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Universidade de So Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de
cana-de-acar
(Saccharum officinarum l.) tratadas com paraquat
Roberta Magalhes Chagas
Dissertao apresentada para obteno do ttulo
de Mestre emCincias. rea de Concentrao:
Fisiologia e Bioqumica de Plantas.
PIRACICABA
2007
-
2
Roberta Magalhes Chagas
Biloga
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de
cana-de-acar
(Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat
Orientadora: Profa. Dra. HELAINE CARRER
Dissertao apresentada para obteno do ttulo de
Mestre emCincias. rea de Concentrao:
Fisiologia e Bioqumica de Plantas.
PIRACICABA
2007
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP
Chagas, Roberta Magalhes Alteraes fotossintticas e respostas
oxidativas em plantas de cana-de-acar
(Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat / Roberta
Magalhes Chagas. - - Piracicaba, 2007.
82 p. : il.
Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, 2007. Bibliografia.
1. Cana-de-acar 2. Fotossntese 3. Herbicidas 4. Superxido
dismutase I. Ttulo
CDD 633.61
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que
citada a fonte O autor
-
3
Talvez possamos um dia nos arrepender do que fizemos...
Mas o arrependimento sinal de que no tivemos medo de
tentar...
E da se as coisas no deram certo como deveriam...
E da se no era bem o que queramos?
E nossa vida segue... para tentarmos e errarmos muitas
vezes...
Isso viver e aprender.
Oscar Wilde
-
4
Aos meus queridssimos pais, Jeov Filho e Vldia Magalhes
-
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira, meu mestre, no
verdadeiro sentido da palavra. Sem o
seu apoio este trabalho no teria se concretizado. Obrigada pelos
conselhos e contribuies
cruciais para este trabalho e para minha formao acadmica. Sempre
lhe serei grata.
Profa. Dra. Helaine Carrer, pela orientao, confiana e apoio para
a realizao deste trabalho,
pelas sugestes e crticas ao mesmo.
Ao Prof. Dr. Victor Vitorello, pela co-orientao e pronta
disponibilizao de seu laboratrio e
casa de vegetao para desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Rafael Ribeiro, do IAC, pela inestimvel ajuda com as
anlises de fluorescncia da
clorofila, bem como na anlise dos resultados obtidos.
CAPES, pela concesso da bolsa de estudo.
Aos amigos Josemir e Christine, da UFC, pelo auxlio nas
atividades enzimticas.
CTC pela concesso dos toletes de cana-de-acar, e ao grupo de
plantas daninhas, coordenado
pelo Prof. Christoffoletti, pela aplicao do herbicida em
estudo.
Aos mestres do Programa de ps-graduao em Fisiologia e Bioqumica
de plantas, pela
contribuio de conhecimentos em minha formao de mestre.
Aos colegas do Laboratrio de Biologia Molecular, em especial, ao
amigo Adriano e aos demais
colegas, Carlos, Ftima, Eduardo, Valesca, Danila, Simone e
Keini, pela amigvel convivncia.
Por fim, mas superiormente importante, Daniel Becker, pelo apoio
incondicional e maravilhosa
companhia durante esses anos. minha avozinha, por suas oraes
dirias, e meus queridos
pais, pelo suporte e afeto, mesmo distncia.
-
6
SUMRIO
RESUMO
..........................................................................................................................
8
ABSTRACT ............................................
........................................................................
9
LISTA DE FIGURAS
......................................................................................................
10
LISTA DE TABELAS
......................................................................................................
12
ABREVIATURAS E DEFINIES
................................................................................
13
1 INTRODUO
............................................................................................................
14
2 REVISO
BIBLIOGRFICA......................................................................................
16
2.1 A cana-de-acar
.......................................................................................................
16
2.2 Ao do Paraquat em plantas
.....................................................................................
17
2.3 A fluorescncia da clorofila a
....................................................................................
19
2.4 O estresse oxidativo em plantas
.................................................................................
21
2.5 Algumas enzimas antoxidantes
..................................................................................
24
2.5.1 Superxido dismutase (SOD)
.................................................................................
25
2.5.2 Ascorbato Peroxidase (APX)
..................................................................................
25
2.6 Protenas induzidas sob condies de estresse
.......................................................... 26
3 MATERIAIS E
MTODOS.........................................................................................
28
3.1 Estratgia experimental e delineamento estatstico
................................................... 28
3.2 Material vegetal
.........................................................................................................
28
3.3 Conduo do experimento
.........................................................................................
28
3.4 Anlise da fluorescncia da clorofila a
......................................................................
29
3.5 Concentrao de espcies reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS)
....................... 30
3.6 Contedo de clorofilas
...............................................................................................
31
3.7 Extrao e determinao das concentraes de protenas solveis e
insolveis ........ 31
3.8 Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) ........................... 32
3.8.1 Revelao do gel com nitrato de prata e coomassie blue
....................................... 33
3.9 Atividade de superxido dismutase
...........................................................................
34
3.9.1 Atividade de SOD por espectrofotometria
.............................................................
34
3.9.2 Atividade de SOD em gel
.......................................................................................
34
3.10 Atividade de ascorbato peroxidase
..........................................................................
35
3.11 Extrao de protenas totais para eletroforese bidimensional
.................................. 35
-
7
3.12 Focalizao isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE
............................................................ 38
4 RESULTADOS E
DISCUSSO...................................................................................
39
4.1 Efeitos do tratamento sobre a fluorescncia da clorofila a
........................................ 39
4.2 Efeitos do tratamento sobre indicadores bioqumicos de
resposta ao estresse
oxidativo......................................................................................................................
47
4.2.1 Peroxidao de lipdeos
..........................................................................................
49
4.2.2 Contedo de clorofilas totais, a e b
........................................................................
51
4.2.3 Concentrao de protenas solveis e insolveis
.................................................... 53
4.2.4 SDS-PAGE 12,5% de protenas solveis e insolveis
........................................... 55
4.2.5 Atividade da enzima Superxido Dismutase (SOD)
............................................... 56
4.2.6 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX)
................................................ 60
4.3 Efeitos do tratamento sobre a expresso de protenas totais
por gis 2-D ................. 61
5 CONCLUSES
.............................................................................................................
66
REFERNCIAS................................................................................................................
67
ANEXOS
.........................................................................................................................
81
-
8
RESUMO
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de
cana-de-acar (Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat
Este trabalho teve como objetivo analisar os efeitos fisiolgicos
do herbicida Paraquat, indutor de estresse oxidativo, em plantas de
cana-de-acar (Saccharum officinarum L.). A escolha desta espcie
como modelo fisiolgico deste estudo deveu-se a sua importncia
econmica para o pas, em especial para o Estado de So Paulo. O
Paraquat (PQ) um herbicida de contato que atua especificamente no
Fotossistema II bloqueando o fluxo de eltrons e impedindo a reduo
do NADPH, aceptor final de eltrons. Como consequncia, h a formao de
radicais instveis, reativos com a molcula de oxignio (EROs), os
quais causam danos em membranas, protenas e cidos nucleicos. A
hiptese central foi a de que a atividade de peroxidase de ascorbato
mais sensvel ao PQ do que a atividade de superxido dismutase, nas
mesmas condies. O experimento principal consistiu da aplicao, via
pulverizao foliar, de diferentes doses de PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM de
Metil Violgeno, agente ativo), que permaneceu em contato por 24 e
48 horas. Aps 18 horas de exposio, observou-se sintomas visuais de
toxocidade e uma reduo significativa da atividade fotossinttica,
medida atravs de parmetros relacionados com a fluorescncia da
clorofila a. O nvel de peroxidao de lipdeos, indicado pela
concentrao de TBARS, foi aumentado, indicando danos nas membranas
causados pela gerao de EROs. Um resultado importante foi o aumento
da atividade especfica de SOD (Superxido Dismutase), primeira
enzima de defesa contra EROs. Esse aumento foi gradativo com o
aumento da dose e do tempo de exposio ao PQ. A isoforma mais
evidente foi a SOD Cu/Zn, visualizada por atividade em gel nativo.
Esta isoforma est presente preferencialmente em cloroplastos,
organela alvo da ao do PQ. importante ressaltar que mesmo em doses
quase letais, a atividade desta enzima manteve-se em nveis
semelhantes ao controle. Entretanto, a atividade de APX (Ascorbato
Peroxidase), enzima que faz a remoo de radicais H2O2, gerados pela
SOD, foi reduzida abruptamnete a partir de 4 mM PQ, apesar de ter
sido observado um aumento na dose inicial (2 mM). Este fato sugere
que os danos oxidativos em cana-de-acar tratadas com PQ podem ser
causados pelo excesso de radicais H2O2. Diferente da SOD, a APX
considerada bastante susceptvel a certos tipos de estresse
ambiental, logo perdendo sua atividade. Analisou-se tambm a
expresso de protenas por SDS-PAGE e eletroforese 2-D. Em ambos
resultados, foram observados diminuio na expresso de algumas
protenas ocasionada pelo tratamento com PQ. Contudo, no foi possvel
detectar claramente a induo de peptdeos nesse caso, provavelmente
devido ao alto grau de degradao das estruturas celulares. O aumento
da atividade de SOD em cloroplastos de folhas de cana-de-acar
tratadas com PQ, deve ser mais estudado, pois esta pode ser uma
enzima alvo para programas de melhoramento gentico visando obteno
de plantas com resistncia ao PQ e a outros herbicidas com modo de
ao no sistema fotossinttico.
Palavras-chave: Cana-de-acar; Estresse oxidativo; Paraquat;
Fotossntese.
-
9
ABSTRACT
Changes in photosynthesis and oxidative responses in sugarcane
plants (Saccharum
officinarum L.) treated with Paraquat
This work had the objective to analyze physiological effects of
Paraquat herbicide, an oxidative stress inductor, in sugarcane
(Saccharum officinarum L.) plants. The choice to use this species
as a physiological model for this study was due its recognized
economical importance for our country, in special to the State of
Sao Paulo. Paraquat (PQ) is a contact herbicide that acts
specifically on Photosystem II by blocking the normal electron flux
and the reduction reaction of NADPH, the electron acceptor
molecule. As consequence, there is formation of instable radicals
and highly reactive oxygen species (ROS), which cause damage to
membranes, proteins and nucleic acids. The central hypothesis was
that ascorbate peroxidase activity is more sensitive to PQ than the
activity of superoxide dismutase in the same conditions. The main
experiment consisted on the sprayed of different concentrations of
PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM of Metil Violagen) that stayed in leaf
contact for 24 and 46 hours. After 18 hours, it was observed
visible symptoms of toxicity and the photosynthetic activity
decreased, measured by chlorophyll a fluorescence. Also, the level
of lipids peroxidation measured by the increase concentration of
TBARS formation, indicate damage to cell membrane caused by the
generation of ROS. An important result was the increase of SOD
specific activity (superoxide dismutase) first enzyme related to
defense against ROS. This gradation increase was correspondent to
the exhibition period to PQ. The most evident SOD isoform by native
PAGE was the SOD Cu/Zn. This isoform is located preferentially in
chloroplasts, organelle target to the action of PQ. It is important
to remark that even in almost lethal concentrations of PQ the
chloroplast SOD activity still remains expressed beilng responsible
for the removal of H O generated by SOD, which was reduced 2 2
abruptly after 4 mM treatment. Although, it has been observed
increase with the initial dose (2 mM). This fact suggests that the
oxidative damages in sugarcane treated with PQ can be caused by
excess of H2O2. Differently of SOD, this enzyme is considered to be
fragile to certain kinds of environmental adversities, loosing its
activity Also the protein expression was analyzed by SDS-PAGE and
2-D electrophoresis. In both analyses, it was observed decrease of
some protein expression caused by PQ. However, it was not possible
to clearly detect peptides induction in this case, probably due to
the elevated level of degradation of cell structures. The increase
of chloroplast SOD activity in sugarcane leaves treated with PQ
should be detailed investigated since it can be a molecular target
for breeding programs with the goal to obtain plants with an
acquired resistance to PQ or others herbicides with model action in
the photochemical system.
