Upload
nguyenthuy
View
221
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
„GR. T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALĂ
REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT
ROLUL MICOTOXINELOR
HEPATOTOXICE ÎN ETIOPATOGENIA
BOLILOR HEPATICE CRONICE (CIROZĂ
HEPATICĂ, HEPATOCARCINOM)
CONDUCĂTOR: PROF. DR. ANCA TRIFAN
DOCTORAND: HUŢANAŞU ILIE CĂTĂLIN
IAŞI 2011
2
Introducere
România se află primul loc în Europa la mortalitate prin
ciroză hepatică cu 538 decese/100.000 locuitori (exceptând Federaţia
Rusă) şi pe unul din primele locuri din lume1. Acest lucru se
datorează în principal prevalenţei crescute a infecţiilor virale B şi C
şi consumului important de alcool pe cap de locuitor, unde România
ocupă locul 2 în Europa (după Republica Moldova) 2. Aproximativ
10% din totalul cirozele hepatice au o etiologie neprecizată, fiind
excluse infecţia virală, consumul de toxice (dintre care alcoolul
ocupă primul loc) şi autoimunitatea. În aceste cazuri, ciroza se
produce aparent fără factori de risc, evoluţia şi prognosticul lor
nedeosebindu-se însă de cea a formelor clasice. În acest context, se
impune căutarea altor factori de risc pentru boala hepatică cronică,
care să explice măcar în parte etiopatogenia acestor cazuri, foarte
numeroase în cazul ţării noastre.
Având în vedere tropismul recunoscut al AFB1 pentru ţesutul
hepatic, precum şi repetatele evidenţe de contaminare a alimentelor
de pe piaţa locală şi europeană, abordarea unei posibile relaţii între
consumul de alimente contaminate şi boala hepatică cronică este
perfect justificată. Aceasta cu atât mai mult cu cât obiceiurile
alimentare specifice ţării noastre includ consumul pe scară largă a
unor alimente cu risc maxim de contaminare, dintre care pe primul
loc se află porumbul şi derivatele sale. Noile obiceiuri alimentare
„importate” includ de asemenea consumul unor alimente cu risc
maxim de contaminare precum cafeaua şi produsele înrudite sau
alunele de pământ şi alte fructe oleaginoase.
Toate aceste considerente fac din aflatoxine, şi în particular
din AFB1, un important factor de risc pentru boala hepatică cronică
în zona noastră, care poate acţiona atât singur cât şi în combinaţie cu
ceilalţi factori binecunoscuţi (alcoolul şi virusurile). Este de
menţionat că prezenţa AFB1 în sângele pacienţilor a fost deja
raportată. În Taiwan, zonă considerată de risc maxim pentru
3
contaminarea cu micotoxine a alimentelor, aceasta a fost prezentă la
20,9% dintre participanţi la studiu, independent de prezenţa VHB, la
pacienţii fără ciroză 3.
Carcinomul hepatocelular (CHC) este a 5-a tumoră malignă din lume
ca frecvenţă, cu o incidenţă anuală de circa 550.000 cazuri şi o
mortalitate similară. Ultimele statistici arată o incidenţă în creștere,
fiind a 3-a cauză de mortalitate prin cancer şi prima cauză de deces la
pacientul cirotic4. Principalii agenţi etiologici ai CHC sunt
reprezentaţi de ciroză hepatică (CH)5, VHC, VHB, aflatoxina B1,
steato-hepatita non-alcoolică şi hiperinsulinismul6. Tratamentul CHC
este eficient doar în fazele incipiente ale bolii, însă cei mai mulţi
pacienţi sunt diagnosticaţi tardiv, când mijloacele terapeutice cu viză
curativă sunt depăşite 7.
