RETOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR:

Red de Enfermedades CardiovascularesFinancia Ministerio de Salud, España

Valencia, Mayo 2004

Resumen de algunos aspectos de las conferenciasIván Palomo

Aspectos Metodológicos, Moleculares, Clínicos y Terapéuticos

Coordinadores: Dr. Vicente Andres G arcía Dr. Juan J. Calvete Ch. Dra. Marta Casado P.

RectoradoUniversidad de Valencia

Sede del curso de RECAVA

Dr. Jordi Soler-SolerCoordinador RECAVA

Necesidad de abordar la investigación cardiovascular de un modo multidisciplinar

IAM 68.000 IAM/año (>Ca pulmón+colon+recto+mama)

34-40% de IAM llegan muertos al hospital

20% de IAM que llegan vivos al hospital mueren antes de 1 año.

Factores de riesgo HTA 35% Tabaquismo 31% Hipercolesterolemia 21% Obesidad 19% Diabetes 11%

Impacto del tratamiento

MortalidadExtrahospitalaria:

Intrahospitalaria :

50% de los pacientes con IAM no presentan FR CV clásicos

De los FR CV clásicos

Más importantes: HTA e HiperColDiferente mortalidad según territorios y razas

Investigación CV

Multidisciplinar: Clínico, Epidemiólogo, Básico

Esfuerzo necesario

Dr. Domingo BarettinoIBV, CSIC

Técnicas de genómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas

Genotipo Fenotipo

Genoma(DNA)

Transcriptoma(RNA)

Proteoma Interactoma*

* Interacción entre proteínas

Post-genómica

• Se conocen varios genomas completos

• Single Nucleotide Polymosphysm• Genómica funcional:

• Investiga para que sirven los genes en diferentes tejidos• Uso de Microarrays (Northern blot x n)

• Soportes• Sondas• Preparación RNA…cDNA ….Marcaje• Adquisición datos y cuantificación• Interpretación (Genómica funcional: sobre-expresión de genes)

Dr. Juan CalveteIBV, CSIC

Técnicas de proteómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas

• Genoma: múltiples proteomas (en diferentes tejidos)

• Comparan células en estudio vs células controles:

- Electrof. bidimensional de proteínas: (1º por carga, 2º por tamaño)

Análisis de 1 “mancha” a la vez (diferente entre cels. estudio y control) Proteína candidata a estudiar

Digestión con tripsina ….software.

Caracterización de péptidos (Secuencia aa): Espectrómetro de masas

Pesquisa modificaciones post-traduccionales (glicosilaciones, fosforilaciones)

- Electrof. unidimensional Si se analiza situaciones más simples

Dra Marta CasadoIBV, CSIC

Diseño de vectores para modificación genética y generación de animales transgénicos

Gen Proteína Modelo animal(Genómica) (Proteómica)

• Modelos celulares

• Modelos animales

• Transferencias directa de gen en animal adulto (transciente)

• Animales transgénicos• Transgénesis clásica o aditiva

• Microinyección• Rendimiento 1%

• Transgénesis sustractiva• Knockout mouse• Rendimiento <1%

Bases moleculares de la cardiopatía isquémica y experimental e identificación de marcadores diagnósticos

y nuevas dianas terapéuticas

Dra. Lina BadimónCentro de Investigación Cardiovascular

U. Autónoma de Barcelona; Hosp. Santa Creu i Sant Pau, Barcelona(>150 ISI)

Trombosis Adhesión y agregación plaquetaria, c/s participación del Sist. Coagulación

Vilahur G, Duran X, Juan-Babot O, Casani L, Badimon L. Antithrombotic effects of saratin on human atherosclerotic

plaques. Thromb Haemost. 2004 Jul;92(1):191-200.

Pedreno J, Hurt-Camejo E, Wiklund O, Badimon L, Masana L. Platelet function in patients with familial hypertriglyceridemia: evidence that platelet reactivity is modulated by apolipoprotein E content of very-low-density lipoprotein particles.Metabolism. 2000;49(7):942-9.

Aterotrombosis

Genes en el endotelio son regulados por elementos de la sangre

PYP51 y ERG25: Participan en el metabolismo del colesterol.Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Llorente-Cortes V, Vilahur G, Badimon L. Modulation of ERG25 expression by LDL in vascular cells. Cardiovasc Res. 2003;58(1):178-85.