Keywords: Sugarcane; Oxidative stress; Paraquat;
Photosynthesis
-
10
LISTA DE FIGURAS
Pgina
Figura 1 Esquema ilustrativo da cadeia de eltrons entre os
Fotossistemas II e I, no
cloroplasto e o local de ao do herbicida Paraquat
.......................................
19
Figura 2 Vista parcial do stand experimental, montado em
casa-de-vegetao, com as
mudas de cana-de-acar aos 30 dias aps plantio
.........................................
29
Figura 3 Esquema da sequncia de extrao de protenas totais de
folhas de plntulas
de cana-de-acar para corrida eletrofortica uni e bidimensional
sob
condies desnaturantes
..................................................................................
37
Figura 4 A-Medidas da fluorescncia basal (Fo) e mxima (Fm) da
clorofila e B-
eficincia quntica potencial do
PSII..............................................................
39
Figura 5 Taxa aparente de transporte de eltrons (ETR)
............................................... 41
Figura 6 Eficincia quntica efetiva do FSII
(PSII)..................................................... 43
Figura 7 A- Excesso relativo de energia no aparato fotoqumico
(EXC) e B-
coeficiente de extino no fotoqumica (quenching) de energia (qN)
..........
44
Figura 8 Relao entre o coeficiente de extino no fotoqumica da
fluorescncia
(qN) e o aumento do excesso relativo de energia (EXC)
................................
46
Figura 9 Aspecto visual de folhas de cana-de-aucar condio
controle e tratadas com
4mM de Metil Violageno durante um perodo de 24 horas
............................
48
Figura 10 Determinao da concentrao de espcies reativas do
cido
Tiobarbitrico (TBARS)
.................................................................................
49
Figura 11 Determinaes do contedo de clorofilas totais (A),
clorofila a (B),
clorofila b (C) e razo clorofila a/b (D)
..........................................................
51
Figura 12 Concentrao de protenas, frao solvel (A) e frao
insolvel (B) .......... 53
Figura 13 Eletroforese desnaturante em mini-gel de
poliacrilamida 12,5 % da frao
de protenas solveis (A e C) e insolveis (B e D) de folhas de
plantas de
cana-de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil
Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas (A e B) e 48 horas (C e D) de
aplicao..............
54
Figura 14 Atividade da enzima Superxido Dismutase em folhas de
plantas de cana-
-
11
de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de aplicao...
....................................
56
Figura 15 Revelao diferencial da atividade em gel nativo 12,5%
da enzima
Superxido Dismutase folhas de plantas de cana-de-acar expostas
a
diferentes concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 24 horas
de
aplicao.......................................................................................................
57
Figura 16 Atividade em gel nativo 12,5% da enzima Superxido
Dismutase folhas de
plantas de cana-de-acar expostas a diferentes concentraes de
Metil
Violgeno (Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de aplicao....
.....................
58
Figura 17 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase em folhas de
plantas de cana-
de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de
aplicao.....................................
60
Figura 18 Eletroforese bidimensional de folhas de cana-de-acar,
condio controle
e condio tratada com 4mM Metil Violgeno aps perodo de 24
horas
de aplicao
.................................................................................................
62
Figura 19 : Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum,
software para anlise
das imagens obtidas por meio do escaneamento dos gis. Os
pontos
vermelhos representam os spots detectados pelo programa em cada
gel.....
62
Figura 20 Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum, mostrando
uma
identificao numrica para cada spot dos respectivos tratamentos
............
63
Figura 21 Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum. Os pontos
vermelhos
representam os spots presentes somente em um gel e os verdes
so
aqueles spots comuns aos dois geis, ou seja, que foram
relacionados por
meio do match, uma ferramenta de sobreposio de gis pelo
programa..
64
-
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Relao dos spots do gel 2-D da amostra no-tratado
(Controle), identificados
pelo programa ImageMaster 2-D Platinum, conforme mostrado na
figura 20,
mostrando seus respctivos pontos isoeltricos (pI), massas
moleculares
(MW), intensidade percentual normalizada (%Intens) e volume
percentual
normalizado (%Vol)
..........................................................................................
82
Tabela 2- Relao dos spots do gel 2-D da amostra tratada com PQ
4mM, identificados
pelo programa ImageMaster 2-D Platinum, conforme mostrado na
figura 20,
mostrando seus respctivos pontos isoeltricos (pI), massas
moleculares
(MW), intensidade percentual normalizada (%Intens) e volume
percentual
normalizado (%Vol)
..........................................................................................
83
-
13
LISTA DE ABREVIATURAS
APX Ascorbato Peroxidase
ATP Adenosina 5-trifosfato
CAT Catalase
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propane
sulfonate
DNA Deoxyribonucleic acid
DTT Dithiothreitol
EROs Espcies reativas de oxignio
EST Expressed sequence tag
ETR Taxa aparente de transporte de eltrons (mol m-2 s-1)
EXC Excesso relativo de eltrons
Fm Fluorescncia mxima aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fm Fluorescncia mxima na presena de luz (unid. rel.)
Fo Fluorescncia basal aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fo Fluorescncia basal aps excitao do fotossistema I (unid.
rel.)
Fv Fluorescncia varivel aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fv/Fm Eficincia quntica potencial do fotossistema II
MF Matria fresca
NADPH Dinucleotdeo adenina fosfato nicotinamida (reduzido)
PAR Radiao fotossinteticamente ativa
PQ Paraquat
PSI/ PSII Fotossistema I /II
QA Quinona A
qN Coeficiente de extino no-fotoqumica da fluorescncia
qP Coeficiente de extino fotoqumica da fluorescncia
SDS-PAGE Sodium dodecylsulfate - Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
SOD Superxido Dismutase
TBA 2-thiobarbituric acid
TCA Trichloroacetic acid
Tris Tris-hidrxiaminometano
PSII Eficincia quntica efetiva do fotossistema II
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14
1 INTRODUO
A cana-de-acar (Saccharum officinarum L.), alm da significativa
importncia
socioeconmica para o sistema agroindustrial do Estado de So
Paulo e do Brasil, tem adquirido
considervel destaque no mbito cientfico e tecnolgico com os
resultados do seqenciamento de
ESTs e da categorizao de milhares de genes (Projeto
SUCEST/FAPESP), cujas funes j
esto em estudo. Alm de estudos de genmica funcional, a
identificao de protenas e suas
propriedades, ou seja, a anlise protemica, um fator importante
para a obteno de variedades e
hbridos com caractersticas agronmicas mais favorveis.
O uso de herbicidas em culturas comercialmente importantes como
a cana-de-acar,
uma prtica bastante comum para minimizar perdas de safra por
infestao de ervas daninhas.
Entretanto, o uso inadvertido ou excessivo de tais agroqumicos
pode causar danos irreparveis na
cultura em questo. Dentre os compostos atualmente mais usados
para este fim na cultura da cana-
de-acar, podemos citar: Velpar-K, Ametryn e o Paraquat ou
Gramoxone (SINDAG, 2001).
Este ltimo em menor escala devido sua alta toxicidade para sade
humana e seu rpido poder
destruidor em plantas, sendo tambm bastante difundido como um
agente dessecante, facilitando a
colheita.
Um dos danos causados por determinados fatores de estresse,
tanto de natureza bitica ou
abitica, a produo de radicais livres, essencialmente, as espcies
reativas de oxignio (EROS).
Estes radicais so responsveis por danos, muitas vezes
irreversveis, em componentes celulares,
caracterizando o chamado estresse oxidativo. O Paraquat, por
exemplo, provoca a gerao de
AOS no cloroplasto e ocasiona danos estruturais em DNA,
protenas, lipdios e pigmentos
(BENAVIDES et al., 2000; EKMEKCI ; TERZIOGLU, 2005). As plantas
dispem de diferentes
estratgias de proteo contra os danos celulares e a possvel morte
causada pelo excesso de
radicais livres.
O sistema de defesa antioxidativo enzimtico das plantas inclui
diversas enzimas
antioxidantes nos diferentes compartimentos celulares. Dentre as
principais enzimas podemos
citar as dismutases de superxido e as peroxidases de ascorbato,
que atuam conjuntamente
removendo radicais superxidos e perxidos, respectivamente. Alm
de um aparato enzimtico, a
alterao e/ou regulao de vias biossntticas de protenas constitui
outra importante estratgia de
defesa.
-
15
Nas plantas, o Paraquat atua rapidamente, por contato, causando
forte toxicidade aps
algumas horas de aplicao. Esse herbicida, pertencente ao grupo
qumico dos bipiridlios, que
agem como inibidores do fotossistema I. O mecanismo de ao d-se
por meio do bloqueio do
fluxo de eltrons da fotossntese, impedindo a reduo do NADP+
NADPH2. Dessa forma,
ocorre um acmulo de eltrons e de radicais txicos no cloroplasto,
causando srios danos no
metabolismo celular. Esse radicais so instveis e rapidamente
sofrem auto-oxidao, onde so
produzidos radicais superxidos, hidroxila, perxido e oxignio
singleto. Estes, por sua vez, so
altamente reativos com os lipdeos das membranas celulares,
promovendo sua peroxidao. Com
a degradao das membranas, h um vazamento do suco celular e a
morte do tecido (VARGAS et
al., 1999). Portanto, a expresso induzida de protenas envolvidas
com a desintoxicao desses
radicais e de outros derivados parece ser uma estratgia
importante na atenuao dos efeitos
deletrios de tais produtos.
Atualmente, grande parte das pesquisas com plantas tem dedicado
esforos procura e ao
desenvolvimento de novas variedades resistentes a estresses
ambientais, quer seja de natureza
bitica ou abitica. No entanto, a habilidade de sobreviver em
tais condies de estresse requer
mltiplas adaptaes das plantas. Tais adaptaes evolucionrias
envolvem um grupo complexo
de parmetros, que ainda no foram totalmente descobertos. nesse
ponto onde se ressalta a
importncia de estudos que focalizem nas respostas fisiolgicas,
metablicas e moleculares das
plantas s diferentes formas de estresse. Com o avano das tcnicas
bioqumicas e moleculares
nas ltimas dcadas estes estudos se intensificaram, fornecendo
maiores informaes sobre a
fisiologia dos cultivares utilizados e auxiliando programas de
melhoramento gentico de diversas
espcies agrcolas.
Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar
possveis alteraes no
metabolismo fotossinttico, bem como a expresso de enzimas
relacionadas com a defesa
oxidativa em plantas de cana-de-acar tratadas com o herbicida
Paraquat.
-
16
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 A cana-de-acar
A cana-de-acar (Saccharum sp.) uma planta pertencente ao gnero
das gramneas
(Poaceae), juntamente com os gneros Zea e Sorghum. Seis espcies
de Saccharum so,
atualmente, reconhecidas: S. officinarum, S. sinensi, S.
barberi, S. edule, S, spontaneum e S.
robustum. O centro de origem deste gnero a regio leste da
Indonsia e Nova Guin
(DANIELS; ROACH, 1987). Hoje, disseminado em todo o mundo, este
gnero foi introduzido no
Brasil em 1553, e desde ento estabeleceu-se nas regies
Centro-Oeste, Sudeste e Nordeste,
principalmente.
Historicamente a cana-de-acar um dos principais produtos
agrcolas do Brasil,
cultivada desde a poca da colonizao. Atualmente, o Brasil o
maior produtor mundial de cana-
de-acar, com uma rea plantada de 5,9 milhes de hectares. Na
safra de 2004/05 foram
produzidas cerca de 415,7 milhes de toneladas, e na safra
2005/06 a produo foi de 463,8
milhes de toneladas, o que representou um crescimento de 5,1% em
relo safra anterior. O
Estado de So Paulo lidera a produo do pas, onde foram produzidos
60,8% do total nacional. A
produo de lcool foi de aproximadamente 17 bilhes de litros e o
acar algo ao redor de 27
milhes de toneladas (CNA, 2006).
A partir da industrializao desta cultura obtm-se produtos como:
o acar, nas suas mais
variadas formas e tipos, o lcool (anidro e hidratado), o vinhoto
e o bagao. A cana-de-acar ,
portanto, o principal tipo de biomassa energtica, base para todo
o agronegcio sucroalcooleiro,
que, com as exportaes de acar, colaboram com o equilbrio da
balana comercial. Alm disso,
o setor sucroalcooleiro, representado por 350 indstrias de acar
e lcool no pas, responsvel
pela gerao de aproximadamente 1.000.000 empregos diretos e
indiretos (MAPA, 2006).
Os 10 principais produtores so responsveis por 74% da produo
mundial de acar, e o
Brasil ocupa um papel de liderana, tanto na produo como na
exportao de acar. Esse
potencial competitivo do Brasil se deve a produtividade e
rendimento industrial, pesquisas sobre
novas variedades, utilizao de novas tcnicas agrcolas e solos
frteis, condies que garantem
ao pas os menores custos de produo do mundo.
O interesse no uso do etanol como combustvel tem-se revigorado
ultimamente devido ao
aumento dos preos do petrleo e a necessidade de reduo de emisso
de gases causadores do
-
17
efeito estufa. Principalmente aps a ratificao do protocolo de
Kyoto, vrios pases esto
voluntariamente aderindo metas de reduo de gases, entre os quais
se destacam Inglaterra,
Alemanha, Holanda, Japo. Da a importncia cada vez maior do lcool
como combustvel, e o
Brasil ganha destaque nesse novo mercado j que as vantagens
competitivas brasileiras do
binmio cana/acar tambm se aplicam cana/etanol.
Entretanto, um dos maiores problemas no cultivo da cana-de-acar
a interferncia das
plantas daninhas que infestam campos de plantio, competindo com
a cultura por luz, nutrientes,
gua e espao, provocando srias perdas na produtividade (VICTORIA
FILHO;
CHRISTOFFOLETI, 2004). Alm disso, a infestao de plantas daninhas
provoca um decrscimo
na longevidade do canavial, queda na qualidade industrial da
matria-prima e dificuldades na
colheita e transporte da cana-de-acar (PROCPIO et al., 2003).
Portanto, um manejo adequado
de ervas indesejveis nesta cultura de fundamental importncia
para o setor agrcola, e este
controle realizado, principalmente, pelo uso de herbicidas.
Dentre os defensivos agrcolas, os
herbicidas correspondem a 56% do volume comercializado no
Brasil, sendo a cana-de-acar a
segunda cultura em consumo deste insumo no pas, ficando atrs
apenas da soja (PROCPIO et
al., 2003)
Atualmente a cultura da cana-de-acar est alicerada em variedades
que so hbridos
obtidos por um criterioso trabalho de seleo e melhoramento
gentico entre espcies conhecidas,
obtendo caractersticas desejveis conforme regies e situaes
especficas. A escolha da
variedade considerada um fator de produo e desenvolvimento
tecnolgico de maior
importncia em uma usina sucroalcoleira (MATSUOKA, 2000). No
presente trabalho adotou-se
como modelo experimental a variedade SP 80-3280, desenvolvida
pelo Centro de Tecnologia
Canavieira (Piracicaba-SP) e amplamente comercializada como
sendo uma variedade robusta,
produtiva e tolerante condies adversas de solo e clima. Tambm,
esta variedade foi a
escolhida para realizao do projeto SUCEST, que disponibilizou
290 mil sequncias de DNA
desta espcie (VETTORE et al., 2001)
2.2 Ao do Paraquat em plantas
O Paraquat, cujo principio ativo o metil violgeno, um dos
herbicidas mais
amplamente utilizados no mundo, aplicado no controle de ervas
daninhas anuais e perenes em
uma grande variedade de culturas, incluindo cereais,
oleaginosas, frutas e hortalias (SCHIMIDT
-
18
et al., 1994). considerado no-seletivo e de amplo espectro, o
que significa que ele mata uma
ampla gama de gramneas anuais e ervas daninhas de folhas largas.
importante ressaltar que o
Paraquat, pertencente famlia dos herbicidas Bipyridylium, age
muito rapidamente, atingindo
diretamente o sistema fotossinttico da planta (EKMEKCI;
TERZIOGLU, 2005)
O Paraquat considerado o herbicida mais txico sade humana nos
ltimos 60 anos, e,
paradoxalmente, o terceiro mais usado no mundo usado
rotineiramente em mais de 50 culturas
em 120 pases (CHEE et al.,1993).Tal fato pode ser atribudo ao
seu custo menor quando
comparado com formulaes mais modernas e mais seletivas de outros
herbicidas. Por razes de
envenenamento, o uso deste herbicida foi proibido em 13 pases, e
o ltimo pas no mais us-lo
foi a Malsia em 2002.
No Brasil, dentre os compostos atualmente mais usados para o
controle de ervas daninhas
na cultura da cana-de-acar esto os comerciais Velpar-K, Ametryn
e Paraquat ou
Gramoxone (SMITH, 1997; SINDAG, 2001), sendo este ltimo bastante
difundido, tambm,
como um agente dessecante, promovendo ressecamento e absciso de
folhas, facilitando a colheita
(AGOSTINETTO et al., 2001; MAGALHES et al., 2002).
O mecanismo de ao deste herbicida d-se por meio do bloqueio do
fluxo de eltrons na
cadeia transortadora da fotossntese, impedindo a reduo do NADP+
NADPH2, no fotossistema
I (Figura 1). Dessa forma, ocorre um acmulo de eltrons e de
radicais txicos no cloroplasto,
causando srios danos no metabolismo celular. Esse radicais so
instveis e rapidamente sofrem
auto-oxidao, onde so produzidos radicais superxidos, hidroxila,
perxido e oxignio singleto,
os quais constituem as espcies reativas de oxignio, que, quando
em excesso, so prejudiciais ao
metabolismo celular como um todo.
-
19
t
Figura 1- Esquema ilustrativo da cadeia de eltrons entre os
Fotossistemao do herbicida Paraquat (www. molecadv.com)
2.3 A fluorescncia da clorofila a
Como j sabido, a captura e armazenamento de energia lum
superiores mediada por uma intricada associao entre
complexos
e um transporte seqencial de eltrons do fotossistema II
(PSII)
(Figura 1). A eficincia da utilizao da luz por cada fotossistema
re
CO2 e gerao de ATP pelas reaes luminosas.
A energia luminosa absorvida no PSII excita as molculas d
passam para um estado instvel e rapidamente liberam parte de
sua
sem a emisso de fton. Entretanto, a clorofila excitada pode
fluorescncia, reemitindo ftons e, assim, retornando ao estado
basa
ser utilizada pelas reaes fotoqumicas ou ainda ser
transferida
contato entre molculas de clorofilas (TAIZ; ZEIGER, 2004).
A emisso de fluorescncia fornece informaes sobre os pro
Sob condio de baixa luz, ao redor de 95% dos ftons absorvido
4,5% so transformados em calor e 0,5% so re-emitidos como l
centros de reao do PSII estiverem fechados por um bloqueio da
fo
pode ser dissipada como calor e 2,5-5,0% via fluorescncia (B
OQUIST, 1993). Paraqua as II e I, no cloroplasto e o local
de
inosa pelas folhas de plantas
de pigmentos captores de luz
para o fotossistema I (PSI)
gula as reaes de fixao de
e clorofilas ali presentes, que
energia ao meio como calor,
tambm perder energia por
l. Outra parte da energia pode
fracamente para o PSI, pelo
cessos fotoqumicos do PSII.
s so usados na fotoqumica,
uz fluorescente. Se todos os
tossntese, 95-97% da energia
OLHR-NORDENKAMPF;
-
20
A relao inversa entre fluorescncia e atividade fotossinttica foi
primeiramente
observada e descrita por Kautsky e pode ser usada para estudar a
atividade fotossinttica potencial
das folhas e para detectar os efeitos de estresses em plantas.
Um sinal tpico de induo da
fluorescncia em luz contnua conhecido como "Efeito Kautsky",
onde aps um pico ou um
mximo de fluorescncia, acontece uma atenuao (o denominado
"quenching"). Normalmente a
extenso do "quenching" expressa por coeficientes que variam de 0
a 1, indicando a proporo
atenuada da fluorescncia mxima (KRAUSE ; WEIS, 1991). A
fluorescncia basal ou mnima
(Fo) a fluorescncia medida quando todos os centros de reao esto
abertos. A fluorescncia
mxima (Fm) a fluorescncia quando todos os centros de reao esto
fechados. A fluorescncia
varivel (Fv) determinada pelo estado do centro de reao (aberto
ou fechado), e definida
como a diferena entre Fm e Fo, ou seja, Fv =Fm-Fo. O estado dos
centros de reao
influenciado por fatores ambientais de origem bitica e
abitica.