AFB1 este considerată un factor etiologic principal în unele
zone ale lumii (Asia de Sud-Est şi Africa Sub-sahariană), numeroase
studii evidențiind rolul etiopatogenic cert al acestei micotoxine, atât
singură, cât şi în combinaţie cu VHB 8. Deşi ţara noastră nu face
parte din arealul considerat propice pentru dezvoltarea fungilor
toxigeni din genul Aspergillus în culturi (între 400 latitudine nordică
şi sudică), există multiple rapoarte ale prezenţe micotoxinelor în
produse vegetal de uz animal9 sau uman
10. Mare parte din hrana
populaţiei din mediul rural este produsă în propriile gospodării, fiind
apoi consumată sau comercializată fără o verificare micotoxicologică
prealabilă.
Având în vedere cultivarea extensivă a plantei care constituie
unul dintre cele mai bune substraturi pentru dezvoltarea Aspergillus
flavus – porumbul, precum şi aptul că aproape 50% din populaţie
trăieşte în mediul rural, este evidentă posibilitatea contaminării
recoltelor (în timpul culesului, dar mai ales în timpul păstrării) şi
ingestiei de cantităţi semnificative de micotoxine, cu un posibil
impact negativ asupra stării de sănătate a populaţiei.
Studiul retrospectiv prezentat în capitolul I arată o creştere
semnificativă, de circa 75% a numărului de cazuri diagnosticate în
IGH Iaşi în decursul a numai 3 ani.
Toate acestea impun efectuarea de cercetări pentru clarificarea
rolului aflatoxinelor în etiopatogenia hepatocarcinomului în ţara
4
noastră, cu atât mai mult cu cât există previziunea creșterii
semnificative a numărului de cazuri în următorii ani.
Luând în considerare studiile experimentale pe animale, studiile
de biologie moleculară efectuate pe tumorile hepatice rezecate de la
om şi studiile epidemiologice existente la acel moment privitoare la
micotoxine, Agenţia Internaţională pentru Cercetarea Cancerului
(IARC) a declarat încă din 1993 micotoxinele ca fiind sigur
cancerigene sau potenţial cancerigene după cum urmează11
:
- există dovezi suficiente pentru a declara carcinogenetice
pentru oameni mixturile de aflatoxinele întâlnite în natură
(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2) (Grup 1),
- există dovezi suficiente pentru a declara carcinogenetică
pentru oameni AFB1 (Grup 1),
- există dovezi suficiente în experimentele pe animale pentru a
declara carcinogenetice pentru animale mixturile de
aflatoxine întâlnit în natură (AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)
precum şi aflatoxinele B1, G1 şi M1,
- există date limitate în experienţele pe animale privind
carcinogenicitatea AFB2,
- datele obţinute din experimentele pe animale privind
carcinogenicitatea AFG2 sunt inadecvate,
concluzionând:
1. Aflatoxinele întâlnite în natură sunt carcinogenetice
pentru om (Grup 1).
2. AFM1 este posibil carcinogenetică pentru om (Grup
2A).
3. STC este un posibil carcinogen pentru oameni (Grup
2B).
5
PARTEA PERSONALA
Capitolul 1
Studiu observaţional descriptiv longitudinal al
etiologiei carcinomului hepatocelular în Nord-Estul
României
Scop. Scopul acestui studiu a fost de a determina principalele
etiologii ale cazurilor de CHC înregistrate în IGH în decursul
ultimilor 3 ani: VHB, VHC, infecțiile combinate (B+C şi B+D) şi
consumul de alcool. În paralel, s-au urmărit ponderea cazurilor de
CHC care nu au avut ca substrat ciroza hepatică, precum şi procentul
de cazuri la care nu a fot identificat un factor clar de risc pentru CHC
(dintre cele enumerate mai sus).
Material şi metodă. Studiul a fost realizat retrospectiv,
utilizând baza de date DRG ale cazurilor internate în IGH Iaşi între 1
ianuarie 2008 şi 31 decembrie 2010.
