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RESPUESTA INMUNE INNATA Y TOLERANCIA ORAL FRENTE A PERIODONTOPATÓGENOS
NELLY STELLA ROA MOLINA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN DE LABORATORIO EN INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Bogotá, Noviembre de 2.005
RESPUESTA INMUNE INNATA Y TOLERANCIA ORAL FRENTE A PERIODONTOPATÓGENOS
NELLY STELLA ROA MOLINA
Dr. CARLOS MARIO AGUDELO MsC
DIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN DE LABORATORIO EN INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Bogotá, noviembre de 2.005
2
RESPUESTA INMUNE INNATA Y TOLERANCIA ORAL FRENTE A PERIODONTOPATÓGENOS
NELLY STELLA ROA MOLINA
Dr. CARLOS MARIO AGUDELO MsC
DIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN DE LABORATORIO EN INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Bogotá, Noviembre de 2.005
3
RESPUESTA INMUNE INNATA Y TOLERANCIA ORAL FRENTE A PERIODONTOPATÓGENOS
__________________________ _______________________
Dr. CARLOS MARIO AGUDELO Dr. DIANA PATIÑO
Director Coordinadora Especialización
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN DE LABORATORIO EN INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Bogotá, Noviembre de 2.005
4
Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas, son
responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la Pontificia Universidad
Javeriana. (Art. 918 del reglamento de trabajos de grado y de investigación.
Agosto de 1989).
5
TABLA DE CONTENIDO
Páginas
DEFINICION DEL PROBLEMA 1
JUSTIFICACIÓN 5
OBJETIVO 5
MARCO TEORICO 6
1. GENERALIDADES DE ENFERMEDAD PERIODONTAL 6
Características generales de la enfermedad periodontal 9
2. MICROBIOLOGIA DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL 11
Placa dental 17
3. PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL 18
3.1 Mecanismos de defensa del huésped 18
3.2 Características clínicas e histopatológicas de la enfermedad
periodontal 19
3.2.1 Lesión gingival inicial 20
3.2.2 Lesión gingival temprana 21
3.2.3 Lesión gingival establecida 22
3.2.4 Lesión gingival avanzada 22
4. INMUNOPATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD
PERIODONTAL 23
Células del sistema inmune en la enfermedad periodontal 25
5. LIPOPOLISACARIDO BACTERIANO E INMUNIDAD INNATA 27
6. RESPUESTA INMUNE INNATA EN MUCOSA ORAL 35
7. TOLERANCIA ORAL 38
8. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL 48
CONCLUSIONES 57
BIBLIOGRAFIA 59
6
DEFINICION DEL PROBLEMA
Las enfermedades periodontales constituyen un grupo heterogéneo de
alteraciones de los tejidos de protección y soporte de los dientes que son en su
gran mayoría de origen infeccioso y de carácter inflamatorio; por el tipo de tejido
que afectan pueden ser clasificadas en gingivitis si se limitan al tejido de
protección o unidad dentogingival, o periodontitis si están involucrados los tejidos
de soporte o unidad dentoalveolar, los cuales incluyen ligamento periodontal,
hueso, y cemento (Tonetti y col, 1999).
La clase más común del trastorno gingival es la afección inflamatoria simple
causada por la placa bacteriana que se adhiere a la superficie dentaria. Este tipo
de gingivitis, denominada gingivitis simple puede permanecer estacionaria por
periodos indefinidos o proseguir en ocasiones hasta destruir las estructuras de
soporte, es decir, periodontitis. Existe un continuo cambio desde la gingivitis
simple hasta la periodontitis y en general se emplea el término enfermedad
periodontal para referirse a todo este proceso (Carranza y col, 1998).
La enfermedad periodontal puede ser clasificada al tener en cuenta factores
modificadores de la presentación clínica de la enfermedad como el avance de la
lesión en el tiempo, en 2 grupos: las enfermedades periodontales crónicas y las
enfermedades periodontales agresivas (Armitage, 1.999).
Las periodontitis crónicas, aunque pueden presentarse en adolescentes y aún en
niños son más comunes después de la cuarta década de vida y su evolución
además de ser episódica es muy lenta, mientras las enfermedades periodontales
7
agresivas se presentan generalmente en adultos jóvenes y progresan muy
rápidamente lo que produce pérdidas de inserción avanzadas en solo semanas
(Flemming y col, 1999). Algunos de los microorganismos involucrados en su
etiología son el Actinobacillus actinomycetemcomtans, Porphyromonas gingivalis y
Bacteroides forsythus entre otros (Caton y col, 1989; Ishikawa y col, 1997)
Todas las enfermedades periodontales cuyo factor etiológico primario es la placa
bacteriana, involucran dos componentes en el curso clínico del daño. El primero
de ellos, el factor microbiológico, el cual ocasiona daño tisular directamente por
productos bacterianos tales como las colagenasas, y el segundo, el factor
huésped en su afán de defender el organismo del ataque bacteriano. Así, la
respuesta inmunológica parece estar directamente relacionada con la destrucción
tisular en este tipo de patologías (Offenbacher y col, 1996; Coman y col, 1997).
Las células de la mucosa oral tales como las células epiteliales gingivales en
regiones inflamadas producen diversas citoquinas proinflamatorias tales como IL-
1β, IL-6, IL-8 y TNF-α, y moléculas de adhesión. En periodontitis, las células
inmunes hematopoyéticas tales como células T, células B, monocitos y neutrófilos
son recluidos y acumulados en áreas inflamadas; lo que hace pensar que las
células de la mucosa oral activamente participan en la infiltración de estas células
inmunes por las citoquinas y moléculas de adhesión producidas (Sugawara y col,
2002).
Lo que sí es claro, es que en las primeras etapas de la enfermedad, los neutrófilos
predominan debido a su movilidad, a su flexibilidad y a los efectos de las
moléculas de adhesión sobre los vasos sanguíneos a los que se unen; además se
8
genera un gradiente quimiotáctico desde el surco hacia el tejido conectivo y de
esta forma los PMN son atraídos. La acumulación de PMN neutrófilos y su
actividad en el surco gingival tiene como resultado la liberación de múltiples
enzimas que ocasionan efectos perjudiciales para los tejidos del huésped igual
que para los microorganismos. La infiltración inmunitaria por linfocitos comienza y
se pierden componentes estructurales y espacio físico importante; las capas
epiteliales son destruidas, el epitelio se reforma en una ubicación más apical y se
da origen a la bolsa periodontal (Lindhe, 2.001).
La función de los PMN neutrófilos en el surco gingival es muy controvertida, ya
que algunos autores afirman que deben existir ciertas condiciones que lo llevan a
convertirse en el “cementerio de los neutrófilos” (Barrios, 1.989); o como Burkotz,
quien afirma que el neutrófilo no tiene función defensiva en el surco gingival ya
que si el neutrófilo tuviera función fagocitaria en el surco o saco periodontal,
seguramente la enfermedad periodontal no existiría. No obstante, autores como
Takayuki y colaboradores afirman que los PMN neutrófilos de saliva están
involucrados en la prevención oral de la enfermedad periodontal, ya que sus
funciones están totalmente activadas a nivel del surco gingival y son los primeros
que reaccionan. Cuando hay alteraciones en éste ó en otros componentes del
sistema inmunológico se desarrolla la patología (Takayuki y col, 1.997).
Dentro de este contexto, las poblaciones de células inmunocompetentes de la
lesión periodontal, han sido el principal foco de atención de los investigadores;
hoy en día, después de varias décadas de estudios y a pesar de los constantes
vacíos existentes en las teorías que intentan mostrar a las células del sistema
inmune como causantes directas o indirectas del daño, se acepta que las lesiones
periodontales destructivas, están determinadas por la naturaleza de la respuesta
inmune específica linfocitaria (Gemmell y col, 2002).
9
La tolerancia oral, es otro de los aspectos importantes de la respuesta inmune en
Enfermedad periodontal, la cual no involucra una respuesta sistémica. La
tolerancia, representa la forma de respuesta más común e importante del huésped
en el mantenimiento de la homeostasis en general, ya que defiende al sujeto de
antígenos del medio ambiente naturales y extraños, incluyendo la alimentación y
componentes bacterianos con mantenimiento de la respuesta de anticuerpos IgA
mucosales ó secretores.
Desde hace 20 años, se ha pretendido dar explicación y determinar, en donde y
cómo, la tolerancia oral puede influir en la respuesta inmune de mucosas y hasta
donde se puede inducir ambas respuestas: sistémica y de mucosas para combatir
con la enfermedad (Fujihashi y col, 2.001).
A partir de los avances y revisiones realizados de la literatura, con este trabajo se
pretende hacer una profundización de la respuesta inmune innata frente a los
periodontopatógenos, que pueda explicar de alguna manera el progreso de la
enfermedad y proponer teorías de tolerancia inmunológica frente a la misma, en
términos de sus mecanismos inmunológicos y la forma en que se involucran las
células inmune y los tejidos, estudios que podrán ser de interés general de la
inmunidad del huésped en el futuro.
JUSTIFICACIÓN
10
Con respecto a la presentación y progreso de la enfermedad periodontal se han
realizado numerosos estudios y revisiones teóricas, los cuales presentan
resultados controversiales. Con este trabajo se pretende ampliar los conceptos,
profundizar en el tema y plantear teorías de tolerancia a nivel oral, que pueda de
una manera explicar el progreso de la enfermedad en algunos pacientes.
Los resultados y conclusiones obtenidos en este trabajo, serán un aporte a la
comunidad científica odontológica, a la línea de investigación Respuesta inmune
en enfermedad periodontal del Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO) de
la Pontificia Universidad Javeriana, y a los estudios que se avanzan en el Instituto
Nacional de Salud, en la línea de investigación Respuesta inmune innata a
lipopolisacárido.
OBJETIVO
Revisar, profundizar y aclarar conceptos de la respuesta inmune innata frente a
periodontopatógenos causantes de enfermedad periodontal en cavidad oral, que
pueda explicar el progreso de la enfermedad.
MARCO TEORICO
11
1. GENERALIDADES DE ENFERMEDAD PERIODONTAL
El periodonto (peri = alrededor, odontos = diente) está conformado por la unidad
dentogingival, la cual está constituida por la encía, y el diente, más
específicamente por las fibras gingivales, el esmalte y el epitelio de unión, y por la
unidad dentoalveolar, conformada a su vez por el ligamento periodontal, el
cemento radicular y el hueso alveolar (Ferro y otros, 2.000) (Figura 1).
Figura 1. Estructura del Periodonto.
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Su función principal es unir el diente al tejido óseo de los maxilares y conservar la
integridad de la superficie de la mucosa masticatoria de la boca. El periodonto
también llamado aparato de inserción o tejido de sostén del diente, establece una
unidad funcional biológica y evolutiva que experimenta algunas modificaciones con
la edad. Esta sujeto a alteraciones morfológicas y funcionales, así como a
modificaciones debidas a alteraciones del medio bucal. (Lindhe, 2001)
Las enfermedades periodontales son un grupo de condiciones heterogéneas
causadas en parte por infecciones bacterianas que afectan los tejidos de soporte
de los dientes, lo cual puede conducir a la pérdida del hueso y del ligamento
periodontal y por otro lado, por la respuesta del huésped como consecuencia de la
12
activación de la respuesta inmune como defensa de los tejidos frente a la infección
(Suárez y col, 2.004).
