polissacarídeos

solúveis totais) e PCA (ácido perclórico).

69

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os teores de oxigênio na solução nutritiva aplicada para inundar as plantas

oscilaram entre 84 e 96% de O2, decrescendo para valores entre 7 e 13% na

solução drenada dos vasos, registrados 24h após início do tratamento de inundação,

permanecendo nesse intervalo no decorrer do experimento de inundação,

caracterizando a baixa disponibilidade de oxigênio no sistema em estudo.

Durante o período de inundação, a atividade da enzima álcool

desidrogenase (ADH) aumentou nas raízes do cultivar BRS-153 no terceiro dia de

exposição ao déficit hídrico, atingindo o máximo aos nove DAÍ, e valores próximos

ao do controle aos 12 DAI (Fig. 3A). Esta queda abrupta da atividade possivelmente

esteja relacionada ao estádio avançado de degradação do tecido das raízes,

observado durante as coletas. Razão pela qual não foi possível avaliar a atividade

da ADH nos nódulos, pois estavam em estado avançado de senescência ou

desprendidos do sistema radical. O genótipo BRS-154 teve atividade da ADH similar

ao genótipo BRS-153 nos primeiros períodos de inundação, porém a atividade da

ADH atingiu maiores valores no sexto dia de inundação, reduzindo somente após o

nono DAI, permanecendo ainda com sua atividade bem superior ao controle até o

final do experimento (Fig. 3C). A desidrogenase alcoólica (ADH) que catalisa a

redução do acetaldeído tóxico a etanol, é transcricionalmente induzida em hipoxia e

anoxia (PREISZNER at al., 2001). Em raízes de milho ocorre aumento de 50 vezes

no mRNA dessa enzima, após 5 a 8h de hipoxia (GERLACH et al., 1982).

O aumento na atividade da ADH em função da deficiência de oxigênio

permite reciclar o NAD+ de maneira a manter a via glicolítica ativa (BLOKHINA et al.,

2003; TADEGE et al., 1999). Dessa forma, a produção de ATP durante a

permanência das plantas nessas condições está relacionada à capacidade das

70

mesmas em manter essa rota por períodos mais prolongados, embora essa possa

ser uma característica do cultivar estudado, tendo em vista que certos cultivares de

soja, sob hipóxia, não aumentam a atividade da enzima ADH, que converte

acetaldeído em etanol (KENNEDY et al, 1992).

Os dois cultivares de soja tiveram tendências similares no que tange a

atividade da ADH nas raízes, durante o período de inundação (Fig. 3A e 3C), mas

diferiram estatisticamente no período de recuperação pós-hipoxia (Fig. 3B e 3D). Em

relação ao período de inundação, a atividade da ADH foi reduzida substancialmente

já no primeiro dia após drenagem (DAD), com valores aproximadamente quatro

vezes menores do que os das plantas aos nove DAI. No entanto, a condição de

normoxia não foi suficiente para reverter a atividade da ADH a níveis equivalentes

ao controle, mesmo nove dias após drenagem, mostrando valores significativamente

elevados em relação ao controle em ambos os genótipos. Porém, o genótipo BRS-

154 teve redução significativa da atividade da ADH aos nove DAI em relação ao

primeiro dia de recuperação (Fig. 3D), sugerindo melhor recuperação do estresse

hipóxico em relação ao genótipo BRS-153 (Fig. 3B).

71

Figura 3 – Atividade da enzima álcool desidrogenase em raízes de genótipos de soja


períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical, após nove dias de

déficit de O2, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).

*P≤0,05; n=4.

*P≤0,05. (B e D) Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras

minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime

hídrico respectivamente; n=4.

