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53An. Sist. Sanit. Navar. 2008, Vol. 31, Nº 1, enero-abril

REVISIONES

Regeneración de la superficie ocular: stem cells/células madre y técni-cas reconstructivasRegeneration of the ocular surface: stem cells and reconstructive techni-ques

A. Fernández1, J. Moreno1, F. Prósper2, M. García2, J. Echeveste3

Correspondencia:Ana FernándezDepartamento de OftalmologíaClínica UniversitariaAvda. Pío XII, 3631008 PamplonaE-mail: [email protected]

RESUMENLa córnea es un tejido transparente constituido

microscópicamente por 5 capas bien diferenciadas. Elepitelio corneal es esencial para la transparencia cor-neal y se encuentra en continua renovación a lo largode la vida a partir de la población de células madre lim-bocorneales. La localización de estas células madrelimbocorneales parece residir en las capas basales delepitelio limbocorneal, de vital importancia para man-tener el microambiente de estas células madre limbo-corneales, que depende de una variedad de factoresintrínsecos y extrínsecos. La insuficiencia límbica seproduce cuando ocurre una pérdida parcial o total deestas células madre limbocorneales. Este cuadro llevaa una opacificación corneal con la consiguiente pérdi-da de visión. En estos casos, el trasplante cornealsupone únicamente un reemplazo temporal del epite-lio corneal; es necesario llevar a cabo un tratamientoprevio con trasplante de limbo autólogo o alogénico,que permita regenerar la población de células limbo-corneales dañadas. Para disminuir el riesgo que supo-ne el trasplante de limbo en el ojo donante, se han pro-puesto técnicas de cultivo de células limbocorneales apartir de pequeñas biopsias limbocorneales.

Palabras clave. Epitelio corneal. Células madrelimbocorneales. Insuficiencia límbica. Cultivo celular.

ABSTRACTThe cornea is a transparent tissue microscopically

constituted by 5 well differentiated layers. The cornealepithelium is essential for corneal transparency and isfound in a state of constant renovation throughout lifeon the basis of the population of limbocorneal stemcells. The localisation of these limbocorneal stem cellsseems to be in the basal layers of the limbocornealepithelium, of vital importance for maintaining themicro-environment of these limbocorneal stem cells,which depend on a variety of intrinsic and extrinsicfactors. Limbic insufficiency occurs when there is apartial or total loss of these limbocorneal stem cells.These clinical features lead to a corneal clouding witha resulting loss of vision. In these cases, cornealtransplant only represents a temporary replacement ofthe corneal epithelium; it is necessary to carry out aprior treatment involving transplant of the autologousor allogeneic limbus, which enables regeneration ofthe population of damaged limbocorneal cells. Toreduce the risk involved in the transplant of the limbusof the donor eye, techniques of cultivation oflimbocorneal cells on the basis of small limbocornealbiopsies are proposed.

Key words. Corneal epithelium. Limbocornealstem cells. Limbic deficiency. Cellular cultivation.

1. Departamento de Oftalmología. Clínica Uni-versitaria de Navarra. Pamplona.

2. Area de Terapia Celular y Hematología. Clíni-ca Universitaria de Navarra. Pamplona.

3. Departamento de Anatomía Patológica. Clíni-ca Universitaria de Navarra. Pamplona.

Recepción el 12 de julio de 2007

Aceptación provisional 7 de noviembre de 2007

Aceptación definitiva 17 de enero de 2008

An. Sist. Sanit. Navar. 2008; 31 (1): 53-69.

ANATOMÍA DE LA CÓRNEA Y DELLIMBO ESCLEROCORNEAL

La córnea es un tejido transparenteque une la esclera opaca y el limbo escle-rocorneal y tiene una función refractiva asícomo de barrera química y mecánica entreel ojo y el medio ambiente.

Microscópicamente, la córnea puededividirse en 5 capas (Fig. 1): epitelio, capade Bowman, estroma, membrana Desce-met y endotelio.

El epitelio es estratificado escamoso noqueratinizado, consta de 4 a 6 capas decélulas y representa el 10% del grosor cor-neal. Morfológicamente está dividido en 3capas:

– Una capa única de células columna-res basales que se unen mediantehemidesmosomas a la membranabasal epitelial. Representan la capagerminativa del epitelio ya que sonlas únicas células epiteliales que tie-

nen capacidad de dividirse pormitosis.

– Dos o tres filas de células que tie-nen finas extensiones “en forma dealas”. En su periferia se unen poruniones tipo desmosoma y tipoGAP.

– Dos capas de células de superficiealargadas y delgadas unidas porpuentes. Después de un tiempo devida de algunos días las célulassuperficiales se desprenden a lapelícula lagrimal. Debido a su exce-lente capacidad de regeneración, elepitelio no se escarifica.

La capa de Bowman es una estructuraacelular que representa la capa superficialdel estroma. Está formada por fibras decolágeno organizadas al azar. Esta capa nose regenera cuando se daña.

El estroma ocupa alrededor del 90% delgrosor de la córnea y está compuesto prin-

A. Fernández y otros

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Figura 1. Imagen histológica de córnea normal (200x): epitelio corneal estratificado y membrana deBowman (A), estroma (B), membrana de Descemet (C) y endotelio (D).

cipalmente por capas de fibrillas de colá-geno orientadas de forma regular. La sepa-ración entre las capas es mantenida poruna sustancia fundamental de proteoglica-nos con un sincitio de fibroblastos modifi-cados (queratocitos) intercalados entrelas capas. Los axones nerviosos y sus célu-las de Schwann asociadas se encuentranen el tercio medio anterior del estroma.