Lo anterior, puede ser explicado de la siguiente manera: la enfermedad
periodontal inicia y se mantiene por factores como la acumulación de placa
microbiana en la superficie dentaria adyacente a los tejidos gingivales que pone a
las células del epitelio surcular y de unión en contacto con productos de desecho,
enzimas y componentes superficiales de bacterias colonizantes. Las sustancias
microbianas estimulan las células epiteliales para que produzcan citoquinas
proinflamatorias y otros mediadores químicos de la inflamación, éstos inician una
respuesta inflamatoria produciendo una inflamación en los tejidos al acumularse
líquido y se genera la gingivitis.
En las primeras etapas de la enfermedad, los neutrófilos predominan debido a su
movilidad y flexibilidad y a los efectos de las moléculas de adhesión sobre los
vasos sanguíneos a los que se unen los PMN, además se genera un gradiente
quimiotáctico desde el surco hacia el tejido conectivo y de esta forma los PMN
son atraídos hacia el surco (Figura 2).
La acumulación de PMN neutrófilos y su actividad en el surco gingival tiene como
resultado la liberación de múltiples enzimas que ocasionan efectos perjudiciales
para los tejidos del huésped igual que para los microorganismos. La infiltración
inmunitaria comienza y se pierden componentes estructurales y espacio físico que
es infiltrado por leucocitos. Las capas epiteliales son destruidas, el epitelio se
reforma en una ubicación más apical y se forma la bolsa periodontal.
13
Activación cel. Endoteliales Vasos
Sanguíneos
A
Vesícula Proteína
Superficie Dental a
Figura 2. El reto bacteriano y la respuesta microbial challenge in periodontitis. Periodont
Al extenderse la infiltración se reabsorbe el
fuertemente vascularizado y lleno de c
anticuerpos. Adicionalmente, las células
enzimas degradantes de la matriz y cito
degradan aun más el tejido conectivo y el hu
Finalmente, la continua estimulación antigé
una mayor infiltración que contribuye al aum
periodontal, extensión del tejido de granula
periodontal que culmina en la desaparición
pérdida del mismo (Lindhe, 2001).
14
INDIRECTA
DIRECTLeucocitos
del huéspeology 2000,
hueso, se
élulas pl
del tejido
quinas qu
eso.
nica por l
ento en l
ción y pé
de estruc
Leucocito
Proteín
d. Darveau y Page, The Vol. 14, 1997, 12- 32.forma tejido de granulación
asmáticas productoras de
de granulación producen
e directa e indirectamente
os microorganismos, induce
a profundización de la bolsa
rdida de hueso y ligamento
turas de sostén del diente y
De acuerdo con lo anterior, se puede concluir que la respuesta inmune que
establece el huésped contra el microorganismo, es en gran parte la causante de la
perdida del diente y que el papel de los linfocitos es muy importante en el
desarrollo de la enfermedad, por lo cual, la mayoría de estudios que se realizan a
nivel inmunológico en este tipo de pacientes van encaminados a determinar el
fenotipo de las células involucradas y su localización a nivel histológico.
(Johannessen y col,1986; Karen y col, 1986; Malberg y col, 1992; Celenligil y col,
1990; Taubman y col, 1984; Reinhardty y col, 1988; Karimzadeh y col, 1999,
Lappin y col,1999; Suárez y col, 2004; Guises y col, 1996; Seguiré y col, 2000;
Yamazaki y col, 2001, Gemmel y col, 1998; Yamamoto y col, 1997, Budunelli y col,
2001; Petit y col, 2001; Zafiropoulos y col, 1990; Afar y col, 1992; Takahashi y col,
1995).
Características generales de la enfermedad periodontal
Las afecciones del periodonto se dividen en dos categorías principales:
enfermedades gingivales y periodontales. Las primeras incluyen a los
padecimientos que afectan solo los tejidos de protección del diente (la encía), en
tanto que las segundas, a los trastornos que comprometen las estructuras de
soporte del diente (ligamento periodontal, hueso) (Carranza y col, 1998) (Figura 3).
Figura 3. Enfermedades gingivales yperiodontales. Una mirada adulta.
Folleto preventivo Colgate.
15
Las reacciones inflamatoria e inmunitaria frente a la placa bacteriana constituyen
los rasgos predominantes de la gingivitis y la periodontitis. La reacción inflamatoria
es visible microscópicamente y clínicamente en el periodonto afectado y
representa la respuesta del huésped a la microflora de la placa y a sus productos,
además, las consecuencias son visibles radiográficamente (Lindhe, 2001). En
1999 la AAP (American Academy of Periodontology) clasifica la enfermedad
periodontal de la siguiente manera: (Tabla 1) (Armitage, 1999)
Tabla 1 Clasificación de la Enfermedad Periodontal
I. Enfermedad Gingival
A. Enfermedad gingival inducida por placa
B. Lesiones gingivales no inducidas por placa
II. Periodontitis Crónica
A. Localizada
B. Generalizada
III. Periodontitis Agresiva
A. Localizada
B. Generalizada
IV. Periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas
V. Enfermedad periodontal necrotizante
VI. Absceso periodontal
VII. Periodontitis asociada con lesiones endodónticas
VIII. Condiciones o deformidades del desarrollo o adquiridas
16
2. MICROBIOLOGIA DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL
La cavidad bucal está habitada por bacterias que colonizan los tejidos blandos,
incluidas las encías, las mejillas y los dientes, este último, constituye una
superficie para la colonización de un grupo considerable de especies bacterianas.
Las bacterias pueden adherirse al diente mismo, a las superficies epiteliales de la
encía o de la bolsa periodontal, a los tejidos conectivos subyacentes, cuando
están expuestos, y a otras bacterias que están adheridas a esas superficies. En
contraste con la superficie externa de la mayoría de las partes del organismo, las
capas externas del diente no se descaman, así la colonización microbiana se ve
facilitada. De esta manera se genera una situación en la cual los microorganismos
colonizan el diente y se mantienen continuamente en inmediata proximidad con los
tejidos blandos del periodonto.
Se estima que alrededor de 400 especies diferentes son capaces de colonizar la
boca y que cualquier persona puede albergar 150 o más especies diferentes. Los
recuentos en zonas subgingivales oscilan desde 103 y 108 en las bolsas
periodontales profundas. (Lindhe, 2001)
Debido a varios factores es difícil reconocer los patógenos bacterianos en las
enfermedades periodontales. La microbiota periodontal es una comunidad
compleja de gérmenes, muchos de los cuales son muy complicados de aislar en el
laboratorio. A pesar de las dificultades propias de la caracterización de la
microbiología de las enfermedades periodontales, se reconocen un grupo limitado
de patógenos por su asociación con el inicio y la progresión de la enfermedad, los
más conocidos son (Ishikawa y col, 1997):
17
a. Anaerobios o microaerofílicos como la Porphyromonas gingivalis (P.
gingivalis), encontrado en la profundidad de la bolsa y especialmente en
sitios activos (Bainbridge, 2.002).
b. Actinobacillus actinomycetemcomitans (A.a.), asociado a las bolsas
periodontales de pacientes con periodontitis crónica.
c. Bacteroides forsythus (B. forsythus), relacionado con la actividad de la
enfermedad.
Entre otros microorganismos causantes se encuentran: Capnochytophaga,
Fusobacteriun nucleatum y Prevotella intermedia.
Estos microorganismos exhiben diferentes mecanismos de virulencia
encaminados unos a evadir la respuesta del huésped, otros, específicamente la
producción de enzimas, a atacar mecanismos de defensa del huésped y por último
mecanismos no aplicables a todos los periodontopatógenos, con el objetivo de
lograr invasión tisular e inducir la inflamación y destrucción del tejido conectivo
(Lovegrove, 2.004).
Dentro de estos grupos se incluyen producción de leucotoxinas, epitelotoxinas,
enzimas que degradan inmunoglobulinas, complemento, citoquinas y, producción
de factores inmunosupresores que puedan inhibir la síntesis de anticuerpos
(Dueñas y col, 2.001). Estos factores de virulencia pueden ser comunes ó
particulares para los microorganismos periodontopatógenos (Ishikawa y col, 1997).
P. gingivalis posee fimbrias, polisacárido capsular, hemaglutinina, lipopolisacárido,
enzimas y otros antígenos proteicos.
18
Las fimbrias son estructuras que le permiten la adherencia a las superficies de los
tejidos gingivales. Se ha observado en suero de pacientes con periodontitis del
adulto y agresiva, la presencia de altos títulos de IgG específicos de fimbria y
bajos niveles de IgA y M, mientras que en sujetos sanos, estos títulos son bajos
(Amano y col, 2004; Ishikawa y col, 1997).
Las cápsulas bacterianas tienen varias funciones, entre ellas, servir de barrera
fisicoquímica para la célula, protección contra la disecación y resistencia a la
fagocitosis por neutrófilos y macrófagos. P. gingivalis tiene una densa cápsula
amorfa de 15 nm que junto con otras membranas constituyen un polisacárido
heteropolimérico, rico en glucosa, glucosalina, galactosamina y ácido
galactosaminouronico, complejo inmunoquímicamente distinto del lipopolisacárido.
Se ha comprobado que la inmunización en ratones con el polisacárido de P.
gingivalis reduce la severidad de la infección pero no previene la invasión del
microorganismo. También se han observado anticuerpos séricos de pacientes con
periodontitis en bajos títulos para el polisacárido capsular de P. gingivalis.
La adhesina hemaglutinante de unión celular (HA-Ag2) de P. gingivalis fue
encontrada como un antígeno común en las especies bacterianas. El complejo de
proteína de superficie no-fimbria, tiene la capacidad de unirse a los eritrocitos, está
compuesto por 2 polipéptidos asociados con masa molecular de 33 a 38 kDa
aproximadamente, y otros dos de 43 a 49 kDa ubicados en la membrana externa
(Ishikawa y col, 1997).
Esta hemaglutinina es considerada un determinante antigénico importante del
microorganismo, debido a que puede funcionar como un epítope específico en
humanos. Lo anterior puede ser explicado por la presencia de varios isotipos de
IgG, IgA e IgM antígeno-específicos para HA-Ag2, en pacientes con periodontitis
crónica.
19
P. gingivalis no tiene un lipopolisacárido (LPS) típico de otras bacterias gram-
negativas, ya que carece de heptosa y 2-keto-3-deoxioctonato, muestra muy poca
actividad endotóxica (demostrada en ensayos de endotoxina clásicos como el
Limulus), pero por el contrario, es significativamente mitogénico. Se han descrito
altos títulos de IgG en pacientes con periodontitis agresiva con mayor frecuencia
por los isotipos IgG2 y cantidades moderadas de IgG1, IgG3 e IgG4 comparados
con los pacientes con periodonto sano (Ishikawa y col, 2000).
Se especula que este microorganismo contiene un lípido A heterogéneo, lo que
contribuye a una respuesta inmune innata del huésped inusual y a su habilidad de
interactuar con diferentes moléculas TLR (Bainbridge y col, 2.002).
P. gingivalis produce una amplia variedad de enzimas las cuales pueden
considerarse como el mayor factor de virulencia, entre ellas la colagenasa y
proteasas semejantes a tripsina; además, por la presencia de estas enzimas y su
actividad puede ser fácilmente distinguido de otras especies anaeróbicas
pigmentadas negras. Entre ellas se encuentras:
• La colagenasa producida por P. gingivalis de 35 kDa, es dependiente de
tiol, requiere metales iones y puede degradar las fibras colágenas como
resultado de la acción mutua con otras proteasas.
• La proteasa de 53 kDa, con actividad semejante a tripsina y dependiente de
tiol.