A atividade da ADH em tecidos nodulares foi semelhante ao das em raízes,

porém significativamente maior que o controle desde o primeiro DAI, em ambos os

genótipos. A atividade aumentou com o tempo de inundação, sendo esta resposta

distinta entre os genótipos BRS-153 e BRS-154, com maior atividade aos nove e

seis DAI, respectivamente (Fig. 4A e 4C). As maiores atividades da ADH nos

nódulos registradas durante a inundação das plantas foram aproximadamente dez

A

I = - 0.0629x 2 + 0.8328x -1.9711

*R 2 = 0,93

C = 0.0108x2 + 0.1765x -1.8833

*R 2 = 0,72

0

3

6

3 6 9 12


B

0.0

0.7

1.4

1 3 9


Aa

Ab

Ba

ABb

Aa

Bb

/

//

//

C

C = -0.0053x 2 + 0.0978x -1.6385

*R 2 = 0,81

I = - 0.0190x 2 + 03164x -0.6309

*R 2 = 0,88

0

3

6

3 6 9 12


D

0.0

0.7

1.4

1 3 9


Aa

Ab

Ca

Ba

Ab Ab

//

//

//

72

vezes maiores que as máximas obtidas nas raízes, evidenciando maior atividade

fermentativa nesse órgão.

Em arroz, os cultivares tolerantes à anoxia FR13A e Calrose, possuem altas

taxas de fermentação etanólica em relação aos que são intolerantes, IR22 e IR42

(SETTER et al., 1994). O aumento da taxa de fermentação alcoólica em arroz

quando submerso aumenta sua sobrevivência nessa condição (QUIMIO et al.,

2000).

Durante o primeiro dia de recuperação pós-hipoxia, a atividade da ADH

aumentou grandemente em relação à registrada aos nove DAI, período de

drenagem. Este efeito foi mais acentuado para o genótipo BRS-154, embora

atividades mais elevadas foram registradas em BRS-153. Com o decorrer do

período após drenagem, a atividade da ADH decresceu, atingindo valores

equivalentes ao controle aos 9 DAD (Fig. 4B e 4D). O retorno das plantas às

condições normais de O2, após três dias de alagamento, promove a restauração do

metabolismo aeróbico e a conseqüente redução na atividade de enzimas

fermentativas, no entanto em milho cv. BRS – 4154, 30min de re-aeração não foram

suficientes para o completo restabelecimento da via aeróbica, uma vez que a

atividade da enzima não atingiu o nível do controle (FRIES, 2003).

O período inicial da recuperação após o estresse por falta de oxigênio pode

ser crucial para a sobrevivência das plantas. Apesar da maioria das injúrias

acontecerem durante o período de estresse, danos também ocorrem no retorno das

plantas às condições normais de oxigênio (VAN TOAI & BOLLES, 1991), ocorrendo,

também, a formação de espécies reativas de oxigênio e de produtos oxidativos

tóxicos, como acetaldeído (CRAWFORD, 1992) que é produzido pela ADH ou

catalase, após a re-aeração (ZUCKERMANN et al., 1997). A catalase

provavelmente oxida o etanol por meio da redução de H2O2 que é produzido durante

a re-aeração (MONK et al., 1987; PAVELIC et al., 2000).

É possível que os mecanismos de tolerância induzidos por um pré-

tratamento hipóxico sejam mais eficazes após o retorno às condições aeradas que

durante o próprio período de estresse (ELLIS et al., 1999). Também, a re-exposição

das plantas ao ar pode gerar radicais superóxidos e o sucesso do retorno se deve à

ação das enzimas superóxido dismutase, catalases, peroxidases e à presença de

antioxidantes naturais, como a glutationa e o ácido ascórbico (ALBRECHT e

73

WIEDENROTH, 1994). Ainda, a oxidação de acetaldeído a acetato pela enzima

acetaldeído desidrogenase torna possível a sua metabolização durante o período

pós-hipoxia, aliviando o estresse causado pelo acetaldeído (TSUJI et al., 2003).