Au fost cuprinşi în studiu toţi pacienţii cu internare în regim
normal externaţi în perioada menţionată, în număr de 19.550, la care
s-a verificat în baza de date diagnosticul de externare (conform
raportării DRG). Având în vedere adresabilitatea deosebită a IGH
Iaşi, majoritatea pacienţilor (58,2%) au fost din judeţele limitrofe şi
40,3% au fost din judeţul Iaşi, lotul fiind reprezentativ pentru
populaţia regiunii studiate. Mediul urban a fost mai bine reprezentat,
de aici provenind 60% dintre pacienţi; raportul femei:bărbaţi a fost
de 1,12.
Au fost selectați pacienţii care prezentau în diagnosticul
principal sau între diagnosticele secundare la externare codul
hepatocarcinomului (C22.0), care au fost analizaţi mai departe în
vederea stabilirii agentului etiologic al bolii şi prezenţei cirozei
hepatice. Verificarea s-a făcut urmărind codurile specifice ale
virusurilor hepatitice B (B18.1) şi C (B18.2) sau ale infecţiilor
combinate: B+C (B18.7) şi B+D (B18.0). Prezenţa cirozei hepatice
6
s-a verificat urmărind codurile de diagnostic ale acesteia, atât pentru
etiologia alcoolică (K70) cât şi pentru etiologia virală (K74).
Datele au fost prelucrate utilizând SPSS v. 13, iar rezultatele
au fost exprimate procentual.
Rezultate şi discuţii. Din totalul de 18970 de pacienţi
internaţi în perioada 01.01.2008 – 31.12.2010, au fost externaţi cu
diagnosticul de CHC un număr de 849 de cazuri, reprezentând 4,47%
din totalul patologiei internate în IGH Iaşi. Numărul de cazuri a avut
o evoluţie crescătoare, de la 188 în 2008, la 339 în 2009 şi 322 în
2010.
Cea mai frecventă etiologie a CHC s-a dovedit a fi VHC,
prezent în 30,62% din totalul cazurilor. Se remarcă creșterea
ponderii VHC ca agent etiologic al CHC de-a lungul perioadei
studiate, de la 28,2% în 2008 la 34,16% în 2010 (Fig. 2).
Ciroza hepatică apărută pe fondul cirozei hepatice alcoolice a
fost următoarea cauză de CHC, fiind înregistrată în 22,05% din
cazuri, urmată de VHB şi asocierea consumului de alcool cu infecţia
virală B sau C, fiecare cu câte 17,43%.
Ponderea asocierii alcool+virus a crescut în 2009-2010 faţă
de 2008, în paralel cu scăderea etiologiei alcoolice, ca unic
determinant al procesului carcinogenetic, care a reprezentat a 2-a
cauză ca frecvenţă depistată pentru pacienţii noştri în perioada
menţionată. De menţionat este faptul că atunci când alcoolul a fost
singurul agent etiologic al CHC, acesta s-a dezvoltat întotdeauna pe
un proces de ciroză etanolică preexistent.
VHB a reprezentat o etiologie aflată într-o scădere relativă,
de la 19,7% în 2008 la 15,2% în 2010, deşi numărul absolut de cazuri
a prezentat o tendinţă de creştere, pe fondul creşterii numărului total
de cazuri de CHC.
Din totalul cazurilor de CHC înregistrate, 18,73% nu au
prezentat un proces precursor de ciroză hepatică, procent care
corespunde cu datele din literatură (10-20% din cazurile de hepatom
apar pe ficat necirotic), aproximativ 50% din aceste cazuri fiind
însoţite de prezenţa unei infecţii virale cronice B sau C.
7
Celelalte 50%, reprezentând 9,89% din totalul cazurilor de
hepatocarcinom înregistrate între 2008-2010 în IGH Iaşi au fost
caracterizate de absenţa unui proces de ciroză hepatică sau a altui
agent etiologic cunoscut, numărul acestora fiind în creştere.
Procentul de cazuri fără o etiologie certă depăşeşte net raportările din
literatură (5-6% pentru pacienţii fără ciroză12
), probabil datorită
lotului studiat – pacienţi internaţi într-un centru terţiar de
gastroenterologie, la care probabilitatea depistării hepatomului este
mult peste cea a clinicilor obişnuite.