A medida da fluorescncia das clorofilas do PSII, entretanto,
muito varivel pois
extremamente influenciada pelo estado fisiolgico do vegetal,
podendo, assim, ser utilizada como
tcnica para monitoramento de coberturas vegetais ou para
predizer a fixao fotossinttica de
CO2 (RODRIGUES, 1998). A capacidade fotossinttica, entretanto,
diminui em proporo ao
tamanho e severidade do dano sofrido pela planta. Dependendo do
tipo de dano, pode haver
recuperao da capacidade fotossinttica em poucas horas ou dias ou
mesmo a morte do tecido.
Em plantas sob condies de estresse, a menor eficincia
fotossinttica pode ser causada
pela: 1) menor dissipao de energia atravs do transporte de
eltrons, ocasionando um declnio
na eficincia quntica potencial do PSII, indicada pelo menor
Fv/Fm, e taxa de transporte de
eltrons (ETR), sendo usualmente associados ao aumento na extino
no-fotoqumica da
fluorescncia (qN) e no "pool" de zeaxantina (HAVAUX; NIYOGI,
1999); 2) incio dos
processos de fotoinibio quando a capacidade de fotoproteo
excedida, sendo indicado pelo
declnio na relao Fv/Fm, acompanhado pelo aumento de Fo, devido
reduo excessiva da
cadeia de transporte de eltrons (OSMOND, 1994).
Em situaes como descrito acima, a taxa de gerao de oxignio txico
excedem a
capacidade dos mecanismos de desintoxicao do PSI (ASADA, 1994).
Parte dos eltrons
envolvidos nos processos fotoqumicos so utilizados em outros
processos que no a fixao de
carbono. Em condies onde a fixao de carbono limitada (ex.: baixa
temperatura e fechamento
estomtico), drenos alternativos de eltrons, como a
fotorrespirao, excetuando-se plantas com
-
21
metabolismo C4, e a reduo de oxignio molecular (durante a reao
de Mehler) podem
aumentar suas atividades (FRACHEBOUD, 2001).
Segundo Krause e Weis (1991), a presena de condies ambientais
estressantes levam ao
decrscimo caracterstico na eficincia quntica potencial do PSII,
podendo ser detectada pela
queda na relao Fv/Fm, conforme j mencionado. Paralela queda da
fotossntese devido
menor eficincia fotoqumica, pode ocorrer reduo na atividade de
algumas enzimas do ciclo de
Calvin e mudanas nas rotas bioqumicas, como acmulo de aminocidos
e cidos orgnicos
(WRIGHT et al., 1995).
Contudo, as plantas possuem um sistema de defesa antioxidativo
composto de vrias
enzimas e biomolculas (ex: cido ascrbico, - tocoferol e
carotenides) responsvel pela
remoo de radicais txicos acumulados devido alteraes metablicas,
inclusive danos no
aparato fotossinttico (FOYER et al., 1994).
2.4 O estresse oxidativo em plantas
As plantas, dada sua caracterstica de seres ssseis, esto
expostas a uma grande variedade
de estresses ambientais que alteram seu metabolismo e
desenvolvimento, exibindo uma grande
variedade de respostas nos nveis molecular e celular (FLOWERS et
al., 2000; ZHU, 2002).
Algumas dessas respostas so desencadeadas por sinais de estresse
ambiental primrio, enquanto
que outras podem resultar de estresses secundrios ou de sinais
secundrios. Entre os fatores de
estresse abiticos mais estudados esto: seca, alta salinidade,
temperaturas extremas (tanto altas
como baixas), metais pesados, radiao ultra-violeta, deprivao de
nutrientes, alta luminosidade,
defensivos qumicos e hipxia.
Ainda que algumas mudanas sejam claramente adaptativas, outras
so simplesmente
conseqncias da injria causada pelo estresse (XIONG et al., 2002;
ZHU, 2002). As respostas ao
estresse podem ser consideradas como desvios da norma metablica,
onde a norma um estado
metablico expresso sob a condio no estressante. Nem todas as
alteraes metablicas so
prejudiciais, e um grande desafio para o bioqumico distinguir
entre as repostas que representam
sintomas acidentais ou injuriosos da condio estressante, e as
respostas que so verdadeiramente
adaptativas, que favorecem o crescimento contnuo durante o
estresse ou na recuperao.
Uma alterao metablica importante para as plantas quando em
condies de estresse, o
aumento da produo de espcies reativas de oxignio (EROs) (APEL ;
HIRT, 2004; FOYER ;
-
22
NOCTOR, 2005). A gerao de espcies reativas de oxignio constitui
uma resposta primria da
planta ao estresse de natureza bitica e abitica, caracterizando
um dano oxidativo (CHANDRU
et al., 2003; ASADA, 2006). Entretanto, algumas das reaes de
produo de EROs esto
envolvidas no metabolismo normal do vegetal, como fotossntese e
respirao (NOCTOR ;
FOYER, 1998; MITTLER, 2002; VRANOV et al., 2002).
Contudo, enquanto que em condies normais de crescimento, essas
espcies qumicas
mantm-se em pequeno nvel, em condies estressantes h um
rompimento da homeostase
celular, provocando o aumento na produo de EROs. Embora esse
aumento seja uma ameaa
clula, essas espcies podem tambm agir como sinalizadores para a
ativao da resposta ao
estresse e vias de defesa do vegetal (MITTLER, 2002; NEILL et
al., 2002). Portanto, as EROs
podem ser vistas como indicadores celulares de estresse e como
mensageiros secundrios
envolvidos na via de transduo de sinais na resposta ao estresse
(MITTLER, 2002).
Dentre alguns dos fatores ambientais que podem gerar a produo de
EROs e,
consequentemente, um estresse oxidativo nas plantas esto: as
radiaes ultra-violetas, seca,
encharcamento, salinidade, temperaturas extremas, alta
luminosidade, metais pesados e
defensivos agrcolas, como herbicidas (BOWLER et al., 1994;
AZEVEDO et al., 1998). Alm
disso, dano fsico e mecnico, bem como o estresse bitico por
ataque de patgenos podem ser
fatores geradores de EROs (LAMB ; DIXON, 1997).
As principais formas de EROs so: radical superxido (O2-),
perxido de hidrognio
(H2O2), radical hidroxila (OH) e oxignio singlet (1O2). Os
radicais superxido e perxido, em
geral, no so txicos, porm, quando em excesso e na presena de
metais de transio, so
convertido em redicais hidroxilas altamente danosos via Reao de
Fenton (CHANDRU et al.,
2003), conforme ser descrito posteriormente.
O oxignio molecular (O2) pouco reativo, mas tem capacidade de
originar estados
intermedirios excitados e altamente reativos durante sua reduo
at H2O (SCANDALIOS,
1993). Estas espcies reativas, quando incompletamente reduzidas
podem causar danos a
organelas celulares, provocar a oxidao de molculas biolgicas
como cidos nuclicos,
protenas e lipdeos, acarretando reduo no crescimento, colapso no
metabolismo celular e
desencadear o processo de morte celular programada (CAVALCANTI,
2002; MITTLER, 2002;
NEILL et al., 2002). Alm de ocasionar mutaes no DNA celular
(EPE, 1991)
-
23
As etapas subseqentes de reduo de um eltron no so dependentes de
energia e podem
ocorrer espontaneamente ou necessitam de doadores apropriados de
e-/H+ (eltrons/ prtons). Na
clula, ons metlicos de transio (Fe2+, Cu+) e semiquinonas podem
agir como doadores de e-
(BLOKHINA et al., 2003). A aceitao do excesso de energia pela
molcula de O2 pode levar
adicionalmente a formao do oxignio singlet (1O2), uma molcula
altamente reativa se
comparado ao O2 (VRANOV et al., 2002; OP DEN CAMP et al., 2003).
O 1O2 pode durar at
aproximadamente 4-6 s na gua e 100 s em ambientes no-polares. O
oxignio singlet pode
ento transferir sua energia de excitao para outras molculas
biolgicas ou reagir com elas,
formando ento endoperxidos ou hidroperxidos.
O radical superxido (O2-) um radical livre moderadamente
reativo, com uma meia-vida
de aproximadamente 2-4 s. No entanto, o superxido no pode
atravessar as membranas
biolgicas e prontamente dismutado a H2O2. Caso essa tal reao no
acontea, o radical
superxido pode reduzir quinonas e complexos metlicos de transio
de Fe3+ e Cu2+, afetando,
portanto a atividade de metalo enzimas. Os radicais
hidroperoxilas (HO2-) que so formados a
partir do O2- por protonoo em solues aquosas pode atravessar as
membranas biolgicas e
subtrair tomos de hidrognio de cidos graxos polinsaturados e
hidroperxidos de lipdeos,
comeando ento, a auto-oxidao de lipdeos (NEILL et al.,
2002).
O perxido de hidrognio (H2O2) moderadamente reativo, possui uma
relativa longa vida
celular e pode atravessar distncias considerveis de seu local de
produo (VRANOV et al.,
2002). O H2O2 tem capacidade de difundir-se livremente atravs
das aquaporinas (HENZLER ;
STEUDLE, 2000). Dessa forma, as EROs produzidas nos cloroplastos
e nas mitocndrias, por
exemplo, podem afetar outros compartimentos celulares. Tais
caractersticas fazem deste radical
tambm um importante sinalizador intracelular, tendo um papel
central em vrias vias de
sinalizao (como por exemplo, a da Resposta Hipersensitiva), que
levam, principalmente, a
tolerncia cruzada (FOYER ; NOCTOR, 2003). Entre os processos
induzidos pelo perxido de
hidrognio esto: formao de ligaes transversas na parede celular,
fechamento estomtico,
expresso de genes relacionados a uma grande variedade de
respostas ambientais, biognese de
peroxissomos, etc. Alm disso, o H2O2 pode tambm inativar
enzimas, como as superxidos
dismutases (Cu/Zn e Fe SODs) e diversas enzimas do ciclo de
Calvin (BOWLER et al., 1994),
induzir enzimas como as catalases e peroxidases, provocar danos
aos cidos nuclicos e protenas
e realizar a peroxidao de lipdeos (NEILL et al., 2002).
-
24
A mais reativa das EROs o radical hidroxila que formado a partir
do H2O2 pelas
chamadas reaes de Haber-Weiss ou de Fenton, pela utilizao de
catalisadores metlicos como
o Fe2+ (HALLIWELL ; GUTTERRIDGE, 1989; CHANDRU et al.,2003). O
radical OH pode
reagir potencialmente com todas as molculas biolgicas. Como as
clulas no possuem
mecanismos enzimticos para eliminar essa espcie altamente
reativa, a sua produo em excesso
leva, por fim, a morte da clula (VAN BRESEUGEN et al., 2001;
VRANOV et al., 2002).