El colágeno constituye aproximada-mente el 71% del peso seco de la córnea yla macromolécula estructural que propor-ciona la transparencia tisular así como laresistencia mecánica a la PIO. El colágenotipo 1 es el que predomina.

Los queratocitos ocupan el 3-5% delvolumen estromal. Su función consiste enmantener las fibras de colágeno y la matrizextracelular mediante una actividad de sín-tesis constante.

La membrana de Descemet es la láminabasal gruesa segregada por el endotelio.Está compuesta por un fino enrejado defibrillas de colágeno. Consta de 2 capas,una zona estriada anterior, y una zona noestriada posterior, que está producida porel endotelio a lo largo de la vida.

El endotelio corneal se deriva de lacresta neural y consta de una única capade células hexagonales. Desempeña unafunción vital en el mantenimiento de la tur-gencia de la córnea. Con la edad, el núme-ro de células endoteliales desciende gra-dualmente por lo que, debido a que nopueden regenerarse, las células vecinashan de progresar para llenar el espacio.

En el nacimiento, la densidad celularoscila entre 3.500 y 4.000 células/mm2,mientras que la córnea del adulto tienedensidades entre 1.400 a 2.500células/mm2. Cuando las células endotelia-les están sometidas a estrés, especialmen-te si se pierden algunas células, las célulasrestantes pierden su forma hexagonal y sevuelven irregulares en forma (pleomorfis-mo) y en tamaño. Estos cambios puedenocurrir con la edad, tras traumatismos ycon el uso prolongado de lentes de contac-to.

Desde un punto de vista clínico, esimportante destacar que el endotelio cor-neal es funcionalmente esencial para la

córnea. Es una capa frágil cuya integridady viabilidad deben ser garantizadas paraasegurar el éxito de cualquier procesointraocular.

Recientemente se ha estudiado la capa-cidad de autorrenovación de los precurso-res del endotelio corneal en conejos y seha visto como el endotelio periférico con-tiene más precursores y tiene una mayorcapacidad de autorregeneración que elendotelio central1.

Una de las propiedades del endoteliocorneal es su impermeabilidad a las sus-tancias hidrosolubles. La ruptura de estabarrera supone la penetración de molécu-las que pueden afectar al medio intraocu-lar dañando los tejidos corneales.

La superficie ocular está compuestapor tres epitelios distintos: corneal, limbary conjuntival. Son todos ellos epiteliosestratificados, escamosos y no queratini-zados procedentes de la superficie ecto-dérmica. Sin embargo, difieren en suscaracterísticas y sus funciones. Estas dife-rencias están reflejadas en sus patronesúnicos de expresión genética.

Epitelio conjuntivalEl epitelio conjuntival es un epitelio

estratificado escamoso no queratinizadoal igual que el epitelio corneal pero contie-ne células caliciformes secretoras de muci-na que contribuyen a mantener la capalagrimal de la superficie ocular y que seencuentran intercaladas entre células epi-teliales (Fig. 2).

Está muy bien vascularizado. Las dife-rencias entre los fenotipos epiteliales con-juntival y corneal se basa en la expresiónde diferentes queratinas, mucinas y glico-calix. Las citoqueratinas característicasdel epitelio no queratinizado estratificado(CK4 y 13), y simple (CK8 y 19), se expre-san en las capas superficiales del epitelioconjuntival2. Sus células precursoras selocalizan en el fórnix conjuntival y la uniónmucocutánea3. Las células progenitorasdel fórnix tienen gran capacidad prolifera-tiva, mucho mayor que las células localiza-das en las regiones bulbar y palpebral4. Launión mucocutánea de la conjuntiva pal-pebral en conejos parece ser la principalfuente de células TAC (Transient Amplif-


REGENERACIÓN DE LA SUPERFICIE OCULAR: STEM CELLS/CELULAS MADRE Y TÉCNICAS RECONSTRUCTIVAS

ying Cells) en continua replicación. Estascélulas migran hacia el fórnix para regene-rar las células maduras que se pierden deforma continua3. Las células madre tiendena localizarse en áreas de mayor grosor delepitelio así como en zonas de mayor pig-mentación. Se ha demostrado que las célu-las progenitoras del epitelio conjuntivalson bipotenciales, es decir, son célulasprecursoras tanto de células caliciformescomo de células no-caliciformes5. La dife-renciación de las células caliciformes, sinembargo, parece requerir un medioambiente estromal más específico, comodemuestran algunos estudios sobre el cul-tivo de células epiteliales conjuntivales deratón sobre membrana amniótica6. Los epi-telios corneal y conjuntival son continuosy componen la superficie ocular. Sinembargo, sus perfiles de expresión genéti-ca son bastante diferentes.

Epitelio limbar

El epitelio limbar es la zona transicio-nal entre los epitelios corneal y conjunti-val. Morfológicamente es diferente de lacórnea en que posee células de Langer-hans y melanocitos y de la conjuntiva enque carece de células caliciformes7. El epi-telio limbar se encuentra sobre un estromaaltamente vascularizado, de donde le llegael aporte sanguíneo. Los vasos sanguíneosforman parte de las empalizadas de Vogt(Fig. 3), que permiten una aproximaciónentre los vasos sanguíneos y el epitelio,proporcionándole altos niveles de nutri-ción y citoquinas. Estas citoquinas tienenun papel importante en el mantenimientode las células madre limbares y tienen 3patrones de expresión, las citoquinas tipoI, II y III8.