În acest context, numărul mare de bolnavi cu
hepatocarcinom, o tumoră de o malignitate şi agresivitate
recunoscută, cu incidenţa egală cu mortalitatea, impune cercetarea
implicării aflatoxinelor ca agent etiologic.
Concluzii
1. Cazurile de carcinom hepatocelular au reprezentat 4,34%
din totalul patologiei diagnosticate în IGH Iaşi în perioada
1 ianuarie 2008 – 31 decembrie 2010, cu o tendinţă clară
de creştere.
2. Cea mai frecventă etiologie a fost reprezentată de VHC,
responsabil de circa 1/3 din cazurile diagnosticate.
3. Ciroza alcoolică este mai frecvent implicată în etiologia
CHC în populaţia studiată decât VHB.
4. Procentul de CHC dezvoltat pe ficat necirotic este
important, dar se înscrie în datele din literatură.
5. Circa 10% din cazurile de hepatocarcinom diagnosticate
sunt de etiologie neprecizată.
8
Capitolul 2
Model experimental de intoxicaţie acută şi cronică
cu aflatoxină B1 şi sterigmatocistină la pui
Scop. Scopul acestei etape a constat în evidenţierea
modificărilor clinice şi histologice induse de ingestia micotoxinelor
studiate.
Materiale şi metodă. Loturile de animale. S-au folosit pui broiler (Gallus gallus) în
vârstă de 4 săptămâni, cu greutate iniţială cuprinsă între 500-550 g.
Motivul alegerii acestora l-a constituit faptul că sunt varianta cel mai
frecvent folosită pentru producţia de carne la nivel industrial,
rezultatele obţinute la această rasă având astfel cea mai mare
importanţă practică. Puii au fost ţinuţi în incinte special amenajate, în
condiţii de mediu relativ constate: temperatură de 20-250C, umiditate
de 40-60%, expunere indirectă la lumina naturală timp de 12 ore/zi.
Hrana a constat din furaje specifice, de provenienţă şi calitate
verificate; apa a fost administrată ad libitum pe parcursul
experimentului.
Substanţe folosite. S-au folosit soluţii de AFB1 şi STC în
concentraţie cunoscută:
- AFB1 cristalină (Aldrich 856207), Sigma-Aldrich, SUA,
reconstituită în soluţie de metanol în concentraţie de 200 μg/ml. În
scopul diminuării expunerii animalelor folosite la doze semnificative
de metanol, soluţia de AFB1 a fost diluată suplimentar cu apă
distilată, fiind administrat un volum total de 5 ml de soluţie.
- STC cristalină (Sigma S3255, puritate peste 98%, CSS), Sigma-
Aldrich, SUA, reconstituită în soluţie de metanol în concentraţie de
900 μg/ml. În scopul diminuării expunerii animalelor folosite la doze
semnificative de metanol, soluţia de STC a fost diluată suplimentar
cu apă distilată, fiind administrat un volum total de 5 ml de soluţie.
- Metanol, apă distilată.
Microscopia optică. Prelevarea fragmentelor de ţesut s-a făcut
după analiza macroscopică a piesei. Acolo unde a fost cazul, s-a
9
prelevat din zonele care prezentau modificări macroscopice
evidente. Din fiecare organ studiat, s-au prelevat cel puţin 3
fragmente (mai multe, dacă existau multiple zone cu modificări
macroscopice sugestive). Fixarea s-a făcut în soluţie de
glutaraldehidă, fragmentele fiind ulterior înglobate în blocuri de
parafină. Secţionarea s-a făcut cu un microtom SL 45, dotat cu lame
Tisue-Tek Accu-Edge (secţiuni cu grosimea de 5 microni), iar
fixarea s-a făcut cu soluţie de fucsină bazică. S-au folosit coloraţii
multiple, în funcţie de parametrii urmăriţi: hematoxilină-eozină, PAS
(pentru glicogen), Gram (pentru bacterii), impregnaţie argentică
(pentru reticulină), iar examinarea s-a făcut cu un microscop optic
Olympus BX41 în lumină artificială.
