RNA Izolasyonu

8/12/2019 RNA Izolasyonu

1/36

Konu 6

RNA:

zolasyon

veAnalizi.

NE?: RNA izolasyonu ve analiziNASIL?: .NEDEN?....

8 Kasm 2007 @ Dr. Bekir lMula niversitesi Molekler Biyoloji

Dier Derslerden Bilinmesi Gerekenler:RNAnn yapsRNA eitleri


2/36

Bu dersi hazrlamak iin yararlanlan Kaynaklardan birisidir.

Master ve doktora almalarnda RNA almalarnda kaynakolarak kullanlabilir.

28 sayfalk bir derleme.

Kaynak 2

Kaynak 1

Kaynak 3:

Molekler Biyolojide KullanlanYntemler Kitab Temizkan. Arda.


3/36

taslak

RNA nedir, RNA cesitleri nelerdir. DNAdan farklar nelerdir?

RNA izolasyonu neden gereklidir? Izoleedilen RNA ne amac icin kullanilir?

RNA nin 3 boyutlu yapisi RNA izolasyonu basamaklari ve bazi

teknikler, resimler

RNA izolasyonda kullanilan kimyasallar vekullanilma nedenleri RNA kullanilarak yapilabilecek bazi

deneylerin genel hatlarla anlatilmasi


4/36

Central Dogmareplikasyon

transkripsiyon Processing:ilenmesi

translasyon

GEN EKSPRESYONU (genin ifade edilmesi)Genotipten Fenotipe gidiat

DNAda (gende) depolanm bilginin Protein ileCRASI ya da FONKSYONU

RNA!!!! Genotipteki bilgiyi FENOTPE (fonksiyonlartoplamna) TAIYAN ara Molekl !!!

Hangi bilginin (hangi genin) ne zaman ve hangikoulda ifade edileceini yani fonksiyona dneceinianlamak, o spesifik genin mRNAsnn hcrede olupolmadna bakmakla balar. (RNA izolasyon veanalizini bilmeniz size bu byk resme ulamanzdayardm eder)

NEDENRNA (mRNA)

ZOLASYONU:

AMA?

ELDE EDLECEKRNA NEREDE

KULLANILACAK

?


5/36

Genleri tahtada iz ve RNA izolasyon veanalizinin byk resme nasl uyduunugster.


6/36

RNA ve Sentezi

RNA: Ribonkleik asit

Kimyasal adan RNA ve DNAbirbirine ok benzerdir denilebilir RNA sentezi, DNA Sentezine benzer

DNAnn bir iplikiindenkomplementer (tamamlayc)

iplikik sentezlenir Ama birtakm farklar vardr:

DNA RNA

DNA polimeraz RNA polymerase

Deoksi-ribonkleotidler ribonnkleotidler

timin (T) Uridine (U)

ki iplikik sentezlenir Bir iplikik sentezlenir(sense)


7/36

Timinde

Ekstra metil


8/36

H DNDNZ M NEDEN DNADAURASL YERNE TMN VAR?

nk sitozin amin grubunu kaybederek (deaminasyon) urasilimeydana getirebilir. Bu hcre ierisinde belli sklkla meydanagelebilen bir olaydr. Bu, DNAda mutasyona neden olur.

Byle bir durum (Sitozin->Urasil mutasyonu) hcrenin DNA tamirmekanizmasyla dzeltilir. Eer DNAda urasil grlrseproofreading ile tamir edilir.

te bu yzden DNAda timin vardr.


9/36

RNA eitleri


10/36

RNA nn 3 boyutlu yaps:

RNA dorusal bir makromolekl olarak sentezlenir amaKendisini oluturan bazlarn birbirleri ile ba yapmas sonucu

ekilde gsterildii gibi bir 3 boyutlu yapya brnr.3 boyutlu yap baz dizisi ve eidine gre farkllk gsterir.

Bilgisayar tarafndan tahminEdilmi bir 3 boyutlu mRNAgrnm.Bu mRNA insan methiyoninSentaz geninin bir parasdr (5UTR blgesi)

PEK RNA y jelde koarken bu 3 boyutlu yap komay etkiler mi?Cevap: EVET. Bunu nasl aabiliriz?: Cevap: Bundan sonraki anlatlacaklarda


11/36

RNA karyot ve prokaryotlarda farkllk gsterir.

Bknz: Baka ders notlarnz.Yukarda bir mRNA nn ematik yaps izilmi.

mRNA y izole etmek iin ekilde gsterilenhangi zellii kullanabiliriz???

