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Ácidos Nucleicos
MD MSc Henrique Azevedo
Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos
• Papel de nucleotídeos no metabolismo celular:– constituinte dos ácidos nucleicos -
RNA e DNA– fonte de energia no metabolismo -> ATP– molécula-sinal em respostas celulares -
> cAMP– componente estrutural de enzimas e co-
fatores -> NAD, FAD, etc
Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos
• DNA: Armazenamento da informacão genética– estabilidade
• RNA: várias funções– RNA ribossomal (rRNA) - componentes estruturais
de ribossomos– RNA mensageiro (mRNA) - intermediário– RNA transferência (tRNA) - moléculas adaptadoras
que traduzem informação do mRNA em amino ácidos
– snRNA, microRNA, etc
Dogma Central
Ácidos Nucleicos
RNA e DNA
Unidades: • Pentose (5 C)• Base nitrogenada – pirimidinas
purinas• Fosfato - C - 5’
Nucleotídeos
• Base nitrogenada + Pentose + Fosfato• Nucleosídeo = Base nitrogenada +
Pentose
Pentoses
• Ribose em RNA• 2’-deoxi-ribose em DNA• -furanose
NucleotídeosBase nitrogenadas• Pirimidina: Timina, Uracil e Citosina• Purina: Adenina e Guanina
Ácidos Nucleicos
Numeração: • Pentose = Carbonos – 1’ a 5’• Base nitrogenada – pirimidinas = 1 a 6
purinas = 1 a 9• Ligação pentose – pirimidina – C 1’ N-1
pentose – purina – C 1’- N-9
• Fosfato 5’: mono-, di-, tri- = fósforo ligação éster (baixa energia)ligação fosfoanidro (alta energia)
NucleotídeosBase Nucleosídeo Nucleotídeo Adenina Adenosina Adenilato RNA
Deoxiadenosina Deoxiadenilato DNAGuanina Guanosina Guanilato RNA
Deoxiguanosina Deoxiguanilato DNACitosina Citidina Citidilato RNA
Deoxicitidina Deoxicitidilato DNATimina Timidina Timidilato DNAUracil Uridina Uridilato RNA
Bases modificadas
Bases modificadas
Ligação Fosfodiester
Polaridade5’ -> 3’
pH 7 = fosfatosc/ carga negativa
neutralizados porinterações iônicascom ptn, ions, poliaminas
Estrutura do DNA• 2 cadeias independentes • Dupla hélice, sentido direito• Hélices anti-paralelas• Complementariedade das bases• Eixo externo hidrofílico - deoxiribose + fosfato• Bases hidrofóbicas (planas) no interior• Bases ligadas pontes de H + empilhadas
(stacking)• Major groove e Minor groove (ondulação)
Estrutura do DNA
• Bases hidrofóbicas, relativamente insolúveis em água pH neutro
• > solublidade em pH + ácido ou + básico
• interações hidrofóbicas por “empilhamento” (base stacking) - duas bases planas sobrepostas
• stacking função de força van der Waals e interação dipolo-dipolo entre bases
• minimiza contato com água
Estrutura do DNA
Estabilidade da estrutura secundária:1. Pontes de H – pareamento Watson e
Crick função de forma tautômero – distância correta entre C-1’ -> A -T e G - C
2. Interações hidrofóbicas1. Empilhamento (base stacking) = interação de
nuvens de elétrons
2. Hidrofobicidade (cavitation energy) = quebra de pontes de H da água – força bases internamente
Estrutura do DNA
Pareamento de bases crítico:1. Biológico – replicação, transcrição,
controle expressão gênica
2. Análise – Hibridização, PCR, microarranjo, seqüenciamento
Propriedades de Nucleotídeos• moléculas altamente conjugadas
afetando estrutura, distribuição de elétrons e absorção de luz UV
• moléculas planas (pirimidina) ou quase (purina)
• absorbância máxima - cerca 260 nm
Espectro de absorbância de nucleotídeos
Química de Ácidos NucleicosEstabilidade do DNA - depósito genético!Propriedades• Desnaturação = separação da dupla fita
– quebra das pontes de H– causado por calor ou pH (e proteínas in vivo)
• Renaturação ou anelamento– decréscimo da temperatura ou pH
• Alteração na Absorbância (UV) Abs 260 nm– hipocromicidade: renaturação– hipercromicidade: desnaturação
Desnaturação e renaturação do DNA
Desnaturação• Calor – melting • pH extremos – DNA em pH 12
– Ácido - hidrolisa DNA e RNA– Base – hidrolisa RNA
• Processo de desnaturação altera Absorbância
– Perda de stacking – aumenta Abs 260 nm– DNA fita simples – hidroxiapatita e S1 nuclease– Alteração Hipercrômica – aprox. 30% maior
Cinética de Renaturação
1. Solução de DNA aquecida lentamente2. Medir Abs260nm
3. Gráfico Abs x Temperatura4. DNA desnatura em faixa estreita de ToC de
forma cooperativa = Tm
Tm = temp. 50% DNA desnaturado
Tm = função de [sais]
Conceito usado em sondas eprimers (estringência)
DNA RNA
Cinética de Renaturação
Renaturação não apenas reverso de desnaturação!