Microscopia electronică. Imaginile de microscopie
electronică au fost obţinute folosind un microscop electronic de
scanare EDAX QANTA 200, utilizându-se următorii parametri:
- Putere de rezoluție:
- 3,0 nm pentru imagini cu electroni secundari (imagini in toate
cele trei moduri de funcționare);
- 4,5 nm pentru imagini cu electroni retrodifuzaţi;
- Tensiune de accelerare: 200 V – 30 kV;
- Mărire: 400.000X (mărire maximă 1.000.000X).
Secţiunile au fost pregătite cu ajutorul unui ultramicrotomului
LKB Ultratom III la o grosime de 500Ǻ, cu dimensiuni maxime de
3/4 cm (suprafaţa maximă 1200 mm2).
Protocolul studiului. Distribuția puilor s-a făcut în 5 loturi:
1. Lot 1 (martor) – 12 pui, la care s-au administrat 5 ml apă
distilată.
2. Lot 2 – 12 pui, la care s-au administrat 0,01 ml din soluţia AFB1
în metanol (200μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza
totală zilnică a fost de 2 μg.
3. Lot 3 – 12 pui, la care s-au administrat 0,1 ml din soluţia AFB1
în metanol (200μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza
totală zilnică a fost de 20 μg.
4. Lot 4 – 12 pui, la care s-au administrat 0,01 ml din soluţia STC în
metanol (900μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza totală
zilnică a fost de 9 μg.
10
5. Lot 5 – 12 pui, la care s-au administrat 0,1 ml din soluţia STC în
metanol (900μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza totală
zilnică a fost de 90 μg.
Administrarea substanţelor s-a făcut pe cale orală (prin intubare)
şi a fost zilnică, între orele 8 şi 9 dimineața. Dozele folosite pentru
reproducerea intoxicaţiei cronice au fost de 2 μg/kgc de AFB1 şi de
9 μg/kgc de STC, conform modelelor experimentale descrise anterior 13,14
, în timp ce pentru producerea efectelor acute s-au administrat
doze de 10 ori mai mari: 20 μg/kgc de AFB1 şi 90 μg/kgc de STC.
Durata administrării a fost de 3 săptămâni, cu menţiunea că
decesul a 4 pui din lotul cu intoxicaţie acută cu AFB1 în doză de 20
μg/kgc/zi s-a produs în prima săptămână. Toţi puii au fost sacrificaţi
la final, cu prezervarea ficatului, unor părţi din tubul digestiv
(stomac, intestin subţire, intestin gros), rinichilor şi pancreasului.
Examene efectuate:
- Cântărirea (înainte, în timpul şi după administrarea
micotoxinelor).
- Monitorizarea stării clinice şi a comportamentului general.
- Examene histologice şi bacteriologice la puii decedaţi – pentru a
exclude o altă cauză de deces.
- Examene histopatologice în microscopie optică ale tubului
digestiv, ficatului, pancreasului, rinichiului.
- Examene în microscopie electronică, pe probele de ţesut hepatic.
Analiza statistică a rezultatelor. Datele numerice (greutatea
puilor) au fost introduse într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS
Statistics v.19. Rezultatele au fost exprimate ca media ± deviaţie
standard (DS), iar diferenţele între loturi au fost comparate folosind
testul t-Student; valoarea p<0.05 a fost considerată cu semnificaţie
statistică. Corelaţia dintre rezultatele obţinute a fost stabilită prin
testul Pearson, fiind considerate semnificative valori ale
coeficientului de corelaţie (r) peste aflate între intervalele -1 – -0.3 şi
0.3 – 1. Corelaţia pozitivă a fost considerată slabă pentru r=0,3-0,5,
medie pentru r=0.5-0.7 şi puternică la r>0.7; valori corespondente au
fost considerate şi pentru corelaţia negativă. Pentru compararea
frecvențelor cu care un eveniment intervine, s-a folosit testul Fisher-
exact, valoarea p<0.05 fiind considerată semnificativă statistic.