Apesar da possibilidade de utilizao pelas plantas do nvel de
EROs para a monitorao
de seu estado intracelular de estresse, este nvel deve ser
mantido sob um fino controle por causa
dos efeitos devastadores de um acmulo dessas espcies (ASADA,
1999; DAT et al., 2000;
MOLLER, 2001; MITTLER, 2002). Para que isto seja evitado as
plantas possuem sistemas de
defesa antioxidantes enzimticos e no-enzimticos muito
eficientes, que permitem a eliminao
dessas espcies ativas e a proteo contra os danos oxidativos. A
partio entre estes dois sistemas
sob condies de estresse pode ser regulada pela concentrao de O2
no sistema (BLOKHINA et
al., 2003).
A distinta localizao subcelular e propriedades bioqumicas das
enzimas antioxidantes,
seus diferentes padres de induo no nvel de enzima e expresso
gnica, e a grande quantidade
de eliminadores no-enzimticos tornam o sistema antioxidante uma
unidade muito flexvel e
verstil que pode controlar o acmulo e a detoxificao temporal e
espacial das EROs
(VRANOV et al., 2002; DEL RIO et al., 2002). Segundo Henriques
et al. (2001), a clula
apresenta algumas maneiras de proteo contra os efeitos deletrios
das EROs: a preveno,
evitando a formao de radicais livres; a interceptao, por meio da
ao neutralizadora de
enzimas antioxidantes, ou por molculas de baixa massa molecular,
como vitaminas C e E,
carotenides, etc; e reparo, que minimizam os efeitos.
Antioxidantes como o cido ascrbico
(AsA, vitamina C), glutationa (GSH), - tocoferol e carotenides
ocorrem em altas concentraes
nas plantas (INZ ; MONTAGU, 1995; SLESAK et al., 2002).
2.5 Algumas enzimas antioxidantes
O sistema de defesa antioxidativo enzimtico das plantas inclui
diversas enzimas
antioxidantes nos diferentes compartimentos celulares. Dentre as
principais enzimas podemos
citar as dismutases de superxido (SOD; EC 1.15.1.1), as
peroxidases de ascorbato (APX; EC
1.11.1.1) e as catalases (CAT; 1.11.1.6) que juntamente com
outras enzimas do ciclo ascorbato-
-
25
glutationa promovem a eliminao das EROs (HERNNDEZ et al., 2001;
CAVALCANTI et al.,
2004). O grau do estresse oxidativo em uma clula determinado
pela quantidade de superxido,
H2O2 e radicais hidroxilas. Portanto, o balano das atividades da
SOD, APX e CAT crucial na
supresso dos nveis txicos de EROs na clula (APEL ; HIRT, 2004).
Nos ltimos anos, um
grande nmero de estudos tem focalizado no balano dessas
atividades, nas diferentes organelas
celulares
2.5.1 Superxido Dismutase
Segundo Alscher e colaboradores. (2002), dentro da clula, as
SODs constituem a primeira
linha de defesa contra EROs. Estas protenas pertencem ao grupo
de metalo-enzimas que
protegem as clulas dos radicais superxidos, catalisando a
dismutao do O2 - em O2 e H2O2
(WU et al., 1999; VAN BREUSEGEM et al., 2001). O radical O2 -
produzido em qualquer
localizao intracelular onde exista um transporte de eltrons, e,
portanto, a ativao do O2 pode
ocorrer em diferentes compartimentos celulares (ELSTNER, 1991),
incluindo mitocndria,
cloroplastos, microssomos, glioxissomos, peroxissomos, apoplasto
e no citosol. Portanto, no
surpresa o fato das SODs estarem presentes em praticamente todas
as regies da clula. Alm
disso, foi provado que as membranas biolgicas so impermeveis a
molculas de O2 -
carregadas, da a importncia da presena destas dismutases onde h
a sua presena. As SODs so
classificadas, de acordo com o seu metal cofator, em trs grupos:
FeSOD, presente nos
cloroplastos; MnSOD, presentes nas mitocndrias e peroxissomas; e
as Cu/Zn-SODs, presentes
nos cloroplastos, peroxissomos, no citosol e possivelmente no
espao extracelular (ALSCHER et
al., 2002; CAVALCANTI, 2002). Recentemente foi publicado a
presena da isoforma FeSOD em
cloroplastos de milho (IANELLI et al., 1999). O nmero e o tipo
de isoformas de SOD varivel
entre as espcies vegetais, bem como a abundncia relativa de cada
isoforma. (ASADA, 1999)
2.5.2 Ascorbato Peroxidase
As APXs so consideradas as enzimas mais importantes na eliminao
de H2O2 no citosol
e nos cloroplastos (INZ ; MONTAGU, 1995). Esta enzima utiliza o
ascorbato como seu doador
de eltrons especficos para reduzir H2O2 a gua, constituindo
parte do ciclo conhecido como
ciclo da ascorbato-glutationa ou ciclo Halliwell-Asada (INZ ;
MONTAGU, 1995; SHIGEOKA
et al., 2002). De acordo com del Rio et al., (1998) e Polle
(2001), este ciclo uma via eficiente de
-
26
clulas de planta que dispem de H2O2 em determinados
compartimentos onde este metablito
produzido e no existe catalase presente, como por exemplo, no
cloroplasto (MITTLER, 2002).
Este ciclo faz uso dos antioxidantes no enzimticos como o
ascorbato e a glutationa em uma
srie de reaes catalisadas por quatro enzimas antioxidativas, e
est bem demonstrado em
cloroplastos, citosol e mitocndrias de ndulos radiculares
(FOYER; MULLINEAUX, 1994;
POLLE, 2001), e em peroxissomos e mitocndrias purificadas de
folhas de ervilha (JIMNEZ et
al., 1997). As isoenzimas de APX so distribudas em pelo menos
quatro compartimentos
celulares distintos: no estroma e ligadas membrana dos tilacides
dos cloroplastos; ligada
membrana (mAPX) nos microcorpos, incluindo glioxissomos e
peroxissomos; e no citosol
(cAPX) (SHIGEOKA et al., 2002). H ainda uma isoforma de APX
ligada a membrana
mitocondrial (mitAPX) (LEONARDIS et al., 2000). Todas estas
isoenzimas tm uma alta
especificidade pelo ascorbato como doador de eltrons.
2.6 Protenas induzidas sob condies de estresse
Conforme j mencionado anteriormente, uma alterao metablica
importante em plantas
sob estresses a produo de espcies ativas de oxignio, que podem
atuar como sinalizadores e
interagir com outras molculas desencadeando uma resposta contra
o agente estressor. A ativao
de cascatas de expresso gnica, bem como a sntese de novas
protenas, efetoras dessa resposta,
constituem importantes alteraes bioqumicas provocadas por um
estresse
Um grande interesse vem sendo gerado na resposta das plantas ao
estresse abitico,
principalmente devido s possveis aplicaes em programas de
melhoramento gentico de
espcies cultivadas. Plantas transgnicas tolerantes aos mais
variados estresses abiticos vm
sendo produzidas ultimamente (WANG et al., 2003). Esse sucesso
vem sendo obtido pelo
aumento nos nveis celulares de protenas que controlam as
quantidades de osmlitos, com
funes de transporte (H+ATPases e H+/ PPi ases) ou ativao de
genes (fatores de transcrio ou
componentes de sinalizao) (ZHU, 2001).
O corrente entendimento das respostas das plantas ao estresse
parece ser ainda incompleto
dado o grande nmero de genes/protenas envolvidas na percepo do
estresse, transduo do
sinal e sntese de molculas efetoras que catalisam reaes para
adaptao a regimes de estresse
tanto em termos de preveno ou reparo de danos. Isso extremamente
importante, portanto, para
-
27
a obteno de informaes futuras a respeito da mudana na expresso
gnica responsvel a
estresses.
A sntese de diversas protenas localizadas tanto em diferentes
rgos da planta como em
diferentes locais na clula (ex: citosol, fraes de membrana,
cloroplastos ou espaos
intercelulares) pode ser induzida ou reprimida por estresse
ambiental, seja de natureza bitica ou
abitica. Na maioria dos casos, a funo desses polipeptdios ainda
desconhecida. (YEN et al.,
1994; CHEN ; PLANT, 1999; PRZYMUSINKI et al., 2004).
Anlises genmicas em plantas tolerantes revelaram a existncia de
possveis efetores que
diretamente modulam a percepo e resposta do estresse ou atenuam
os seus efeitos, ou a
molculas que esto envolvidas na percepo do estresse, transduo de
sinal ou modulao da
funo do efetor (ZHU, 2001; CHINNUSAMY et al., 2004). Como
exemplos desses efetores da
tolerncia ao estresse esto enzimas-chave relacionadas com
homeostase osmtica e remoo de
espcies ativas de oxignio (MAESTRI et al., 2002).
Apesar da lacuna existente a respeito da falta de informao no
funcionamento da maioria
dos genes/proteinas de estresse, pesquisas empregando protenas
de funo conhecida (choline
oxidase, P5CS - 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, BADH -
betaine-aldehyde dehydrogenase,
etc) bem como aquelas com funo pouco conhecidas (LEA - late
embriogenesis abundant, HSPs-
heat shock proteins, osmotin-like etc) tm fornecido uma
contribuio importante no
planejamento de estratgias para melhorar a tolerncia ao estresse
por meio da tecnologia dos
transgnicos. (GROVER et al., 1999). Este fato justifica a
necessidade constante de identificao,
isolamento e caracterizao de um nmero crescente de protenas
induzidas por estresse
ambiental.
Os trabalhos recentes sobre a importncia desses genes/protenas
na concesso da
tolerncia ao estresse esto embasados em dois princpios: (a)
Protenas de estresse so
sintetizadas no momento em que ocorre uma represso geral da
maquinaria protica biossinttica
constitutiva e (b) Existe um nvel marcante de conservao na
estrutura e outros aspectos de
genes/protenas de estresse. Conforme j discutido acima, o papel
destes na tolerncia ao estresse
vem sendo experimentalmente verificado em instncias seletivas
nos ltimos anos.
Visando a obteno de informaes esclarecedoras sobre os mecanismos
de defesa
antioxidantes em plantas, a busca por protenas envolvidas nesse
processo, bem como sua
-
28
identificao e funo desempenhada, ser de grande importncia,
juntamente com o estudo da
expresso de genes candidatos, para a elucidao desses
mecanismos.
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Estratgia experimental e delineamento estatstico
O propsito deste trabalho foi observar alteraes fisiolgicas e no
padro das atividades
de enzimas antioxidantes, bem como na expresso de protenas, em
folhas de plntulas de cana-
de-acar, submetidas diferentes concentraes de Praquat, cujo
princpio atibo o Metil
Violgeno, e coletadas em tempos distintos. Para tanto, o
delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em fatorial 5 x 3 (5 tratamentos x 3
repeties), sendo cada repetio,
composta, em mdia, de 4 plntulas (4 vasos contendo 1 kg
substrato cada). Os dados foram
submetidos anlise de varincia (ANOVA) e as mdias comparadas
atravs do teste de Tukey
com p 0,05.
3.2 Material Vegetal
Mudas de cana-de-acar (Saccharum officinarum L.), variedade SP
80-3280,
provenientes de toletes com gemas meristemticas, foram crescidas
em substrato completo
Plantamax, da Eucatex, sob condies de casa-de-vegetao. Os
toletes foram gentilmente
cedidos pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), localizado
em Piracicaba-SP.
