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RNA interference2006 Nobel Prize in Medicine

A 班第二組05王德雄 09江孟軒 25周大鈞 34林炯宏 36林瑾薏 46張恩慈

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Timeline

1998

1999

2000

2001

2002

1990 cosuppression of purple color in plantsdsRNA injection in worms

short RNAs identified in plants

RNAi shown in vitro

RISC activity partially purified

siRNAs identified Dicer identified

RNAi used against HIVgenome-wide RNAi screens begin

RNAi 發現經過及實驗

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Plant experiment

RNAi 發現經過及實驗

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The Key Experiment

Caenorhabditiselegans（秀麗隱桿線蟲 ）

millimeter-long

RNAi 發現經過及實驗

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The Key Experiment

in vitro transcribe an antisense RNA:

cap AAAA...

mRNA can no longer be translated into a protein

RNAi 發現經過及實驗

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RNAi 發現經過及實驗

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Double-stranded RNA-induced RNA interference causes destructionof a specific mRNA in C. elegans

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RNAi 的機制

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RNAi 的機制

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steps

由外源導入或 transposon 、病毒感染的 dsRNA 經由 ATP 依賴方式的 Dicer 切割成 siRNA

siRNA 與 PAZ 、 MID 、 PIWI 、 N結合成 RISC MID 可以 activate RISC ，使之與目標 mRNA結合

PIWI 切割 mRNA 目標 mRNA 分解

RNAi 的機制

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siRNAi 的作用機制

dsRNA ：雙鏈 RNA Dicer 酶 ：可以切割 dsRNA 雙鏈 siRNA ： dsRNA 被切割後的產物 (21~23 個鹼基

) 單鏈 siRNA ：由 siRNA 雙鏈結構解開 RISC ： siRNA 和 protein 的複合體

RNAi 的機制

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siRNA structure

RNAi 的機制

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Dicer 的結構及切割機制

RNAi 的機制

RNase III signatures

connector helix

amino-terminal helicase domain

PAZ domain

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Dicer 的結構及切割機制 需要 dsRNA binding proteins 辨識機制： 藉由 RNase III signatures 和 PAZ domain 間的距離（ 65 埃）來辨識 siRNA 分子（ 25 個鹼基長）。

RNAi 的機制

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RISC 的組成 RISC 是由一類名為 Argonaute2的蛋白質所構成。依其構造可分為四部份： PAZ 、 Mid 、 PIWI 、 N

( 如圖所示 ) PAZ 可以辨認 siRNA 的 3‘

端並和之結合； PIWI 是屬於 RNase H 家族

成員之一，因此含有核酶活性，得以進行 mRNA 的切割。

Mid 則是可形成一個和 PIWI吻合的 deep basic pocket surface ，並和 siRNA 的 5’端的 P結合，使 RISC 活化且更穩定，也使 RISC 更能在正確位子和 mRNA 結合。

RNAi 的機制

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siRNAi 的信號擴增系統 線蟲的實驗 (探討 siRNA 遺傳現象 ) 被 RISC 切斷的 mRNA 片段可以被 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 附著，並進行複製，形成一 dsRNA 。 Dicer 酶再對 dsRNA 進行切割，造出新的雙鏈 siRNA 。如此不斷循環，便可達到信號擴增的效果。

請仔細看影片

RNAi 的機制

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miRNA

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steps

由基因組中轉錄出 pri-miRNA 在 microprocessor complex 中被切割成 70個鹼基的 pre-miRNA( 髮夾狀 )

pre-miRNA 被 Exportin-5 由細胞核運到細胞質中

Dicer 酶能以 ATP依賴方式切割 pre-miRNA pre-miRNA 變成 20~22 個鹼基的 miRNA duplex

RNAi 的機制

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steps

miRNA duplex 被分解成兩個單鏈 miRNA 其中一鏈會成為 mature miRNA mature miRNA 和一群蛋白質形成 RISC RISC 會和標靶 mRNA 結合，使之分解或不能轉譯

RNAi 的機制

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miRNA 的作用機制 pri-miRNA ：由基因組中轉錄出來 Drosha ：一種 RNaseIII pre-miRNA ：由 Drosha切割 pri-miRNA 而來 Exportin-5 ：可將 pre-miRNA 由細胞核運到 細胞質。 miRNA duplex ： pre-miRNA 被切割後的產物 (20~22個鹼基 ) mature miRNA ：有活性的單鏈miRNA

RNAi 的機制

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RNAi 的機制

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siRNA 和 miRNA 的比較

二者的長度都約 22 個鹼基左右。二者都是 Dicer 產物二者的生成都需 Argonaute 家族蛋白的存在二者同是 RISC 的組成成分，因此在 siRNA 和 miRNA主導的沉默機制上有重疊

相同點

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相異點

siRNA miRNA 由來 人工插入 dsRN

A 或病毒 髮夾狀的 pri-miRNA

存在構造 雙鏈形式 duplex 形式 與目標 RNA 結合

沒有錯配現象 存在錯配現象

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相異點

siRNA miRNA專一性 siRNA 的目標序列有

一個核甘酸突變，就會影響到 RNAi 的沉默效應。

miRNA 的目標序列有一個核甘酸突變，也不會影響到 miRNA途徑的調節效應。

機制 影響 mRNA 的穩定性 影響蛋白質的合成功用 抑制 transposon 的

活性和病毒感染在發育過程中，調節內在基因的表現

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Huntington’s disease

Normal HD gene

Mutant HD gene (CAG repeat)

Polyglutamine disease

RNAiRNAi 的應用的應用

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患者的腦部掃描 ( 基底核 )

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RNAi and Huntington’s disease

正常 HD gene 和突變 HD gene 的差異(CAG repeat)

Off-target effect

SNPs, single nucleotide polymorphisms

RNAiRNAi 的應用的應用

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Challenging problems

適合的載體 ? Adeno-associated virus Spinocerebellar Ataxia Type 1

RNAiRNAi 的應用的應用

29

RNAi and antivirus

RNAi 和抗病毒的關連性

RNAiRNAi 的應用的應用

30

RNAi and HIV

CCR5, a co-receptor of HIV

Chemokine receptor Co-receptor 的隱憂

RNAiRNAi 的應用的應用

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CCR5 的構造

G-protein-linked receptor

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基因研究的改良傳統作法 : 利用自然發生的突變種不斷交配，得到大量純種需

要研究之素材。問題： 1. 突變種的多樣性 2.得到大量素材所需時間

RNAi 的改良： 1.可針對特定的基因做抑制 2. 操作簡單 3.可在細胞發育任何階段執行　　　

RNAiRNAi 的應用的應用

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癌症治療的應用1.細胞週期素依賴 CDK-2 在調控細胞週期中發揮關鍵作用 , 利用特定序列的 dsRNA去阻斷 CDK-2

2. 直接抑制制癌基因3. 抑制腫瘤細胞中與血管生長相關的生長因子

即可治療腫瘤細胞異常增值或是抗腫瘤轉移

Ex.結腸癌— Survivin(凋亡蛋白抑制劑 ) 子宮頸癌— HPV基因 (人類乳突病毒的治病基因 ) 乳腺癌— Spl 基因 (與細胞增值分化相關的核轉錄基因 )

RNAiRNAi 的應用的應用

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結語 新興的基因組斷技術 !! (cp.傳統針對蛋白質作用 ) 仍存在之問題1.siRNA 的設計困難 ?2.RISC 的組裝步驟及其相關蛋白如何與 siRNA組合、活化 ?

3.如何找到一種高效、低毒適合人體的轉運載體 ?