11
Rezultate şi discuţii.
Greutatea medie a puilor. Toţi cei 60 de pui au fost cântăriţi
iniţial, distribuţia pe loturi fiind efectuată astfel încât greutatea medie
iniţială să nu prezinte diferenţe semnificative între loturi. Greutatea
medie iniţială a puilor a fost cuprinsă între 519,42±14,28 g şi
524,33±18,9 g, fără diferenţe semnificative statistic la compararea
loturilor între ele: p>0.05, în toate cazurile (tabelul 1).
Greutatea medie a puilor intoxicaţi cu micotoxine a înregistrat la
sfârşitul celor 21 de zile de administrare valori care au oscilat între
423 g şi 602 g, comparativ cu lotul martor care a cântărit în medie
635 g; au rezultat diferenţe negative semnificative la puii intoxicaţi,
cu limite de variaţie cuprinse între 33-212 g/pui.
Puii din lotul martor au crescut semnificativ în greutate în medie
cu 113,75 g în cele 3 săptămâni ale experimentului, creştere aflată în
limite normale pentru rasa de pui şi vârsta iniţiale (p=10-15
). Creştere
ponderală s-a înregistrat şi în loturile cu doze mici de micotoxine:
- lotul 2 – creştere medie de 45,5 g, înalt semnificativă statistic
(p=10-6
);
- lotul 4 – creştere medie de 65,5 g, înalt semnificativă statistic
(p=10-10
).
Creşterea a fost proporţională cu greutatea iniţială, valorile
iniţiale şi finale ale masei corporale prezentând o corelaţie pozitivă
medie pentru lotul 1 şi 4 (r=0.59, respectiv r=0.65), şi puternică
pentru lotul 2 (r=0.72).
Rezultatele obţinute arătă că un nivel mic de intoxicaţie zilnică
nu stopează creşterea în greutate a puilor, care îşi continuă
dezvoltarea morfologică, dar la un nivel suboptimal. Comparaţia cu
lotul martor arată o scădere de 11,03% a progresului ponderal la lotul
cu 2 μg/kgc/zi de AFB1 (p=10-10
) şi cu 7,56% la lotul cu 9 μg/kgc/zi
de STC (p=10-8
). Rezultatele sunt comparabile cu datele din
literatură, care apreciază o scădere a progresului ponderal la puii cu
intoxicaţie cronică cu micotoxine de circa 10% 15
.
Loturile de pui care au primit doze mari de micotoxine au
prezentat scădere ponderală faţă de începutul experimentului, pe
fondul unei reduceri semnificative a ingestiei de furaje, iar unii dintre
puii care au primit AFB1 în doză de 20 μg/kgc/zi au şi decedat.
12
Aceasta a fost semnificativă pentru toate aceste loturi, atât faţă de
martor, cât şi faţă de greutatea iniţială:
- lotul 3 – scădere a ponderală cu 13,5% faţă de greutatea iniţială,
proporţională cu acesta (corelaţie pozitivă puternică, r=0.81);
- lotul 5 - scădere a ponderală cu 7,51% faţă de greutatea iniţială,
de asemenea proporţional cu acesta (r=0.82).
Rezultatele demonstrează efectul metabolic profund al dozelor
mari de micotoxine, ca şi mortalitatea de 25% determinată de AFB1
în doze mari (crescută comparativ cu martorul, dar nesemnificativă
statistic; test Fisher-exact, p=0.09), observată şi în epidemiile
înregistrate la om. Se confirmă astfel că şi la pui, ca şi la om,
sensibilitatea la acţiunea AFB1 este individuală, animalele
reacţionând complet diferit la toxină (de la păstrarea unei stări
generale bune şi o scădere uşoară în greutate, la deces după numai 2
administrări).
