MC MARISOL CASTILLO MORALESMC MARISOL CASTILLO MORALES

CromatografíaCromatografía

Método usado para la separación de los componentes de una muestra.

Técnica Cromatográfica

Fase Móvil

Fase Estacionaria

Interacción

Ciencia de las separaciones.

Cromato= ccoolloorr/ Grafos= Escritura

separación

AntecedentesAntecedentes

En los tiempos de Aristóteles se utilizaban los efectos absortivos de distintas tierras para tratar el agua de mar.

Sin embargo fue documentada por primera vez por el científico Ruso Tsweet en 1903-1906.

En el cual los componentes son En el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras las cuales es estacionaria, mientras

que la otra es móvil. La fase que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en líquido soportado en un sólido o en

un gel (matriz). Mientras que la móvil un gel (matriz). Mientras que la móvil es un solvente.es un solvente.

Sólido Líquido

G a s

Sólido Liquido

Fluido Supercrítico

Sólido Líquido

Líquido

Modos de crom a togra fía

Sólido

F aseNorm al

F aseReversa

F ase unida Int. Iónico

Exc lus iónpor T am años

Perm eac iónpor G e l

Exc lus ión

C olum na

C apa F ina Pape l

Planar

C rom atogra fíade L íquidos

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Los métodos cromatográficos son Los métodos cromatográficos son de dos tipos fundamentales:de dos tipos fundamentales:

Cromatografía en columna:Cromatografía en columna:

La fase estacionaria se mantiene La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la dentro de un tubo angosto y la fase móvil se hace pasar por el fase móvil se hace pasar por el tubo con presión o por gravedadtubo con presión o por gravedad

Cromatografía planaCromatografía plana

La fase estacionaria esta sujeta por La fase estacionaria esta sujeta por una placa plana en los poros de una placa plana en los poros de un papel. En este caso la fase un papel. En este caso la fase móvil se mueve a través de la móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción fase estacionaria por acción capilar por la influencia de capilar por la influencia de gravedad.gravedad.

las retenciones mencionadas pueden las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos interacción que se dan entre las dos

fases y que pueden ser :fases y que pueden ser :La adsorciónLa adsorciónLa absorciónLa absorción

AdsorcionAdsorcion

LaLa adsorción adsorción, , que es la retención de que es la retención de una especie química por parte de los una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.superficie interfacial.

El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una mezcla de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con mezcla de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con otra fase, las sustancias se concentran más o menos en la superficie otra fase, las sustancias se concentran más o menos en la superficie de la otra fase; esto se llama adsorción.de la otra fase; esto se llama adsorción.

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LÍQUIDO-GAS:CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LÍQUIDO-GAS:

La fase fija es un liquido y la fase móvil un gas.La fase fija es un liquido y la fase móvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-GAS:CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-GAS:

La fase fija es un sólido y la móvil un gas.La fase fija es un sólido y la móvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO:CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO:

La fase fija es un sólido y la móvil un líquido. Es la mas usual, se puede La fase fija es un sólido y la móvil un líquido. Es la mas usual, se puede hacer en columna o en capa fina.hacer en columna o en capa fina.

ABSORCIONABSORCION

2. La2. La absorción absorción, , que es la retención que es la retención de una especie química por parte de de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la esta tiene a formar mezcla con la primera, primera, absorción puraabsorción pura, o a , o a reaccionar químicamente con la reaccionar químicamente con la misma, misma, absorción con reacción absorción con reacción química,química, considerando ambas como un considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.fenómeno másico y no superficial.

METODOLOGIAMETODOLOGIA

Algunos de los métodos cromatográficos Algunos de los métodos cromatográficos son:son:

Cromatografía en papelCromatografía en papel

Cromatografía de capa finaCromatografía de capa fina

La cromatografía en capa fina se basa en la

preparación de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de

vidrio u otro soporte.

Cromatografía de intercambio iónicoCromatografía de intercambio iónico

Utilizan este método para separarUtilizan este método para separar

isótopos de Litio y Potasio isótopos de Litio y Potasio

utilizando resinas de zeolita.utilizando resinas de zeolita.

Cromatografía de gel-filtraciónCromatografía de gel-filtración

Fodin y Porath en 1958 descubren

que usando como fase estacionaria

geles se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.

Cromatografía de afinidad. Cromatografía de afinidad.

Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o

proteína unida covalentemente a un

ligando y se utiliza para la separación de

moléculas proteicas.

Cromatografía de gas.Cromatografía de gas.

Es una de las técnicas más utilizadas e importantes,

de forma que ha revolucionado el campo de

la química analítica.

APLICACIÓN APLICACIÓN

La cromatografía es un medio muy eficaz La cromatografía es un medio muy eficaz para responder a las mas variadas para responder a las mas variadas

preguntas que tengan relación con las preguntas que tengan relación con las mezclas químicas. mezclas químicas.

En 1906 Tswett : En 1906 Tswett : Método en el cual los componentes de una mezcla son Método en el cual los componentes de una mezcla son

separados en una columna adsorbente dentro de un separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyentesistema fluyente..

I.U.P.A.C : I.U.P.A.C :

Método usado principalmente para la Método usado principalmente para la separación de los componentes de una separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc...una capa, distribuida como una película, etc...

Esta versión instrumental de la Esta versión instrumental de la cromatografía convencional cromatografía convencional

resulta más ventajosa debido a resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en se necesitan para el estudio en

cuestión y los resultados se cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. obtienen en un tiempo mínimo.

Estos aspectos la hacen preferida Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.entre las técnicas de separación.

APLICACIONAPLICACION

Se ha convertido en una de las herramientas más poderosas para el químico analista en muy diversos campos de aplicación.

¿Qué es H P L C ?¿Qué es H P L C ?

High Pressure

Liquid Chromatograp

hy

Inicios de la instrumentación

High Performance

Liquid Chromatography

Avance de la instrumentación

Técnica que realiza la separación física de una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta resolución.

¿Qué es H P L C ?¿Qué es H P L C ?

SISTEMA CROMATOGRAFICOSISTEMA CROMATOGRAFICO

La cromatografía de líquidos de alta resolución ( HPLC ) es un método fisicoquímico de separación, basado en elprincipio de la PARTICIÓN.

PARTICIÓN: es el reparto o distribución de los componentes de una muestra entre dos fases: una móvil que es un líquido y una fija que puede ser un sólido o un líquido.

MUESTRAFASE MÓVIL FASE FIJA

líquido sólido o líquido

ColumnaColumna

Es un tubo ordinario de acero inoxidable de Es un tubo ordinario de acero inoxidable de diámetro interno uniforme.diámetro interno uniforme.

EmpaqueEmpaque

TIPOS DE COLUMNASTIPOS DE COLUMNAS

ANALITICASANALITICASLong. 5-30 cm.Long. 5-30 cm.Diámetro interno 2 a 10 mmDiámetro interno 2 a 10 mmTamaño de partículas 2 a 10µmTamaño de partículas 2 a 10µm

PreparativasPreparativasLong. 50 – 100 cmLong. 50 – 100 cmDI desde 5cm DI desde 5cm

Tipos de empaqueTipos de empaque

CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA:CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA: La fase estacionaria es apolar, y la fase móvil polar. La fase estacionaria es apolar, y la fase móvil polar.

Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano. activos de la sílice con un trialquilclorosilano.

La retención se produce en esta especie de capa La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase móvil (polar).la fase estacionaria ( apolar) y la fase móvil (polar).

Los compuestos más retenidos son los más apolares. Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y La retención y selectividadselectividad se controlan se controlan fundamentalmente con la composición de la fase fundamentalmente con la composición de la fase móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

CROMATOGRAFIA EN FASE NORMALCROMATOGRAFIA EN FASE NORMALEn esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase

estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar estacionarias se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano. un trialquilclorosilano.

La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.polar el último en eluir.

PARTICIONPARTICION

Es el reparto o distribución de los componentes de Es el reparto o distribución de los componentes de una muestra entre dos fases: una muestra entre dos fases: una móvil que es ununa móvil que es un líquidolíquido y y una fija que puede ser un sólido o un una fija que puede ser un sólido o un líquidolíquido

MUESTRAFASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA

sólido o líquido

0.009"

0.020"0.040"