Bir mRNA nn ematik ekli:


12/36

RNAnn yapsndaki ribozda bulunan (DNAya gre) ekstrahidroksil grubu (OH) nasl bir fark yaratr?

Bu OH grubu hcre ierisinde nkleofilik ataa urayabilir. Yani protona (H)ihtiyac olan bir baz, OH grubundan H yi koparabilir.

Meydana gelen H siz O ba yapmak ihtiyac ile, fosfodiester bandaki P yeatak eder ve bu olay ban kopmasna neden olur. Dolaysyla RNA yapsn

bozar.YAN bundan dolay RNA, DNA ya GRE, daha ok degradasyon olmaya

yatkndr.

Ayrca hcrede bol miktarda RNaz enzimi vardr. YLEYSE: RNA y paralanmadanbir btn olarak izole etmek DNA ya gre daha zordur.Peki NE YAPMALIYIZ K bunu aabilelim???


13/36

mRNA molekllerinin degradasyon yar mrleri

mRNA yar-mrleriHcre Hcrenin blnme Averaj Aralk

zaman

Escherichia coli 20 - 60 dakika 3 - 5 dakika 2 - 10 dakika

Saccharomyces

cerevisiae(maya) 3 saat 22 min 4 - 40 dakika

Kltr edilminsan hcreleri 16 - 24 saat 10 saat 30 min ya da daha az

(histone, c-myc RNA lar)0.3 - 24 saat (spesifik

mRNA lar)

Dn ve balant kur:NEDEN NSAN HCRELERNN RNA s daha OK ZAMAN DAYANABLYOR?mRNA nn YARI MRLER neden DAHA FAZLA olabilir?

O O S O


14/36

Organizma:Escherichia coli Kltr, LB besiyerinde 24 saat nceden remeye braklr (10ml), Santrifj edilir (12000g, 4C, 5dk), Pellet zndrlr (10ml protoplast tamponu iinde), lizozim eklenir ve 15 dk buzda bekletilir, Santrifj edilir (5900g, 4C, 10dk),

Lizis tamponunda zndrlr, DEPC eklenir, kartrlr ve mikrosantrifj tplerine aktarlr, 37C de 5dk

bekletildikten sonra buzda soutulur, Tuz ile doyurulmu DEPCli su eklenerek 10dk buzda tutulur, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 10dk),

st sv eit olarak 2 mikrosantrifj tpne alnr ve zerine souk saf etanoleklenir ve bir gece - 20C de bekletilir, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 15dk), kelti souk %70 lik etanolde ykanr ve havada kurutulur kelti DEPC li suda zndrlr.

TOTAL RNA ZOLASYONUGram negatif bakteriler

G i if b k il


15/36

Gram pozitif bakteriler Organizma:Bacillus subtilis Kltr, LB besiyerinde 24 saat nceden remeye braklr (10ml), Santrifj edilir (12000g, 4C, 5dk), kelti lizis tamponunda ktrlr,

Mikrosantrifj tpne aktarlr ve kuru buzda dondurulur, rnek zndkten sonra, 3 kez 10sn sonikasyon yaplr ve 37C de 60dk bekletilir, Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek kartrlr ve santrifj edilir

(14000dv/dk, 5dk, oda scakl) st faz alnarak baka bir mikrosantrifj tpne aktarlr, zerine eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm ile 1 kez, sonra eit kloroform/

izoamil karm eklenerek ekstrakte edilir, st faza NaCl eklenir ve tp souk saf etanol ile doldurulur ve kartrlr, -20de 1

gece bekletilir, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 15dk), kelti souk %70 lik etanol ile ykanr, kelti DNA paralama tamponunda zdrlrve zerine DNaz eklenir, 37C de

60dk

Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek ekstrakte edilir st faz yeni tpe alnr, alt faza TE tamponu eklenir ve 5dk oda scaklnda santrifj st faz bir nceki st faz ile birletirilir. Bu sv kloroform/ izoamil alkol ile ekstrakte edilir, yeni st faza NaCl ve souk saf

etanol eklenir ve -20 C 1 gece Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 30dk),

kelti souk %70 lik etanolde ykanr ve havada kurutulur kelti DEPC li suda zndrlr.


