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1 RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入を可能にする 新規ガイドRNA 福岡大学理学部化学科 助教 福田 将虎

RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入 …...4 DNA RNA タンパク質 設計図 生命現象の担い手 DNA情報を運ぶ タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、

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RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入を可能にする

新規ガイドRNA

福岡大学理学部化学科

    助教 福田将虎

Page 2: RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入 …...4 DNA RNA タンパク質 設計図 生命現象の担い手 DNA情報を運ぶ タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、

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研究背景(タンパク質の合成経路 -セントラルドグマ-)

DNA

RNAタンパク質

設計図生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

遺伝情報はDNA→RNA→タンパク質の順に流れる。 タンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている

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DNA

RNAタンパク質

多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる

作られる量や機能が変わる

研究背景 (タンパク質機能の異常は病気の原因)

設計図生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

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DNA

RNAタンパク質

設計図 生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、 生命現象を制御できる。

=病気の予防、治療ができる

機能制御

研究背景(タンパク質機能制御の位置づけ)

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DNA RNA タンパク質

生体内標的タンパク質の機能を制御する方法

情報 機能

情報のレベルで標的タンパク質の機能を制御

標的タンパク質の機能を直接制御する

(一般的な薬剤)(遺伝子改変技術)

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ゲノム編集siRNA, miRNA

恒常的 一過的効果

標的

オフターゲットのリスク

DNA RNA

大 小

遺伝子改変技術の比較

タンパク質制御 発現抑制自在

RNA

一過的小

自在

用途 DNA遺伝子治療 核酸製剤

使用物質

標的設定 相補鎖 相補鎖

RNA、タンパク質 RNA

相補鎖

RNA

未開発

RNA編集

(目的)RNAレベルで情報を改変する新たな技術を開発する

内在の機構を利用 内在の機構を利用

(CRISPR-Cas9)

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RNA編集機構

DNA

RNAタンパク質

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

adenosine inosine

A-to-I RNA 編集

RNAの段階で遺伝情報を変換する

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A-to-I RNA編集

● ほぼ全ての高等生物が持つ

● 生体の恒常性維持に必須の機構

● IはGとして翻訳される(DNA上のA→G変異と等価)

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

アデノシン (Adenosine)

イノシン (Inosine)

ADAR

ADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA

A I

=タンパク質のアミノ酸配列(機能)が変わる

● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)

● スプライシングを制御

二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ

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Prior to editing After A-to-I editing

AGU/C IGU/C

UAU/C UIU/C

ACA/C/G/U IGA/C/G/U

AUU/A/C IUU/C/A

AUG IUG

UAA UII

CAU/C CIU/C

AAA/G IGA/G

AAU/C IAU/C

CAA/G CIA/G

GAU/C GIU/C

GAA/G GIA/G

IAA/G

AIU/C

Ser

Tyr

Thr

Ile

Start/Met

Stop

His

Lys

Asn

Gln

Asp

Glu

Gly

Cys

Ala

Val

Val

Trp

Arg

Gly Glu

Asp Ser

Arg

Gly

Gly

UAG, UGA UIG, UGI

A-to-I RNA編集によるコドン変換

-AGU- -IGU- -GGU-Ser Gly

=(例)

● タンパク質リン酸化制御

約30%の細胞内タンパク質がリン酸化される(機能が調節されている)

がんを始めとする腫瘍細胞では タンパク質リン酸化シグナル伝達が異常

● タンパク質活性制御

● タンパク質発現調節開始コドン、終止コドンの変換

活性中心、金属配位アミノ酸の変換

様々な生体プロセスの制御が可能

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Adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)

● ADARノックアウトマウスは、

ADAR1: 胚性致死

ADAR2: 生後2〜3週間で致死

RNA編集酵素

● 二本鎖構造中のアデノシンを編集する

Higuchi, M. et al., Nature, 406, 78. (2000)

Wang, Q. et al., Science, 290, 1765. (2000) dsRBD2 dsRBD1

Deaminase domain

Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005)Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010)

hADAR2の構造 ● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

A I

● ほとんどの細胞種で発現(特に神経細胞で高発現)

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A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入

dsRBD2

標的RNA

A I

hADAR2標的RNAにADARを誘導し、 部位特異的にA-to-I変異を導入する

RNA変異導入法

標的アデノシン

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Deaminase domain (DD)

guide-RNA (gRNA)

SNAP-DD

SNAP-tag

Stafforst, T. and Schneider, M. F. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 51, 11166. (2012)

ABzG-gRNA

λN-DD

λN

Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PNAS, 110, 18285. (2013)

AboxN-gRNA

(修飾したADARを用いる)・煩雑な操作が必要

・内在のRNA編集に干渉する可能性

従来のRNA変異導入法の特徴

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本RNA変異導入技術のコンセプト

標的RNA

A I

hADAR2

ADARを目的部位に誘導するガイドRNA

ADAR-guide RNA (AD-gRNA)

AD-gRNAによるRNA変異導入 ・内在のRNA編集機構を利用 ・相補配列で標的を設定

標的アデノシン

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CAUUA GGUGGGUGG AUA UAUAACAAUAU

GUAGU CCAUCCACC UAU AUAUUGUUGUA

A G GCUA

AGCC

A

dsRBDsとGluR2 RNAの複合体

(Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))

hADAR2

dsRBD1dsRBD2

Deaminase domain

GluR2 RNA (生体内の編集基質RNA)

