RNAi 的发现1995 年， Guo S 等试图阻断秀丽新小杆线虫（ C. elegans ）中的 par-1 基因的表达。

设计： 反义 RNA 特异性地阻断 par-1 基因的表达； 正义 RNA 以期观察到基因表达的增强。

结果 : 二者都同样地切断了 par-1 基因的表达途径。这是与传统上对反义 RNA 技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。

RNAi 的提出直到 1998 年 2 月， Fire A 和 Mello C 才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链 RNA 纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链 RNA 却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实， Guo S 博士遇到的正义 RNA 抑制基因表达的现象，以及过去的反义 RNA 技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得 RNA 中污染了微量双链 RNA 而引起。该小组将这一现象称为 RNA 干扰（ RNA interference ， 简称 RNAi ）。

RNAi 广泛存在于自然界

随后， RNAi 现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了 RNAi 很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入， RNAi 的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具， RNAi 也越来越为人们所重视。

11 、、 RNAi RNAi 机机制制

体外实验结果的提示

体外实验表明： RNAi 反应中，加入的 dsRNA 被切割为 21-23 核苷酸长的 RNA 片段，后者会使目的 mRNA被切割为 21-23 核苷酸长的片段。从已经发生 RNAi 的果蝇 S2 细胞中， Hammond 等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起 RNAi 的 dsRNA 具有同源序列的 mRNA 。那么这种核酸酶是如何确定哪些 mRNA 该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出 21-23 核苷酸长的 dsRNA 片段，这暗示该核酸酶对 mRNA 的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种 RNAi 作用的简单模型。

RNAi 作用的简单模型当 dsRNA 导入细胞后，被一种 dsRNA 特异的核酸内切酶识别，切割成 21-23 核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结合，并且作为模板识别目的 mRNA 。识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替，从酶 -dsRNA 复合物中释放出来，而 mRNA 则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对 mRNA 进行切割，这样又产生了21-23 核苷酸长的 dsRNA 小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的 mRNA 进行切割，从而使目的基因沉默，产生 RNAi 现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到 RDE-2,RDE-3 和 Mut-7 等 RNAi 相关的基因。

RNAi 研究的一般技术路线

22 、、 siRNA siRNA 的设的设计计

何为 siRNAs

越来越多的研究人员开始采用小分子干扰 RNA（ small interfering RNAs ， siRNAs ）来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标并将其降解而介导 RNA 干扰途径的短片断双链 RNA 分子。如何设计有效的 siRNA 一直是当前 RNAi 研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。

一般设计原则（ 1 ）从 mRNA 的 AUG 起始密码开始，寻找“ AA” 二连

序列，并记下其 3' 端的 19个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC含量在 30%—50%左右的 siRNA要比那些 GC含量偏高的更为有效。

Tuschl 等建议不要针对 5'和 3' 端的非编码区（ untranslated regions ， UTRs ）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP核酸内切酶复合物结合 mRNA 从而影响 siRNA 的效果。

（ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列 /EST同源的序列。例如使用 BLAST

（ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA 序列。

负对照

一个完整的 siRNA 实验应该有负对照。作为负对照的 siRNA 应该和选中的 siRNA 序列有相同的组成，但是和 mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的 siRNA 序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

33 、制备、制备 siRNAssiRNAs 的方的方法法

（ 1 ）化学合成尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA 。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成 3—4 对 siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的 siRNA 的情况下，需要大量 siRNA 进行研究；不适用于：筛选 siRNA 等长时间的研究，主要原因是价格因素

（ 2 ）体外转录 相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选 siRNAs 的好方法。更重要的是能够更快的得到 siRNAs 。值得一提的是体外转录得到的 siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成 siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的 siRNAs ，但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于：筛选 siRNAs ，特别是需要制备多种 siRNAs ，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的 siRNA 。长期研究。

Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting ß-Actin to Induce Gene Silencing.

（ 3 ）用 RNase III 消化长片断双链RNA 制备 siRNA

其他制备 siRNA 的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA 序列以便找到一个有效的 siRNA 。这种方法——制备一份混合有各种 siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是 200—1000碱基的靶 mRNA 模版，用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA  ，然后用 RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众 siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的 dsRNA 后，这个 siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的 siRNA转染一样。由于 siRNA混合物中有许多不同的 siRNAs ，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

（ 3 ）用 RNase III 消化长片断双链RNA 制备 siRNA

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA 序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用 RNAse III比用 Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响 (1-4) 。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的 siRNA 进行研究，特别是基因治疗

Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.

（ 4） siRNA 表达载体 多数的 siRNA 表达载体依赖 3 种 RNA聚合酶 III 启动子 (pol II

I) 中的一种，操纵一段小的发夹 siRNA 在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的 U6启动子和人 H1启动子。

之所以采用 RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA ，而且它是通过添加一串（ 3 到 6个）U 来终止转录的。

使用这类载体，需要 2 段编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链，退火，克隆到相应载体的 pol III 启动子下游。

由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。

（ 4） siRNA 表达载体 毫无疑问， siRNA 表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于 siRNA 表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于：已知一个有效的 siRNA 序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达 siRNA 的细胞。长期研究。不适用于：筛选 siRNA 序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）

Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an "empty" siRNA expression vector.

HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert.

（ 5 ） siRNA 表达框架 siRNA 表达框架 (siRNA expression cassettes ， SECs) 是一种由 PCR得到的 siRNA 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由 Castanotto 采用，包括一个 RNA pol III启动子，一段发夹结构 siRNA ，一个 RNA pol III终止位点。和 siRNA 表达载体不同的是， SECs 不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由 PCR得到，不用一天的时间。因此， SECs 成为筛选 siRNA 的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和 siRNA 的最适搭配！

（ 5 ） siRNA 表达框架 如果在 PCR两端添加酶切位点，那么通过 SECs筛选出的最有效的 siRNA 后，可以直接克隆到载体中构建 siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达 siRNA 和长效抑制的研究。 这个方法的主要缺点是 PCR 产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高 SEC 的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的 PCR 片断并不适于大规模制备。最适用于：筛选 siRNA 序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 。

72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of reduction in g

ene expression was quantified and is provided in the bar graph.

Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), and human H1 (Hu-H1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells.

制备 siRNA5 种不同方法的比较

制备 siRNA5 种不同方法的比较（续）

4. 4. 转染细胞转染细胞siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。例如，一个 siRNA 对某个特定基因表达的抑制效率是 90% ，但是其转染效率只有 10% ，那么总的抑制率只有 9% 。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。但是有专门的 RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的 RNAi研究。

5. RNAi5. RNAi 的效果分析的效果分析可从 mRNA 和蛋白质两方面进行。

mRNA ： RT-PCR ；定量 PCR ； Northern 杂交等。

蛋白质： Western杂交； ELISA；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是 RNAi 效果最终和最大的体现。

66 、、 RNAiRNAi 技术的应用技术的应用

（ 1 ）在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。由于 RNAi 具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此 RNAi 可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的 RNA 可形成 dsRNA ，产生 RNA 干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为 RNAi技术。根据所选用序列的不同，可将其分为编码区 RNAi 和启动子区 RNAi技术。

编码区 RNAi技术自 1998 年在线虫中发现 RNAi 现象以来，以基因编码区为靶序列的编码区 RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这种早期的 RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成 dsRNA 的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。为弥补早期 RNAi技术的上述不足， Tavernarakis 等对 RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的 dsRNA ，从而产生 RNAi ，使目的基因沉默。

编码区 RNAi技术这种改进的 RNAi技术与传统的 RNAi技术相比，具有明显的优点：

首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析； 其次 dsRNA 可以被诱导产生， RNAi 能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能；

另外，当用细胞特异性启动子控制 dsRNA 的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。Kennerdell J. R. 和 CarthewR. W. 用 GAL4/UAS系统控制 dsRNA 在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控制 RNAi 的发生。

编码区 RNAi技术随着应用 RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展，研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。加州理工大学的 Chuang C. F. 和 Megerowitz E. M.使用此技术研究了拟南芥的 AG, CLV3, AP1, PAN四个开花相关基因。结果表明使用 RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变体，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。RNA 原位杂交表明， RNAi突变体的目的 mRNA显著降低。该结果说明 RNAi技术亦可以成为植物功能基因组研究中的有力工具。

启动子区 RNAi技术M. F. Mett 等证明含有启动子区的 dsRNA 在植物体内同样被切割成 21-23 核苷酸长的片段，这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。 由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区 RNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区 RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区 RNAi技术和启动子区 RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。RNAi 现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。

启动子区 RNAi技术与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比， RNAi技术具有明显的优点，它比反义 RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与 T-DNA技术造成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。作为一种新的、强有力的研究工具， RNAi 在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。相对于基因敲除技术 (knockout)， RNAi 具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制 (knockdown) 技术，是研究特定基因功能的有效方法。因此，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物细胞基因组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于 PCR技术。

（ 2 ）在基因治疗中的应用

治疗 HIV 感染由于 RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制， HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将 RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。针对 HIV病毒研究有 Jacque 等设计的抑制 HIV 1 长末端重复序列、附件基因 vif 和 nef 表达的 siRNA ， Lee 等针对 rev 转录子设计的 siRNA 及 Novina 等 ]针对 HIV 病毒 gag 基因设计的 siRNA ，其基本策略都是选择 HIV病毒或宿主细胞基因为靶点。

治疗 HIV 感染然而， RNAi治疗 HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决：

Ａ、作用靶点的选择， siRNA 对序列要求非常严格， 1个碱基的错配，将大大降低 siRNA 基因表达抑制作用。如果 HIV逆转录酶有较高的错配率 (1/1000 个核苷酸每个复制循环 )，就可能迅速导致所谓 siRNA逃逸突变的出现。感染个体中 HIV序列的多样性，为 siRNA 的设计和合成增加了难度。

Ｂ、如何有效导入 siRNA. DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。

Ｃ、增强 siRNA 在细胞中的稳定性 . 为了防止细胞内 RNA 酶对siRNA 的降解，可以用 DNA质粒和病毒载体将 siRNA 以发夹 (hairpins)的形式导入细胞内。