NOR-1: Factor de transcripción Se expresa paredes vasculares con placa ateromatosa. LDL regula la expresión de NOR-1.

Rius J, Martinez-Gonzalez J, Crespo J, Badimon L. Involvement of neuron-derived orphan receptor-1 (NOR-1) in LDL-induced mitogenic stimulus in vascular smooth muscle cells: role of CREB. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(4):697-702.

Lisil Oxidasa (LOx): En la maduración del endotelio (fase inicial de la placa)Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Casani L, Badimon L. Low density lipoproteins downregulate lysyl oxidase in vascular endothelial cells and the arterial wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22(9):1409-14.

Dra. Badimón (cont.)

Casani L, Segales E, Vilahur G, Bayes De Luna A, Badimon L.Moderate Daily Intake of Red Wine Inhibits Mural Thrombosis a nd Monocyte Tissue Factor Expression in an Experimental Porcine Model. Circulation. 2004

Vilahur G, Segales E, Casani L, Badimon L. A novel anti-ischemic nitric oxide donor inhibits thrombosiswithout modifying haemodynamic parameters. Thromb Haemost. 2004 May;91(5):1035- 43.

Royo T, Martinez-Gonzalez J, Vilahur G, Badimon L.Differential intracellular trafficking of von Willebrand factor (vWF) and vWF propeptide in porcine endothelial cells lacking Weibel-Palade bodiesand in human endothelial cells. Atherosclerosis. 2003 Mar;167(1):55-63.

Otras líneas de investigación

Dra. Bamidón (cont.)

Investigación en animales Citometría de flujo Microscopía confocal Proteómica PCR real time Transgénicos (pendiente)

Factores de riesgo emergentes• PCR• CD40L (plaquetas activadas, células endoteliales activadas)• PAI-1

Hipertensión arterial y Patología

Dr. Josep RedónHosp. Clínico de valencia

HTA: Mayor causa de morbimortalidad de todos los países (D y SD) Mas que Tabaquismo e Hipercolesterolemia.

Impacto sobre varios órganos diana:• Vasos sanguíneos (Moléculas de adhesión solubles: VCAM-1, E-selectina)

• Cerebro• Corazón• Riñones

Fisiopatología de la HTA

Alteraciones en la señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G en las ECV

Dr. Federico MayorCentro de Biología Molecular; U. Autónoma de Madrid

>1000 Receptores acoplados a Proteína G ()

Arrestinas y GRK:

• Bloquean la interacción de receptor-ligando con proteína G.• Gatillarían otros procesos

• Reclutamiento de proteínas citoplasmáticas:• Clatrina • AP-2• Otras

             

Mayor F Jr, Penela P, Ruiz-Gomez A. Role of G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 and Arrestins in beta-Adrenergic Receptor Internalization. Trends Cardiovasc Med. 1998;8(5):234-40.

Epidemiología CV: del DNA al acontecimiento coronario

Dr. Jaume Marrugat Institut Municipal d’Investigació Mèdica, Barcelona

Aterotrombosis: Mayor causa de muerte en el mundo.Manifestaciones clínicas mayores:

• Accidente cerebrovascular• IAM (H:M=3:1)

• TVP (vasculopatía periférica)

Disminución de infecciones y aumento ECV

Mortalidad por cardiopatía isquémica:• Mayor en noreste de Europa, respecto a países del mediterráneo.• Mayor variabilidad inter-países que intra-países.

Dr. Marrugat (cont.)

En EspañaDurante los últimos 20 años incidencia de ECV estable:

• H: 184/100.000 habitantes• M: 30/100.000 habitantes

Mortalidad

Incidencia

Prevalencia

Aumento del número de pacientes que requieren servicios de salud. No cura.

En 20 años altas se han multiplicado

Por prevención secundaria y tto terciario.(No existiría prevención primaria) Tabaquismo

Dr. Marrugat (cont.)Tipos de Placas ateromatosasClasificación histológica (6 tipos)

• 1-4 : relativamente estables• 5, 6: Inestables

• Muertos por IAM (España): Solo placas 1-4¿Placas evolucionan más lentamente?¿Son más estables?

