RFLPRestrictiefragment-lengte polymorfisme

J. Smeets - A. Leen

CGGAGGTGCGCATACTGACCGCGGTATACTAGGCCTCCACGCGTATGACTGGCGCCATATGATCDNA

Restrictie-enzym zal DNA verknippen

Principe

CGTATACTGCATATGA

CGACCGCGGTATACTAGTCCTGCTGGCGCCATATGATCAGGA

CGGAGGCCTC

Een enzym zal bijvoorbeeld het DNA verknippen in het midden van de sequentie

CT CGGA GC

In dit geval ontstaan er 3 DNA-fragmenten met verschillende lengte, dus met een verschillend

aantal basenparen. In de praktijk kan het aantal basenparen in 1 fragment zeer hoog zijn,

bijvoorbeeld 15 630 basenparen (bp).

8 basenparen 21 basenparen 5 basenparen

Elektroforese

Referentiestaal met gekende DNA-fragmenten van bijvoorbeeld 10, 20 en 30 basenparen.

Ons DNA-staal Negatief geladen Kleurstof

putje

putje

+ + + + + pool + + + + +

Elektroforese

Ons DNA-staal+ kleurstof

- - - - - pool - - - - -

Referentiestaal + kleurstof

Kleurstof is negatief geladen en zal naar de positieve pool migreren. Alzo kan men op zicht het proces volgen.

De DNA-fragmenten (die ook negatief geladen zijn) zullen ook migreren, maar deze fragmenten kunnen we niet zien!

Alzo kan men a.h.v. het referentiestaal het aantal basenparen van onze DNA-fragmenten schatten.

DNA zichtbaar maken

Ons DNA-staal Referentiestaal

30 basenparen

20 basenparen

10 basenparen

? basenparen

? basenparen? basenparen

21

8

5

RESULTAAT

DNA wordt zichtbaar onder UV-

licht

Alzo kan men patronen vergelijken en conclusies trekken. Voorzichtigheid is geboden!

Toepassing 1: CRIMINOLOGIE

Verdachte A B C

DNA(vb. in bloed) aangetroffen

op slachtoffer

Alzo kan men patronen vergelijken en hiermee bijvoorbeeld stofwisselingsziekten opsporen.

Toepassing 2: ERFELIJKE ZIEKTEN OPSPOREN

Gezond persoon Persoon met ziekte

Men vergelijkt soorten op erfelijke basis. Doel: mutaties zoeken en evolutielijnen opstellen.

Toepassing 3: dier- of plantensoorten vergelijken

Soort A Soort B Soort C

600 bp

300 bp

240 bp

10 bp

600 bp

280 bp240 bp

10 bp

400 bp

300 bp240 bp200 bp

10 bp

basensubstitutieDeletie

Aansluitend practicum.

Vliebergh Sencie 1999

Mutaties zoekenWerken met papieren DNA-modellen.

Een schaar gebruiken als restrictie-enzyme.

Mogelijke verklaringen geven voor deze mutaties: deletie, insertie, substitutie (inversie).

DNA-monsters worden behandeld met een bepaald enzym: restrictie-endonuclease.

Hiervan zijn er nu al meer dan honderd verschillende bekend. Elk enzym herkent een

welbepaalde opeenvolging van 4 tot 5 basen in het DNA en zal het DNA telkens ter hoogte van een dergelijke sequentie “doorknippen”. Daarom worden ze ook wel knipenzymen genoemd.

Zo ontstaat voor elk behandeld DNA-monster een verzameling van fragmenten met verschillende

lengte. Via elektroforese kan men dan deze fragmenten van elkaar scheiden.

Als er wijzigingen optreden (mutaties) in het DNA, zal de basenvolgorde anders zijn en kunnen er, na gebruik van restrictie-enzymen, fragmenten ontstaan die een andere lengte hebben. Alzo zullen de elektroforesebeelden er anders uitzien; er ontstaat een zogenoemd polymorfisme (veelvormigheid). Vandaar de naam van de methode: RESTRICTIEFRAGMENT-LENGTE POLYMORFISME.

Gedurende de evolutie van een soort ontstaan er in het DNA mutaties, waardoor individuen ontstaan die genetisch verschillend zijn. Voorbeelden van mutaties zijn o.a. de omzetting van een base in een andere (basensubstitutie) of het bijkomen (insertie) of verdwijnen (deletie) van één of meerdere basen in het DNA.

Benodigdheden

• lange papieren strook waarop in grote letters de basenpaaropeenvolging van een kort dubbelstrengig DNA-molecule staat afgebeeld.

• scharen (= ‘knipenzymen’).

• blad papier.

Werkwijze

• leerlingen moeten zich als knipenzymen gedragen. Hiervoor overlopen zij de DNA-streng van links naar rechts en knippen het dubbelstrengig DNA-molecuul in het midden van een bepaalde herkenningssequentie door. Sommige leerlingen kunnen als knipenzym A functioneren, anderen als enzym B. Beiden hebben een andere herkenningssequentie. Alle DNA-moleculen worden met beide enzymen bewerkt.

• op een blad papier kan men een XY-assenkruis tekenen. Op de Y-as kunnen dan nummers (aantal basenparen) aangebracht worden, overeenkomend met de lengte van de fragmenten. Op de X-as kunnen bijvoorbeeld vier condities aangebracht worden (bv DNA I verknipt met enzym A, DNA II verknipt men enzym A, DNA I verknipt met enzym B, DNA II verknipt met enzym B)

• zoek mogelijke verklaringen voor de resultaten

• controleer je hypothesen (bv leg de fragmenten met 10 bp en 7 bp op de juiste manier achter elkaar en vergelijk met fragment met 17 bp)

Aantal bp

DNA I knipenzym A

30

20

10

0DNA II

knipenzym ADNA II

knipenzym BDNA I

knipenzym B

26

2321

10

75

26

2321

17

4

22

18

13

1012

8810

13

18

20

23

+ 8

Vergelijking DNA I en DNA II

Conclusie

• via vergelijking van de lengte van bepaalde fragmenten kan men bepaalde soorten mutaties als mogelijke oorzaken aangeven

• niet alle fragmenten met dezelfde lengte hebben noodzakelijk dezelfde basenvolgorde

• fragmenten met dezelfde lengte bevinden zich op eenzelfde plaats op het elektroforesebeeld