16/36

Mayalar Organizma:Saccharomyces cerevisiae Maya kltr santrifj edilir (5000g, 4C),

Pellet, SDS tamponu iinde zndrlr ve mikrosantrifjtpne aktarlr, PCIA ve asit ile ykanm cam boncuk eklenir, Karm vortekslenir, zerine fenol/kloroform/izoamil alkol ve SDS ieren tampondan

eklenir, kartrlr ve -20 C 1h bekletilir, Buz iine alnr kendi halinde znmesi beklenir ve santrifjedilir (5000g, 4C, 5dk)

Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek kartrlrve santrifj edilir (15000g, 5dk, 4C)

st sv yeni tpe aktarlr, zerine LiCl eklenir, alt st edilir ve -20 C 1gece bekletilir, Santrifj edilir (15000g, 20dk, 4C) keltinin buz iinde kurumas salanr,

kelti DEPCli suda zndrlr ve kk hacimlereblnerek -20C de saklanr.

M li d k l


17/36

Memeli dokularmateryal:istenilen memeli dokusu

Doku zerine paralama tamponu konur ve homojenizatr yardm ileparalanr,

Homojenat tpe aktarlr ve Na-asetat eklenerek kartrlr,

Fenol eklenir, kartrlr, kloroform:izoamil alkol eklenir ve 15dk 4C debeklenir,

Santrifj edilir (10000g, 20dk, 4 C),

st faz baka tpe alnr, zerine izopropanol eklenir ve -20

C de 30dkbeklenir,

Santrifj edilir ve RNA ktrlr (10000g, 10dk, 4 C),

RNA, paralama tamponu iinde zndrlr ve mikrosantrifj tpneaktarlr,

zerine izopropanol eklenir, -20 C de 30dk beklenir, santrifj edilir ve RNAktrlr (10000g, 10dk, 4 C),

RNA %70 lik etanolde sspanse edilir, vortekslenir, oda scaklnda 10-15dk bekletilir, santrifj edilir (10000g, 5dk, 4 C),

RNA keltisi vakumda kurutulur,

kelti DEPCli suda zndrlr, -70C de saklanr.

Bitkil


18/36

Bitkilermateryal:soan tipi gvde Paralama tamponu 65 C de stlr,

Scak tampon zerine -20 C de dondurulmu bitki materyalieklenir ve homojenizatr yardm ile paralanr,

zte proteinaz K ve KCl eklenir, 37C de 60dk bekletilir, Karm buz zerinde 1h tutulur ve santrifj edilir (10000g,

20dk, 4

C), st sv yeni tpe alnr, LiCl eklenir ve 4C de 1 gece beklenir, RNA ktrlr, Santrifj edilir (10000g, 20dk, 4 C),

kelti 2 kez LiCl ile ykanr, kelti TE iinde zndrlr veya souk saf etanol iinde-70C de aylarca saklanr.


19/36

RNA izolasyonuna yaklasim ve basamaklar:

1.Hucre membran ve ceperini etkili sekilde parcalamak

gereklidir. (daha onceki derste anlattik)

2. Nukleaz aktivitesinin inaktif hale getirilmesi (bu derste detaylicaanlatacagiz)

3. Solusyonu proteinlerden arindirmak icin uygun metodunsecilmesi (proteinlerin Proteinaz K enzimi ile parcalanmasi, fenol-kloroformekstraksiyonu, guanidyum tampon cozeltisinde cozunurluk..)

4. Nukleik asitin konsantre edilmesi icin uygun metodun

secilmesi (tuz + alkol kullanilir. Tuz olarak uygun miktarda NaOAc, NaCl, LiCl,KOAc ya da NH4OAc. Alkol olarak ethanol ya da izopropanol)

5. Izole edilen RNAnin uygun olarak depolanmasi


20/36

RNA PURFKASYONU

Deneylerin total RNAym kullanacak, yoksa mRNAym?Total RNA: Birok deneyde yeterli, kfi, rn: Northern analizi, RT-PCR, ribonukleazprotection assay gibi tekniklerpoly Aieren RNA: (baz deneylerde sadece mRNA gerekir) rn: c DNAktphanesi inas, array deneylerinde, cDNAnn iaretlenmesi (cDNA hazirlarkenrRNA istenmez) vs deneylerde

Genellikle izole edilen total hcre RNAsnn, %5i mRNAdr

rnek: 5 mg dokudan (ya da 2.5 X 10 6 hcreden) 10 mg civarnda total RNAelde edilebilir. Bunun spesifik RNA eitlerine dalm aadaki gibidir.

