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1
RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入を可能にする
新規ガイドRNA
福岡大学理学部化学科
助教 福田将虎
2
研究背景(タンパク質の合成経路 -セントラルドグマ-)
DNA
RNAタンパク質
設計図生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
遺伝情報はDNA→RNA→タンパク質の順に流れる。 タンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている
3
DNA
RNAタンパク質
多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる
作られる量や機能が変わる
研究背景 (タンパク質機能の異常は病気の原因)
設計図生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
4
DNA
RNAタンパク質
設計図 生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、 生命現象を制御できる。
=病気の予防、治療ができる
機能制御
研究背景(タンパク質機能制御の位置づけ)
5
DNA RNA タンパク質
生体内標的タンパク質の機能を制御する方法
情報 機能
情報のレベルで標的タンパク質の機能を制御
標的タンパク質の機能を直接制御する
(一般的な薬剤)(遺伝子改変技術)
6
ゲノム編集siRNA, miRNA
恒常的 一過的効果
標的
オフターゲットのリスク
DNA RNA
大 小
遺伝子改変技術の比較
タンパク質制御 発現抑制自在
RNA
一過的小
自在
用途 DNA遺伝子治療 核酸製剤
使用物質
標的設定 相補鎖 相補鎖
RNA、タンパク質 RNA
相補鎖
RNA
未開発
RNA編集
(目的)RNAレベルで情報を改変する新たな技術を開発する
内在の機構を利用 内在の機構を利用
(CRISPR-Cas9)
7
RNA編集機構
DNA
RNAタンパク質
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
adenosine inosine
A-to-I RNA 編集
RNAの段階で遺伝情報を変換する
8
A-to-I RNA編集
● ほぼ全ての高等生物が持つ
● 生体の恒常性維持に必須の機構
● IはGとして翻訳される(DNA上のA→G変異と等価)
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
アデノシン (Adenosine)
イノシン (Inosine)
ADAR
ADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA
A I
=タンパク質のアミノ酸配列(機能)が変わる
● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)
● スプライシングを制御
二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ
9
Prior to editing After A-to-I editing
AGU/C IGU/C
UAU/C UIU/C
ACA/C/G/U IGA/C/G/U
AUU/A/C IUU/C/A
AUG IUG
UAA UII
CAU/C CIU/C
AAA/G IGA/G
AAU/C IAU/C
CAA/G CIA/G
GAU/C GIU/C
GAA/G GIA/G
IAA/G
AIU/C
Ser
Tyr
Thr
Ile
Start/Met
Stop
His
Lys
Asn
Gln
Asp
Glu
Gly
Cys
Ala
Val
Val
Trp
Arg
Gly Glu
Asp Ser
Arg
Gly
Gly
UAG, UGA UIG, UGI
A-to-I RNA編集によるコドン変換
-AGU- -IGU- -GGU-Ser Gly
=(例)
● タンパク質リン酸化制御
約30%の細胞内タンパク質がリン酸化される(機能が調節されている)
がんを始めとする腫瘍細胞では タンパク質リン酸化シグナル伝達が異常
● タンパク質活性制御
● タンパク質発現調節開始コドン、終止コドンの変換
活性中心、金属配位アミノ酸の変換
様々な生体プロセスの制御が可能
10
Adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)
● ADARノックアウトマウスは、
ADAR1: 胚性致死
ADAR2: 生後2〜3週間で致死
RNA編集酵素
● 二本鎖構造中のアデノシンを編集する
Higuchi, M. et al., Nature, 406, 78. (2000)
Wang, Q. et al., Science, 290, 1765. (2000) dsRBD2 dsRBD1
Deaminase domain
Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005)Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010)
hADAR2の構造 ● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
A I
● ほとんどの細胞種で発現(特に神経細胞で高発現)
11
A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入
dsRBD2
標的RNA
A I
hADAR2標的RNAにADARを誘導し、 部位特異的にA-to-I変異を導入する
RNA変異導入法
標的アデノシン
12
Deaminase domain (DD)
guide-RNA (gRNA)
SNAP-DD
SNAP-tag
Stafforst, T. and Schneider, M. F. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 51, 11166. (2012)
ABzG-gRNA
λN-DD
λN
Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PNAS, 110, 18285. (2013)
AboxN-gRNA
(修飾したADARを用いる)・煩雑な操作が必要
・内在のRNA編集に干渉する可能性
従来のRNA変異導入法の特徴
13
本RNA変異導入技術のコンセプト
標的RNA
A I
hADAR2
ADARを目的部位に誘導するガイドRNA
ADAR-guide RNA (AD-gRNA)
AD-gRNAによるRNA変異導入 ・内在のRNA編集機構を利用 ・相補配列で標的を設定
標的アデノシン
14
CAUUA GGUGGGUGG AUA UAUAACAAUAU
GUAGU CCAUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G GCUA
AGCC
A
dsRBDsとGluR2 RNAの複合体
(Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))
hADAR2
dsRBD1dsRBD2
Deaminase domain
GluR2 RNA (生体内の編集基質RNA)
編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト
15
GGGUGG AUA UAUAACAAUAU
XXXXX XXXUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G GCUA
AGCC