• Una proteasa de cisteína de 50 kDa denominada gingipain, con tres
características inusuales: a. la estimulación de actividad amidolítica por
dipéptidos con glicina, b. especificidad limitada a péptidos unidos con
residuos de arginina, c. resistencia a la inhibición por inhibidores de
proteinasa en plasma humana (Kadowaki y col, 2.003; Imamura y col,
2.003).
• Proteinasas específicas a Arginina de 50 kDa y de 44 kDa identificadas
como hemaglutininas (Ishikawa y col, 1997; Takii y col, 2.005).
• La proteinasa específica a lisina de 60 kDa.
20
• La proteasa de 44 kDa denominada P. gingivalis 381, con actividad
proteolítica dependiente de tiol, comparte características de endopeptidasas
metalo y serina, y degrada colágenos tipos I, IV e IgG.
• La proteasa tiol de 64 kDa, una proteasa importante para el crecimiento de
los microorganismos, produce enzimas que proveen resistencia a la
fagocitosis y otras que degradan proteínas del suero, incluyendo
inmunoglobulinas, y componentes del complemento.
• La proteasa de 95 kDa que degrada el componente C3 y participa de una
forma importante en el mecanismo de evasión de la respuesta inmune.
Las proteínas de la membrana externa de P. gingivalis, contiene antígenos
proteicos de diferentes pesos moleculares: 115,82,75, 57, 55, 51, 47, 46, 44, 43,
40, 35, 27, 25, 18 y 19 kDa, los cuales participan de una forma importante en la
patogenesidad del microorganismo.
A. a. es clasificado dentro de los serotipos a, b, c, d y e. El antígeno
inmunodominante para A. a. serotipo b, es un carbohidrato específico, y los
serotipos a y c son polisacáridos. Tiene un LPS muy similar al de otras bacterias
gram negativas, posee un amplio espectro de actividad inmunobiológica y
actividad endotóxica, reflejado en la respuesta mitogénica y policlonal, induce la
activación del LB y del macrófago, síntesis de IL-1, prostaglandina E2 y
reabsorción de hueso en el ratón (Ishikawa y col, 1997).
Se ha reportado la presencia de altos títulos de anticuerpos IgG e IgM en suero de
pacientes con periodontitis agresiva, comparado con sujetos sanos.
A. a. posee una leucotoxina de 115 kDa, lo cual lo hace citotóxico para los
leucocitos polimorfonucleares humanos. Se ha demostrado que los pacientes con
periodontitis agresiva, contienen anticuerpos que neutralizan la leucotoxina,
21
mientras que en individuos normales ó con otros tipos de periodontitis se amplifica
la reacción leucotóxica más que la inhibición de la misma (O’Brien y col, 2.004).
GroEL-like protein de 64 kDa, es una proteína que ha sido purificada en sujetos
con periodontitis agresiva, presenta homología del 48% con la hsp60 humana. La
alta respuesta de IgG en suero a la proteína de 64 kDa, puede ser dirigida hacia
epítopes de la autoproteína de choque térmico, como bien a la hsp65
micobacteriana involucrada en la artritis autoinmune.
El componente asociado a la superficie de A. a., ha sido ampliamente estudiado, y
se ha comprobado que tiene una potente actividad osteolítica en huesos calvarios
murinos.
Este microorganismo posee fimbrias de aproximadamente 5 nm en diámetro y
diversos µm en longitud. El suero antifimbria es un inhibidor de unión que
reacciona con una proteína de 54 kDa, siendo mejor la respuesta en los sujetos
sin A. a. que en los sujetos con el microorganismo en las bolsas periodontales
(Delima y col, 2.003).
Al realizar el sonicado de A. a. se puede observar 13 proteínas antigénicas que
varían de los 14 a los 78 kDa, induciendo diferentes títulos de anticuerpos de tipo
IgG en sujetos con periodontitis y sanos.
B. Forsythus, fue la primera cepa identificada, requiere de ácido acetilmurámico
porción amino para la proliferación y el mantenimiento de la forma celular. Es difícil
de cultivar. Este microorganismo es positivo en los test de sustratos enzimáticos
para α-glucosidasa, β-glucosidasa, α-fucosidasa, α-glucoronidasa y tripsina, lo
que lo hace distinguible de las especies Capnocytophaga y Fusubacterium
(Ishikawa y col, 1997, Kinane y col, 1999).
22
Placa dental
La placa dental es una agregación bacteriana homogénea causante de
enfermedad periodontal cuando se acumula hasta el punto de exceder la
capacidad de defensa del huésped. Se desarrolla sobre la superficie expuesta del
diente y comienza con la precipitación de una capa salivar. Esta última es una
película orgánica compuesta principalmente de proteínas y glicoproteínas que se
encuentran en la saliva y el fluido crevicular que se deposita sobre la superficie del
diente (Christersson y col, 1991). La película contiene pocas bacterias en etapas
tempranas, sin embargo pocas horas después de la acumulación las bacterias
orales se adhieren a la película formando la base para la acumulación de placa.
Bajo algunas condiciones como la adquisición de ciertas especies, la combinación
de especies y una defensa no optima del huésped, estas pocas bacterias pueden
causar una inflamación destructiva que en casos extremos puede causar la
perdida del diente. La placa dental ha sido definida como un biofilm. Los biofilms
poseen características específicas como:
• Son comunidades ecológicas que evolucionaron para permitir la
supervivencia de la comunidad como un todo.
• La comunidad presenta cooperación metabólica.
• hay un sistema circulatorio primitivo.
• Posee numerosos microambientes con diferentes radicales de pH,
concentraciones de oxigeno y potenciales eléctricos.
• Los biofilms resisten la defensa usual del huésped.
• Los biofilms resisten antibióticos sistémicos o locales y agentes
antimicrobianos (Darveau y col, 1997)
La placa microbiana es notablemente resistente a los mecanismos de defensa
normal del huésped. El fluido gingival que contiene complemento, anticuerpos y
todos los otros sistemas presentes en la sangre para prevenir y controlar la
23
infección continuamente bañan el biofilm, el complemento es activado y millones
de leucocitos migran continuamente hacia la bolsa periodontal y entran en
contacto con la placa subgingival, sin embargo las bacterias sobreviven y se
diseminan lateral y apicalmente a lo largo de la superficie de la raíz, causando la
destrucción del tejido.
El biofilm subgingival puede proveer una mayor y continua fuente de LPS
circulante. El desprendimiento bacteriano de LPS y proteínas proporciona una
gran relación entre la placa dental y el huésped. Vesículas liberadas en la
superficie de la placa dental actúan recíprocamente con monocitos y células
endoteliales. La activación del endotelio puede ocurrir directa o indirectamente
actuando recíprocamente primero con monocitos que liberan citoquinas. El
resultado de estas interacciones es la salida de leucocitos de la vasculatura a los
tejidos circundantes para eliminar el estímulo bacteriano. Sin embargo, la
naturaleza perseverante de la placa dental en la superficie del diente previene el
desprendimiento completo del biofilm y contribuye a un estímulo constante por
parte de los antígenos bacterianos (Darveau y col, 1997).
3. PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL
3.1 Mecanismos de defensa del huésped
24
Los microorganismos de la placa subgingival parecen desarrollarse excesivamente
y conducir a enfermedades graves en los huéspedes inmunocomprometidos
(Genco y col, 1986; Shenker y col, 1987; Winkler y col, 1989). Esto sugiere que los
mecanismos de defensa del huésped son importantes para limitar las cantidades
de bacterias en la placa subgingival y prevenir así daños al endotelio gingival. Una
especie bacteriana debe superar varios obstáculos del huésped para colonizar un
sitio subgingival. Algunos de estos son el flujo salival, el fluido gingival y el
desplazamiento mecánico por la masticación.
Las sustancias de la saliva pueden ayudar en la prevención de la colonización
mediante varios mecanismos como anticuerpos específicos, glucoproteinas
salivales, proteínas ricas en musina, y prolina que podrían actuar como agentes
bloqueantes inespecíficos (Lindhe, 2001).
La enfermedad puede llegar a ser más destructiva si aspectos específicos de los
mecanismos de defensa del huésped (anticuerpos, PMNs, citoquinas,
prostaglandinas, etc.) dentro de los tejidos son más abundantes. Esto parece
ocurrir por lo menos en parte, debido a la hiperrespuesta a los factores, intrínsecos
(genéticos) e inducidos (fumar), que aumentan el desafío bacteriano dentro de los
tejidos que lleva al desarrollo de los signos y síntomas de la enfermedad
periodontal.
3.2 Características clínicas e histopatológicas de la enfermedad periodontal
Las encías sanas tienen entre sus características un infiltrado de células
inflamatorias, predominantemente neutrófilos asociados al epitelio de unión y
linfocitos en el tejido conectivo subyacente. Los neutrófilos predominan en la
región de la hendidura y parecen migrar continuamente a través del epitelio de
unión hacia el surco, el reclutamiento de los leucocitos de los tejidos hacia la
hendidura se debe a las acciones quimiopositivas de los sistemas del huésped
como IL-8, componente C5a del complemento, leucotrino B4, etc.
Al igual que productos derivados de los microorganismos como formal metionil
leucil fenilalanina, lipopolisacáridos, etc. Con el depósito de más placa y la
formación de gingivitis hay un marcado incremento de los leucocitos reclutados en
la zona. Un efecto adicional de la inflamación, que alienta la rápida acumulación
de leucocitos, es la regulación aumentada por las moléculas de adhesión
mediadas por citoquinas proinflamatorias. Esto induce a los polimorfonucleares en
25
las primeras etapas, a adherirse a las vénulas postcapilares y a comenzar a migrar
a través del vaso y quimiotácticamente hacia la hendidura gingival.
Dentro de los 10 a 20 días de acumulación de placa, se establecen signos de
gingivitis en la mayoría de las personas. Esta gingivitis se presenta con
enrojecimiento de las encías, tumefacción y sangrado ante un suave sondeo. Las
alteraciones clínicas pueden parecer sutiles en las primeras etapas de la gingivitis,
pero las modificaciones histopatológicas subyacentes son bastante marcadas. Se
producen cambios en la red vascular, con apertura de muchos lechos capilares. El
exudado liquido y las proteínas invaden los tejidos y se produce la penetración de
células inflamatorias en el tejido conectivo subyacente al epitelio de unión. Al
aumentar la infiltración celular se modifica la composición estructural y celular de
los tejidos (Lindhe, 2001).
En 1976, Page y Schroeder realizaron estudios en encías de perros definiendo la
progresión de la inflamación gingival y periodontal en función de la evidencia
clínica e histopatológica en cuatro fases: inicial, temprana, establecida y avanzada
(Page y col, 1976).
3.2.1 Lesión gingival inicial
Se produce 24 horas después de la acumulación de placa en el diente.