Figura 4 – Atividade da enzima álcool desidrogenase em nódulos de genótipos de

soja, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes

períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de


*P≤0,05. (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras



O tratamento de inundação causou um grande incremento da

concentração de sacarose em raízes, no terceiro dia de tratamento, aumentando no

sexto dia e decrescendo nos períodos posteriores, resultando em teores abaixo do

controle no 12 DAI. Essa resposta ocorreu nos dois genótipos testados, porém foi

A

0

25

50

3 6 9


Aa

Ba

Bb

Ba

Bb

B

0

45

90

1 3 9


Aa

Ba

Ca Ab

Ab Ba

//

//

//

C

0

25

50

3 6 9


Aa

Ab

Bb

Ba

Ba

B

Ab

D

0

45

90

1 3 9


Ab

Aa

Ba

Ca

ABb Ba

//

//

//

74

mais expressiva no genótipo BRS-153 (Fig. 5A e 5C). Baixas concentrações de O2

promovem aumento nos teores de sacarose em ápices de raízes de cevada e arroz

(LIMPINUNTANA e GREENWAY, 1979). Do mesmo modo, ocorre maior taxa

respiratória no genótipo de trigo sensível ao alagamento e maior concentração de

sacarose no genótipo tolerante (HUANG e JOHNSON, 1995), sugerindo que a

combinação entre a redução na respiração das raízes e os altos níveis de sacarose

são responsáveis pela tolerância das plantas à condição de hipoxia.

Aumento no conteúdo de sacarose de quase três vezes durante os nove

dias de inundação em raízes de cana-de-açúcar (INDRA DENI e SUGI HARTO,

2001) sustentam os resultados obtidos neste trabalho.

Durante o período de recuperação, a concentração de sacarose em

raízes aumentou grandemente no primeiro dia. Em seguida houve diminuição,

chegando ao terceiro dia de tratamento a teores próximos aos das plantas controle e

inferiores aos nove DAI (Fig. 5B e 5D), evidenciando com isso sua utilização em

função da retomada do metabolismo aeróbico. Ainda em plantas de milho a

sacarose é a principal fonte de carbono sob privação de O2, logo disponibilidade de

sacarose pode contribuir para a adaptação de plântulas sob anaerobiose (RICARD

et al., 1998).

75

Figura 5 – Teores de sacarose em raízes de genótipos de soja nodulada, BRS-153

(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e

pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O2, sendo


*P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras



A concentração de sacarose em nódulos foi influenciada positivamente pelo

tratamento hipóxico, semelhante ao obtido em raízes. Houve um acréscimo no

terceiro dia de inundação, elevando significativamente no sexto dia de hipoxia e

reduzindo a concentração da sacarose drasticamente aos 9 DAI. Essa resposta foi

mais acentuada para o genótipo BRS-153, onde aos 9 DAI, os teores decresceram a

níveis inferiores ao controle (Fig. 6A e 6 C).

No primeiro dia de retorno às condições de normoxia, ocorreu uma

diminuição do teor de sacarose nos tecidos nodulares do genótipo BRS-153,

A

C = 0.0072x2 -0.0653x +1.8303

*R 2 = 0,99

I = -0.0150x 2 + 0.1385 x + 2.0928

*R 2 = 0,98

0

150

300

3 6 9 12


B

50

150

250

350

1 3 9


Ab

Aa

Aa

Ba Ba

Cb

//

//

//

C

C = 0.0164x

2 -0.2393x + 2.5973

*R 2 = 0,87

I = -0.0119x

2 + 0.1006x + 2.0873

*R 2 = 0,95

0

150

300

3 6 9 12


D

50

150

250

350

1 3 9


Aa

Bb

Aa Ba

Ba

Cb

// //

//

76

permanecendo inferior ao seu controle por todo o período de recuperação, sugerindo

um grande consumo desse açúcar pela respiração aeróbica. De forma diferenciada,

em BRS-154 ocorreu um acréscimo da concentração de sacarose no primeiro DAD,

seguido de diminuição no terceiro dia de recuperação, atingindo níveis

significativamente menores do que o controle, permanecendo assim até o fim do

experimento. Este efeito foi mais intenso para o genótipo BRS-153 (Fig. 6B e 6 D).

Figura 6 – Teores de sacarose em nódulos de genótipos de soja, BRS-153 (A e B) e

BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-

hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O2 (B e D), sendo



não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;

n=4.