8 mg rRNA0,3 mg mRNA1,7 mg tRNA ve dier RNA

Bir doku tipinden ve ktlesinden izole edilecek total RNAytahmin edebilmek mmkn mdr?


21/36

Prife ettiin RNAnn iinde protein kontaminasyonu var m? Var ise bubir problem mi?

Saf RNA iin A 260 : A 280 = 2.0

Eer protein kontaminasyonunun bir problem olduuna karar verilirse;organik ekstrasyon yaplarak (fenol: kloroform : izoamil alkol 25:24:1)kontaminasyon giderilebilir.Az miktarda kalan, fenol A 260 : A 280 orann azaltabilir. Ve ayrca baz

enzimatik reaksiyonlar inhibe edebilir. Fenolu ortamdan uzaklatrmak iinkloroform /izoamilalkol (24:1) kullanlabilir.

Prifiye ettiiniz RNA salam m? Degradasyona uram m?

zole edilen RNAnn kalitesi en iyi formaldehit- agaroz jel elektroforez iledenatre edici koullar altnda tespit edilir.rnekler 10g /ml EtBr ile gzlemlenebilir. (RNA rneine eklenecek) 28SrRNA ve 18S rRNAy jelde grebilirsiniz. yi kalitede olan bir RNAda 28SrRNA bandnn younluu 18S rRNA nn 2 kat ise izole edilen total RNA iyibir kalitedir.


22/36


23/36

Hangi total RNA izolasyon teknii, sizin aratrmanz iin en uygun olandr?

Organ ve dokulardan RNA izolasyonu iin 3 temel teknik vardr. ounluklaguanidium yada deterjan kullanlarak hcre paralanr. Ve hcre iindeki RNaz

inaktif hale getirilir. Daha sonra elde edilen Lysis solusyonundaki protein, genomikDNA ve dier hcresel kompartmanlardan kurtulmak iin aadaki yntemleruygulanr.

1. GuanidiumCesium Klorid Metodu-Yava bir tekniktir, -ok emek gerektirir. -ok rnek varsa kullanlmas uygun

deildir. -RNA temizdir.*Guanidium izothiocyanate, hcreleri lizis eder ve hemen ardndan RNazenzimlerini inaktif hale getirir.* Ultrasantrifgasyon + Cesuum Klorid 12-24 saat santrifgasyon (32000 rpm)RNA alta ker ve DNA dier proteinlerden ayrlm olur.


24/36

2. Tekli ve ok basamakl Guanidium Asit Fenol metodu-Daha hzl, daha az basamak. -Genomik DNA konsantrasyonu sz konusuolabilir.

-ok rnek var ise hantal ve uygun olmayan bir teknik. -Ultrasantrifigasyonagerek yok ve RNAy 2-4 saatte izole edebilir.Bu teknikte: RNA 4M Guanidium thiocyanate (GITC); pH:4.0 + fenol/ kloroformzeltisinde sv fazda znm olarak elde edilir. Dk pHda DNA organikfazda, dier proteinler ve makomolekller ise iki faz arasnda kalr.

ekil bir sonraki slaytta.

***Eer tuz kalmsa, alkol ile ykanr.


25/36

2. Tekli ve ok basamakl

Guanidium AsitFenolmetodu1. GuanidiumCesium

Klorid Metodu


26/36

3. Fenolsz teknikler-ok Hzl. -Temiz RNA. -ok byk miktardaki rnekler ile allabilir. -GenomikDNA kontaminasyonu olabilir.Fenol zararl bir kimyasaldr. Hem kullanlmas hem de artklarnn yok edilmesi

problem yaratr. Bundan dolay yeni teknikler aratrlm ve guanidium ierentampon zelti iinde nkleik asitlere balanabilen cam-elyaf(lif) filtreler dizaynedilmitir.Guanidium burada hcreyi lizise uratmak iin kullanlm ve elde edilen Lizis rnethanol yada izopropanol gibi organik zc ile seyreltilmi ve camlif-filter (ya darezin reine) iine rnek eklenmitir. RNA bu materyale balanm, DNA ve

proteinler ise uygun tampon zeltilerde ykanmtr. En sonunda bal kalan uyguntuz ve pH ieren tampon zeltilerle elsyona uratlm ve izole edilmitir. (Buteknik, bir nevi kk kolon kullanlan bir prifikasyon stratejisidir)Bu teknikte RNA 1 saatten az srede izole edilebilir.