治疗肝炎病毒感染Jude Lieberman 等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（ FAs ）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了 FAs 基因所导致的。Jude Lieberman 等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默” FAs 基因的 siRNA ，发现有 90％的肝细胞接收到了这种 RNA 分子， FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受 RNAi治疗的实验鼠有 40％在３天内死亡。而 40只接受过治疗的实验鼠有 33只活了下来， 10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。

治疗肝炎病毒感染McCaffre A及其导师 Kay M 结果则证明 RNAi 可以直接治疗肝炎并病毒。他们首先将 HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，模拟 HBV感染，然后合成靶向 HBV基因组不同部分的 2 种 siRNA 并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒 RNA 的数量与对照组相比减少了 92%。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。但 Kay指出，这种运送 siRNA 方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将 siRNA运送到细胞中。对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。如果解决了将 siRNA 有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。

治疗肿瘤 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的 siRNA 。 Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将 siRNA 导入肿瘤细胞中 , 特异性抑制了癌基因 k ras (v12)的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。Scher 等以引起慢性髓性白血病和 bcr ab1阳性急性成淋巴细胞白血病的 bcr ab1癌基因为靶基因 , 设计了对应的 siRNA, 并获得了 87%的有效抑制率。Wilda 等用 siRNA 抑制白血病 bcr/abl融合基因表达也取得了成功。 因此基于 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。

7.7. 内源性内源性 RNAiRNAi 机制机制及其作用及其作用

体内 RNAi 机制研究在深入

是什么原因使我们有可能通过外源 siRNA诱导内源性的靶基因转录后沉默？为解开这个迷题，更有效地进行 RNAi 应用，随着 RNAi 应用研究的广泛开展，，并迅速成为 RNAi 研究中的重要领域，吸引着越来越多的研究者投身其中，涌现出一系列令人耳目一新的成果。多年来，生物学家认为 RNA 在生命过程中的作用仅仅是将遗传信息从 DNA 传递到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般没有创意。但近几年的一系列发现使研究者对 RNA ，尤其是 mRNA 以外的哪些小 RNA 的功能有了全新的认识。

体内小 RNA 作用的重新认识生物体中有一群小 RNA （目前看来人体中编码约 255 种小 RNA ，竟占整个基因组近 1% ，很多可能编码自以前被认为的“垃圾 DNA” ）可以影响蛋白表达水平，从而控制细胞的多种生命活动。尤其在发育过程中 2003年有一些激动人心的最新发现：

仅约 22个核苷酸长度的小 RNA ，发现竟能引导早期发育——从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中的细胞增殖；

缺少 RNAi蛋白 Dicer （一种 RNA 酶 III家族的酶，参与 RNAi 过程中对 RNA 的剪切）的小鼠会缺少干细胞的某些分化系（ swathsofstemcells ），在出生前就夭折；

小鼠中特定的小 RNA 能帮助引导干细胞生成胚胎的血细胞系统。

11 ）抗病毒功能）抗病毒功能

Voinnet 和 Li 等分别在植物和果蝇中发现了通过 RNAi 实现的抗外源核酸机制：被大多数 RNA病毒启动的 RNAi 可导致病毒基因组降解。例如在果蝇细胞中， Flock house virus(FHV) 就能引发果蝇内部的 RNAi 反应，产生 FHV 特异性的 siRNA 来降解感染的 FHV 。

22 ）基因调控）基因调控

目前在人、蠕虫，果蝇和植物等生物体中都发现了小 RNA ，有的通过结合 3‘非翻译区（ UTR ）和靶 mRNA 抑制 mRNA翻译，有的作为 siRNA 通过 RNAi机制破坏靶基因转录本。

33 ）染色质浓缩）染色质浓缩

内源的一些 siRNA 可能通过使染色质浓缩调节基因表达。 一些研究小组发现 dsRNA 结合到植物启动子区域能通

过一种使 DNA甲基化的作用导致基因沉默； 在蠕虫体内检测到许多 Polycomb 蛋白（能结合染色质）是 RNAi 过程所必须的；

裂殖酵母中内源 siRNA 可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。如 Vera Schramke 等在裂殖酵母中通过合成 shRNA 反式抑制同源位点，导致在mate区沉默的 Swi6染色质浓缩。这些结果都提示一些内源性的 siRNA 通过导致染色质浓缩来调节基因水平。

44 ）转座子沉默）转座子沉默目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及 siRNA 。

其一，发现蠕虫 mut-7 基因参与 RNAi 和转位抑制。

其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出 siRNA ，并检测到这些 siRNA 介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列——含转座子片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子 LTR （长末端重复序列）介导的 RNAi ，推测在 siRNA 介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。

55 ）基因组重组）基因组重组

siRNA 可能参与纤毛虫，四膜虫虫体间结合时的基因重组。结合到重组序列的 siRNA ，在虫体之间的结合过程中介导 DNA缺失和染色体断裂。有趣的是，在这些 siRNA 介导的程序性DNA删除事件中，也发现需要重组区域组蛋白的甲基化。