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RMN no Desenvolvimento
de fármacos
José Daniel Figueroa-Villar
Grupo de Química Medicinal
Departamento de Química
Instituto Militar de Engenharia
Rio de Janeiro, Brasil
Definição da Doença Definição de alvos
Estrutura e função do alvo
Mecanismo de ação Planejamento de Inibidores (in cerebro)
Modelos virtuais Bibliotecas
QSAR
“Screening” in silico
Projeto de novo
Potenciais antagonistas Testes de ligação
Síntese
Aplicações Comuns da RMN
em Química Medicinal
• Determinação da estrutura e dinâmica do receptor
(proteínas, DNA)
• Determinação da estrutura, dinâmica e
conformação dos ligantes (agonistas e
antagonistas)
• Estudos da interação ligante-receptor e ligante-
ligante
• Avaliação e seleção de ligantes de media e baixa
afinidade
Vantagens da RMN em Química
Medicinal
•É uma técnica universal para a detecção de
interações inter-moleculares. •Grande sensibilidade para interações fracas (afinidade da ordem
milimolar) que é importante para o seleção de fragmentos
moleculares para o planejamento de fármacos.
•Não é necessário o conhecimento da estrutura
ou função do alvo biomolecular. •Fornece informação estrutural detalhada sobre a forma de
interação dos ligantes.
•Pode ser feita a observação do alvo (biomolécula) ou do ligante
(fármaco).
•Os métodos por RMN testam diretamente a interação entre o
alvo e o ligante, minimizando a possibilidade de falsos positivos.
Métodos por observação dos ligantes
• Apropriados para seleção primária:
– Eficiência da seleção normalmente alto.
– Uso de espectros 1D de rápida aquisição.
– Pode ser usado para a seleção de ligantes em misturas sem a
necessidade de deconvolução.
– Já que o alvo molecular (enzima ou DNA) não é detectado:
• O alvo não precisa ser enriquecido isotopicamente.
• Podem ser usadas baixas concentrações do alvo.
• Não há problemas com o tamanho (massa) do alvo molecular.
– Existem limitações com relação ao nível de afinidade.
– A interação não específica do ligante com o alvo pode levar a
falsos positivos.
• É necessário realizar metodologias competitivas com ligantes que
interagem com o sítio ativo.
• Características do ligante para métodos com
detecção do ligante usando sondas convencionais:
– Necessário obter soluções com pelo menos concentração de
100 M em água (tampão).
– Para seleção através de detecção do ligante a concentração de
proteína deve ser entre 1 e 50 M.
– Para seleção através de detecção do alvo a concentração de
proteína marcada deve ser entre 100 e 300 M.
– Para proteínas até de 50 kDa simples marcação com 15N é
normalmente suficiente.
– Para proteínas com massa acima de 50 kDa marcação com 15N
e per-deuteração é necessário (TROSY), o que permite o uso de
proteínas com massa maior que 70 kDa.
– Uso de grupos metila marcados com 13C também permite o uso
de proteínas acima de 70 kDa.
– Marcação específica do sítio de interação.
• Métodos necessários para obter informação detalhada
sobre o sítio de ligação da macromolécula:
– Ampla faixa de afinidade sem limite superior.
– Utiliza espectros multidimensionais que precisam de muito tempo
para sua obtenção (baixa velocidade de avaliação).
– Necessário usar deconvolução para avaliação de misturas de
ligantes.
– Distinção direta entre ligação específica e não específica.
– Informação direta sobre o modo de ligação.
– Detecção direta do efeito do pH.
– Já que o alvo (enzima ou DNA) é detectado:
• O alvo precisa estar enriquecido isotopicamente (15N e 13C).
• Concentrações bem altas do alvo devem ser usadas.
• Há problemas com o tamanho do alvo (<100 kDa).
– Crio-sondas e o baixo custo de marcação isotópica com 13C
permite avaliação prática de cerca de 100.000 compostos.
Propriedades dos métodos de RMN para screening
Murray Coles, Markus Heller and Horst Kessler, Drug Discovery Today, 8(17),803-810, 2003.
Estudos de Interação
Ligante-Receptor por RMN
• Métodos Diretos:
– Deslocamento Químico
– Acoplamento Spin-Spin
– Relaxação Nuclear
• Tempos de Relaxação
• Efeito Overhauser Nuclear (NOE)
– Difusão Molecular
• Métodos Indiretos:
– Método de Dalvit
L + P LP
Kd = klig/kdes
obs = ( livre x flivre) + ( complexo x fcomplexo)
SAR (Structure-activity
Relationships) by NMR
Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.
mM ou M
nM
Deslocamento Químico
15N-HSQC: FKBP e FKBP con ligante
" 2
" 9
" ambos
Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.
Molecular modeling:
• GH minimization using AM1
• B-DNA DD dodecamer minimized with CVFF:
d(CGCGAATTCGCG)
• Docking followed by minimization of the
assembly with CVFF (Insight Discover)
Santos-Filho et col. Bioorg. Med. Chem. Lett.,
1997, 7(13), 1797-1802.