Ya ha sido demostrado cómo las célu-las madre del epitelio corneal tienen una



Figura 2. Imagen histológica de epitelio conjuntival (400x) con presencia de células caliciformes (fle-cha).

localización en la capa basal de la córneaperiférica, en la zona limbar, jugando unpapel fundamental en la proliferación ydiferenciación celular del epitelio corne-al9,10. Esta idea se apoya en varios hechos:el patrón único de expresión de la citoque-ratina 3 en las células corneales diferencia-das, la localización de las células de ciclolento en el limbo, el mayor potencial proli-ferativo de las células limbares en compa-ración con las células corneales centralestanto in vivo como in vitro y la capacidadde las células limbares basales de regene-rar un epitelio corneal dañado10. El epiteliocorneal utiliza tres estrategias para expan-dir su población celular durante la cicatri-zación: el reclutamiento de células madrepara producir más células TAC, el aumentode la tasa de replicación de las células TACy el aumento de la eficacia de la replica-ción de las células TAC con el acortamien-to del ciclo celular11. Las células madre lim-bocorneales se encuentran en la capabasal del epitelio limbar mientras que lascélulas TAC se encuentran en la capa basalde todo el epitelio corneal. La localizaciónlimbar de las células madre limbocornea-les explica propiedades corneales como elpredominio de formaciones tumorales enla zona limbar y la migración centrípeta de

las células corneales periféricas hacia lacórnea central. Este movimiento celularcentrípeto es el responsable de la regene-ración del epitelio corneal central12,13. Con-forme las células se mueven centrípeta-mente, van desarrollando característicasde células TAC y adquiriendo marcadoresde novo, como las citoqueratinas 3/12.Schermer y col9, en cultivos de células cor-neales de conejo, observaron que la cito-queratina 3 se asociaba a las capas supe-riores y más diferenciadas, lo que implicaque esta citoqueratina 3 constituye unmarcador de estados avanzados de dife-renciación. También se expresaba unifor-memente en el epitelio corneal central delos conejos. Esta expresión homogéneasugiere que, aunque las células basales enla zona limbar son indiferenciadas, las delepitelio corneal central son más diferen-ciadas en función de la expresión de cito-queratina 3. Esto les llevó a proponer quelas células madre del epitelio corneal no sedistribuyen uniformemente a lo largo de lacapa basal del epitelio corneal completo9.La preservación de las células madre lim-bocorneales parece depender de las condi-ciones ambientales. Su regeneraciónrequiere unas condiciones específicas quesólo se encuentran en el nicho de localiza-



Figura 3. Empalizadas de Vogt.

ción de estas células madre. Fuera de estascondiciones, las células madre proliferandesarrollando una expresión gradual dediferentes marcadores celulares. Durantela diferenciación, se van expresando nue-vos genes a la vez que se suprimen otrospreviamente expresados. Los estadosintermedios presentan una gran capacidadproliferativa. Tras un número de replica-ciones, esta capacidad va disminuyendohasta alcanzar la diferenciación terminal.Llegado un momento, las células TACcesan sus mitosis y entran en el comparti-mento no proliferativo, pasando a la dife-renciación celular terminal14. El esquemade diferenciación seguido es de stem cellsa células TAC y a células diferenciadas9,15.La capa basal del epitelio limbar contienetanto células madre como células TAC, asícomo los precursores tempranos que pue-den existir entre ambos tipos celulares. Elepitelio corneal está constituido por unajerarquía de células TAC, aquellas localiza-das en la periferia con capacidad de múlti-ples divisiones y las células TAC de la cór-nea central con capaces de dividirse tansólo una vez11. El hecho de que las célulasTAC de la córnea central tengan una esca-sa capacidad de replicación concuerdacon los estudios que muestran que lascélulas de la córnea central constituyencolonias terminales que no pueden ser cul-tivadas más de dos veces16. La transiciónde células madre a células TAC no puedeser identificada con marcadores químicos.La localización anatómica de las célulasmadre puede ser identificada por lasempalizadas de Vogt17 (Fig. 3), que estánpigmentadas, y se encuentran en el mar-gen de la córnea clara.

Parece que las células madre limbocor-neales no se encuentran en igual propor-ción en los distintos cuadrantes, siendo suproporción mayor en la córnea superior einferior en comparación con los cuadran-tes temporal y nasal18. El marcador mole-cular DNp63 está altamente expresado enel epitelio limbar. Otros marcadores nega-tivos, como la conexina 43, también seusan para identificar las células basalesdel limbo más inmaduras. Una serie de ras-gos anatómicos, como la presencia demelanocitos, sugieren la existencia de estenicho de células madre necesario para la

supervivencia de estas células madredurante el ciclo celular. Parece que existeotra población celular (Side Population) enel epitelio limbar, que también expresa laproteína ABCG2, al igual que las célulasmadre hematopoyéticas de la médulaósea19.