Histopatológicamente, es evidente la dilatación de las arteriolas, capilares y
vénulas. Simultáneamente a las alteraciones vasculares, la migración de los
neutrófilos desde el sistema vascular dentogingival es reforzada por las moléculas
de adhesión como la molécula-1 de adhesión intracelular (ICAM-1) y la molécula-1
de adhesión leucocitaria endotelial (ELAM-1). Los leucocitos migran por un
gradiente quimiotáctico hacia la hendidura y la mayoría tienen la capacidad de
producir receptores CD44 en sus superficies, que permite la unión de la célula con
26
el tejido conectivo. La mayoría de leucocitos se acumulan en el epitelio de unión y
en el área de la hendidura gingival (Lindhe, 2001; Page, 1976) (Figura 4).
l
3.2.2 Les
Se produ
linfocitos
etapa y s
de colág
persistir m
Tejido Gingiva
ión gingival temprana
ce aproximadamente siete días d
y neutrófilos constituyen la infilt
e observan muy pocos plasmoc
eno en el área infiltrada (Lind
ucho tiempo y con gran variabil
Tejido Gingival
2
Figura 4. Lesión gingival inicial. Sucesos clínicos e histopatológicos de la lesión. Korman, Page and Tonetti, The host response to the microbial challenge in periodontitis,1997, Periodontology 2000, Vol. 14; 33-53.
espués de la acumulación de placa. Los
ración leucocitaria predominante en esta
itos en la lesión. Se produce destrucción
he, 2001). La lesión temprana puede
idad entre un individuo al otro. (Figura 5)
Figura 5. Lesión gingival temprana. Sucesos clínicos e histopatológicos de la lesión. Korman, Page and Tonetti, The host response to the microbial challenge in periodontitis,1997, Periodontology 2000, Vol. 14; 33-53.
7
3.2.3 Lesión gingival establecida
En la lesión establecida se ven grandes cantidades de células plasmáticas
maduros situados primariamente en los tejidos conectivos coronarios, así como en
torno de los vasos, la perdida de colágeno continua al expandirse el infiltrado
inflamatorio. En esta etapa el epitelio de la bolsa no esta adherido a la superficie y
tiene una fuerte infiltración leucocitaria. Parecen existir dos tipos de lesión
establecidas, una que se mantiene estable y no progresa por meses o años y
otra que se hace mas activa y se convierte en lesiones periodontales destructivas.
(Lindhe, 2001; Page y col, 1976) (Figura 6).
Tejido Gingival
3.2.4 Lesión gingival avanzada
2
En esta lesión la placa continua su cre
células inflamatorias, principalmente célu
y mas apicalmente en los tejidos conec
características de la lesión establecida p
alveolar, el daño a las fibras es amplio
desde el límite cemento adamantino y
Figura 6. Lesión gingival establecida. Sucesos clínicos e histopatológicos de la lesión.Korman, Page and Tonetti, The host responseto the microbial challenge in periodontitis. 1997.Periodontology 2000, Vol. 14; 33-53
8
cimiento en profundidad, el infiltrado de
las plasmáticas, se extiende lateralmente
tivos. La lesión avanzada tiene todas las
ero difiere en que existe perdida de hueso
, el epitelio de unión migra apicalmente
hay amplias manifestaciones de lesión
tisular inflamatoria e inmunopatológica. La lesión ya no esta localizada y el
infiltrado celular inflamatorio se extiende lateral y apicalmente en el tejido
conectivo (Lindhe, 2001, Page, 1976) (Figura 7).
Tejido Gingival
4. INMUNOPATOGENESIS DE LA ENFER
Por décadas la patogenia de la enfermed
de un perfil celular inmunológico implicad
(Ranney y col, 1991; Seymor y col, 1993; K
Waldrop y col, 1981).
El tejido gingival en contraste con otro
inflamatorias expresan moléculas de adhe
continua de neutrófilos que migran a trav
gingival. Un estimado de 530.000 leucoci
oral en adultos con periodonto sano (Page
La barrera epitelial intacta del epitelio gin
invasión bacteriana a los tejidos periodon
barrera frente a la penetración de product
29
Figura 7. Lesión gingival avanzada. Sucesos clínicos e histopatológicos de la lesión.Korman, Page and Tonetti, The host responseto the microbial challenge in periodontitis. 1997.Periodontology 2000, Vol. 14; 33-53
MEDAD PERIODONTAL
ad periodontal ha sugerido la presencia
o en la destrucción del tejido gingival.
inaney col, 2001; Gemmell y col, 2002;
s tejidos bajo condiciones sanas no
sión como E- selectina y una corriente
és del epitelio de unión hacia el surco
tos por minuto migran hacia la cavidad
y col, 1997).
gival, surcural y de unión previenen la
tales y normalmente son una efectiva
os bacterianos y sus componentes. Las
secreciones salivares proporcionan un suministro continuo de anticuerpos
aglutinantes específicos que pueden agregar y matar bacterias presentes.
Cuando hay un incremento del desafío bacteriano, los componentes bacterianos o
sus productos de desecho interactúan con el epitelio y penetran hacia el tejido
conectivo induciendo un aumento en la expresión de moléculas de adhesión como
la E-selectina y de productos pro inflamatorios como citoquinas y quemoquinas.
Hay un aumento en la permeabilidad vascular y señales quimoatrayentes que
guían a los leucocitos (especialmente neutrófilos) hacia los tejidos gingivales.
Si el desafío microbiano permanece inalterado en cuestión de días aparece la
gingivitis. Si la actividad de defensa del huésped puede detener este desafío
resulta en una inflamación que no empeora a menos que el reto microbiano logre
superar la defensa del huésped. Cuando esto ocurre la placa supragingival se
extiende hacia el surco gingival interrumpiendo la unión entre la mayor parte de la
porción coronaria del epitelio de unión y la superficie de la raíz formando “una
bolsa” superficial gingival.
Esta última, proporciona acceso disponible para que sustancias bacterianas
rieguen el tejido y activen células epiteliales que expresan IL-8 y células
endoteliales para aumentar la expresión de las moléculas de adhesión que resulta
en aumento de la migración de linfocitos, edema y formación de infiltrado celular
inflamatorio, este infiltrado consiste en monocitos, linfocitos T (CD8+ y CD4+),
linfocitos B y neutrófilos (Page y col, 1997).
30
Citoquinas producidas por estas células y antígenos bacterianos conducen la
diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas productoras de anticuerpos
creando una respuesta humoral. Cuando la formación de placa continúa hay
formación de un infiltrado inflamatorio en los tejidos conectivos donde predominan
los linfocitos (especialmente linfocitos T) y algunos macrófagos.
Los macrófagos activados por el lipolisacárido producen IL-1β, factor de necrosis
tumoral α (TNF-α), metaloproteinasas de matriz y prostaglandina E2 (PGE2). La IL-
1β y el TNF-α activan los fibroblastos residentes para producir PGE2 y
metaloproteinasas. Ambos activan tipos celulares que disminuyen la producción
de inhibidores de metaloproteinasas de tejido, dando como resultando un gran
aumento de los niveles de metaloproteinasas de matriz. Estas destruyen
componentes de la matriz extracelular creando un espacio para la expansión del
tejido.
Las células epiteliales activadas por lipopolisacárido producen metaloproteinasas
de matriz que destruyen las fibras agregadas de colágeno y el epitelio de unión
permitiendo la extensión apical del epitelio formando una bolsa gingival. Las
metaloproteinasas de matriz median la pérdida de la ligadura clínica y la
prostaglandina media la resorción del hueso alveolar (y en algunos casos el
cemento y la dentina), y la bolsa gingival progresa para volverse una bolsa
periodontal. Siguiente a esto hay un cambio en la naturaleza de la respuesta
inflamatoria (hacia LB y células plasmáticas) que termina en la producción de
anticuerpos protectores y subsiguiente control de la infección o anticuerpos no
protectores, destrucción del tejido conectivo y pérdida de hueso (Page y col,
1997).
Células del sistema inmune en la enfermedad periodontal
Células fagocíticas como neutrófilos y macrófagos constituyen la primera línea de
defensa contra las infecciones bacterianas. Los neutrófilos han sido descritos
como las células más importantes en la enfermedad periodontal ya que existen
evidencias que en pacientes con enfermedades con déficit de neutrófilos como la
neutropenia cíclica, síndrome de Chediak-Higashi o síndrome de deficiencia de
31
adhesión leucocitaria tienen un incremento en la susceptibilidad a tener
destrucción periodontal. (Waldrop y col, 1987; Cohen y col, 1961; Hamilton y col,
1974; Springer y col, 1984).
La función más importante de los neutrófilos es la fagocitosis y muerte de los
microorganismos. En el surco gingival los neutrófilos forman una barrera entre el
epitelio y la placa que previene la invasión bacteriana hacia el epitelio y daño al
tejido conectivo. Los neutrófilos pueden minimizar los efectos destructivos. Sin
embargo bacterias como P. gingivalis tienen el poder de evadir la respuesta
inmune innata. P. gingivalis no estimula la expresión de la E-selectina sobre la
superficie de la célula endotelial para de esta manera inhibir la migración de
neutrófilos hacia la circulación de los tejidos. P. gingivalis induce bloqueo de la
migración de neutrófilos hacia el epitelio oral por el bloqueo en la producción de IL-
8. Además P. gingivalis produce proteasas que pueden clivar el complemento y
las inmunoglobulinas. Previniendo la opsonización y la subsiguiente muerte del
neutrófilo que ha fagocitado la bacteria.
Además de procesar los antígenos para la activación del sistema inmune
especifico, los neutrófilos dentro de los tejidos secretan varias citoquinas en
respuesta a los antígenos. Estas citoquinas tienen varias funciones: inducir
inflamación, daño del tejido y amplificación de la respuesta inmune específica.
El daño del tejido puede ocurrir directamente por el neutrófilo que secreta enzimas
o indirectamente por la estimulación por parte de las enzimas a células como el
fibroblasto. Además, las citoquinas producidas por el neutrófilo como IL-1β y PGE2
promueven el daño del hueso (Dennison y col, 1997).
32
La histopatología de la gingivitis establecida en adultos muestra un predominio de
células plasmáticas. Estos hechos pueden llevar a la confirmación de la hipótesis
de que el evento crítico de la progresión de la periodontitis es la conversión de
lesiones con predominio de células T hacia un predominio de células B en lesiones
más avanzadas (Seymour y col, 1979; Van Dyke y col, 1993).
Claro que en estas últimas también se observa la presencia de linfocitos T
supresores (CD4+) y linfocitos T citotóxicos (CD8+) al igual que algunas células
NK. Es por esto que en las diferentes publicaciones se evidencia una importancia
de la inmunidad celular adquirida de acuerdo al estadio de progresión de la lesión
periodontal (Page y col, 1976, Seymour y col, 1979) al igual que una relación
directa entre la respuesta del huésped mediada por células T y sus perfiles de
citoquinas, y la susceptibilidad del huésped a presentar una lesión estable o una
lesión periodontal progresiva (Gemmell y Col, 1997).
5. LIPOPOLISACÁRIDO BACTERIANO E INMUNIDAD INNATA:
El LPS bacteriano, es el mayor componente de la membrana externa de todas las
bacterias Gram-negativas, y actúan como fuertes estimuladores de la inmunidad
natural ó innata en diversas especies eucariotas de insectos a humanos
(Alexander y col, 2.001) (Figura 8).
33
Figura 8. Arquitectura de una pared celular de una bacteriaGram negativa. Alexander C, Rietschel E. BacterialLipopolysaccharides and Innate Immunity. J EndotoxinResearch 2001; 7(3): 167-202.
Los LPS son moléculas estables al calor, compuestas por un componente
lipofílico, el lípido A y una región de poli- ó oligosacáridos que está
covalentemente unida a su dominio de anclaje de membrana externa bacteriana
(Figura 9).
Polisacárido Fosfolípido
Región central Lípido A
Cadena-O específica
NH3+
-P - Kdo
P - GlcN-Kdo
Kdo -
PHep -
GlcN
P
Hep -
Hep -P n
Unidad de Repetición
Interno Externo
Figura 9. Estructura química del Lipopolisacárido.