Contribución de la columnaContribución de la columna

BOMBABOMBA

RequisitoRequisitoss6000 psi (lb/in6000 psi (lb/in22))Flujo sin pulsacionesFlujo sin pulsacionesCaudal 0.1 a 10 mL/minCaudal 0.1 a 10 mL/minReproducibilidad del caudalReproducibilidad del caudalComponentes resistentes a la corrosiónComponentes resistentes a la corrosiónTeflón, rubí, zafiro, cerámica, TefzelTeflón, rubí, zafiro, cerámica, Tefzel

TIPOS DE BOMBASTIPOS DE BOMBAS

BOMBA RECIPROCABOMBA RECIPROCA

Bomba de Bomba de desplazamientodesplazamiento

Bomba neumáticaBomba neumática

Sistemas de inyecciónSistemas de inyección

ManualManual

AutomáticaAutomática

DETECTORESDETECTORES

INDICE DE REFRACCIONFRESNELDEFLEXIÓNINTERFEROMETRICO

GENERALES

UVFLUORESCENCIAELECTROQUIMICO

SELECTIVO

DETECTORES

REGISTROREGISTRO

REGISTRADORREGISTRADOR

Señal en un grafico X-YSeñal en un grafico X-Y INTEGRADORINTEGRADOR

Incluye tratamiento matemáticoIncluye tratamiento matemático COMPUTADORACOMPUTADORA

Software que incluye grafico, cálculos y Software que incluye grafico, cálculos y almacenamiento de datosalmacenamiento de datos

En el proceso cromatográfico se obtienen En el proceso cromatográfico se obtienen señales o picos:señales o picos:

Res

pues

ta d

el d

etec

tor

Tiempotr= Tiempo de retenciónt’r= Tiempo de retención ajustado

Inyección

tr

t’r

tm

tm= Tiempo de retención de un soluto no

retenido

CROMATOGRAMACROMATOGRAMA Parámetros principales Parámetros principales

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

tr= Tiempo de retención

t’r= Tiempo de retención ajustado

tm= Tiempo de retención de un soluto no

retenido

Inyección

h = altura del pico

Wb= Ancho del pico en su base

W1/2 = ancho del pico a la media altura

2/12/1212121

12

21

*176.1

)(

*2

)(Re

bb

rWWt

WW

t

WW

ttRsolución

bb

r

bb

rr

ResoluciónResolución

CROMATOGRAMA Parámetros principales:Platos teóricos

tr

Inyecciónt’r

tmWb

W1/2

2

2/1

2

554.516 Teóricos Platos

Wt

Wt

N r

b

r

NL

HHETP c teóricoplatoun a eqivalente Altura

Lc = Longitud de la columna

CROMATOGRAMA Parámetros principales:Platos teóricos

Ecuación Maestra de la Resolución:

4*

1*

1N

kk

RS

Capacidad Selectividad EficienciaFactor

de retenciónFactor

de separación

PlatosTeóricos

El Proceso CromatográficoEl Proceso Cromatográfico

¿Cómo identificar cada compuesto cuando se tiene una seriede picos en un Cromatograma?

Yo lo sé por el Tiempo de

Retención de los picos de Estándares puros

Tiempo

El Proceso CromatográficoEl Proceso Cromatográfico

¿Cómo sé qué cantidad está presente en la muestra?

Yo lo sé por el área y altura de los picos

Medición del área o altura del pico Cálculo de la concentración del analito

– Normalización Interna– Estándar interno– Estándar externo– Estándar agregado

CuantificacióCuantificaciónn

Estándar externoEstándar externo

Es el método de cuantificación más utilizado en HPLC. Consiste en la preparación de estándares de concentración semejante al analito en la muestra y en el ensayo cromatográfico de ambas, muestra y estándar en las mismas condiciones operativas. Su exactitud depende de manera importante de la calidad del estándar utilizado.

P P = (Am Cs / As) D * 100– Am = Area de la Muestra– Cs = Concentración del estándar– As = Area del Estándar– D = Factor de Dilución

GLOSARIOGLOSARIO

ElectronegatividadElectronegatividad PolaridadPolaridad CromatografiaCromatografia Tipos de cromatografiasTipos de cromatografias Fase movilFase movil Fase estacionariaFase estacionaria BombasBombas ColumnasColumnas

Fase normalFase normal Fase reversaFase reversa Exclusion de tamañoExclusion de tamaño quiralidadquiralidad Parámetros Parámetros

cromatograficoscromatograficos Rs. Rt, Vo, To, N, etcRs. Rt, Vo, To, N, etc