CÉLULAS MADRE LIMBOCORNEALES

Las células madre son una pequeñasubpoblación del total de los tejidos,caracterizadas por una rápida y continuarenovación celular. Las células diferencia-das son células con un ciclo de vida cortoque se regeneran por medio de la prolife-ración de la subpoblación de célulasmadre. Las células madre fueron definidaspor Potten y Loeffler20 como células indife-renciadas capaces de proliferar, automan-tenerse, dar lugar a una gran progeniecelular diferenciada, regenerar los tejidostras un daño y poseer gran flexibilidad encada una de estas capacidades13. Las carac-terísticas principales de las células madreson el estar pobremente diferenciadas conun citoplasma primitivo, el tener una altacapacidad de autorrenovación sin errores,una larga esperanza de vida, un ciclo celu-lar largo y el ser capaces de llevar a cabodivisiones simétricas o asimétricas, acti-vándose su proliferación por la cicatriza-ción o por su puesta en cultivo. Por defini-ción, las células madre están presentes entodos los tejidos autorrenovables con unalto grado de diferenciación celular. Estascélulas permanecen relativamente quies-centes, pero tienen un gran potencial parala división celular clonogénica y son res-ponsables de la proliferación y la diferen-ciación celulares. Las células madre pue-den llevar a cabo divisiones celulares asi-métricas, es decir, originando una célulahija que permanece indiferenciada y otracélula hija destinada a la diferenciación ydivisión celular, las células amplificadorastransitorias o células TAC. Estas células,por mitosis, aumentan el número de célu-las, diferenciándose en células postmitóti-cas. Las células madre y las células TACconstituyen el compartimento proliferati-vo del tejido, diferenciándose en su ciclovital y en la actividad mitótica. Las célulasTAC tienen un potencial proliferativo limi-



tado, se dividen con más frecuencia y danlugar a células diferenciadas incapaces dedividirse20. Las células madre de muchostejidos están siendo estudiadas como tra-tamiento de enfermedades degenerativasintratables de ninguna otra forma21. Scher-mer y col9 determinaron la localización lim-bar de estas células madre limbocornealesa partir de un estudio sobre la expresiónde la keratina corneal de 64kD. Tambiénsugirieron que las células TAC están locali-zadas en la capa basal corneal y las célulaspostmitóticas en las capas suprabasales.Conforme las células madre limbocornea-les van migrando desde el limbo al centrode la córnea, se van diferenciando en célu-las epiteliales corneales maduras o dife-renciadas. Se han estudiado diversosgenes, como el gen de la involucrina huma-no22, que pueden estar implicados en laregulación de los cambios que ocurrendurante esta diferenciación de célulasmadre limbocorneales a células TAC.Actualmente, la localización limbar de lascélulas madre del epitelio corneal se basaen varios datos:

– La ausencia de marcadores específi-cos del epitelio corneal diferencia-

do, como son las citoqueratinas 3 y12.

– La presencia de células de ciclolento en el epitelio limbar basal, conuna gran capacidad proliferativa encultivo.

– La cicatrización corneal anormalcon conjuntivalización, vasculariza-ción e inflamación crónica en casosde daño parcial o completo del epi-telio limbar.

– La utilización de las células limba-res en la reconstrucción del epiteliocorneal de pacientes con insuficien-cia límbica23.

Existe una hipótesis propuesta porThoft y col24 que explica la renovación delepitelio corneal por medio de tres ejes(Fig. 4): el X, que consiste en la prolifera-ción de las células basales, el Y, que con-siste en la proliferación y migración centrí-peta de las células limbares y el Z, que con-siste en la pérdida de células epiteliales dela superficie corneal. El mantenimiento delepitelio corneal, por tanto, puede definirsepor medio de la ecuación: X + Y = Z (Fig. 4),la cual representa cómo, para mantener el



Figura 4. Representación gráfica de los tres ejes descritos en la hipótesis de Thoft.

epitelio corneal, la pérdida celular debeestar en equilibrio con el reemplazo celu-lar. El componente Y es un movimientocelular centrípeto que ocurre incluso enausencia de un defecto agudo. Es impor-tante no confundir Y con otro fenómeno, elmovimiento rápido de las células periféri-cas en respuesta a un defecto centralagudo25. Utilizando esta hipótesis X, Y y Zes posible clasificar tanto las enfermeda-des como los tratamientos según el com-ponente específico implicado (X, Y o Z).

El epitelio conjuntival, sin embargo, esun epitelio autorrenovable con un granrecambio celular, cuyas células madrevan diferenciándose en células epitelialesa lo largo de la vida. Su localización hasido muy controvertida, pero los estudiosclínicos señalan que las células madreconjuntivales se localizan en el fórnix y/oen la conjuntiva bulbar26,27. Las técnicaspara determinar la localización de estascélulas se basa en la determinación decélulas de ciclo lento mediante el marcajedel DNA mitótico, en la estimulación mitó-tica, en la capacidad proliferativa de lascélulas aisladas en cultivo y en la defini-ción del origen del movimiento celular.Existen estudios que han analizado la dis-tribución de las células madre epitelialesen la conjuntiva bulbar mediante losmovimientos homeostáticos y las mitosisde las células epiteliales en esta zona. Seha observado que estas células epitelialesde la conjuntiva bulbar eran activas mitó-ticamente, pero permanecían estaciona-rias, lo que indicaba su capacidad deautorregeneración así como una distribu-ción uniforme de estas células madre entoda la conjuntiva bulbar28.

MARCADORES HISTOLÓGICOS DELAS CÉLULAS MADRE CORNEALES

El objetivo funcional del epitelio limbo-corneal es proporcionar una capa celularintrínsecamente transparente, lisa, alta-mente hidrofílica, impermeable a la pene-tración de soluciones fisiológicas y queproteja del ataque de gérmenes patógenos.Estas propiedades dependen de la adquisi-ción de ciertas características así como dela organización celular de una variedad decomponentes citoplasmáticos, citoesque-

léticos y de membrana que se van adqui-riendo conforme se va produciendo la dife-renciación celular.