A deficiência de O2 refletiu em aumento da produção de açúcares solúveis

totais em raízes, sendo obtidos teores muito elevados em relação às plantas sob

normoxia, no terceiro e sexto dia de inundação, especialmente no genótipo BRS-153

A

0

200

400

3 6 9


Ba

Bb

Aa

Cb

Cb

Aa

B

0

150

300

1 3 9


Ba Ab

Aa

Bb

Cb

Aa

//

//

//

C

0

200

400

3 6 9


Bb

Ba

Cb

Aa

ABa Aa

D

0

150

300

1 3 9

Período de Recuperação ( Dias)

Bb Ba

Cb

Bb

Aa Aa

//

//

//

77

(Fig. 7A e 7C). Por outro lado, a translocação de açúcares solúveis das folhas para

as raízes é bastante afetada pelo alagamento, e, drasticamente reduzida em

numerosas espécies não-tolerantes (KOZLOWSKI e PALLARDY, 1984; PEZESHKI,

1994; KOZLOWSKI, 1997). Em plantas jovens de Bactris gasipaes Kunth, durante o

tratamento de anoxia, aumenta os teores de açúcares solúveis nas raízes

(CARVALHO, 2002). Em muitos trabalhos, o acúmulo de açúcares solúveis em

raízes de plantas sob alagamento é descrito como forma de tolerância a esse

estresse (LIAO e LIN, 2001). O aumento de açúcares solúveis observado no início

do período de estresse por deficiência hídrica ocorre por causa da paralisação do

crescimento e certa manutenção da atividade fotossintética e com o avanço desse

período, devido à hidrólise de amido (McCREE et al. 1984; PIMENTEL e

ROSSIELO, 1995;), semelhante aos resultados obtidos por excesso hídrico neste

trabalho.

Após seis dias de tratamento hipóxico, os teores de AST foram diminuindo

até atingirem concentrações equivalentes aos seus respectivos controles (Fig. 7A e

7C), possivelmente devido à elevada atividade respiratória sob hipoxia, evidenciada

pela grande atividade da ADH em raízes nesse período (Fig. 3A e 3C).

Durante o período de recuperação, o teor de AST nas raízes foi muito

superior ao controle no primeiro dia de drenagem dos vasos em ambos os

genótipos, e tendeu a se equivaler aos teores pré-hipóxicos, a medida em que as

plantas se recuperaram dos efeitos do estresse (Fig. 7B e 7D). A diminuição de AST

com o aumento do período de drenagem, provavelmente esteja relacionada à maior

atividade metabólica da planta sob normoxia, estimulando o processo respiratório

aeróbico e a utilização de esqueletos carbônicos produzidos para retomada do

crescimento.

78

Figura 7 – Teores de açúcares solúveis totais em raízes de genótipos de soja


períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de





A variação dos teores de AST em nódulos durante o período de inundação

foi semelhante em ambos os cultivares, não havendo influência do fator genótipo. No

entanto, em relação ao efeito do tratamento de inundação nessa variável, produziu

uma diminuição no terceiro DAI em relação às plantas controle, com posterior

elevação significativa aos seis dias e grande decréscimo aos nove dias de

tratamento (Fig. 8A). Sob drenagem, os genótipos diferiram na resposta à

recuperação dos teores de AST. Acompanhando o decréscimo aos nove DAI,

A

I = -0.1821x 2 + 1.3879x + 2.145

*R 2 = 0,96

C = -0.0091 x 2 + 0.0538x + 2.5435

*R 2 = 0,83

0

260

520

3 6 9 12 Periodo de Inundação (Dias)

B

50

150

250

1 3 9


Aa

Ab

Ab Aa

Bb

Aa

//

//

//

C

I = -0.0086x 2 + 0.0786x +2.3509

*R 2 = 0,89

C = -0.0009x 2 + -0.0105x + 2.3662

*R 2 = 0,75

0

260

520

3 6 9 12


D

50

150

250

1 3 9


Aa

Bb

Aa Aa

Ba Cb //

//

//

79

mesmo após o retorno à condição aeróbica, as plantas tiveram dificuldade em

retomar os níveis iniciais equivalentes aos seus respectivos controles. Embora para

o genótipo BRS-154 os teores foram equivalentes ao controle no primeiro DAD, com

o avanço do período de drenagem ficaram inferiores, sendo este efeito menos

intenso quando comparado ao genótipo BRS-153 (Fig. 8B e 8C). Os teores de AST

inferiores aos obtidos no controle, sugerem maior respiração e consumo de

carboidratos na retomada da fixação e reconstituição dos tecidos e órgãos

prejudicados pela anaerobiose.

