Reverse transcription

1970 Temin ค้�นพบเอนไซม์�จากไวรั�ส (viral enzyme) ที่��เปลี่��ยน RNA เป�น DNA เรั�ยกว�า RNA-directed DNA polymerase หรั�อ reverse transcriptase

mRNA

cDNA(complementary DNA

Reverse transcriptase

หรื�อ RNA-directed DNA polymerase

Reverse transcriptase - ส�งเค้รัาะห�สาย DNA จากปลี่าย 5’ 3’

- ต้�องใช้� primer (tRNA) เป�นจ"ดเรั$�ม์ต้�นของการัส�งเค้รัาะห� cDNA

Reverse transcriptase ม์� 3 activities ที่��ใช้�ในการัที่&างานของไวรั�ส

1. RNA-directed DNA polymerase activity: เต้$ม์ nucleotides เพ��อใช้�ในการัส�งเค้รัาะห� cDNA

2. RNase H: exonuclease ส&าหรั�บย�อย tRNA primer เม์��อม์�การัส�งเค้รัาะห� cDNA แลี่�ว

3. DNA-directed DNA polymerase: ส�งเค้รัาะห� ssDNA (single-stranded DNA)หลี่�งจากที่�� tRNA primer ถู)กย�อยแลี่�วด�วย Rnase H แลี่�ว

Cappoly(A)

poly(A)Cap

TranscriptionmRNA cappingpolyadenylation

Splicing

mRNA transport

poly(A)Cap

Translation mRNA decay

nucleus

cytoplasm

Translation

RNA(mature mRNA)

Protein

• 5’ cap structure - 7-methyl guanosine residue

• 3’ poly(A) tail - ~200 adenosine residues in mammals ~60 in yeast

• Start codon - this defines the end of the 5’ untranslated region (5’UTR)

• Stop codon - this defines the start of the

3’untranslated region (3’UTR)

poly(A)Cap

ORF5’UTR 3’UTR

startstop

Prokaryotic ribosome Eukaryotic ribosome

แบ�งได� 3 stages:-

• Initiation - การัน&า (Recruitment) ribosome ลี่งบน mRNA แลี่ะจดจ&า (Recognition) จ"ดเรั$�ม์ต้�น(start codon)ของการั

translation

• Elongation - การัเค้ลี่��อนที่��ของ ribosome ไปบน mRNA แลี่ะแปรัรัห�ส (Decoding) ของ mRNA แลี่ะส�งเค้รัาะห�

สายโปรัต้�น (polypeptide chain)

• Termination - การัจดจ&ารัห�สหย"ด (Recognition of the stop codon)แลี่ะปลี่ดปลี่�อย ribosome แลี่ะสาย protein ออกจากmRNA

Translation initiation ค้�อขบวนการัที่�� ribosome (แลี่ะ initiator methionyl tRNA) ถู)กน&า (recruited) ลี่งไปที่�� start codon.

เป�นขบวนการัที่��ซ�บซ�อน แบ�งได� 4 ข�+นต้อนค้�อ

1. การัเต้รั�ยม์ 40S ribosomal subunit/ methionyl tRNAi

2. การัเต้รั�ยม์แลี่ะการัค้�ดเลี่�อก mRNA (mRNA selection and preparation)

3. การัจ�บก�นของ 40S ribosome แลี่ะ mRNA, การัสแกนแลี่ะการัจดจ&า AUG (40S/ mRNA binding, scanning and AUG recognition)

4. การัจ�บก�นของ 40S แลี่ะ 60S subunit (60S ribosomal subunit joining)

f-Met-tRNAfMet

: tRNA ที่��จดจ&า AUG (GUG, UUG, prokaryotic) 5’-P

3’-OHCOOH

60S

40S40S

3

60S

1A3 1A

2GDP

2GTP

GTP GDP

M

2GTP

M

2B

Ternarycomplex

3 2GTPM

1 1A

1 5

5

• The mRNA is bound by eIF4F (eIF4E, eIF4G, eIF4A)

• Pab1 binds the poly(A) tail and may recruit eIF4F

• eIF4B and eIF4H facilitate the helicase activity of 4A

32

GTP1

1AAUG

Cap4E

4G4B

eIF3 in the 40S complex and eIF4G in the mRNA complex interact

4H

4A

5 M

• The 40S complex scans each codon in a 5’ to 3’ directionlooking for an AUG.

• The eIF4A helicase activity irons out RNA hairpins

allowing the 40S complex to move.

• ATP hydrolysis is required

32

GTP1

1AAUGCap

4E4G

4B4H

4A

5 M

32

GTP1

1A

AUGCap

5 M

3 1

1A

AUGCap

5

M

• eIF5 stimulates the GTPase activity of eIF2 leading to loss of most of the initiation factors

2GDP

M

Cap AUG

60S

5B

M

Cap AUG

GTP

GDP

1A

5B 1A

SHINEDELGARNO

30S

3

150S

30S

3 1

50S

2fM

3 12fM

16SrRNA

GTP

GTP

AUG

312

fM

16SrRNA

GTP

AUGSHINEDELGARNO

50S3

1

2fM

16SrRNA

GDP

AUGSHINEDELGARNO

• Smaller ribosomal subunits (30S and 50S)

• Prokaryotic translation occurs co-transcriptionally and often there are several open reading frames in a single mRNA i.e. polycistronic mRNAs

• During initiation the ribosome directly interacts with the mRNA via the Shine Delgarno sequence (directly upstream of each ORF).

• Initiation is much less complicated than eukaryotes (Just three initiation factors IF1, IF2 and IF3)

• Elongation and termination similar to eukaryotes

Defined as the sequential addition of amino acids to the carboxy-terminal end of the nascent peptide.

Relies on three tRNA binding sites in the ribosome:-

1. The A site amino-acyl tRNA binding site2. The P site peptidyl tRNA binding site3. The E site where the empty tRNA is ejected from the ribosome

E P A

mRNA5’ 3’

aaaa

aaaa aa

n

Four major steps:-

1. Amino acyl tRNA binding in the A site

2. GTP hydrolysis and guanine nucleotide exchange on eEF1A

3. Peptide bond formation

4. Translocation of mRNA and peptidyl-tRNA on the ribosomal surface

E P A

mRNA5’ 3’

aaaa

aaaa

E P A

mRNA5’ 3’

aaaa

aaaa

eEF1A

aa

aa GTPeEF1A

GDP

eEF1B

E P A

mRNA5’ 3’

aaaa

aaaa

aa

Peptidyltransfer

E P A

mRNA5’ 3’

aaaa

aaaa

aa

n+1n+1

n nAmino-acyltRNA binding

translocation

eEF2 eEF2GDPGTP

eEF= eukaryotic elongation factor

• Catalysed by eRF1 (eukaryotic release factor).

• eRF1 recognises all three stop codons and its crystal structure resembles a tRNA even though it is a protein.

• Hence the molecular mimicry model predicts that eRF1 gives termination by binding the ribosome in a similar way to tRNA.

• eRF3 stimulates eRF1 activity in a GTP-dependent manner