Los métodos para identificar las célu-las madre limbocorneales son indirectos.Todavía no se han establecido marcadoresdirectos de las células madre limbocornea-les pero existen evidencias clínicas y expe-rimentales de la localización de estas célu-las madre en la región limbar8,29-33. Arpitha ycol34 sugirieron que las células madre lim-bocorneales probablemente estén consti-tuidas por un grupo de células pequeñascon un cociente núcleo/citoplasma eleva-do y altos niveles de la proteína celularp63. Se han propuesto una serie de marca-dores celulares asociados a las célulasmadre epiteliales de tejidos oculares y nooculares. La proteína p63 parece tener undoble papel en la formación del epitelio, eliniciar la estratificación epitelial durante eldesarrollo y el mantener el potencial proli-ferativo35. Los principales marcadores pro-puestos se clasifican en tres grupos:

– Proteínas nucleares como el factorde transcripción p63.

– Proteínas de la membrana celularde transmembrana, incluyendointegrinas (β1, α6, etc), receptores(receptor del factor de crecimientoepidérmico o EGFR) y transporta-dores resistentes a fármacos comoel ABCG223,36,37.

– La expresión variable de keratinasen las células epiteliales permite laseparación de las poblaciones celu-lares dentro del epitelio cornealsegún su nivel de diferenciación. Lascitoqueratinas 3 y 12 son marcado-res de diferenciación corneal38. Lacitoqueratina 3 se expresa en el epi-telio suprabasal del limbo y en el epi-telio corneal completo, pero no seexpresa en el epitelio basal del limboni en la conjuntiva bulbar adyacente.El epitelio basal limbar tampocoexpresa la citoqueratina 12, que sí seexpresa en el epitelio limbar supra-basal y en el epitelio corneal com-pleto8,12. La mayoría de células limba-res basales están desprovistas deconexinas y proteínas de unión gap.Las uniones gap son un tipo de



comunicación específica entre doscélulas formada por la agrupaciónlocal de canales intercelulares deporos grandes (unos 2 nm). Estoscanales están constituidos por poli-péptidos de tipo conexina, que sonidentificados según su peso molecu-lar39. La falta de comunicación inter-celular entre las células limbaresbasales refleja la necesidad de unmedio ambiente intracelular especí-fico para mantener su indiferencia-ción8. La membrana basal constituyeun componente fundamental en losestímulos exógenos que controlan elcrecimiento y la diferenciación delas células limbocorneales. La com-posición de la membrana se vedirectamente afectada por la activi-dad secretora de las células epitelia-les que se apoyan en ella36.

Chen y col23 estudiaron los marcadoresde los epitelios corneal y limbar con inmu-nohistoquímica, PCR (Polymerase ChainReaction) e hibridación in situ. Observa-ron cómo el p63, una proteína nuclear, sedetectaba en el núcleo de la capa basal delepitelio limbar, pero no en la mayoría delas células epiteliales corneales ni de lacapa suprabasal limbar. Este marcador esindicativo de una alta capacidad prolifera-tiva. Kawakita y col no observaron laexpresión de p63 en las células basales yen algunas células suprabasales de la cór-nea normal del conejo. Experimentos invitro muestran cómo las células madreproducen altos niveles de p63 mientrasque las células TAC no producen nivelesdetectables de p63 con técnicas de Wes-tern blot. También se ha demostrado cómoel ABCG2, proteína transportadora, seencuentra en la membrana celular y en elcitoplasma de la mayoría de las célulasbasales del epitelio limbar, expresándoseprimariamente el gen ABCG2 en las célulasbasales limbares36,41,42. Igualmente se hacomprobado una alta expresión de integri-na a9. También se encontraron otros mar-cadores, aunque no de forma exclusiva, enesta capa basal del epitelio limbar, comocon los marcadores anteriores. Estos sonla integrina b1, el EGFR y la citoqueratina19, que se expresan también en todas lascapas del epitelio corneal. Por último, tam-

bién se ha observado cómo ciertos marca-dores no se expresaban o se expresabanmínimamente en el epitelio basal limbar;son la conexina 43, las citoqueratinas 3 y12, la nestina, la caderina E y la involucri-na. Algunos de estos marcadores son espe-cíficos del epitelio corneal diferenciado. Sehan encontrado en algunos estudios célu-las que coexpresan dos componentes defilamentos celulares intermedios, la vimen-tina y la keratina 19. Sin embargo, todavíano está claro si se trata de células madrelimbocorneales o de células TAC8.

Otros autores, como Watanabe y col36

investigaron si la capa basal del epitelio lim-bar contiene una subpoblación celular pre-sente en muchos tipos de células madreespecíficas y que se conoce como célulascon fenotipo SP (Side Population). Estascélulas se identifican por su capacidad paracaptar la tinción Hoechst 33342 y expresanel marcador ABCG236,43-47. El porcentajemedio de células SP en el epitelio limbar apartir de 6 estudios independientes es de0,29%. Otros estudios, como el de Unemotoy col45, encontraron un 0,4% de células SP enla población epitelial limbar. Los autorescomprobaron que la expresión del ABCG2 essignificativamente mayor en la subpobla-ción de células con fenotipo SP que en lasque no presentan ese fenotipo. El ABCG2 seexpresa en las células epiteliales limbaresbasales, pero no en las células epitelialescorneales. Este estudio concluye que el mar-cador ABCG2 puede servir como un marca-dor de la superficie de células madre del epi-telio corneal aunque su función permaneceaún desconocida. Actualmente, el ABCG2parece ser el marcador de superficie celularmás útil en la identificación y aislamiento delas células madre limbocorneales48. Tambiénse ha demostrado la existencia de estapoblación de células SP en el limbo de cone-jo, caracterizada por ser una población indi-ferenciada y por aumentar su tasa de repli-cación en casos de cicatrización cornealcentral49.

