新一代测序平台文库制备技术简介

Roche 454 GS

Roche 454 GS简介

Roche 454 GS

454 GS 技术特点

• 测序通量：每次实验可产生450Mb的数据；

• 运行时间：每次实验运行10h；

• 序列读长：单条序列读长平均为450bp；

• 序列质量：单碱基准确率为99.995% ；

• 序列产量：平均每次实验可产生100万条序列。

454 GS应用特点

• 454 GS也许是目前所有的二代测序仪中读长最长的测序仪，最高可达1000bp，平均在400bp以上,可用于基因组框架的搭建。因此454 GS在全基因组测序、转录组测序、扩增子测序和宏基因组测序领域都有着良好的应用。

454 GS 技术原理

• Roche 454 GS是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统，依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；

• 将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。

焦磷酸酶级联化学反应

454 GS 技术流程

1.文库制备

2.乳滴PCR扩增（Emulsion PCR）

Emulsion PCR（油包水）乳滴PCR

将PCR反应物包被于“油包水”的乳化剂中，PCR扩增过程就可以在每一滴乳化剂内独立进行。

3. Bead Deposition

4.焦磷酸测序

5.图像获取、处理和数据分析

454 GS文库制备

• 454 GS的文库要求片段长度较长，一般在300~800bp左右，起始样品有gDNA, cDNA, or amplicons；

• 基因组de novo测序：DNA文库构建的方法；

• 转录组de novo测序：具有方向性的RNA文库构建方法。

Gnomegen DNA建库在454 GS平台上的应用特点

• 应用实例：-全基因学研究；-比较基因组学研究

• 特点：- 酶切打断；- 末端修复、加A尾和连接在同一试管内完成；- 再现性优化；- 更窄的片段长度范围且可重复性好。

• 优势：- 无需大量资本投入；- 可节约大量建库时间；- 产量高且可自动化操作；- 构建高质量文库。

Gnomegen DNA建库流程

Forward PrimerReverse Primer

AA

AA

AA

TA

AT

End Repair and dA Tailing

Ligase Adaptors

PCR

Fragmented DNA

Gnomegen RNA文库构建在454 GS上的应用特点

• 特点和优势：- 获得mRNA转录方向的信息—具有方向性的全转录组测序，有助于de novo拼接；- 简化的实验流程—单管反应，一天实验流程；- 初始量需求少—仅需10ng mRNA。

Gnomegen RNA文库构建流程（全转录组）

5’ Adaptor ligation

Reverse

Transcription

PCR

AAA

Fragmented RNA

5’ Adaptor

NNNNNN RT Primer

Forward Primer

Reverse Primer with barcode

454 GS应用领域

• Gnomegen系列文库制备试剂盒配合GS 454新一代测序仪可以为用户提供完整的文库构建解决方案。

基因组测序

转录组测序

扩增子测序

甲基化测序

454 GS应用举例

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