3.3 Conduo do experimento
Os toletes, recm-coletados, foram colocados para germinar
individualmente, em vasos de
15 cm de dimetro, durante 30 dias ou at a completa expanso do
segundo par de fololos.
Durante esse perodo foi feito um monitorameno dirio de
temperatura e umidade do ar, as quais
apresentaram valores mdios de 29,1 C 2,8 e 81,1 % 6,0
respectivamente. No referido
estgio de desenvolvimento (Figura 2) foi aplicado o herbicida
Paraquat, via pulverizao foliar.
A aplicao foi feita com um pulverizador costal, pressurizado a
CO2, com presso de 30 lb/pol2,
com consumo de 200 L/ha de calda. Foram aplicadas diferentes
concentraes (0, 2, 4, 6 e 8 mM)
de Metil Violgeno.
-
29
Aps perodos de 24 e 48 horas de contato, as folhas foram,
respectivamente, coletadas,
pesadas, congeladas em N2 lquido j na forma de p, e armazenadas
em freezer -80C para
posteriores anlises.
Figura 2- Vista parcial do stand experimental, montado em
casa-de-vegetao, com as mudas de cana-de-
acar aos 30 dias aps plantio
3.4 Anlise da fluorescncia da clorofila a
As avaliaes da fluorescncia da clorofila a das plantas de
cana-de-acar aps 18 horas
de tratamento com Paraquat foram realizadas em fluormetro
Portable Chlorophyll Fluorometer
(PAM 2000, Hinz Walz, Alemanha) equipado com uma unidade de
controle de disparo de pulsos
saturantes. As anlises foram feitas seguindo a metodologia
descrita por Schreiber et al. (1986) e
Genty et al. (1989), avaliando a emisso da fluorescncia da
clorofila a pela superfcie superior
das folhas. Os parmetros foram obtidos em duas intensidades de
PAR, mdia e alta, com
intensidades mdias de 100 e 325 mol.m-2.s-1 ftons,
respectivamente. Os dados de todas as
medidas e o monitoramento contnuo durante as anlises foram
analisados em planilhas e graficos
por meio do programa Excel 2003, considerando-se os resultados
da mdia de trs leituras para
cada parmetro mensurado.
-
30
Antes do incio das anlises, as plantas foram mantidas no escuro
por um perodo de 30
minutos para completa oxidao dos componentes do sistema de
transporte de eltrons; a seguir,
os seguintes parmetros foram determinados: Fo, Fm, qN, PSII,
Fv/Fm, EXC e ETR.
Os parmetros foram obtidos da leitura direta e calculados de
acordo com as seguintes
frmulas (BILGER et al., 1995; WALZ, 1993) :
Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm
PSII = qP x Fv/Fm = qP x (Fm-Fo)/Fm
qP: Fm-Fs/Fm-Fo
qN: (Fm-Fm)/Fm
ETR= PSII *0,5*0,84 *PAR
EXC= (Fv/Fm - F/ Fm)/ Fv/Fm
em que :
Fo: fluorescncia mnima obtida com todos os centros de reao do
PSII abertos enquanto a
membrana do tilacide est no estado no energizado, isto ,
adaptado ao escuro (qP=1 e qN=0);
Fm: fluorescncia mxima obtida quando todos os centros de reao do
PSII esto fechados
(oxidados), isto , no estado adaptado ao escuro (qP=0 e
qN=0);
Fv = (Fm-Fo): fluorescncia varivel mxima obtida em folhas
adaptadas ao escuro;
Fs: fluorescncia no steady-state (equilbrio) (qP >0);
Fo: fluorescncia mnima obtida em folhas aps a iluminao
actnica;
Fm: fluorescncia mxima obtida em folhas adaptadas luz;
Fv: fluorescncia varivel mxima obtida em folhas adaptadas
luz.
qP: "quenching" fotoqumico ou atenuao fotoqumica da
fotossntese;
qN: "quenching" no fotoqumico ou atenuao no-fotoqumica da
fotossntese;
PSII : eficincia quntica efetiva do transporte de eltrons pelo
PSII;
EXC : excesso relativo de eltrons na parte fotoqumica
3.5 Concentrao de espcies reativas ao cido tiobarbitrico
(TBARS)
A peroxidao de lipdios foi mensurada a partir da quantidade de
malonaldedo (MDA)
do extrato de folhas, atravs de reao especfica deste, com o cido
tiobarbitrico (TBA), onde,
-
31
na reao, foi gerado um cromforo de cor avermelhada. O mtodo
utilizado foi descrito
inicialmente por Heath e Packer (1968) e adaptado por Peixoto
(1998). Para a determinao, foi
reservado 1 g de tecido fresco, macerados em almofariz de
porcelana, na presena de nitrognio
lquido, adicionados 2 mL da soluo de TCA a 1 % (p/v) e, em
seguida, a mistura foi macerada
continuamente por mais 2 minutos. A mistura foi, ento,
acondicionada em tubos tipo eppendorf
de 2 mL e centrifugada a 10.000 x g por 15 minutos. O
sobrenadante foi coletado e o precipitado
descartado.
Para o ensaio, os extratos foram diludos, quando necessrio,
sendo alquota de 500 L
transferidas para tubos de ensaio, aos quais foram adicionados 2
mL de reagente contendo TBA
0,5 % (p/v) dissolvido em TCA 20 % (p/v). Os tubos foram
hermeticamente fechados e a mistura
de reao incubada em banho-maria a 95 C, por 1 hora, sendo
resfriada, em seguida, em banho de
gelo. Quando necessrio, as amostras foram centrifugadas a
temperatura ambiente (25 C) por 10
minutos a 9.000 x g, em centrfuga de bancada. As leituras foram
realizadas a 25 C nas
absorbncias de 532 e 660 nm, respectivamente (esta, relativo
reao no especfica). A segunda
leitura foi subtrada da primeira para obteno da leitura
especfica e a quantidade do complexo
MDA-TBA formado foi calculado atravs do coeficiente de extino
molar de 155 mM-1 cm-1
(HEATH; PACKER, 1968). Os resultados foram expressos em nmol g-1
MF.
3.6 Contedo de Clorofilas
A extrao do pigmento foi feita com Acetona 80%, considerando-se
a seguinte
proporo: 500 mg de tecido fresco para 5 mL de soluo de Acetona
80%. Aps centrifugao
5000 x g, por 10 min, o sobrenadante foi coletado e lido em
espectrofotometro a 663 e 645nm,
correspondente aos picos de absoro das clorifilas a e b,
respectivamente. Para quantificar as
clorofilas a, b e total, segundo Arnon (1949), foram feitos os
seguintes clculos: Clorofila a =
(12,7 x A663 - 2,69 x A645) x V/1000W; Clorofila b = (22,9 x
A645 - 4,68 x A663) x V/1000W;
Clorofila total = (20,2 x A645 + 8,02 x A663) x V/1000W. Sendo,
A= absorbncia dos extratos no
comprimento de onda determinado; V= volume final do extrato
clorofila-acetona e W= matria
fresca em gramas do material vegetal utilizado.
3.7 Extrao e determinao das concentraes de protenas solveis e
protenas
insolveis totais
-
32
As folhas foram maceradas em almofariz de porcelana, na presena
de nitrognio lquido. Em
seguida, a uma quantidade de 1g de folhas, foi adicionado 2 mL
de Acetona 80% e macerado por
mais 5 minutos. Aps centrifugao a 6000 g por 10 minutos, o
sobrenadante foi descartado. Ao
precipitado, adicionou-se 2,0 mL de tampo Tris 40 mM pH 7,8
contendo Manitol 350 mM,
EDTA 2 mM e PVPP3 % (p/v), macerando por mais 5 minutos. O
macerado foi transferido para
Eppendorfs de 2mL e centrifugados a 10.000 g, por 20 minutos,
temperatura de 4 C. O
sobrenadante, considerado a frao de protenas solveis totais, foi
coletado e armazenado
temperatura de 20 C, para determinaes posteriores.
Para extrao da frao de protenas insolveis totais, o precipitado
retornou para o
almofariz e foi novamente macerado com 2,0 mL de soluo de Lise
contendo Uria 8M, Tiouria
1M, CHAPS 2%, DTT 50mM, por um perodo de 5 minutos. O macerado
retornou, ento, para os
tubos tipo eppendorfs de 2 mL que foram centrifugados a 10000 g
por 20 minutos, a 4 C. O
sobrenadante, considerado a frao de protenas insolveis totais,
foi coletado e armazenado
temperatura de 20 C, para determinaes posteriores
A determinao do contedo de protenas solveis totais, na primeira
frao protica, foi
realizada pelo mtodo descrito por Bradford (1976). O mtodo
baseado na mudana da
colorao do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250 quando ligado
a protenas. Os extratos
congelados foram lentamente descongelados em banho de gelo (4
C). As amostras foram
diludas no prprio tampo de extrao, na proporo de 1:10 (v/v).
Alquotas de 100 L do
extrato diludo foram transferidas para tubos de ensaio e 2 mL do
reagente de Bradford (105,26
mg de Coomassie brilliant blue G-250 + 50 mL de etanol 95 % +
100 mL c. fosfrico orto-
xaroposo 85 % + q.s.p. H2O p/ 1000 mL) foram adicionados ao meio
de reao.
Aps leve agitao, os tubos foram incubados a 25 C por 15 minutos
e ento realizada
leitura da reao a 595 nm em espectrofotmetro. A concentrao de
protenas totais foi obtida
pela comparao das leituras, com as obtidas em curva padro onde a
protena utilizada foi a
Albumina Srica Bovina. A concentrao de protenas solveis foi
expressa em mg de protena g-1
MF.
3.8 Eletroforese desnaturante de protenas em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese das amostras foi realizada segundo metodologia
desenvolvida por Laemmli
(1970), com modificaes. O mtodo se sustenta na idia de que as
protenas podem ser separadas
-
33
pela massa molecular, atravs da induo do deslocamento pela
aplicao de um campo eltrico
(LEHNINGER et al., 1995). A preparao do gel e a corrida
eletrofortica foram conduzidas no
sistema MiniVE (Amersham Biosciences), com placas de 8 cm x 9 cm
e espaadores com 1,0 mm
de espessura. O gel de aplicao foi preparado com 5,0 % de
acrilamida (p/v) em tampo tris-HCl
0,5 M, pH 6,8, contendo SDS 0,1 % (p/v) e polimerizado com 0,15
% de persulfato de amnio
(p/v) e TEMED 0,1 % (v/v). O gel de separao foi preparado com
12,5 % de acrilamida (p/v) em
tampo tris-HCl 3,0 M, pH 8,8, contendo SDS 0,1 % (p/v), sendo
polimerizado com persulfato de
amnio 0,15 % (p/v) e TEMED 0,05 % (v/v).