Las células madre limbocorneales, ori-ginadas embrionariamente en el ectoder-mo neural, parecen tener propiedades neu-rológicas in vitro, lo que ha sido demostra-do por la reacción inmunohistoquímica areceptores de neurotransmisores (GABA,dopamina, serotonina, etc)50,51.



Harkin y col52 han estudiado la expre-sión de citoqueratinas y del marcador p63en cultivos autólogos de células epitelialeslimbares. Encontraron una marcada expre-sión de las citoqueratinas 14 y 19 en lascélulas limbares basales asociada a muybajos niveles de expresión de citoquerati-na 3 y a una alta expresión de p63. Losbajos niveles de citoqueratina 3 confirmanla baja diferenciación celular de este epite-lio limbar mientras que existe una coex-presión de las citoqueratinas 14 y 19 y delp63, lo que se asocia a un gran potencialproliferativo de las células epiteliales lim-bares in vitro52. Previamente, Koizumi y colrealizaron cultivos directamente sobremembrana amniótica o disociándolos trassu expansión ex vivo53. Esta expansión exvivo proporciona un número suficiente decélulas para realizar varios trasplantes evi-tando la realización de nuevas biopsias. Ladisociación se lleva a cabo con tripsina al0,25% y con EDTA 1mM. Aunque el papelexacto de los fibroblastos no está claro, lasupervivencia y proliferación de las célu-las progenitoras epiteliales se ve potencia-da por interacciones con las células deri-vadas del ratón y con los productos secre-tados por dichas células.

INSUFICIENCIA LÍMBICA: DIAGNÓS-TICO Y CARACTERIZACIÓN

La insuficiencia límbica es la pérdidaparcial o total de las células madre limbo-corneales. La etiología de la insuficiencialímbica (IL) puede relacionarse con unmicroambiente estromal insuficiente paramantener las funciones de las célulasmadre corneales o, en la mayoría de loscasos, con factores externos que destru-yen las células madre limbares como agre-siones químicas o térmicas, radiacionesultravioletas o ionizantes, síndrome de Ste-vens-Johnson, penfigoide ocular cicatri-cial, cirugías, crioterapias, utilización delentes de contacto o infecciones microbia-nas54. Incluso, se ha descrito el desarrollode una insuficiencia límbica completacomo complicación del tratamiento conmitomicina C tópica55. Otras veces, lo queocurre es una hipofunción de estas células,con una pérdida gradual de la función delas células limbocorneales debida a unsoporte estromal insuficiente. Esto ocurre

en casos de aniridia, queratitis asociada atrastornos endocrinos, queratopatía neu-rotrófica, inflamaciones limbares crónicaso causas idiopáticas56.

La destrucción parcial o completa delepitelio limbar lleva a una cicatrizaciónanormal del epitelio corneal, dando lugar auna serie de signos clínicos. Los principa-les signos son la invasión del epitelio con-juntival o conjuntivalización corneal, lavascularización y la inflamación crónicadel estroma corneal54,57. Otros signos sonun reflejo corneal irregular, una pérdida delas empalizadas de Vogt y una córnea degrosor variable58. La conjuntivalizacióncorneal supone una pérdida del epiteliolimbar como barrera entre los epitelioscorneal y conjuntival. En condiciones nor-males, la invasión corneal por parte delepitelio conjuntival vecino es impedidapor las células limbares. La conjuntivaliza-ción corneal produce una tinción anómalacon fluoresceína. Se trata de una tincióntardía debido a que el epitelio conjuntivaldeja pasar la fluoresceína a diferencia delepitelio corneal. Las células limbares sedañan y el epitelio conjuntival migra sobreel estroma corneal produciendo la conjun-tivalización, que se acompaña de vascula-rización corneal8 (Fig. 5). Estas dos mani-festaciones clínicas constituyen la defini-ción de insuficiencia límbica. La asocia-ción entre ambos signos clínicos podríaestar relacionada con la producción, porparte del epitelio conjuntival, de factoresque estimulan la inflamación estromal y lavascularización corneal. El tercer signo clí-nico que completa la triada de la insufi-ciencia límbica es una cicatrización enlen-tecida asociada a erosiones cornealesrecurrentes. Entre las posibles complica-ciones se encuentran la cicatrización, cal-cificación, ulceración, meelting y perfora-ción corneal.

Los síntomas clínicos son una disminu-ción de la agudeza visual, fotofobia, lagri-meo, blefaroespasmo y episodios recu-rrentes de dolor junto con inflamación yenrojecimiento crónicos. Los signos típi-cos de la insuficiencia límbica aguda sonfundamentalmente la desaparición de lasempalizadas de Vogt59 y el defecto epitelialcorneal total que sobrepasa en 2 ó 3 mm ellímite limbocorneal. En la insuficiencia lím-



bica crónica, sin embargo, a la desapari-ción completa de las empalizadas de Vogtse le añaden la neovascularización subepi-telial desde el limbo, la queratitis puntatasuperficial y la hiperpermeabilidad del epi-telio que recubre la córnea53.