O
ON
H
N
H
NH2
NH2+
Br H
N
-O2C
CH3
O
d(CGCGAATTCGCG)2
Drew-Dickerson Dodecamer (DDD)
X-Ray and NMR structure: R. E. Dickerson, H. R. Drew, J. Biol. Chem., 23, 1981, 761-786.
A. Y. Denisov, E. V. Zamaratski, T. V. Maltseva, A. Sandstrom, S. Bekiroglu, K. H. Altmann, M. Egli, J. Cattopadhayaya, J.
Biomol. Struct. Dyn., 16, 1998, 547.
GHBP
Messeder et col.Bioorg. Med. Chem Lett., 1995, 5(24), 3079-3084.
Borges et col. European Journal of Medicinal Chemistry, 2004
7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
H6 – T7
H1´-T7
H1´–T8
H6-T8
H6-C9
H2
H1´-T8
H2-A6
NOESY (50 ms mixing time)
Red: Pure DDD; Black: DDD + GHBP
NMR
(NOESY)
MM
1997
Tamanho molecular
T1 e T2 como função do tempo
de correlação c
Figueroa-Villar et col. Curr. Top. Med. Chem., 2009
Excitação Nuclear
Efeito do campo magnético B1 estático
Efeito do campo magnético B1 girando na
frequência Larmor
Origem de B1
z z
x
y
Mz
M-z
Mxy=0
M0
y
x
z
= =
Magnetização Líquida Mo
e
Magnetização Líquida
Representação clássica de um pulso de 90o
x
y
z
Mo Mo
z
y
x
90x0
z
y
x
z
y
x
Mxy=Mo
Mxy=0
t
t
DETECÇÃO E TRANSFORMADA DE FOURIER
FID
Tempo
Transformada
de Fourier
Frequência
Pulso de RF
• Relaxação Transversal: T2
– Relaxação Spin-Spin
– Troca de energia entre os núcleos
– Determina a largura (resolução) dos sinais de RMN
2
21Tπ
1SW /
SW1/2
h
h/2
Mxy = Mo
Mxy = -Mo
t
a
b
c
d
e.
..
x
y
z
-x
-y
-z
Det Det
-z
-y
-x
z
y
x
ab
x
z
-x
-y
-z
Det
-z
-y
-x
z
y
x
d e
..
.
t
Mxy = -Mo
Mxy = Mo
2T
t
oxy eMM
Equação para relaxação no plano xy
y'
x'
z
x'
z
y'
x'
z
y'
MB1
y'
z
x'
y'
z
x'
y'
z
x'
z
x'
y'
Pulso Defasamento ( Pulso ( Eco
Defasamento (3 Pulso ( Eco
B1
B1
180°90°x y
n
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
CPMG
N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
NO2
N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
O2N N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
O2N
10 mM
25 mM
50 mM
75 mM
BSA
Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286
PPM 7.92 7.84 7.76 7.68 7.60 7.52 7.44 7.36 7.28 7.20 7.12
PPM 8.70 8.60 8.50 8.40 8.30 8.20 8.10 8.00 7.90
N
CH3
NOH
S
N OH
2-PAM (35 mM)
2-PAM (27 mM) + AChE (0.9 u/650 L)
ThioOx (47 mM)
ThioOx (36 mM) + AChE (0.9 u/650 L)
Relaxação Longitudinal ou Spin-Rede
180x t
x
y
z z
y
x
x
y
z
z
y
x
t
z
y
x
t
z
y
x
t
Mz=-Mo
Mz=0Mz=Mo
Mz=Mo
Mo
-Mo
0Mxyt
to
1T
t
oz e21MM
2ln
tT o
1
180x
x
y
z z
y
x
z
y
x
z
y
x
z
y
x
Mz=-Mo
Mz=0
Mz=Mo
90x
90x
90x
90x
x
y
z
z
y
x
z
y
x
z
y
x
t
t
t
Inversão-Recuperação
D1-180x- -90x-Detecção
180 [NS]o
o
90 [NS]
d1
Espectros para medição de T1
Relaxação:
Variações de T1 com concentração
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
10 30 50 70 mM
T1 (
s)
H7 H3 H6 H5 H4GH2NB
NO2
H
NN NH2
NH2
H
3
6
5
4
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
10 30 50 70 mM
T1 (
s)
H2 H4 H7 H6 H5
GH3NB
7
6
5
4 2
+
HH
NN NH2
NH2
NO2
Cl-
Molecular modeling and docking
9.40 55.9 4NBGH
0.00 182.6 3NBGH
4.99 87.5 2NBGH
Erel (kcal/mol) ID50 ( M) Compound
NGHAs Rns
/Rs
purac pura R
ns/R
s
BSAc BSA c pura
/ c BSA
ID50
( m)
GH2NB 1,2 5,3x10-10
0,3 4,2x10-9
0,13 87,5
GH3NB 1,1 6,6x10-10
0,7 1,5x10-9
0,43 182,6
GH4NB 1,3 0,1x10-10
0,5 1,8x10-9
0,06 55,9
Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286
Determinação do
Tempo de Correlação
Molecular: c
Variação de T1 na interação
de guanil-hidrazonas com micelas
0
0.5
1
1.5
2
2.5
2 3 4
PURO
SDS
CTABT1 (s)