Adaptación de las tablas de Framingham a población española(Estimación de riesgo coronario a 10 años)

• Sexo • Colesterolemia, HDL-Col• Tabaquismo• Diabetes

www.regicor.org (tablas y publicaciones)

Membranaplasmática

Intracelular

ICAM-1

VCAM-1

Dominio Ig

Extracelular

Puentes di-sulfuro

Superfamilia Inmunoglobulinas

Membranaplasmática

Intracelular

Región ricaen C y S

VLA -4 LFA-1

Región de unión ametales divalentes

Extracelular

α1

α4

β1 β2

Familia Integrinas

Familia Selectinas

Intracelular

Memb plasmática

Región de unión acarbohidratos

Extracelular

Dominio tipo EGF

SCR

L

E

P

Bases moleculares y celulares de la adhesión y migración transendotelial de leucocitos en patologías inflamatorias crónicas

Dra. María Yañez Hospital de la Princesa, U. Autónoma de Madrid

Moléculas de adhesión celular (MAC)

En Leucocitosparticipan las

siguientes moléculas

Contacto al azar Rodar Adhesión firme Diapedesis Adhesión tisular

a) L-Selectina

b) SLex. otros

carbohidratos

Sialilados y fucosusilados

a) α4 β1

b) LFA-1

c) CD-31

Α4 β7 (mucosas)

a) α4 β1

b) LFA-1

a) α3 β1

b) α4 β1

a) α5 β5

En Cél. Endotelialesparticipan las

siguientes moléculas

a) GlyCAM-1 CD-34 Mad CAM-1 (mucosas)

b) E-Selectina P-Selectina

a) VCAM-1b) ICAM-1, ICAM-2c) CD-31d) Mad CAM-1 (mucosas)

Inductores:IL-2, IL-8, TNFα, MIP 1β

a) VCAM-1b) ICAM-1

a) Epiligrinab) Fn (CS-1)c) Fn (RGD)

Células endoteliales

Lumen Vascular

Leucocitos

Flujo Sanguíneo

Tejidos

Quimiotractantes

Modelo de las interacciones adhesivas que actúan en la migración transendotelial

Dra Yañez (cont.)

Citometría de flujoMicroscopía confocal

Proteínas ERM (Ezrin, Radixin, Moesin; citoplasmáticas) ICAM-1

ERM

Actina

Tetraspaninas•CD9•CD81•CD151

AdhesiónMovilidadCoestimulación

Asociación a otras proteínas de membrana (ICAM-1, VCAM-1)

Imágenes de rolling y migración transendotelial

MAC: proteínas muy ubicuas (malas dianas)

Dra Yañez (cont.)

Desarrollo de biochips para el diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar

Dr. Miguel Pocovi Inst. Aragonés de Ciencias de la Salud, Saragoza

Genes + ambiente = Hipercolesterolemia

En Hipercolesterolemias monogénicas … Principalmente genes:• LDL-R (>850 mutaciones)

• ApoB-100• ARH (estabilizadora de LDL-R)• AYP7A1• Apo E

Molecular characterization of familial hypercholesterolemia in Spain: identification of 39 novel and 77 recurrent mutations in LDLR. Mozas P, Castillo S, Tejedor D, Reyes G,Alonso R, Franco M, Saenz P, Fuentes F, Almagro F, Mata P, Pocovi M. Hum Mutat. 2004;24(2):187.

Pocovi M, Civeira F, Alonso R, Mata P. Familial hypercholesterolemia in Spain: case-finding program, clinical and genetic aspects. Semin Vasc Med. 2004; 4(1):67-74.

Garcia-Alvarez I, Castillo S, Mozas P, Tejedor D, Reyes G, Artieda M, Cenarro A, Alonso R,Mata P, Pocovi M, Civeira F. Differences in clinical presentation between subjects with a phenotype of familial hypercholesterolemia determined by defects in the LDL-receptor and defects in Apo B-100. Rev Esp Cardiol. 2003;56(8):769-74.