編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト

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GGGUGG AUA UAUAACAAUAU

XXXXX XXXUCCACC UAU AUAUUGUUGUA

A G GCUA

AGCC

ANNNNN NNN

編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト

標的RNA

AD-gRNA

相補領域(<15 nt)

ADAR結合領域(40-49 nt)

● 天然型ADARを誘導  (内在のRNA編集機構を利用) ● 相補領域の配列で標的部位を設定

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実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)

200

複合体形成確認(Gel shift assay)

(Annealing reaction condition) 300 nM GFPs RNA (160 nt) 900 nM AD-guide GFP_A200 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min

8% Native PAGE (EtBr staining)

Lane 1: GFPs RNA (160 nt) Lane 2: AD-guide GFP_A200 Lane 3: Annealed sample

1 2 3

hADAR2A

+

in vitro editing reaction

RT-PCR

Direct sequencing

In vitro 編集解析

5’

ACUGGUGGGACUCGA

AGFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

GCC

3’

AD-guide GFP_A200

3’ C

配列設計

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(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol reaction duration: 2 h

A GG GC T A C GG G C

hADAR2

A

Antisense RNA

A GG GC T G C GA G C

hADAR2

A

AD-gRNA

A GG GC T A C G G C

A

hADAR2

No guide-RNA

GFP RNA

200

0

20

40

60

80

100

guide (-) antisense AD-guide GFP_A200

% e

ditin

g�

編集率(反応時間1時間)※ ピーク高の比(G/(A+G))から算出

実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)

標的部位特異的な 変異導入に成功 (変異導入効率:約80%)

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改変型ADg-RNA(ADg-rRNA)の設計

3’-antisense

GCCGCACGUCAUGAAC5’CGA

5’-antisense

200

5’

ACUGGUGGGACUCGA

AGFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

GCC

3’

ADg-GFP_A200

3’ C

200

5’ AGFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

3’

ADg-rGFP_A200

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(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol

guide RNA (-)

AD-guide GFPr_A200

Editing efficiency (vs time)

0 30 60 90 120 150 180Time (min)

% e

ditin

g

100

80

60

40

20

0

AD-gRNA (5 -AS)

AD-gRNA (3 -AS)

·

·

実施例 2 (ADg-rGFP_A200の設計と機能評価)

変異導入効率の向上に成功 (変異導入効率:約100%)

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AU G

173

AUG UGA

stop

IU G

173

AUG UGA

Trp

ADg-GFP_A173

Reporter mRNA (GFP W58X)

�MV promoter�

pcDNA3.1_ GFP W58X�

GFP W58X

�MV promoter�

pcDNA3.1_ ADAR2�

hADAR2

H1 promoter�

pSuper_AD-gRNA�

AD-gRNA

Transfection

HEK293 cell

Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PNAS, 110, 18285. (2013)

実施例3 (AD-gRNAを用いた細胞内RNA変異導入)

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GFP WT ADg-rGFP-A173

ADAR2

GFP W58X (-)

ADAR2

GFP W58X 5’-AS

ADAR2

GFP W58X ADg-rGFP-A173

ADAR2

Phase GFP Merge(Transfected plasmid)

実施例3 (AD-gRNAを用いた細胞内RNA変異導入)

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新技術の特徴・従来技術との比較

•  ゲノム編集技術とは異なる原理の遺伝子改変技術   (一過的な変異導入が可能、off-targetのリスクが低)

•  タンパク質因子を必要とする従来技術と比べ、本技術はガイドRNAのみで目的RNA変異導入を達成できる(使いやすい、低コスト)

•  標的部位の設定は単純な相補配列で設定できる (汎用性が高い、カセットベクター等の構築も可能)

•  本RNA変異導入法は、タンパク質機能制御に応用できるため、多くの生体内プロセスの制御に適用できる(創薬基盤技術への展開)

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想定される用途

•  本技術(RNA変異導入)の特徴は、ゲノム情報を改変することなく、遺伝情報(タンパク質機能情報)を変換できることにある。

○ 新たな創薬基盤技術

核酸創薬(タンパク質リン酸化阻害剤、など)

○ 一過的遺伝子変異導入ツール(基礎研究用)

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実用化に向けた課題

•  現在、in vitro (培養細胞内)における変異導入が可能。一方、一過的なRNA変異導入により、細胞プロセスを制御できるかを明らかにする必要がある。

•  生物個体での実施が課題。

•  アプタマー、siRNA等を用いた核酸創薬と同様の問題(コスト、薬効、ドラッグデリバリーなど)に直面する。逆に、これら技術に適用されている化学修飾や導入方法を応用し、実用化に向けて、編集ガイドRNAの最小化及び高機能化する必要がある。

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企業への期待

•  RNA変異導入技術の確立及びその応用研究に興味を持って頂ける企業。特に、核酸創薬及び生物個体における機能評価技術を持つ、企業との共同研究を希望。

•  また、核酸医薬品を開発中の企業、遺伝子治療への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

「RNA変異導入技術」を用いた創薬は未だ例が無い

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本技術に関する知的財産権

出願番号(国内) :特願2015-140894出願番号(国際) :PCT/JP2016/070915出願人    :福岡大学発明者    :福田 将虎

(発明の名称)

部位特異的RNA変異導入方法およびそれに使用する 標的編集ガイドRNAならびに標的RNA-標的編集ガイドRNA複合体

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問い合わせ先

福岡大学

研究推進部 産学官連携センター

担当コーディネーター 芳賀 慶一郎

TEL 092-871-6631(内線2809)

FAX 092-866-2308

e-mail [email protected]