Posição
OCH3
+
H
NH2
NH2
H
NN
M. N. Borges et col. Biopolymers, 2001, 62(1), 9-14.
Messeder et col. 2009
NN
H
NH2
NH2
OCH3
H3CO
IC50 3.1 M (T. cruzi)
IC50 59.1 M (T. cruzi)
21
N
O
H3C
CH3
COONa
COOH
OH
3
CH3
COOH
H3C
CH3
G. Bai, Y. Cui, Y. Yang, C. Ye, M. Liu, A competitive low-affinity binding model for determining the mutual
and specific sites of two ligands on protein, The Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38,
588-593, 2005
Exemplo com anti-inflamatórios não esteroidais
(Ibuprofeno, Tolmetina e Ácido salicílico)
32
4 28
2
N
CH3
N
H
OH
H
H
H
H
2.2
1.4
2.9
1.3
1.7
1.6
T1
1.15
0.94
0.79
1.16
1.44
1.01
N
CH3
N
H
OH
H
H
H
H
BSA AChE
S
N OH
HH
H H
5.48
4.18
4.55
6.17S
N OH
HH
H H
2.23
2.11
3.05
1.97
Comparação da ancoragem de pirimetamina
Com a DHFR nativa e a mutante S108N
N
N NH2
NH2
C2H5
Cl
O N
N
NH2
NH2
R. T. Delfino et col. Biophys. Chem., 2002, 98(3), 287-300.
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8/12 1,8 2,1 0,3H9/11 1,3 1,7 0,4H13 0,5 0,4 -0,1H14 1,0 1,1 0,1
Pyrimethamine HCl
14
13
12
11
10
9
8
7
6
2
54
3
1
Cl-
+N
N
ClNH2
NH2
H
H3C
O N
N
NH2
NH2
H
12
3
45
7
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8 5,0 2,9 -2,1H6 4,4 3,7 -0,7H7 4,4 3,7 -0,7H9 4,5 3,6 -0,9
O N
N
NH2
NH2
H
O2N
12
3
45
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
7
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8 1,54 1,78 0,24H9 1,45 1,48 0,03
T1 na comparação da interação de inibidores
com a DHFR de Plasmodium falciparum
IC50 16.10 M
IC50 8.34 M
IC50 >2500 M
Interação da 2,4-diamino-benzopiranpirimidina
com DHFR-NADPH por T1 Seletivo
O N
N
NH2
NH2
1
3
2
4567
8
9
Hidrogênio T1 Livre (s) T1 DHFR (s) T1 (s)
H-9 6.52 1.72 -4.80
H-8 4.78 1.80 -2.98
H-6 4.95 3.26 -1.69
O N
N
NH2
NH
HH
H6
H9
H8
O O
Asp54
NCONH2NADPH
+
-
44
Pirimetamina (45)
Amostra Branco:
DMSO
LQB/2003
42
44
Pirimetamina (45)
Amostra Branco:
DMSO
LQB/2003LQB/2003
42
O N
N
NH2
NH2
H
O2N
12
3
45
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
7
O N
N
NH2
NH2
H
12
3
45
7
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
N
N
ClNH2
NH2
H
H3C
+Cl
-
1
34
5
2
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Pirimetamina HCl
N
N NH2
NH2
H2N
R
Inhibition of P. falciparum DHFR by Novel Flexible Ligands
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentration (ng/mL)
Su
rviv
al (%
)
PirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3B
MR1-X: IC50 80 nM
MR1-D: IC50 100 nM
MR3-F: IC50 150 nM
Inibidores da
Tirosinase como
potenciais agentes
para tratamento de
melanoma
CHO
R
O
O
OR
OOO+
EtOH
Reflux
R = NO2, H, OCH3
1 2
3
4
5
6
78
9
10
11 O O
OO H
HAr
H
H
NN
H
NH2
NH.HClOH
H
H-7
BA
H
NN
H
NH2
NH2.HClOCH3
H H
NN
H
NH2
NH2.HClOH
H
A B
DH-7-H6 (Å) com SDS 3.86 3.68
DH-7-H6 (Å) sem SDS 2.80 3.58
H6-H7 distância 2.80 Å
Ângulo diedro -3.81o
R1iNULL = j i ij + j i,k jk
R1iNS = j i ij + j i,k jk + ik
ik = R1iNS – R1i
NULL
c2c
2
c
6ij
2H
2
ij41
6
r10
1
O método NULL
d1
90 [NS]o
o
180 [NS]
180 [S]o
Gibbs et col. J. Magn. Reson. 1991, 93, 395-402.
Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.
• Distância entre os hidrogênios H-2 e H-1’(r21’ Ao) por RMN e Modelagem
molecular
Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.
Complexos Fenol-Piperazina como Anti-helminticos
N
N
H
O
H
H
O
H
R2
R1
R2
R1
H
H
1: R1 = H; R2 = CH32: R1 = R2 = CH3
11'
2'
5' 6'