Biochip (microarray) para Hipercolesterolemia familiarLDL-R (>850 mutaciones)

(Biotina)

Denaturaión

*

Estreptavidina

* Fluorocromo

Sondas específicas (25 nucleótidos)(con diferentes mutaciones)

Progénica

Dr. Miguel Pocovi

Interacción entre Óxido nítrico (NO) y Metaloproteínasas en el Endotelio vascular

Dr. Santiago Lamas Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares,, Madrid

Metaloproteinasas de matriz (MMP)

• Familia de enzimas• Acción en remodelación y reparación de tejidos.

• Capacidad de degradar proteínas de sostén

Colagenasa-3 (MMP-13) Interés en proceso inflamatorio de la aterosclerosis • El NO puede modular la expresión de MMP

•Induce acúmulo de MMP-13 en el frente de re-endotelización•NO y MMP-13: primera etapa de la revascularización

• Knockout mouse en eNOS

• Microscopía confocal

Muerte celular durante la isquemia-reperfusión miocárdica y desarrollo de tratamientos preventivos

Dr. David García-Dorado Laboratorio de Cardiología Experimental

Hospital Universitari Vall d`Hebrón

Características• Depende de severidad y duración de isquemia.• En bandas de contracción.• Durante primeros minutos de reperfusión.• No se amplifica por apoptosis tardía (horas siguientes).• Se puede prevenir en primeros minutos de reperfusión.

Mecanismos• Detención de la fosforilación oxidativa.• Aumento de glicólisis anaerobia.• Acumulación de metabolitos.• Acidificación.• Aumento de Na+

• Ingreso de Ca2+

Necrosis

Dr. David García-Dorado

Miocitos en situación de “rigor isquémico” se contraen.

99 ISI

Agullo L, Garcia-Dorado D, Escalona N, Ruiz-Meana M, Inserte J, Soler-Soler J. Effect of ischemia on soluble and particulate guanylyl cyclase-mediated cGMP synthesis in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;284(6):H2170-6.

                       

Ruiz-Meana M, Pina P, Garcia-Dorado D, Rodriguez-Sinovas A, Barba I, Miro E, Mirabet M, Soler-Soler J.GLYCINE PROTECTS CARDIOMYOCYTES AGAINST LETHAL REOXYGENATION INJURY BY INHIBITING MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION. J Physiol. 2004 Jun 24

Modelos experimentales de Aterosclerosis y Reestenosis: Aspectos moleculares y terapéuticos

Dr. Vicente AndresLaboratorio de Biología Vascular

Inst. de Biomedicina de Valencia (IBV)

Aterosclerosis: Proceso inflamatorio

Proliferación y migración celular

Dr. Vicente Andres

Diez-Juan A, Andres V. The growth suppressor p27(Kip1) protects against diet-induced atherosclerosis. FASEB J. 2001;15(11):1989-95.

• p27 regula aterogénesis

• Polimorfismo (NTPs) de p27: C838A• AA … Menos p27….IAM

Andres V. Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential. Cardiovasc Res. 2004 Jul 1;63(1):11-21.

• Proteína Kinasa, ciclina dependiente (CDK) • Proteínas inhibidoras de CDK (CDKIs)

• Migración celular ocurre preferentemente en fases G1/S.• CDK y CDKIs regulan el ciclo celular

¿Estas proteínas como dianas farmacológicas? Ej. Fármaco que aumente síntesis de p27

60 ISI

Modelo animal: knockout mouse para apoE

Estudios de microarrays: varios componentes del S. Complemento se inducen en respuesta a hipercolesterolemia en ratones deficientes en apoE

Terapia celular para el tratamiento de la cardiopatía isquémica

Dr. Francisco Fernandez Instituto de Ciencias del Corazón

• La reperfusión precoz fracasa en el 50%.

• Miocitos no se regeneran.

Estrategias celulares: • Mioblastos de músculo estriado: No se integran bien en corazón.

• Stem cells de MO vía sanguínea colonizan corazón: Beneficio dudoso

• Stem cells localmente ….

Stem cells localmente, después de revascularización con stent

3/13 casos: reestenosis

Mejor que solo con revascularización

Falta: • Estudios ramdomizados• Investigación experimental

*

Fotografía post-clausura del curso (60-70% de los asistentes al curso)

* Dr. Jordi Soler

*

Dr. Vicente A. García Dra. Marta CasadoDr. Juan J. Calvete Dr. Domingo Barettino

Café después de almuerzo. Frente al IBV