Hay casos en los que, a pesar de apare-cer signos clínicos indicativos de IL, noexiste una evidencia citológica de IL en lacitología de impresión. Se han postuladodiversas causas para explicar esta situa-ción: puede que el daño de las células lim-bocorneales no sea lo suficientementesevero para destruir toda la poblacióncelular, que la insuficiencia límbica seasubclínica y empeore posteriormente, quela citología de impresión no sea lo sufi-cientemente sensible o que algunospacientes no manifiesten la IL56.

La insuficiencia límbica puede presen-tarse de forma localizada (parcial) o difusa(total). El diagnóstico de la insuficiencialímbica es muy importante y es determi-nante del tratamiento a seguir59. En estospacientes, la queratoplastia lamelar y laqueratoplastia completa proporcionansólo el reemplazo temporal del epiteliocorneal del receptor pero no reconstruyenla función limbar. Es necesario llevar acabo el trasplante autólogo o alogénico delimbo para conseguir la reconstrucción dela superficie corneal. Este tratamientopuede combinarse con una queratoplastiasimultánea o posterior.

Insuficiencia límbica parcialEn estos casos la insuficiencia límbica

afecta sólo a parte del limbo. El diagnósti-



Figura 5. Signos clínicos de insuficiencia límbica: neovascularización corneal 360º (A,B), inflamacióncrónica (B), tinción tardía con fluoresceína (C) y presencia de células caliciformes en citolo-gía de impresión (D).

co también se basa en la pérdida de lasempalizadas de Vogt, y, en algunos casos,en la presencia de células caliciformes enla superficie corneal, observadas en lacitología de impresión. Se ha demostradocomo el trasplante de membrana amnióti-ca ayuda a la regeneración de la superficiecorneal en casos de insuficiencia límbicaparcial sin necesidad de llevar a cabo untrasplante de células madre limbocornea-les60. Esto apoya la teoría de que la mem-brana amniótica ayuda a preservar yexpandir la población de células madrelimbocorneales remanente en casos deinsuficiencia límbica parcial60,61. Otrosautores también han utilizado la trasloca-ción limbar ipsilateral en casos de insufi-ciencia límbica parcial secundaria a caus-ticación por álcalis. Esta técnica consisteen trasplantar una zona sana de tejido lim-bar superior a la zona causticada delmismo ojo, sin tener que recurrir al ojocontralateral62.

Insuficiencia límbica completaEn la insuficiencia límbica completa

(ILC), la afectación ocurre en todo el limbocorneal. La detección clínica de la ILC esimportante porque estos pacientes sonmalos candidatos para el trasplante decórnea convencional. La citología deimpresión es una técnica sencilla, no inva-siva, que se ha demostrado útil en el diag-nóstico y monitorización de la ILC. Enestos pacientes, se ha propuesto comoalternativa a la queratoplastia convencio-nal el trasplante de células madre autólo-gas asociado al injerto de membranaamniótica. Es necesario el trasplante deuna fuente autóloga o alogénica de lascélulas madre limbocorneales que se hanperdido63. La membrana amniótica parecepreservar las células madre limbocornea-les y retener sus propiedades in vivo,actuando como soporte ideal en el cultivode estas células64. El objetivo de este trata-miento es promover la reepitelización cor-neal, conseguir un epitelio estable, preve-nir la neovascularización y restaurar latransparencia corneal. El injerto de mem-brana amniótica asociado al alotrasplantede limbo ayuda a la regeneración de unmicroambiente estromal perilímbico ade-cuado para soportar el tejido limbar tras-

plantado. Según Tseng y col los resultadosson igual de satisfactorios independiente-mente de que el trasplante de membranaamniótica se haga antes o en un mismotiempo que el trasplante de limbo60. El tras-plante alogénico presenta muchos proble-mas asociados, principalmente el alto ries-go de rechazo del injerto debido al grannúmero de antígenos HLA-DR y células delangerhans en el injerto. De ahí que seannecesarias altas dosis de inmunosupresióndurante largos periodos de tiempo8.

TRATAMIENTO QUIRÚRGICO EN LAINSUFICIENCIA LIMBICA

QueratoplastiaLa queratoplastia penetrante es una

técnica quirúrgica que consiste en la extir-pación de un botón corneal en el receptory su sustitución por un botón corneal deun donante, que se sutura a la córnea resi-dual del receptor con una sutura suelta(Fig. 6) o continua. La queratoplastia esindispensable para la reconstrucción deldaño estromal severo, pero sólo estimulala reepitelización corneal completa si exis-ten células madre limbocorneales epitelia-les en el ojo dañado. Las células limbarespueden ser estimuladas para migrar y pro-liferar por los efectos paracrinos de lascélulas del donante, como ocurre con loscultivos de queratinocitos de la piel. Enausencia de células epiteliales limbocorne-ales, la queratoplastia produce reepiteliza-ción corneal a partir de células conjuntiva-les, es decir, una conjuntivalización corne-al. En estos pacientes, el trasplante autólo-go de células limbares previo es la únicaposibilidad de cicatrización corneal nor-mal. Este procedimiento implica el tras-plante de injertos limbares del ojo sano alojo dañado.