A concentrao de protenas totais nos extratos foi determinada
segundo o mtodo de
Bradford (1976), obedecendo aos mesmos procedimentos descritos
no
item de determinao da concentrao de protenas solveis totais
(item 3.7). O extrato total das
amostras foi diludo no tampo de lise de modo que, ao final da
diluio, todos os extratos
tivessem a mesma razo mg de protena mL-1. As amostras foram
preparadas para corrida
adicionando azul de bromofenol a 0,4 % (p/v) em alquota retirada
da diluio do extrato bruto. A
corrida foi realizada com amperagem constante de 20 mA para cada
gel, e transcorreu por um
perodo de aproximadamente1 hora.
3.8.1 Revelao do gel com Nitrato de Prata e Comassie blue
As bandas proticas foram visualizadas pela revelao do gel com
nitrato de prata,
segundo metodologia descrita por Blum et al. (1987). O mtodo tem
por objetivo impregnar as
protenas localizadas na superfcie do gel, com ons prata
fornecidos pelo nitrato de prata. Depois
da corrida, o gel foi retirado cuidadosamente da placa de vidro
e mergulhado em soluo de etanol
40 % (v/v) e cido actico 10 % (v/v) para fixao da posio das
protenas no gel. Em seguida,
foi lavado em soluo de etanol a 30 % (v/v), por 2 ciclos de 20
minutos, e tratado com tiossulfato
de sdio 0,02 % (p/v), por 1 minuto. O gel foi ento enxaguado em
H2O deionizada, por 3 ciclos
de 20 segundos, e impregnado com soluo de nitrato de prata 0,2 %
(p/v) e formaldedo 0,02 %
(v/v), por 20 minutos. Aps visualizao das bandas, o gel foi
lavado com H2O deionizada, por 20
segundos, e a reao interrompida pelo tratamento do gel com soluo
de glicina a 0,5 % (p/v),
durante 5 minutos, e mais 3 ciclos de 20 minutos de lavagem em
H2O deionizada.
A revelao dos gis tambm foi feita por meio de uma soluo corante
(Coomassie Brilliant
Blue R-250 0,025%, contendo Metanol 40% e cido Actico 7%). Aps
corrida eletrofortica, os
-
34
gis foram imersos na soluo de corante por, no mnimo, 2 horas. Em
seguida, foram tranferidos
para uma soluo descorante (Metanol 50% e cido Actico 25% em
gua). Aps um perodo de
20 minutos sob agitao branda, a soluo descorante foi trocada e
assim sucessivamente at a
descolorao completa do gel e visualizao ntida das bandas.
3.9 Atividade de superxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1)
3.9.1 Atividade de SOD por espectrofotometria
Esta atividade enzimtica foi determinada segundo metodologia
adaptada de Peixoto
(1999) a partir de Del Longo et al. (1993) e Gianopolitis e Ries
(1977). Por esse mtodo,
determinada a inibio da reduo do NBT (p-nitro blue tetrazolium)
pelo extrato enzimtico,
evitando assim a formao do cromforo. Neste ensaio, uma unidade
de atividade enzimtica
(UA) de SOD, considerada como a quantidade de enzima necessria
para obter 50 % de inibio
da reduo do NBT pela SOD contida no extrato enzimtico.
As amostras utilizadas foram as mesmas para determinao do teor
de protenas solveis
totais (item 3.7). Para tanto, os extratos foram lentamente
descongelados em banho de gelo (4
C) e aps liquefao, diludos (conforme necessidade) no prprio
tampo de extrao. Alquotas
de 100 L foram transferidas para tubos de ensaios protegidos da
luz, contendo tampo fosfato de
potssio 50 mM, pH 7,8, EDTA 0,1 Mm, L-metionina 13 mM e NBT 75
M.
A reao foi iniciada pela adio de Riboflavina 2 M e a
concomitante transferncia dos
tubos para uma cmara iluminada, por uma lmpada fluorescente
circular de 30 Watts, por
perodo de 15 minutos. Em seguida, leituras de absorbncia a 560
nm foram tomadas em
espectrofotmetro (Spectronic 20 Genesys). Para efeito de correo
nos clculos, o branco da
reao foi considerado como sendo os tubos que no continham
extrato, expostos e no expostos
luz. A atividade foi determinada pelo clculo da quantidade de
extrato que inibiu 50 % da reduo
de NBT (BEAUCHAMP ; FRIDOVICH, 1971) e expressa em UA g-1 MF
min-1.
3.9.2 Atividade de SOD em gel
A atividade das diferentes isoformas de SOD em gel foi realizada
por meio de uma corrida
eletrofortica de protenas em gel nativo e, em seguida, os gis
foram revelados com inibidores
especficos de cada isoforma da enzima. Aps a corrida, os gis
foram lavados em gua
-
35
deionizada e incubados numa soluo de Fosfato de Potssio 50mM, pH
7,8 + EDTA 1mM +
Riboflavina 0,05 mM + NBT 0,1mM, por 30 minutos em temperatura
ambiente. Em seguida, aps
lavagem com gua, um deles foi incubado por 20 minutos com uma
soluo-tampo de Fosfato de
Potssio 100mM, pH 7,8 + KCN 2mM. O segundo gel foi incubado com
a mesma soluo-tampo
contendo H2O2 5mM. O terceiro gel, que serviu de controle para a
comparao, permaneceu em
gua deionizada. Os gis foram ento iluminados por 5 minutos ou at
o aparecimento das bandas.
A FeSOD de cloroplastos inativada por H2O2 e resistente a
Cianeto de potssio. A MnSOD,
presente em mitocndrias e peroxissomos, no inativada por H2O2
nem inibida por cianeto de
potssio. As Cu-ZnSODs so inativadas por cianeto e perxido de
hidrognio e esto presentes
nos cloroplastos e no citosol (ALSCHER et al., 2002).
3.10 Atividade de peroxidases de ascorbato (APX) (EC
1.11.1.11)
A atividade de APX foi determinada de acordo com o mtodo de
Nakano e Asada (1981),
modificado por Koshiba (1993), onde a presena de APX no extrato
bruto diminui a concentrao
de perxido de hidrognio do meio, pela reduo do cido ascrbico
fornecido. Para tanto, o
primeiro extrato obtido no item 3.7 foi utilizado. Diluies das
amostras foram feitas quando
necessrio e alquotas de 100 L dos extratos diludos, transferidas
para tubos de ensaio. Ao meio
de reao, 2,7 mL de tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 6,0,
contendo cido L-ascrbico 0,8
mM. foram adicionados.
O experimento foi iniciado pela adio de H2O2 ao meio de reao,
observando o
decrscimo da leitura no intervalo de 60 segundos, absorbncia de
290 nm em
espectrofotmetro modelo Pharmacia LKB Ultrospec III.
Adicionalmente, leituras de tubos
controles, com e sem a amostra, na ausncia de perxido de
hidrognio, foram realizadas. Para
efeito de clculo, foi considerado que o decrscimo de 1 unidade
de absorbncia seria equivalente
a 1 unidade de atividade (UA). As atividades do extrato total
foram determinadas pelo clculo da
quantidade de extrato que reduziu a leitura de absorbncia em 1
UA e expressos em UA g-1 MF
min-1.
3.11 Extrao de protenas totais para eletroforese bidimensional
(2-D)
O extrato de protenas totais, para corrida eletrofortica, foi
obtido seguindo metodologia
adaptada de Rabilloud (1996) e Molloy (1998). Da matria fresca
de folhas congeladas, 500 mg
-
36
de uma amostragem composta de cada tratamento, foram macerados
em almofariz de porcelana,
na presena de nitrognio lquido, por 5 minutos. Em seguida, 5 mL
de uma soluo contendo
TCA 10 % (p/v), DTT 0,07 %(p/v) em acetona P.A. foram
adicionados. As amostras foram
deixadas em repouso para precipitao natural, a 20 C, por 2
horas, e, em seguida, centrifugadas
a 30.000 x g a 4 C, por 40 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado lavado duas
vezes com uma soluo contendo DTT 0,07 % (p/v) dissolvido em
acetona P.A., por 30 minutos,
a 20 C. A mistura foi novamente centrifugada a 30.000 x g, por
10 minutos e o sobrenadante
descartado. Aps essa etapa, o precipitado foi ressuspendido em 3
mL de tampo de lise contendo
uria 7 M, tiouria 2 M, tris 40 mM, DTT 24 mM e CHAPS 0,1 %(p/v)
e, novamente, as amostras
foram centrifugadas a 15.000 x g, a 4C, por 15 minutos. Desta
vez, o sobrenadante foi coletado
(frao protica) e o precipitado, descartado (Figura 3).
-
37
MF folhas
TCA 10 % (p/v), DTT 0,07 %(p/v) em Acetona.
Precipitao natural por 2h, -20 C
Centrifugao a 30.000 x g, 40, 4C
Sobrenadante Descartado
Precipitado Sobrenadante Descartado
Lavagem (2x) com soluo 0,07%
DTT em Acetona, a -20C
Centrifugao a 30.000 x g, 10
minutos, 4C
Precipitado Descartado
Sobrenadante
SDS-PAGE e 2D
Ressuspenso em soluo 7 M uria/ 2 M
tiouria/ 40 mM tris/ 24 mM DTT /0,1 %
CHAPS (p/v)
Centrifugaos a 15.000 x g, 4C, 15 minutos
Precipitado
Figura 3- Esquema da sequncia de extrao de protenas totais de
folhas de plntulas de cana-de-acar para
corrida eletrofortica uni e bidimensional sob condies
desnaturantes
-
38
3.12 Focalizao isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE As amostras de
protenas extradas conforme a descrio anterior (~ 400 g) foram
homogeneizadas com 450 l de tampo de re-hidratao de gel (8M
Ureia/ 1M Tioureia/ 10%
Glicerol/ 2% CHAPS/ 1% IPG Buffer pH 3-10/ 25mM DTT/ 0,001% Azul
de bromofenol). As
amostras foram transferidas para Strip Holders e as tiras de
focalizao (Imobiline dry strips
18cm, pH 3-10 NL) colocadas sobre os mesmos. Logo em seguida leo
de silicone (IPG cover
fluid) foi despejado sobre ambos. A hidratao das tiras ocorreu
durante 12-15h em sistema Ettan
IPGphor II (Amersham Biosciences), seguindo com a focalizao
isoeltrica, a 20 C, em corrente
mxima de 50 A/gel, voltagem mxima de 8000 V e potncia
mxima de 0,2 W/gel. De acordo com Gorg et al (1988), os
parmetros para IEF usando tiras de
18cm e pH 3-10 foram 500Vh; 1000Vh; 2000Vh; 3000Vh; 3500V (5h) ~
24kVh.