27/36

Bir baka teknik:


28/36

RNaz inhibe eder.

nasl?:RNazdan arndrlm solsyon ya da su hazrlamak iin

dietilpyrocarbonate (DEPC) kullanlr. DEPC RNaz enziminde bulunan spesifikaminoasitlerin R gruplarnda karboksietilasyona neden olarak, bu proteini etkisizhale getirir. DEPCnin karsinogen olabilecei konusunda pheler vardr.Dolaysyla bu konuya dikkat edilmelidir.

DEPC ne yapar?

Baz nemli NoktalarKullanlan cam malzemelerin, materyallerin, solsyonlarn, RNaz enzimindenarndrlm olmas gereklidir.

Cam malzeme 180 C de 8 saatten fazla tutularak RNaz dan arndrlabilir.0,1 % DEPC ile 37 C de 2 ssat inkbasyon ve daha sonra steril su ile ykanarakRNaz etkisiz hale getirilir.Kullanlan elektroforez tanklar % 3 lk hidrojen peroksit solsyonu ile 10 dakiikainkbe edilerek ve daha sonra DEPC-dH2O le ykanarak RNaz etkisiz halegetirilebilir.

RNA ile alrken daima eldiven giyilmeli ve sk sk eldivenler deitirilmelidir.


29/36

mRNA nn izolasyon stratejisi:


30/36

SalamRNA Degrade

olmu RNA

Grntlemecihaz

Analiz software

RNA A li i


31/36

RNA nn Analizi

a) Spektral yntemler

RNA = A260xseyreltme faktr x40 (g/ml)

b)Elektroforetik Yntemler(Agaroz- Formaldehit Jel Elektroforezi)

MOPS tamponu iinde agaroz zndrlr, 55 C e kadar soutulur, formaldehit ve etidyum bromr

eklenir, Tank iersine dklr ve tarak yerletirilir, RNA 75 C de 10dk stlr, buzda soutulur, ykleme

tamponu ile seyreltilip taraklara konur, Jel koulur. Bittikten sonra UV altnda baz rRNA

bandlar gzlemlenebilir.

Sonuta:


32/36

Sonuta: Paralanm total RNA;

jel zerinde belirgin 28S

(veya 23S) ve 18S (veya16S) rRNA bantlarnasahiptir.

Bantlardaki parlaklkgze arpar;

28S rRNA band 18SrRNA bandndan 2 kat

daha parlaktr. Bu oran(2:1) total RNA nnparalanmadan eldeedildiiningstergesidir.

Bozulmam

Bozulmu

M

arkerlar

Ksmen paralanm RNA bulutumsu grnt verirken


33/36

KsmenparalanmRNA bulutumsu grnt verirken,belirgin bantlar gzlenmez,

ParalanmamRNA daise 2:1 orangzlenmez,

Tamamen paralanm RNA ise ok kk bantlarnbile gzlendiiyaygnbir grnt oluturur.

karacier

cier

beyin

yaprak

kk

virs

dalak

Markerlar

(2g)

maya

E.coli

RNA izolasyon ve analizine bir ornek: gercek bir data


34/36

Northern

Radyoaktif Firefly lucgeni ile

hibridize olan lucmRNA si hucrede

bu genin iyi bir seviyede ifade edildigini gosteriyor.

RNA Cos-1 (fibroblast) hucrelerinden izole edildi ve formaldehit-agaroz jel

elektroforezinde kosuldu. EtBr ile boyanip UV isigi altinda fotografi

cekilen RNA jelinde ustteki band 28SrRNA ve alttaki ise 18SrRNA dir. Bu RNA

larin miktarlari cok oldugu icin boyama sonucu jelde gorulebilir. Ancak mRNA lergorulemez. Bunun icin (spesifik bir mRNA yi gorebilmek icin) RNA analiz

teknikleri vardir ve bunlardan birisi Northern Analizidir.

RNA jel resmi.

rRNA EtBR ve UV

ile gozlemlenebilir.

RNA izolasyonununbasarili oldugunu

gosteren jel resmi.Degradasyon yok.RNA iyi kalitede.Sonraki analiz teknigiyapilabilir.

Luciferase mRNA si

28srRNA

18SrRNA

RNA izolasyon ve analizine bir ornek: gercek bir data


35/36

POST-GENOMIK DEVIR:

YENI BIYOLOJI VE

GELECEK!

RNA ILE YAPABILECEKLERIMIZDEN

BAZILARI:

BU SLAYTTAN SINAVDA SORUMLU DEGILSINIZ.


36/36

Documents

RNA Izolasyonu