Figura 8 – Teores de açúcares solúveis totais em nódulos de genótipos de soja,

BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia

(A) e pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O2 (B e

C), sendo (controle) e (inundado ou recuperação).



n=4.

Os teores de polissacarídeos solúveis em água (WSP) em tecidos das raízes

de ambos os genótipos aumentaram significativamente com o tratamento hipóxico,

demonstrando ser uma resposta comum de raízes sob deficiência de O2. Aos três

dias de inundação houve elevação significativa em WSP em relação ao controle,

intensificando esse efeito com o decorrer do tempo de inundação. No genótipo BRS

-153 o maior acréscimo foi obtido no sexto dia, enquanto que para o genótipo BRS -

154 aos nove dias de tratamento. Com o aumento do período de inundação os

teores de WSP diminuíram drasticamente em ambos os genótipos, atingindo valores

A

300

650

1000

3 6 9


Aa

Aa

Ca

Cb

Bb Bb

B

250

750

1250

1750

2250

1 3 9


Aa

Cb

Ba

Bb

Ba Ab

//

//

//

C

250

750

1250

1750

2250

1 3 9


Aa

Cb

Ba

Ba

Ba

Ab

//

//

//

80

inferiores aos das plantas controle em BRS-153 ou equivalente, em BRS-154 (Fig.

9A e 9C).

O aumento do WSP é atribuído a um decréscimo da hidrólise, o mesmo

efeito regulatório, em que o incremento da concentração de açucares solúveis induz

ao aumento na síntese de amido (BARTA, 1987). Entretanto, em raízes de soja

nutrida com nitrato sob hipoxia ocorre um aumento das concentrações de WSP,

antes do incremento dos açúcares solúveis em água (SOUSA e SODEK, 2002),

diferentemente dos resultados obtidos neste trabalho em que houve aumentos

concomitantes destes carboidratos.

Durante o período após drenagem, foi observada resposta diferenciada entre

os genótipos para a variável WST. No primeiro dia de recuperação ao estresse

hipóxico o genótipo BRS – 153 teve acréscimo muito superior ao seu controle, sendo

essa resposta bem menos expressiva em BRS-154. No terceiro dia de recuperação,

houve diminuição significativa em BRS-153 e grande aumento em BRS-154 e aos 12

DAD, os teores aproximaram-se aos das plantas controle em ambos os cultivares,

embora significativamente mais baixos (Fig. 9B e 9D).

81

Figura 9 – Teores de polissacarídeos solúveis em água de raízes de genótipos de


diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove

dias de déficit de O2, sendo (controle) (inundado ou recuperação).




Por outro lado, em tecidos nodulares, a produção de polissacarídeos

solúveis em água foi bem diferente do obtido em raízes, pois ambos os genótipos

tiveram decréscimos nos teores de WSP durante o período de inundação (Fig. 10A e

10C), sendo mais acentuado no genótipo BRS-154. Durante a drenagem das

plantas, os teores de WSP de ambos genótipos, não superaram os valores de seus

A

I =-0.0222x 2 +0.3023x-1.6690

*R 2 = 0,97

C = -0.0088x 2 +0.1496x -1.5808

*R 2 = 0,89

0.00

0.15

0.30

3 6 9 12

Período de Inundação (Dias )

B

0.00

0.15

0.30

1 3 9


Bb

Aa

Aa Aa

Bb

Cb

//

//

//

C

I = -0.0139x 2 + 0.1907x -1.4008

*R 2 = 0,82

C = -0.0011x 2 + 0.0149x -1.1220

*R 2 = 0,05

0.00

0.15

0.30

3 6 9 12

Período de Inundação ( Dias)

D

0.00

0.15

0.30

1 3 9


Aa

Aa

Cb

Bb Bb

Ba

//

//

//

82

respectivos controles (Fig. 10B e 10D), sugerindo um redirecionamento do

metabolismo de carboidratos para síntese de outros compostos essenciais.