Trasplante de membrana amnióticaLa membrana amniótica, es decir, el

amnion, es la capa más interna de la mem-brana placentaria y está constituida poruna membrana basal gruesa y un estromaavascular65. El trasplante de membranaamniótica proporciona un buen sustratoque favorece la cicatricación del epitelio ala superficie corneal. La membrana basal



de la membrana amniótica estimula lamigración y adhesión de las células epite-liales. La presencia de su matriz estromalavascular disminuye la inflamación, la neo-vascularización y la fibrosis66. La membra-na amniótica produce una mejoría clínicade la fotofobia y el dolor, facilita la epiteli-zación más rápida, ayudando a restauraruna superficie epitelial corneal normal65.Constituye también un sustrato ideal pararestaurar el nicho estromal de las célulaslimbocorneales epiteliales así como paraconseguir la expansión de estas células67.Ésto se ve favorecido por su carencia decomponentes vasculares y por su gruesamembrana basal constituída por colágenoIV y V58.

Trasplante de limboLa regeneración de esta población lim-

bocorneal epitelial es necesaria para larecuperación de la visión y de la superficiecorneal normal cuando existe un déficit delas células madre limbocorneales. Kenyony Tseng68, en 1989, demostraron la utilidaddel trasplante de limbo en casos de insufi-ciencia límbica completa secundaria acausticaciones térmicas o químicas. Estoshallazgos confirmaron la utilidad del epite-lio limbar como fuente de células madre enla regeneración de esta población celular

destruida69. Mediante este procedimientose trasplantan células madre viables pro-cedentes del propio individuo (autotras-plante límbico) o de un donante (alotras-plante límbico) en casos de afectación bila-teral. La técnica descrita por ellos consis-tía en el trasplante de dos fragmentos lim-bocorneales grandes, de 6-7 mm de arcode limbo, extirpados del ojo sano. El tras-plante de limbo no debe hacerse en la faseaguda tras la causticación debido a la altaposibilidad de fracaso asociada a la graninflamación, debe esperarse varios mesespara llevar a cabo el tratamiento70. El auto-trasplante de limbo es el primer tratamien-to quirúrgico en causticación química otérmica de la córnea unilateral, tras el cualpuede llevarse a cabo la queratoplastia enlos casos de opacidad estromal71.

Trasplante de células limbaresLa pérdida limbocorneal que implica el

trasplante de limbo supone un riesgo dedesarrollar insuficiencia límbica para elojo sano. Una forma de minimizar el dañodel ojo donante es la expansión in vitro decélulas epiteliales limbares para su poste-rior implante. Las células madre limbocor-neales expandidas ex vivo pueden recons-truir con éxito la superficie corneal encasos de insuficiencia límbica completa



Figura 6. Queratoplastia penetrante.

unilatera72. Existen diversas técnicas parallevar a cabo el trasplante de células lim-bares. El objetivo de este tratamiento esextirpar el tejido corneal anómalo y el pan-nus corneal del receptor y trasplantar unanueva fuente de células epiteliales cornea-les. Si el trasplante es eficaz la córnea delreceptor queda recubierta por un epiteliocorneal sano generado a partir de las célu-las trasplantadas. Se ha demostrado cómouna biopsia limbar de 1 mm2 es suficientepara obtener las células necesarias pararegenerar un epitelio corneal sano y cubrirla superficie limbocorneal. Esto significa-ría una mínima pérdida de células madrelimbocorneales en el ojo sano16. El tejidodel donante puede proceder del ojo con-tralateral (autotrasplante), cuando ésteestá sano, o de un donante (alotrasplante),si la afectación es bilateral. Se necesita unsoporte tisular para trasplantar las célulasya que éstas no pueden trasplantarse deforma aislada. Están descritos diferentessoportes para el cultivo celular, el más fre-cuente es la membrana amniótica73-75, perotambién se han usado otros como el colá-geno76 o el gel de fibrina77. Diversos estu-dios experimentales han demostrado quedurante la expansión ex vivo sobre mem-brana amniótica se preservan la tasa dereplicación, la cinética del ciclo celular ylas características fenotípicas de las célu-las progenitoras del epitelio limbar y con-juntival78. La membrana amniótica estimulala migración del epitelio corneal sobre ellapromoviendo una fuerte adhesión entrelas células basales corneales y el estromaamniótico53. Parece ser que esta posibleinteracción entre las células limbocornea-les y la matriz de la membrana amnióticapodría tener un papel fundamental en elmantenimiento de las características delas células madre limbocorneales. Lascélulas expandidas se adhieren fuertemen-te a la membrana amniótica formándoseunas estructuras entre el epitelio y la mem-brana amniótica similares a la membranabasal78.

Las células madre del epitelio limbo-corneal expandidas y preservadas en elcultivo sobre membrana amniótica danlugar a un epitelio estratificado de fenotipoindiferenciado similar al epitelio limbar invivo79.

Recientemente, Hiti y col80 han descritocomo tratamiento de la insuficiencia límbi-ca completa la realización de una querato-plastia lamelar-penetrante combinada conel trasplante de células limbocorneales y lahan llevado a cabo en 6 pacientes. Estaqueratoplastia lamelar-penetrante consis-te en una queratoplastia lamelar periféricaasociada a una queratoplastia penetrantecentral. Vajpayee y col81 ya habían descritopreviamente la utilidad de la queratoplas-tia lamelar de gran diámetro en el trata-miento de causticaciones químicas, consi-guiéndose una superficie ocular establedebido al aporte de células madre limbo-corneales.

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