ocorre naturalmente 5 – 10oC abaixo Tm- Renaturação = função de [DNA] – freqüência
de bases complementares se encontrarem- Depende de complexidade do genoma
- Genoma – não retorna a Abs260nm original
- Genoma fragmentado – renatura completamente
- Renaturação = função tamanho e complexidade do genoma
- Afetado concentração de sais e temperatura
Taxa de Renaturação
- Função do tamanho do genoma- Genoma menor renatura mais rapidamente
Curvas CoT
C/Co = 1/(1 + kCoT)
C = [ssDNA]Co = [DNA]K = constante da taxa de reassociaçãoT = tempo
Cinética de Renaturação• Temperatura de desnaturação = Tm
– Função: composição G+C• Permite estimar tamanho de genoma
(CoT)1/2
• Complexidade do Genoma– soma dos comprimentos das seqüências
únicas mais as unidades de comprimento de cada família de seqüências repetitivas
– Seqüências únicas – componente cinético único
– > componente cinéticos genoma complexo
Fold-back
Highly Repetitive
Medium Repetitive
Single/Low copy
Curva Cot Cebola
Cinética de RenaturaçãoComplexidade de Seqüência: grupo mínimo
(em pb) que define o genoma;Valor Cot: definido como o produto da
concentração de nucleotídeos em moles por Litro (Co) e seu tempo de renaturação (t);
Componente Cinético: grupo de seqüências genômicas que exibem propriedades de renaturação similares, e consequentemente aparecem como região sigmoidal distinta na curva Cot.
Número de clones necessáriospara 99% certeza que todas as
seqüências estão presentesZ = tamanho médio inserto (pb)
G = tamanho 1 C do genoma (pb)
Número de clones necessáriospara 99% certeza que todas as
seqüências estão presentesconsiderando as frações de
componentes cinéticos(a, b, c e f)
Artigos publicados sobre cinética de reassociação
RNA
• 1961 - Jacob & Monod -> RNA intermediário– RNAs ocorrem no núcleo e citoplasma
• mRNA– monocistrônico - eucariotos– policistrônico - procariotos
• rRNA• tRNA
rRNA em Ribossomo
tRNA
Hidrólise espontânea de RNA em condições alcalinas
Estrutura de RNA• mRNA -> fita simples
– tendem a assumir conformação helicoidal direita dominada pelo emplihamento das bases (pur-pur)
– auto-complementariedade - estrutura mais complexas– pareamento: A-U, G-C e G-U!– estrutura 3ária função de seqüência (~ a ptn)
• interações com grupo OH de C-2’• formas A e Z, mas não ocorre forma B!
• rRNA• tRNA
Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas
• desaminação - perda de grupo amina– alterações espontâneas, baixíssima
taxa– perda de amina por C -> U -
reconhecido em DNA taxa 10-7 24 h-1
– DNA - possui T ao invés de U!
Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas• hidrólise da ligação N--glicosidil entre base e
pentose ou Depurinação– ocorre mais para purinas– acelerado em meio ácido
Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas
• radiação UV– condensação de 2 etilenos
em ciclobutano– DNA - 2 pirimidinas (T)
adjacentes -> dímeros
• agentes ambientais– deaminanntes
– alquilantes