El LPS tiene enormes variantes debido a una diversidad en la composición
química de la región de polisacárido, y a las variaciones en la estructura fina del
lípido A, el cuál está formado por cadenas de manosa. El lípido A, es el centro
inmunoestimulatorio del LPS, determinando la endotoxicidad en especies
mamíferas. De esta forma, es el responsable del efecto del lipopolisacárido,
debido a la especificidad y al reconocimiento altamente sensible por numerosos
componentes celulares y humorales de la inmunidad innata, vía receptor manosa
(Alexander y col, 2.001).
34
La porción oligosacárido está constituida por dos subregiones: la región central y
la cadena O- específica. Ésta última está compuesta por 50 unidades de repetición
y de cadenas ricas en manosa, responsables junto con la porción del lípido A, de
la propiedad del LPS como adyuvante en muchas vacunas, ya que aumenta la
respuesta inmune.
En la región central del oligosacárido se encuentra el centro externo e interno, los
cuales pueden ser distinguidos de acuerdo a la composición predominante de
carbohidratos.
La región central externa principalmente está constituida de hexosas semejantes a
D-glucosa, D-galactosa, D-glucosamina, N-acetilglucosamina ó N-
acetilgalactosamina. La región central interna muestra una variabilidad dentro de
la región de polisacáridos y en muchas bacterias Gram-negativas. Consiste en
unidades de monosacáridos 3-deoxi-D-mano-ácido octulosónico usualmente
también denominado 2-keto-3-ácido deoxioctulosonico y L- ó D-glicero-D-mano-
heptosa a menudo transportando sustituyentes aniónicos semejantes a grupos
fosfato, difosfato ó difosfoetanolamina.
El azúcar ácido Kdo representa una característica y un componente esencial de la
región central interna del LPS bacteriano y es además considerado un marcador
de diagnóstico para LPS y blanco en el desarrollo de nuevos agentes
antibacterianos en la inhibición del paso Kdo en la biosíntesis de LPS.
35
La estructura del lípido A, está caracterizada por una unidad de disacárido unida
central β(1→6), que está compuesta de D-glucosamina (D-GlcN) ó D-2,3-diamino-
2,3-dideoxy-glucosa (D-GlcN3N; DAG) en cada combinación homodimérica ó
heterodimérica y en la cual en muchos casos es monofosforilada en posiciones 1 y
4’ (Alexander y col, 2.001).
El lípido A y el centro interno, contienen muchos grupos aniónicos formando una
estructura ó región cargada negativamente, la cual es fuertemente estabilizada por
cationes divalentes asociados. Al mismo tiempo es blanco para una amplia
variedad de antibióticos catiónicos cargados positivamente en defensa contra el
microorganismo (Alexander y col, 2.001).
La familia de receptores Toll-like (TLR), son activados por LPS en numerosas
células eucariotas incluyendo el grupo de fagocitos naturales, pero de forma
especial con el TLR-4 y con el antígeno de membrana CD14 presentes en
monocitos/macrófagos (Bainbridgey col, 2.002), neutrófilos y actualmente
descubierto en células dendríticas, permitiendo la maduración y la activación de
esas células presentadoras de antígeno (Alexander y col, 2.001; Dixon y col,
2.005).
Además, diversos tipos de LPS ó lípido A pueden inducir una activación de la
cascada de proteasas serinas humorales constituyentes del sistema complemento
en mamíferos, ya que representa un marcador altamente específico ó modelo
molecular asociado a patógenos (PAMP) para la infección por la bacteria Gram-
negativa.
El sistema fagocítico representa filogenéticamente el sistema inmune en
vertebrados más antiguamente estudiado. Las células, las cuales son altamente
sensibles al LPS ó al lípido A han sido detectadas por el sistema hemolinfoide. Los
gránulos de sus hemocitos ó amebocitos contienen una serie de proteasas de
serina cimógenas que forman una cascada de coagulación sensitiva al lípido A ó
al LPS simulando la coagulación sanguínea y el sistema de complemento de
organismos mamíferos.
36
Siguiendo la degranulación amebocítica inducida por el LPS ó la bacteria intacta,
la activación extracelular de la cascada de proteasas serina conduce a la
formación local de un gel que media la inmovilización inicial de los
microorganismos en el sistema hemolinfoide invertebrado, facilitando el
subsecuente ataque sobre los agentes infecciosos por una serie de péptidos
antimicrobianos. Este sistema proveyó la base para el desarrollo del ensayo de
lisado amebocitico Limulus.
Entonces, el test Limulus, es derivado de un invertebrado marino y es similar a la
cascada del complemento mamífero y reconoce un amplio espectro de variantes
de LPS ó lípido A más que el sistema sensor de endotoxina celular central de los
fagocitos mamíferos (Alexander y col, 2.001).
La activación temprana de la inmunidad innata vía el dominio del lípido A, también
induce subsecuentemente el reclutamiento de los componentes de la respuesta
inmune específica, como es la selección y expansión clonal de linfocitos T y B
antígeno-específicos. Esta fase de blanqueamiento particular de la especie
bacteriana infectada normalmente resulta en la producción de anticuerpos
específicos, que son frecuentemente dirigidos contra epítopes expresados por la
porción polisacárido de LPS, pero también otros antígenos bacterianos.
La activación secuencial de la inmunidad adaptativa e innata inducida por el lípido
A-dominio de LPS es en muchos casos seguido por la generación de un memoria
inmunológica protectora para la especies particulares infectantes y cepas de
bacterias Gram-negativas.
El reconocimiento del LPS es iniciada por LBP (proteína fijadora del
lipopolisacárido), una glicoproteína extracelular de 58 kDa que selectivamente
opsoniza agregados estructurales de LPS por la subsecuente adherencia
37
dependiente de mCD14 en la superficie de los fagocitos, ó en la forma soluble
sCD14 en el espacio extracelular (Alexander y col, 2.001).
En humanos, especialmente los mononucleares reaccionan con extrema
sensibilidad a las preparaciones de LPS endotóxicamente activas in vitro, pero la
hipersensibilización es clave, especialmente causada por el IFN-γ, el cual induce la
expresión de mRNA de TLR4 en monocitos y neutrófilos, conduciendo a la
secreción de un amplio espectro de mediadores endógenos, entre los cuales se
encuentra las citoquinas proinflamatorias TNF-α, factor inhibitorio de migración del
macrófago (MIF), citoquinas como IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, el factor
estimulador de colonias M-CSF, G-CSF y GM-CSF, mediadores derivados de
lípidos semejante al factor activador de plaquetas (PAF), prostaglandina E2
(PGE2), tromboxano A2 (TXA2) ó leucotrienos, como bien especies reducidas de
oxígeno semejantes al anión superóxido (O2-), radicales hidroxilo (OH) ú oxido
nítrico (NO).
Adicionalmente, el LPS puede causar una activación intensa y rápida del sistema
complemento en vertebrados, por las tres vías: clásica, alternativa y de las
lectinas, vía el dominio de lípido A y la región polisacárido respectivamente. La
activación del complemento por el LPS ó la bacteria Gram-negativa intacta
contribuye a la opsonización mediada por suero y a la muerte de la bacteria
invasora. También participar en la inducción de actividades celulares del huésped
por la liberación de anafilotoxinas como C3a y C5a.
Dos proteínas humorales de la familia pentraxina, la proteína C reactiva (PCR) y P
amiloide de suero (SAP), están involucradas en la activación del complemento
inducida por LPS ó el lípido A. Los reactantes de fase aguda PCR activan la
cascada del complemento por la vía clásica en una manera independiente de
anticuerpos, por la unión del LPS y otros polisacáridos microbianos, SAP ha sido
38
identificado como una proteína de reconocimiento del lípido A, la cual inhibe
específicamente la activación del complemento por la vía clásica inducida por
ciertos tipos R de LPS ó LOS y la correspondiente bacteria intacta.
La forma soluble ó secretada del antígeno CD14, agonísticamente eficiente al
LPS, puede activar constitutivamente células CD14 negativas y positivas, como las
células dendríticas, células endoteliales, células del músculo liso, células
epiteliales y fibroblastos, muchas de las cuales expresan TLR-4 (Alexander y col,
2.001; Dixon y col, 2.005).
Por diversos mecanismos paracrinos y autocrinos, los mediadores endógenos
liberados durante la fase temprana de la activación inducida por la endotoxina de
la inmunidad innata, inician un complejo de reacciones secundarias como: la
secreción de proteínas de fase aguda por los hepatocitos del hígado, la activación
de linfocitos, trombocitos, basófilos, mastocitos y eosinófilos, una actividad
hematopoyética elevada de la médula ósea y un incremento en el estado
procoagulante sistémico.
IL-12 e IL-18 han mostrado ser sinergistas estimuladores de producción de IFN-γ
por TH1 y células NK y pueden indirectamente reforzar la respuesta de
mononucleares al LPS.
Efectos pleiotrópicos de LPS inducidos por medidores endógenos incluyen la
secreción de sustancias neuroendocrinas, por activación del axis hipotálamo,
pituitaria-adrenal (HPA), induciendo la secreción de hormonas y neuropéptidos
tales como los glucocorticoides, catecolaminas ó endorfinas representando un
camino sistémico para la regulación de la respuesta inflamatoria por feedback.
39
Los mediadores inflamatorios primarios, inician una comunicación bidireccional
entre las células del sistema inmune y el cerebro, orquestando una serie de
cambios hormonales, de crecimiento y fisiológicos referidos como “sickness
response” (respuesta a la enfermedad). De acuerdo con esto, la IL-1β y la IL-6 son
los mediadores citoquinas primarios en la inducción clásica de la fiebre por
agonistas del LPS. La PGE2 y la transmisión neuronal vía fibras nerviosas vagus
aferente activadas por esos mediadores, pueden contribuir a la reacción
pirogénica que es centralmente regulada por el hipotálamo anterior preóptico en el
Sistema Nervioso Central (SNC).
Los glucocorticoides y catecolaminas proveen un camino hormonal central para la
baja modulación sistémica ó supresión de la inmunoactivación pro-inflamatoria
inducida por la endotoxina. Los efectos antinflamatorios de las catecolaminas tales
como la epinefrina ó la norepinefrina ayudan a la inducción rápida de la IL-10 en
células mononucleares humanas in vitro, en cambio los glucocorticoides inducen
inhibición en la expresión de citoquinas en células mieloides por interferencia con
el camino de señalización intracelular específicamente en el sistema de activación
NF-κB, además son considerados inmunosupresores clásicos.
Otros estudios han reportado que los glucocorticoides en forma mínima también
pueden inducir localmente la secreción del factor inhibidor de migración del
macrófago (MIF) por los fagocitos mononucleares, linfocitos T y otras células. MIF
antagonistamente neutraliza ó anula el efecto inmunosupresor del glucocorticoide
y refuerza la activación inflamatoria de células mieloides. Entonces, MIF puede
fisiológicamente proveer el mantenimiento de una respuesta pro-inflamatoria local
en el sitio de la infección a pesar de la presencia de glucocorticoides en la
circulación.
Dependiendo de la dosis, de la ruta de aplicación de LPS, y de la susceptibilidad
genética individual (polimorfismo de TLR4), el LPS puede inducir un incremento de
la resistencia inmune general contra infecciones microbianas ó virales, como bien
enfermedades neoplásicas ó evocar serios síntomas patológicos característicos de
40
varias formas de síndromes sépticos relacionados a la bacteria Gram-negativa
como bacteremia y endotoxemia (Abreu y col, 2.004).