Figura 10 – Teores de polissacarídeos solúveis em água em nódulos de genótipos

de soja nodulada, BRS-153(A e B) BRS-154 (C e D), submetidos a

diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove

dias de déficit de O2, sendo (controle) (inundado ou recuperação).



n=4.

Os teores de amido nos nódulos foram reduzidos significativamente ao longo

de todo o tratamento hipóxico, ocorrendo diferença de teores entre genótipos. A

inundação causou maior redução em BRS-154, porém a tendência em atingir teores

próximos ao controle foi mais evidente que em BRS-153 (Fig. 11A e 11C). A grande

diminuição do teor de amido especialmente nos períodos iniciais de inundação pode

A

0.02

0.05

0.08

3 6 9

Período de Inundação ( Dias)

Aa

Aa Aa

Aa Aa

Ab

B

0.02

0.05

0.08

1 3 9

Período de Recuperação (Dias )

Ba Ba Aa

Ab

Bb

Ab

//

//

//

C

0.02

0.05

0.08

3 6 9 Período de Inundação ( Dias )

Ba

Ba

Aa

Bb

Ab

Bb

D

0.02

0.05

0.08

1 3 9


Aa

ABa

Aa

Ab

Ba Ab

//

//

//

83

estar relacionada ao acúmulo de sacarose, evidenciada no sexto dia de tratamento

hipóxico em ambos os genótipos (Fig. 6A e 6C). O aumento da concentração de

amido nos demais tempos de inundação podem indicar a sua menor degradação

devido à inibição da α-amilase, (PERATA et al., 1993). A variação dos teores de

amido em nódulos durante o tratamento de recuperação foi semelhante em ambos

os genótipos, porém inferior aos das plantas mantidas sob normoxia, incrementando

ao longo do período de recuperação e atingindo teores próximos ao controle aos

nove dias de tratamento (Fig. 11B).

Figura 11 – Teores de amido em nódulos de genótipos de soja nodulada, BRS-153

(A) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-

hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O2, sendo




n=4.

A

1000

2250

3500

3 6 9


Bb

Cb

Ab

Aa

Ba

Ca

B

2000

3500

5000

1 3 9


Bb

Cb

Ab

Aa

Ba

Ca

//

//

//

C

1000

2250

3500

3 6 9


Cb

Ba

Ab

Aa

Aa

Bb

84

4 CONCLUSÕES

Os genótipos de soja BRS-153 e BRS-154 são capazes de manter elevadas

taxas de fermentação alcoólica por um período de nove dias em nódulos e raízes em

condição de hipoxia por alagamento do sistema radical.

O período de nove dias de drenagem não é suficiente para reverter a

atividade da ADH a níveis pré-hipóxicos em raízes, sendo o tempo requerido para

em nódulos reduzir o metabolismo fermentativo aos níveis do controle.

O grande aumento das concentrações de sacarose, açúcares solúveis totais

em raízes e nódulos e de amido em nódulos, sobretudo nos períodos iniciais de

hipoxia em ambos os genótipos é devido a redução da atividade metabólica desses

tecidos em função da pouca disponibilidade de oxigênio.

No período de recuperação pós-hipoxia os teores de sacarose e de açúcares

solúveis totais em raízes tendem a ser restabelecidos após o período compreendido

entre três e nove dias de normoxia. Em nódulos, por outro lado, os teores de

sacarose, de açúcares solúveis totais e de amido não atingem as concentrações das

plantas controle nesse mesmo período, permanecendo baixos, em virtude da alta

taxa de utilização de carboidratos nas raízes, em conseqüência da retomada de sua

atividade metabólica.

85

A hipoxia aumenta a concentração de polissacarídeos solúveis em água em

raízes e diminui nos nódulos, sugerindo existir mecanismo diferenciado de

adaptação desses órgãos à baixa disponibilidade de O2. O retorno às condições de

normoxia favorece o restabelecimento da concentração desses carboidratos em

raízes em relação aos nódulos.

86

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and ethanolic fermentation in the roots of two wetland and non-wetland

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