Em seguida, as tiras de gis contendo as protenas focalizadas
foram incubadas em soluo
de equilbrio (50 mM Tris, pH 8,8, 6M Ureia, 30% v/v Glicerol, 2%
SDS e traos de Azul de
bromofenol) contendo 10 mg/mL de DTT, por 15 min, a 20C, e
depois em soluo de equilbrio
contendo 25 mg/mL de iodoacetamida, por 15 min a 20C. Uma vez
processada a segunda
incubao, as tiras foram posicionadas no topo de gis SDS-PAGE
12,5% para realizao da
segunda dimenso. A corrida foi realizada em sistema vertical
(BioRad) seguido os seguintes
parmetros de corrida: 25mA/gel; Emax 250 V e Pmax 25 W. A durao
da corrida foi de
aproximadamente 5 horas. Em seguida os gis foram revelados em
soluo de Coomassie Blue,
conforme descrito no item 3.8.1.
-
39
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Efeitos do tratamento sobre a fluorescncia da clorofila
a
As medidas de fluorescncia da clorofila so rpidamente obtidas e
processadas, alm de
serem bastante precisas e no-destrutivas. Atualmente a principal
ferramenta para anlise da
performance fotossinttica da planta e seu estado fisiolgico
geral (SCHREIBER et al., 1998).
Fo X Fm A
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0 2 4 6 8Metil Violgeno (mM)
Fo
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Fm
Fo
Fm
Fv / Fm B
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 2 4 6 8Metil Violgeno (mM)
Fv/F
m
Figura 4- A-Medidas da fluorescncia basal (Fo) e mxima (Fm) da
clorofila e B- eficincia quntica
potencial do PSII em plantas de cana-de-acar expostas a
diferentes concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de
aplicao
Os resultados expostos na Figura 4A indicam um discreto aumento
na fluorescncia basal
(Fo) seguido de uma queda na fluorescncia mxima, em especial na
dose de 4mM Metil
Violgeno. O mesmo ocorreu com a eficincia quntica mxima do
fotossistema II (Fv/Fm), ou
seja, uma drstica queda a partir da dose de 4mM Metil Violgeno
(Figura 4B). Decrscimos de
Fv/Fm e da fluorescncia mxima (Fm) indicam dano no aparato
fotossinttico (FRACHEBOUD,
2001; KRAUSE ; WEIS, 1991; LAISK et al., 1998).
O parmetro Fo reflete o estado da clorofila nos centros antena e
pode ser considerado
uma medida da distribuio de energia inicial para o PSII, bem
como a eficcia de captura da
mesma (SEPPANEN et al., 1998). A relao Fv/Fm reflete a mxima
eficincia com que a luz,
absorvida pelo complexo antena do fotossistema II, convertida em
energia qumica. Guidi et al.,
-
40
(2000) observaram que o declnio de Fv/Fm em folhas de Phaseolus
vulgaris tratadas com PQ foi
acompanhado por um aumento fluorescncia mnima (Fo). Estes
autores infeiram que o PQ foi
capaz de induzir danos ao PSII, excedendo a capacidade
fotoprotetora da planta.
Em geral, a ocorrncia de estresses ambientais que afetam a
eficincia do PSII levam ao
decrscimo de Fv/Fm (KRAUSE ; WEIS, 1991). No caso do presente
estudo, as plantas foram
tratadas com um herbicida atuante no PSI, inibindo o fluxo
normal de eltrons, ocasionando danos
no PSII tambm. Isto porque os principais transportadores
existentes entre os dois fotossistemas
(Pheo, Qa, Qb, PQ, Cyt bf, PC) perdem sua capacidade funcional,
gerando um acmulo
prejudicial de eltrons e o desbalano do gradiente de prtons
entre estroma e lmen do
cloroplasto. Alm disso, radicais reativos de oxignio (EROs),
especialmente o superxido (1O2),
foram detectadas no PSII. Estas espcies foram produzidas pela
re-oxidao do PQ reduzido e
propagaram para os centros de reao do PSII, ocasionando uma
perda da eficincia fotossinttica
(Fv/Fm) (IANNELLI et al., 1999) e, tambm, efeitos sobre as
membranas celulares (SLOOTEN
et al., 1995).
O parmetro Fv/Fm uma estimativa da capacidade fotoqumica total e
da eficincia do
PSII, ou seja, o nmero de complexos do PSII ativos. Valores
tpicos desse parmetro em folhas
saudveis e iluminadas variam em torno de 0.8 ou um pouco abaixo
desse valor (CRITCHLEY,
1998). Logo, o resultado da figura 4B evidencia que as plantas
no-tratadas (0mM Metil
Violgeno) estavam em perfeitas condies fotossintticas. Uma
dimunuio significativa deste
parmetro, tal como ocorreu na dose 4, sugere uma diminuio na
eficincia quntica da evoluo
do O2 ou da fixao do CO2, alm de ser tambm um indicativo de
fotoinibio (HIDEG et al.,
2000; KATO et al., 2003)
No presente estudo, a reduo do valor de Fv/Fm, em especial na
dose 4, pode ser
atribudo ao aumento de Fo observado na mesma dose (Figura 4).
Entretanto, mesmo com nveis
baixos, como na dose 4, a atividade funcional do PSII foi
mantida, pois, conforme j
mencionando, uma reduo de Fv/Fm indica uma perda na eficincia
fotoqumica primria de
folhas fotoinibidas. Essa diminuio atribuda ao PQ, que induz uma
reduo na fluorescncia
varivel da clorofila, resultando numa reduo de Fm. Os valores de
Fm, em todas as doses de
PQ, reduziram significativamente devido a uma menor taxa de
transporte de eltrons, conforme o
grfico a seguir.
-
41
ETR
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 2 4 6 8
Metil Violageno (mM)
ETR
baixa
mdia
Figura 5- Taxa aparente de transporte de eltrons em plantas de
cana-de-acar expostas a diferentes
concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de aplicao
A taxa aparente de transporte de eltrons (ETR) foi afetada pelo
tratamento com Metil
Violgeno, notadamente na dose intermediria de 4mM, em que os
valores em mol eltrons.m-
2.s-1 alcanaram valores prximo de zero. importante ressaltar que
as medidas de fluorescncia
da clorofila no claro, foram realizadas em duas intensidades
distindas, conforme j mencionado na
metodologia. Os resultados das medidas de claro, obtidos em
intensidades de PAR baixa e mdia,
asseguram que no h quaisquer interferncias desses valores de PAR
na resposta fisiolgica das
plantas, ou seja, no existe possibilidade de haver uma induo de
estresse por excesso de luz.
Portanto, as medidas obtidas representam o real estado
fotossinttico das plantas em estudo. Este
parmetro est relacionado diretamente com a resposta do PSII a
determinada intensidade de
PAR.
Ao penetrar nas folhas da plantas, a molcula de PQ tranforma-se
num radical, na presena
de luz, e este ir reagir com o oxignio molecular formando
espcies reativas de oxignio (EROs)
(ASADA; TAKAHASHI, 1987). Isso ir afetar a ETR nos tilacides dos
cloroplastos, provocando
uma diminuio, como observado em feijoeiro por Schmitz-Eiberger ;
Noga (2001). De maneira
similar, na figura 5, com exceo da dose inicial (2mM), o PQ
ocasionou uma reduo na ETR.
Essa inibio do transporte fotossinttico de eltrons em folhas da
cana-de acar deve,
tambm, ser associada aos danos gerados no PSI pelo tratamento
com Paraquat. Em estudo com
batateiras submetidas alta temperatura, Havaux (1993) observou
que os seguintes aspectos esto
-
42
interligados com a queda da ETR: a inibio da fotlise da gua (em
temperaturas superiores a
32C), a reduo da eficincia de captao de energia pelos centros de
reao do PSII, alteraes
no fluxo de eltrons aps QA (Tf > 42C) e danos no PSI (Tf >
45C).
A manuteno do fluxo de eltrons atravs do aparato fotossinttico,
mesmo na ausncia
de quantidades suficientes de NADP+, aceptor de eltrons,
essencial para a proteo do
cloroplasto do estresse oxidativo, que neste estudo foi induzido
pelo tratamento com PQ. Existem
pelo menos duas diferentes vias que participam desse processo:
fluxo cclico de eltrons e o ciclo
gua-gua. Este ciclo consite no seguinte: parte dos eltrons
resultantes da fotlise da gua, no
PSII, so usados na gerao de redutores para o perxido de
hidrognio (H2O2); a outra parte
segue para que haja a reduo univalente do O2 no PSI (ASADA,
2006). Os eltrons fluem da
gua, consumida no PSII, para a gua produzida na reduo do H2O2,
no PSI.
De forma sucinta, no PSI, duas molculas de O2 so reduzidas, por
dois eltrons do PSII, a
radicais superxidos (1O2). Estes radicais ento so convertidos em
H2O2 e O2 em reao
catalisada pela Superxido Dismutase e o H2O2 reduzido, pela
Ascorbato Peroxidase, gerando
gua. Ento, os eltrons oriundos da molcula de gua no PSII so
doados para a reduo do O2. O
ciclo gua-gua tem funo fisiolgica de proteo de molculas alvo
contra a ao de EROs,
ajustamento da fotoproduo da razo ATP/NADPH e dissipao do
excesso de ftons (ASADA,
1999).
O fluxo de eltrons atravs do ciclo gua-gua foi estimado a partir
da assimilao de CO2
e parmetros de fluorescncia da clorofila de folhas adaptadas em
escuro (MAKINO et al., 2002).
Estes autores observaram que o fluxo de eltrons pelo ciclo
gua-gua antes da fotoativao do
Ciclo de Calvin similar ao fluxo para assimilao de CO2, em
steady state,, aps a fotoativao.
Tais observaes indicam que o ciclo gua-gua importante o
suficiente para permitir o fluxo de
eltrons em steady state, tornando-se a principal via de eltrons
antes da fotoativao. Dessa
forma, esta via parece ser indispensvel ao incio da fotossntese
em folhas adaptadas ao escuro
sem haver danos fotooxidativos.
Um aumento no fluxo de eltrons atravs do ciclo gua-gua foi
observado em plantas sob
condies de estresse por baixa disponibilidade de CO2 (MIYAKE;
YOKOTA, 2000), baixas
temperaturas (HIROTSU et al., 2004; LI et al., 2005) e estresse
salino (CHEN et al., 2004). Em
plantas C4, uma reduo de ETR e fixao de CO2 pode representar um
aumento de eltrons para
o ciclo gua-gua devido a baixa atividade fotorrespiratria (FRYER
et al.,, 1998).
-
43
PSII
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 2 4 6 8
Metil Violageno (mM)
PS
IIbaixa
mdia
Figura 6- Eficincia quntica efetiva do FSII em plantas de
cana-de-acar expostas a diferentes
concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de
aplicao
Da mesma maneira que a eficincia quntica potencial (Fv/Fm) e a
taxa de transporte de
eltrons (ETR), os resultados da eficincia quntica efetiva (PSII)
evidenciam um decrscimo na
dose de 4mM Metil Violgeno para valores prximos de zero (Figura
6). Entretanto, diferente dos
resultados de ETR, os valores de PSII foram maiores em baixa
intensidade de PAR (100
mol.m-2.s-1 ftons).
Este parmetr