El mimetismo de los glicoconjugados del huésped por las estructuras de
oligosacáridos terminales de LPS contribuye al incremento en la resistencia de la
especie bacteriana en particular ó de cepas, a la fagocitosis y actividades
bactericidas como el sistema complemento por la vía clásica ó alterna.
Un estado de desensibilización reversible en la reactividad a la endotoxina de
acuerdo a la secreción de citoquinas proinflamatorias mayores ha sido observado,
la cual puede ser inducido por la exposición previa a la endotoxina a la cual es
comúnmente referida como “tolerancia a la endotoxina”. Esta tolerancia puede ser
debida a efectos autocrinos de diversos mediadores de fase tardía provocada por
la respuesta inicial al LPS tal como la IL-10, TGF-β ó PGE2.
La baja regulación del componente de señalización intracelular receptor IL-1
asociado a kinasas (IRAK ó IRAK-1) ha sido implicado en la inducción del estado
tolerante a la endotoxina de células mononucleares humanas in vitro. La
regulación de la expresión del gen ó el estado funcional de TLR4 como también de
la proteína MD-2 asociada a TLR4, contribuyen la inducción de la tolerancia a la
endotoxina en células mononucleares in vitro, en presencia de IL-10, IL-4, IL-11,
IL-13, TGF-β, PGE2, glucocorticiodes, catecolaminas, camino regulatorio neuronal,
y una incrementada neutralización ó eliminación de LPS sistémico (Alexander y
col, 2.001)
6. RESPUESTA INMUNE INNATA EN MUCOSA ORAL:
Las células de la mucosa oral en especial las epiteliales actúan como una barrera
física contra la invasión de organismos patogénicos y en zonas inflamadas
41
expresan diversas citoquinas proinflamatorias como la IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α y
moléculas de adhesión, permitiendo en estas zonas además, la presencia de
células T, B, monocitos y neutrófilos, induciendo una inflamación crónica oral tal
como sucede en la periodontitis.
Pocos estudios han demostrado que la producción de citoquinas por las células
epiteliales gingivales humanas es causada por la bacteria misma. Varias teorías
soportan lo anterior a partir de estudios realizados in vitro, como por ejemplo:
1. Al poner células epiteliales humanas en cultivo en presencia de IFN-γ por
tres días y componentes bacterianos (LPS, LTA (ácido lipoteicoico), PGN
(peptidoglicano), se observó respuesta de las células epiteliales humanas
por la producción de IL-8 y GM-CSF.
2. Se observa también en las células epiteliales la presencia de mRNA de
CD14, Toll-like receptor (TLR)2, TLR4, MD-2 ó MyD88, receptores
importantes para la activación de las células con el LPS bacteriano (Wang y
col, 1998, Mochizuki y col, 2004).
3. Las células epiteliales orales constitutivamente expresan mRNA de la IL-18
en coestimulación con proteinasa del neutrófilo 3 (PR3) y LPS por 24 h
después de la imprimación de IFN-γ por 3 días. PR3 es una proteinasa
serina de 29 kDa secretada por los neutrófilos activados, participando
activamente en el proceso inflamatorio. El mecanismo por el cual PR3
activa las células epiteliales es por medio del clivaje del péptido
correspondiente a la porción N-terminal del receptor activado de proteasa -2
(PAR-2) con exposición a su ligando tetéreo.
4. PR3 solo, activó las células e indujo IL-8 y MCP-1 (proteína
quemoatrayente de monocito) y la expresión de ICAM-1 (molécula de
adhesión intercelular 1, en una manera dosis dependiente. Esos hallazgos
42
sugieren que PR3 del neutrófilo pueden activar las células epiteliales orales
a través de la proteína acoplada G PAR-2
Estos resultados sugieren que la respuesta inmune innata de las células epiteliales
orales es regulada en el proceso inflamatorio (Sugawara y col, 2.002).
El LPS de P. gingivalis (Wang y col, 1998; Sugawara y col, 1998) y de A. a.
(Mochizuki y col, 2004) ha sido implicado en la iniciación y desarrollo de la
enfermedad periodontal, ya que se encontró que activa el fibroblasto gingival
humano vía CD14 e induce la secreción de IL-6, citoquina que estimula al
osteoclasto para producir la reabsorción ósea osteoclástica (Wang y col, 1998), de
IL-1 e IL-8 citoquinas quimioatrayentes (Sugawara y col, 1998) y de moléculas de
adhesión, conduciendo a la pérdida del soporte dentario (Hayashi y col, 1999).
El lipopolisacárido se une a una proteína de unión de 60 kDa, glicoproteína
encontrada en el suero de fase aguda y normal, y aumenta la sensibilidad de
monocitos/macrófagos y neutrófilos al LPS (Wang y col, 1998).
CD14 existe en dos formas: una proteína de anclaje fosfatidilinositol, expresada
fuertemente en la superficie de monocitos/macrófagos, y débilmente en neutrófilos
y fibroblastos, funciona principalmente como un receptor para un complejo de
lipopolisacáridos y la proteína de unión (Wang y col, 1998), y una forma soluble
secretada en orina, suero (Hayashi y col, 1999) y recientemente en saliva (Wang y
col, 1998, Sugawara y col, 1998).
43
Cuando sucede la unión del CD14 con el LPS, se induce la activación de diversas
proteínas quinasas tales como la proteína kinasa C, la proteína tirosin kinasa y la
proteína kinasa activada por mitógeno. La fosforilación de proteínas intracelulares
es esencial para la activación funcional de monocito/macrófago, neutrófilo y el
fibroblasto gingival inducida por LPS (Wang y col, 1998, Wang y col, 2.002)
Varios estudios han mostrado que la saliva tiene una función crítica en el
mantenimiento y protección de la salud oral, ya que contiene numerosas proteínas
y glicoproteínas que protegen los tejidos orales, pero poco es conocido a cerca de
su papel en la inmunidad innata.
Inmunohistoquímicamente se ha encontrado la presencia de la proteína CD14 en
las células del ducto intercalado y acinar de la glándula parótida humana, una
glándula serosa. En la glándula submandibular, una glándula mixta (células
mucosas y serosas), CD14 es expresado en las células serosas, más no en las
mucosas.
Se demostró que la glándula parótida secreta 10 veces más CD14 que las otras
glándulas, y que CD14 es secretada constitutivamente y está presente en la
saliva, ayudando en la activación y producción de IL-8 por células epiteliales
orales carentes de CD14 ó TLR-4, por la presencia de LPS bacteriano; sugiriendo
un papel protector de CD14 en el mantenimiento de la salud oral (Sugawara y col,
2.002, Hayashi y col, 1999).
7. TOLERANCIA ORAL
La tolerancia oral ha sido reconocida como una forma de tolerancia periférica en la
cual los linfocitos maduros en los tejidos linfoides periféricos son no funcionales ó
con hiporrespuesta por previa administración oral de antígeno (Strobel y col,
1998).
44
El término tolerancia también se le ha dado a la respuesta fisiológica a antígenos
de comida y flora común por la inducción de un estado de no respuesta
inmunológica. En contraste, antígenos asociados con patógenos ó aquellos que
desencadenan inflamación ó una respuesta inmune potente en el intestino, indican
que el sistema inmune puede además distinguir entre antígenos inocuos ó
potencialmente dañinos (Garside y col, 2.001; Smith y col, 2.000).
La exposición oral al antígeno tiene diversos resultados potenciales, incluyendo:
1. Inducción de la hiporrespuesta inmunológica (tolerancia)
2. Imprimación sistémica
3. Inducción de la IgA secretoria local en ausencia de respuesta inmune sistémica
moderada.
La exposición a patógenos vivos ó multiplicantes conduce a una imprimación local
y sistémica, donde el resultado más frecuente de un encuentro oral con el
antígeno soluble es la tolerancia sistémica.
Muchos aspectos de la respuesta inmune sistémica de animales vírgenes pueden
ser suprimidos por antígenos alimentarios múltiples ó simples. Alimentos simples
han demostrado inhibir respuesta de anticuerpos como IgM, IgG e IgE, respuesta
inmune mediada por células tales como la hipersensibilidad de tipo retardada,
proliferación de célula T, sensibilidad al contacto y respuesta de células T
citotóxica (CD8+) y producción de citoquinas.
Algunos autores reportan que la tolerancia puede ser debida por una supresión de
la inmunidad sistémica acompañada por la producción de la IgA secretoria local ó
la inducción de la célula T en las placas de Peyer, que ayudan en la producción de
IgA. Otros reportan que la producción de IgA intestinal es reducida por la
administración oral de antígenos. Los anticuerpos IgA secretores específicos a
alimentos son generalmente ausentes en individuos normales, indicando que la
producción de IgA mucosal es regulada en un camino similar a la inmunidad
sistémica (Strobel y col, 1998).
45
Aparte de los antígenos alimentarios a los cuales los sujetos están
constantemente en contacto, hay que tener en cuenta que en la cavidad oral
habitan aproximadamente 500 especies bacterianas diferentes, incluyendo
microorganismos comunes y patógenos, los cuales de una u otra manera pueden
generar tolerancia oral.
Los comensales intestinales juegan un importante papel temprano en la
estimulación de la respuesta inmune durante el desarrollo postnatal. Más tarde
esa respuesta inmune sistémica y local es bajo regulada y reprogramada por
inducción de la tolerancia oral.
La inducción de la tolerancia inmune hacia comensales combinada con la
respuesta a patógenos es esencial para sostener la homeostasis inmune mientras
se previene las infecciones que amenazan la vida. No es claro aún como la
mucosa oral puede distinguir entre patógenos y comensales y realizar una
apropiada respuesta.
Dentro de los mecanismos potenciales de tolerancia se pueden encontrar los
siguientes:
Deleción: Normalmente la célula T puede encontrar el antígeno y desencadenar
un proceso funcional que termina en la eliminación del mismo. Esto puede ser
alterado dependiendo de la dosis del antígeno. Se ha comprobado que en las
células T antígeno específicas se les puede inducir un estado de deleción, cuando
se han ingerido dosis altas de antígeno, produciendo una Tolerancia de larga
duración y estable. Una dosis baja de antígeno en frecuencias cortas puede
producir el mismo efecto en la célula T.
46
Anergia: este estado además de ser producido por dosis altas de antígeno durante
la ingesta, también puede ser causada por una mala presentación antigénica, la
cual puede ser por:
a. Presentación del antígeno en ausencia de coestimulación. Esto puede ser
observado cuando la célula T puede tener fallas funcionales. Esta mala
presentación puede depender del fenotipo y el estado de activación de la célula
presentadora de antígeno. No es igual una APC profesional a la no profesional, ya
que estas últimas poseen un bajo potencial coestimulatorio.
b. Ausencia de mediadores inflamatorios por ejemplo citoquinas.
c. Ausencia de adyuvante (Smith y col, 2.000)
Células T regulatorias: La inducción de células T regulatorias puede inducir
tolerancia en las células T. La respuesta de estas células tras la activación
antigénica, tienen como producto la secreción de citoquinas, respuesta
denominada TH3. Dentro de estas se encuentran la IL-4, IL-10 y la TGF-β. La IL-4
no parece esencial en la tolerancia oral (Smith y col, 2.000). Particularmente a la
IL-10 se le ha otorgado el papel de inhibir la respuesta de tipo TH1, principalmente
en la modulación de la respuesta inmunológica (tolerancia). A la TGF-β, además
de ayudar en el cambio de clase de la IgA, también se le ha dado un papel en la
homeostasis epitelial y tolerancia oral.