ANNNNN NNN
編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト
標的RNA
AD-gRNA
相補領域(<15 nt)
ADAR結合領域(40-49 nt)
● 天然型ADARを誘導 (内在のRNA編集機構を利用) ● 相補領域の配列で標的部位を設定
16
実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)
200
複合体形成確認(Gel shift assay)
(Annealing reaction condition) 300 nM GFPs RNA (160 nt) 900 nM AD-guide GFP_A200 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min
8% Native PAGE (EtBr staining)
Lane 1: GFPs RNA (160 nt) Lane 2: AD-guide GFP_A200 Lane 3: Annealed sample
1 2 3
hADAR2A
+
in vitro editing reaction
RT-PCR
Direct sequencing
In vitro 編集解析
5’
ACUGGUGGGACUCGA
AGFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
GCC
3’
AD-guide GFP_A200
3’ C
配列設計
17
(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol reaction duration: 2 h
A GG GC T A C GG G C
hADAR2
A
Antisense RNA
A GG GC T G C GA G C
hADAR2
A
AD-gRNA
A GG GC T A C G G C
A
hADAR2
No guide-RNA
GFP RNA
200
0
20
40
60
80
100
guide (-) antisense AD-guide GFP_A200
% e
ditin
g�
編集率(反応時間1時間)※ ピーク高の比(G/(A+G))から算出
実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)
標的部位特異的な 変異導入に成功 (変異導入効率:約80%)
18
改変型ADg-RNA(ADg-rRNA)の設計
3’-antisense
GCCGCACGUCAUGAAC5’CGA
5’-antisense
200
5’
ACUGGUGGGACUCGA
AGFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
GCC
3’
ADg-GFP_A200
3’ C
200
5’ AGFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
3’
ADg-rGFP_A200
19
(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol
guide RNA (-)
AD-guide GFPr_A200
Editing efficiency (vs time)
0 30 60 90 120 150 180Time (min)
% e
ditin
g
100
80
60
40
20
0
AD-gRNA (5 -AS)
AD-gRNA (3 -AS)
·
·
実施例 2 (ADg-rGFP_A200の設計と機能評価)
変異導入効率の向上に成功 (変異導入効率:約100%)
20
AU G
173
AUG UGA
stop
IU G
173
AUG UGA
Trp
ADg-GFP_A173
Reporter mRNA (GFP W58X)
�MV promoter�
pcDNA3.1_ GFP W58X�
GFP W58X
�MV promoter�
pcDNA3.1_ ADAR2�
hADAR2
H1 promoter�
pSuper_AD-gRNA�
AD-gRNA
Transfection
HEK293 cell
Montiel-Gonzalez, M. F. et. al. PNAS, 110, 18285. (2013)
実施例3 (AD-gRNAを用いた細胞内RNA変異導入)
21
GFP WT ADg-rGFP-A173
ADAR2
GFP W58X (-)
ADAR2
GFP W58X 5’-AS
ADAR2
GFP W58X ADg-rGFP-A173
ADAR2
Phase GFP Merge(Transfected plasmid)
実施例3 (AD-gRNAを用いた細胞内RNA変異導入)
22
新技術の特徴・従来技術との比較
• ゲノム編集技術とは異なる原理の遺伝子改変技術 (一過的な変異導入が可能、off-targetのリスクが低)
• タンパク質因子を必要とする従来技術と比べ、本技術はガイドRNAのみで目的RNA変異導入を達成できる(使いやすい、低コスト)
• 標的部位の設定は単純な相補配列で設定できる (汎用性が高い、カセットベクター等の構築も可能)
• 本RNA変異導入法は、タンパク質機能制御に応用できるため、多くの生体内プロセスの制御に適用できる(創薬基盤技術への展開)
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想定される用途
• 本技術(RNA変異導入)の特徴は、ゲノム情報を改変することなく、遺伝情報(タンパク質機能情報)を変換できることにある。
○ 新たな創薬基盤技術
核酸創薬(タンパク質リン酸化阻害剤、など)
○ 一過的遺伝子変異導入ツール(基礎研究用)
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実用化に向けた課題
• 現在、in vitro (培養細胞内)における変異導入が可能。一方、一過的なRNA変異導入により、細胞プロセスを制御できるかを明らかにする必要がある。
• 生物個体での実施が課題。
• アプタマー、siRNA等を用いた核酸創薬と同様の問題(コスト、薬効、ドラッグデリバリーなど)に直面する。逆に、これら技術に適用されている化学修飾や導入方法を応用し、実用化に向けて、編集ガイドRNAの最小化及び高機能化する必要がある。
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企業への期待
• RNA変異導入技術の確立及びその応用研究に興味を持って頂ける企業。特に、核酸創薬及び生物個体における機能評価技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、核酸医薬品を開発中の企業、遺伝子治療への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
「RNA変異導入技術」を用いた創薬は未だ例が無い
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本技術に関する知的財産権
出願番号(国内) :特願2015-140894出願番号(国際) :PCT/JP2016/070915出願人 :福岡大学発明者 :福田 将虎
(発明の名称)
部位特異的RNA変異導入方法およびそれに使用する 標的編集ガイドRNAならびに標的RNA-標的編集ガイドRNA複合体
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問い合わせ先
福岡大学
研究推進部 産学官連携センター
担当コーディネーター 芳賀 慶一郎
TEL 092-871-6631(内線2809)
FAX 092-866-2308
e-mail [email protected]