Interacción-Afinidad: dependiente del contacto célula-célula durante la
presentación antigénica. Esto puede ser modificado por citoquinas, quemoquinas,
moléculas de unión a membrana, etc. (Garside y col, 2.001) (Smith y col, 2.000).
El trayecto: porque la tolerancia se puede dar en cualquier parte del sistema
inmune de mucosas. En el mismo momento en que el antígeno es digerido, este
47
puede ser destruido por digestión antes de llegar a la barrera epitelial asociado a
mucosas, la cual tiene dos funciones importantes:
a. Presentación: Las células epiteliales intestinales expresan moléculas del
Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II, las cuales se comportan como
APC no profesionales, ya que no poseen moléculas coestimulatorias y se va a dar
una presentación antigénica polarizada.
b. Filtración: es la capacidad de esta barrera para señalizar ó indicar a las células
T y APC de microorganismos dañosos o no. Esta filtración puede hacerse ya que
puede remover agregados inmunogénicos en formas solubles gracias a la
motilidad del tejido.
Sitios:
GALT se puede presentar por células B poco competentes ó en reposo, por la
presencia de Células Dendríticas que expresan un ligando flt3: aumentando la
susceptibilidad a la tolerancia oral.
Lámina Propia: permanece en estudio.
Placas de Peyer: por la presencia de células dendríticas que producen IL-10, con
capacidad de primar a la célula T para que produzca esta citoquina.
Nódulos linfoides mesentéricos: células dendríticas con fenotipo: CD4-OX41+,
CD4-OX41-, son células dendríticas que migran constantemente de las placas de
Peyer y pared intestinal a los nódulos linfoides mesentéricos, con pobre capacidad
de presentación antigénica. Contienen inclusiones apoptóticas derivadas de IEC,
produciendo una presentación antigénica tolerogénica a células T vírgenes.
(Garside y col, 2.001)
48
En cavidad oral se puede presentar una tolerancia oral local a partir de la
presencia de microorganismos orales como P. gingivalis ó A.a. entre otros.
La P. gingivalis es un habitante oral que como se ha visto y descrito anteriormente,
produce la enfermedad periodontal, incita una respuesta inmune de tipo TH1 in
vivo e in vitro y al mismo tiempo induce una tolerancia oral in vitro, ya que las
células epiteliales gingivales pueden ser sujetas a una regulación negativa de los
TLRs presentes en la superficie y a otros receptores de mediadores inflamatorios,
debido a la exposición repetida de los patrones moleculares asociados a
patógenos provenientes de los microorganismos presentes en la placa bacteriana,
dando como resultado de forma local una tolerancia a la endotoxina, lo que puede
resultar en una resistencia a la infección (Bainbridge y col, 2.001; Muthukuru y col,
2005; Cross y col, 2002; Cavaillón y col, 2.003)
Lo anterior puede ser soportado a partir de ensayos realizados en 1.997 por
Ogawa y colaboradores, quienes observaron in vitro, que los fibroblastos
gingivales inflamados humanos de pacientes con enfermedad periodontal,
produjeron menores cantidades de IL-8 comparados con los fibroblastos de
sujetos sanos en presencia de componentes celulares de la P. gingivalis, tales
como fimbrias, LPS y lípido A, en repetidas oportunidades ó en exposiciones
prolongadas lo que puede explicar la presencia de la enfermedad. Esta respuesta
no fue igual con componentes de otras especies (Ogawa y col, 1.997).
49
La tolerancia a la endotoxina, es un fenómeno muy bien descrito in vivo, que
resulta de la exposición sostenida de LPS en dosis subletales de forma
intravenosa (inducción de la tolerancia sistémica), intraperitoneal ó intradérmica
(inducción de la tolerancia local) (Muthukuru y col, 2005). Otros autores la definen
como el estado de hipo respuesta después de un segundo contacto ó dosis
adicionales de endotoxina, contraria a la respuesta observada después de una
exposición inicial a la misma (Cross y col, 2.002; Cavaillón y col, 2.003).
Además, de forma importante, los mediadores de la inflamación como la IL-1α, IL-
1β, TNF-α, IL-18 y la IL-6 (Muthukuru y col, 2005; Cavaillón y col, 2.003), regulan
este proceso; que junto con la tolerancia, ayudan a la destrucción del tejido y a
favorecer la patogénesis de la enfermedad periodontal. Modelos in vivo reflejan
que los niveles de estas citoquinas se mantienen estables, in vitro la
hiporeactividad de estas, es dosis dependiente, es decir, se presenta más severa
después del estímulo con grandes cantidades de LPS, mientras que ex vivo,
monocitos de pacientes con sepsis, la cantidad de citoquinas fue reducida. En los
neutrófilos circulantes de pacientes con sepsis la producción de IL-1β in vitro fue
disminuida también (Cavaillón y col, 2.003).
Desde 1.980 la inducción de la tolerancia por el LPS sobre las citoquinas fue
descrita. Se ha reportado disminución en la producción de IFN-γ (Cavaillón y col,
2.003), la actividad estimulante de colonias granulocito-macrófago en modelo
animal, desencadenando un estado refractario de las células inmunocompetentes;
mientras que in vitro, se incrementó la función de CSA con repetidas exposiciones
al LPS. Una medida del estado tolerante por LPS es la reducida expresión de
citoquinas seguida de la exposición por el LPS.
Las citoquinas como la IL-6, IL-12 y reactantes de fase aguda (en ausencia de IL-
10 y TGF-β) pueden disminuir en el estado tolerante desencadenado por el LPS,
mientras que la IL-1, la IL-8 y algunas quemoquinas han presentado resultados
variables, ya que algunos estudios ha demostrado reducción mínima y en otros no.
Con respecto a la IL-10 y al TNF-β, tampoco hay resultados conclusivos, ya que
algunos autores reportan ausencia de éstas y otros demuestran la presencia de
las mismas, que estando combinadas actúan como coadyuvantes a la tolerancia y
agravantes de la enfermedad (Cross y col, 2.002). Entre otros mecanismos que
50
pueden participar en la tolerancia a la endotoxina, están los glucocorticoides, los
macrófagos, inhibidores específicos del LPS como las propiedades inhibitorias del
plasma los cuales contienen altos niveles de sCD14 y proteínas de unión al LPS,
los cuales pueden ser inhibitorios para la avivación inducida por el LPS en altas
concentraciones (Cavaillón y col, 2.003).
A través de los avances, se ha demostrado que la porción lípido A de la molécula
es el principio activo del LPS, al cual se le atribuye su función. Esta actúa
directamente a través del TLR4 presente en las células. Otra molécula inductora
de fiebre que puede inducir tolerancia es la MDP (dipédptido muramil sintético), el
cual actúa directamente en el TLR2. Este último receptor también actúa con
lipoproteínas y peptidoglicanos de la bacteria. Receptores como TLR5 se activan
frente a la flagelina bacteriana y el TLR9 por el DNA.
Además de la baja regulación de los receptores que actúan con el LPS, la falta de
activación o la refractoriedad de proteínas encargadas de la traducción de
señales, con la consecutiva activación de genes, también puede explicar la
presencia de tolerancia a la endotoxina. Por ejemplo la disminución de las
proteínas de unión GTP, las MAP kinasas, y el factor transcripcional NFκβ (Cross
y col, 2.002)
Vogel en 1.985 reportó que la inducción de la tolerancia por LPS fue asociada con
un incremento en el recuento de macrófagos de la médula ósea, y sugirió que la
falta de respuesta de LPS por los macrófagos puede ser debido a la falla de
respuesta en las células inmaduras. De esa forma el macrófago no puede producir
IFN-γ, tampoco puede actuar sobre otras células como las T (alteración en la
proporción CD4/CD8) y las NK y mucho menos éstas últimas podrán funcionar
contra el patógeno atacante.
51
Las células dendríticas y las células epiteliales también pueden ser tolerizadas por
el LPS. Las células dendríticas en presencia de la endotoxina producen poca IL-
10, IL-12 y TNF. Durante el estado tolerante, algunas funciones son retenidas
como por ejemplo la presentación de antígenos. Con las células endoteliales se
observa una reducida expresión de NF-κβ y E-selectina, no cambia la expresión
de ICAM1 y hay una reducida habilidad para soportar la adhesión de
polimorfonucleares (PMN) (Cross y col, 2.002)
Se ha comprobado in vitro, que la tolerancia a la endotoxina puede ser reversible,
con el uso de IFN-γ ó con (GM-CSF) factor estimulante de colonias granulocito-
macrófago, siempre y cuando se inducida en dosis bajas de LPS, particularmente
por la inhibición de la degradación de IRAK y por la promoción de su asociación
con MyD88, después de una segunda estimulación con LPS, lo cual conduce a
una activación de NFκβ y a la producción de TNF. In vivo el IFN-γ y GM-CSF
restaura la respuesta a sistémica de TNF a LPS en ratones tolerantes a la
endotoxina. En humanos, la inyección subcutánea de IFN-γ en pacientes con
cáncer reversó la reducción de niveles en suero de TNF, IL-6 y GM-CSF en
respuesta a un segundo cambio de LPS, pero no afectó los niveles de IL-8
(Cavaillón y col, 2.003; Cross y col, 2.002).
A la célula T se le ha dado un papel muy importante en el control ó la progresión
de la enfermedad periodontal. Un Dogma corriente sugiere que la inmunidad a la
infección es controlada por un clon de células diferentes a las de un perfil de TH1
y TH2 correspondiente a las células T regulatorias a las cuales se les ha dado un
papel supresivo ó inhibitorio, en las respuestas autoinmunes. Los estudios
realizados sobre estas células están encaminados en el desarrollo de nuevas
modalidades terapéuticas en el control de la enfermedad. (Yamazaki y col, 2.003)
52
La presencia de la enfermedad periodontal puede ser explicada por numerosos
factores, entre ellos los más importantes: la bacteria (agente causal principal) y la
respuesta inmune del huésped como se ha venido explicando en el transcurso del
trabajo. De ésta última, a la que se le debería de dar más importancia, es a la falla
de una buena respuesta inmune innata que pueda controlar el microorganismo,
antes de desencadenar una respuesta inmune específica. (Figura 10 y Figura 11).
53
Dientes y Tejidos Gingivales
Placa Bacteriana
Promoviendo daño óseo
Mecanismos paracrinos ó autocrinos
Proteínas Fase Aguda Activación Linfocitos
Trombocitos Basófilos
Mastocitos Eosinófilos
Actividad hematopoyética Procoagulante sistémico
Citoquinas Moléculas de adhesión
ENFERMEDAD PERIOD
* Tolerancia (dosis - susceptibilidad)* Regulación negativa * Desensibilización reversible * Falta de regulación en señalización intracelular y del gen.
Figura 10. Respuesta inm
P. giA. acB. F
Neutrófi
IL-TNPG
Metalopr
ONTAL
R
une inn
ngivalis tinomycetemcomitans
orsytus Factores de Virulencia
54
Fimbrias Polisacárido capsular Hemoglutinina Antígenos proteicos LPS
Reconocido por:
LBP: Opsonina Adherencia dependiente mCD14 sCD14
Complemento
ComponenteCelular
Monocito/Macrófago
lo
Fibroblasto
Células epiteliales orales
1β F-α E2
oteinasas
TLR4CD14
PGE2 Metaloproteinasa
IL-6 IL-1 IL-8
Moléculas de adhesión
Metaloproteinasa IL-8 IL-18
GN-CSF mRNA: CD14
TLR2 TLR4 MD-2 MyD 88
Quimiotaxis
esistencia Inmune
ata en Enfermedad Periodontal. Resumen de eventos.
Figura 11. Resumen de la Respuesta Inmune Innata en la enfermedad periodontal. Page et al. Advances in the pathogenesis of periodontitis: summary of developments, clinical implications
and future directions. Periodontology 2000, Vol. 14, 1997, 216 - 248.
8. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD PERIODONTAL
La mejor forma de diagnosticar Enfermedad Periodontal, es a través del el exámen
clínico (exploración oral) y radiográfico.
Las encías se ven rojas, agrandadas, lisas y brillantes. La profundidad del surco
es medida a partir de un instrumento intraoral llamado sonda periodontal, la cual
provee una medición en su parte activa por milímetros. Un surco de más de 3 mm
se considera patológico y recibe el nombre de bolsa periodontal.
Por medio de la radiografía se puede observar el grado de pérdida ósea presente
en la lesión, corroborando la medida del surco desde el punto de vista clínico
(bolsa periodontal) (Figura 12).
55
Figura 12. Radiografía Periapical zona premolares y molares inferiores.
Se observan pérdidas óseas generalizadas con bolsa periodontal
en el primer molar y lesión apical.
El diagnóstico microbiológico, también podría corroborar el diagnóstico, a partir de
un cultivo realizado por la toma de placa bacteriana presente en el surco. De esa
manera se podrían obtener colonias de los diferentes periodontopatógenos
presentes en la lesión, caracterizar su genotipo por PCR, el fenotipo por
microscopía y la funcionalidad (Pruebas químicas).
Actualmente, por medio de pruebas de biología molecular, se podría determinar
varias cosas en el proceso patológico de la periodontitis, como es el caso de la
caracterización de la población celular presente en la lesión, ya sea por
Inmunohistoquímica, Inmunofluorescencia ó Citometría de flujo (Fonseca y col,
2.005).
Lo anterior puede ser posible, gracias al uso de anticuerpos monoclonales
específicos para las moléculas de membrana celulares de interés, los cuales
deben ser marcados con enzimas ó fluorocromos dependiendo de la técnica que
se utilice. Una vez marcada la lámina de tejido ó la suspensión celular, la muestra
puede ser leída con la ayuda de microscopio de luz en el caso de la
56
inmunohistoquímica, con un microsocopio de fluorescencia (inmunofluorescencia)
ó con un Citómetro de flujo, si se realiza por citometría.
En la figura 13 se observa un ejemplo de caracterización celular por citometría de
flujo en pacientes con enfermedad periodontal.
R2 R1
R3
R4
Figura 13. Caracterización celular por Citometría de Flujo. Representación de la población linfoide de una biopsia de tejido de un paciente con periodontitis crónica, usando anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos: α-CD45 PerCP (población linfoide en general), α-CD19 Cychrom (LB), α-CD3 FITC (LT), α-CD8 APC (LTCD8+), α-CD4 PE (LTCD4+) y α-CD16+CD56+ PE (NK). Fonseca A, Roa N, Cuellar A, Rodríguez A, Suarez L. Poblaciones Linfoides en Enfermedad Periodontal. Journal of Periodontal Research. 2.005. In press.
Otro de los aspectos que pueden observarse gracias a las diferentes técnicas de
biología molecular, es la expresión de receptores de activación celulares, los
cuales pueden ser observados por inmunohistoquímica, como se observa en la
figura 14, por inmunofluorescencia, como se observa en la Figura 15.
57
Figura 14. Infiltrado de células expresando TLR2 y TLR4 por inmunohistoquímica. Cortes de tejido gingival interproximal de pacientes con periodontitis crónica (dos primeras columnas) y pacientes con tejido gingival sano (dos últimas columnas). Los receptores TLR2 y TLR4 como en este ejemplo, pueden ser identificados y cuantificados, después de colocar al tejido fijado a una placa de vidrio, anticuerpos monoclonales específicos marcados con una enzima (peroxidasa ó fosfatasa alcalina), capaz de convertir sustratos incoloros en sustancias insolubles coloreadas que precipitan en el lugar donde se encuentra la enzima. Una vez revelada y contrastada la placa, con ayuda de un microscopio óptico convencional se puede identificar el receptor celular. Muthukuru M, Jotwani R, Cutler C. Oral Mucosal Endotoxin Tolerance induction in Chronic Periodontitis. Infection and Immunity 2005; 73(2): 687-694.
58
Figura 15. Monocitos/Macrófagos TLR2+ en mucosa oral por inmunofluorescencia. Ejemplo de una biopsia de tejido gingival de una persona con periodontitis crónica, la cual fue teñida con un anticuerpo monoclonal α-CD68 marcado con Rojo Texas (rojo) y α-TLR2 FITC (verde), los cuales pueden ser observados por microsocopio de fluorescencia. Muthukuru M, Jotwani R, Cutler C. Oral Mucosal Endotoxin Tolerance induction in Chronic Periodontitis. Infection and Immunity 2005; 73(2): 687-694.
RT-PCR ó Citometría de flujo, son otras de las técnicas por las cuales se puede
observar marcadores de membrana de activación celular (Wang y col, 2.000;
Wang y col, 2001; Mori y col, 2003; Hjishengallis y col, 2004; D’Aituro y col, 2.004;
Laine y col, 2.005; Muthukuru y col, 2.005).
59
La primera puede ser explicada así: a partir de una biopsia de tejido gingival la
cual puede ser disgregada con ayuda de enzimas como la colagenasa por
ejemplo, se puede obtener el RNA mensajero celular de los marcadores deseados
ó citoquinas proinflamatorias. Una vez obtenido el mRNA, con la ayuda de la
transcriptasa inversa se puede obtener el ADN y de esa forma, por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) obtener copias y amplificación de las secuencias
específicas del mismo. Si hay expresión del mRNA, se observará la presencia de
bandas en un gel teñido posterior a un corrido electroforético SDS Page de la
muestra sujeta a PCR (Figura 16).
Figura 16. Procedimiento de RT-PCR. Ejemplo de cómo se puede observar el mRNA de marcadores de activación celular ó de citoquinas en biopsias de tejido gingival.
60
La presencia de citoquinas intracelulares ó secretadas que podría producir una
célula in vitro ó in vivo por ejemplo las citoquinas proinflamatorias como la IL-1β,
IL-6, TNF-α, IL-18, IL-12, pueden ser observadas por diferentes técnicas, ya sea a
partir de tejido gingival ó del fluído gingival (surco).
Las citoquinas intracelulares pueden ser observadas por RT-PCR ó Citometría de
flujo; mientras que las citoquinas secretadas por células en el tejido (in vivo ó in
vitro), son evidenciadas gracias a la ELISA, Inmunohistoquímica,
inmunofluorescencia, entre otras. (Chin y col, 1993; Fokkema y col, 2003; Mark y
col, 2000; Socransky y col, 2000; Yutaka y col, 1993; Suárez y col, 2004).
La ELISA, ha sido la técnica más usada desde hace muchos años para la
cuantificación de antígenos, en este caso de citoquinas proinflamatorias. La
técnica se basa en la unión antígeno-anticuerpo. Una vez se ha colocado el
antígeno (anticuerpo monoclonal α-citoquina) en una superficie de poliestireno, se
adiciona la muestra que se desea estudiar (sobrenadante de cultivo ó fluído
gingival que contiene la citoquina). Utilizando una molécula indicadora (anti-
citoquina) que se une de forma covalente a una enzima, la cual puede
cuantificarse determinando la tasa con que la enzima convierte un sustrato
incoloro en un producto coloreado con un espectrofotómetro (absorbancia).
La Citometría de Flujo, es la técnica más actualizada y útil para evidenciar muchos
aspectos, ya que discrimina partículas diferentes a partir del tamaño y el color.
Con respecto a la cuantificación de citoquinas, lo puede realizar de forma
individual (una citoquina) ó simultáneamente (varias citoquinas), a partir de una
misma muestra.
El sistema CBA de Beckton Dickinson (BD) es un ejemplo de la cuantificación
simultánea de múltiples citoquinas, sistema por el cual usa la sensibilidad de la
61
detección fluorescente amplificada por citometría de flujo para medir analitos
solubles en un inmunoensayo basado en la partícula. Cada perla, provee una
superficie de captura para una proteína específica y es análogo a un pozo cubierto
individualmente en una placa de ELISA. El kit de CBA captura la mezcla de perlas
en suspensión permitiendo la detección de múltiples analitos en una muestra de
volumen pequeño en poco tiempo.
El kit de inflamación humano pude ser usado para cuantificar la IL-8, IL-1β, IL-6,
IL-10, TNF-α y la IL-12p70 (Figura 17 y 18).
(http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/manuals/live/web_enabled/0
1-81014-551811-F.pdf)
62Figura 17. Cuantificación de citoquinas proinflamatorias, sistema CBA por citometría de flujo.
Figura 18. Concentración de las citoquinas a partir de una Curva Standard (Software)
A partir de este conocimiento a cerca de las diferentes técnicas utilizadas en
biología molecular y aplicadas en sujetos con periodontitis, se podría dirigir futuros
estudios encaminados en el tratamiento, control ó prevención de la enfermedad,
posiblemente por inmunoterapia.
63
CONCLUSIONES
Después de revisar, profundizar y aclarar conceptos de la respuesta inmune innata
frente a periodontopatógenos causantes de enfermedad periodontal en cavidad
oral, se puede concluir que:
1. A la enfermedad periodontal se le ha caracterizado por un proceso
infeccioso en el que participa una serie de componentes inflamatorios en
respuesta al periodontopatógeno, como la IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α, PGE2,
junto con el reclutamiento de células inmunocompetentes como el
neutrófilo, el macrófago, posteriormente el LT y el LB, explicando de esa
forma un proceso inflamatorio agudo.
2. Los microorganismos presentes en cavidad oral como P. gingivalis, A. a. y
el B. Forsythus, presentan en su estructura factores de virulencia como las
fimbrias, peptidoglucanos, Lipopolisacárido (lípido A), entre otros, que
desencadenan una respuesta inmune innata por células como el
macrófago/monocitos, el neutrófilo, células epiteliales de la mucosa oral y
fibroblastos, gracias a la presencia de receptores específicos en la
membrana de las mismas, como son el TLR4 y el CD14.
3. El complemento, es otro de los componentes humorales de la respuesta
inmune innata que puede ser activado a partir del encuentro con el
peridontopatógeno por las tres vías, clásica, alternativa y de las lectinas.
64
4. Más comúnmente el LPS y más por el lípido A, de los microorganismos
causantes de la enfermedad periodontal presentes en la placa bacteriana
adherida al diente, pueden inducir tolerancia oral y de esa forma generar la
enfermedad, lo que correspondería a una inflamación crónica, a la cual se
le adiciona presencia de citoquinas regulatorias que coadyuvan a la
hiporrespuesta por parte del sistema inmune.
5. Los componentes celulares como macrófagos, células dendríticas, células T
y NK pueden ser tolerizadas en presencia de LPS en altas concentraciones
y en forma repetitiva situación explicada por “la tolerancia a la endotoxina”.
6. Con la ayuda de diferentes técnicas de biología molecular además de ser
usadas como herramientas de apoyo en el diagnóstico de la enfermedad
periodontal, se puede profundizar en el conocimiento de la misma, con el
objetivo de estudiar el tratamiento, control ó prevención de la enfermedad,
posiblemente por inmunoterapia.
65
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