Monitorizarea stării clinice şi a comportamentului general.
Puii cărora li s-au administrat cantităţi mici de AFB1 (2 μg/kgc)
şi STC (9 μg/kgc) şi nu au prezentat pe parcursul experimentului
modificări ale stării generale.
Puii din loturile care au primit doze mari de aflatoxină (20
μg/kgc) şi sterigmatocistină (90 μg/kgc) au acuzat o stare evidentă de
suferinţă, observată chiar după prima administrare în cazul AFB1 şi
după câteva zile, la anumiţi indivizii din lotul care a primit
sterigmatocistină. Semnele clinice s-au caracterizat prin apatie,
somnolenţă, adinamie, astazii şi ataxii, cifoză, horiplumaţie
(pierderea luciului penelor, care au devinit mate). La toţi puii lotului
cu 20 μg/kgc aflatoxină B1, s-a observat absenţa totală a apetitului,
ingluvia fiind complet lipsită de furaje. Un alt semn clinic evident
caracteristic a fost lipsa de vioiciune şi a mobilităţii puilor. După
câteva zile de la administrarea celor două micotoxine, modificările
clinice s-au accentuat, puii preferau decubitul şi acuzau sindrom de
imobilitate, stare de prostraţie, cu reducerea până la abolire a funcţiei
de relaţie. După 48 de ore de la prima administrare de AFB1, un pui
a murit, apoi un altul la 36 de ore, un al treilea după 6 zile şi încă
unul după 7 zile. Mortalitatea a fost înregistrată numai la puii care au
13
fost intoxicaţi cu AFB1 în doză de 20 μg/kgc, şi nu a depins de
greutatea lor de la iniţierea experimentului. La puii decedaţi în prima
săptămână, s-au efectuat examenul histopatologic şi bacteriologic a
multiple organe (os, ficat, cord, măduvă osoasă), care nu au
evidenţiat prezenţa microorganismelor aerobe mezofile, astfel încât
decesul s-a datorat ingestiei de aflatoxină.
Experimentul a demonstrat că a existat un grad accentuat de
heterogenitate al indivizilor din toate loturile care au ingerat
micotoxine, unii dintre aceşti decedând rapid iar alţii supravieţuind
toată perioada. După cum s-a observat şi în practica zilnică
(zootehnie), nu există semne clinice evidente în cazul ingestiei
dozelor mici de micotoxine, consecinţele acestora fiind mult mai
subtile şi manifestându-se pe termen lung: deficit de creştere
ponderală, care va duce în cele din urmă la scăderea marcată a
productivităţii (principalul scop al creşterii puilor broiler, folosiţi în
experiment, este cel al producţiei de carne).
Examene histopatologice în microscopie optică. Semnele
clinice severe manifestate de puii cărora li s-au administrat AFB1 şi
STC în doze mari au fost expresia unor leziuni grave caracteristice,
de distrofie grasă hepatică şi renală care se întâlneşte constant în
intoxicaţia cu micotoxine hepato-nefrotoxice.
Examenul macroscopic efectuat la necropsia puilor a evidenţiat
hipotrepsia acestora (severă la cei cu dozele mari de micotoxine),
distrofie grasă hepato-renală şi o accentuată supradimensionare a
glandelor suprarenale.
Modificările morfopatologice induse experimental prin
administrarea orală de aflatoxină B1, au fost evidente, unele
caracteristice, iar intensitatea lor s-a diferenţiat în funcţie de doză şi
perioada de ingerare a substanţei toxice. Rezultatele obţinute în cazul
intoxicaţiei puilor de carne cu doza de 2 μg/kgc aflatoxină B1, au
arătat că substanţa s-a comportat ca un compus toxic care a afectat în
primul rând ţesuturile cu care a venit în contact. În urma
administrării micotoxinelor, s-a constatat o activare a secreţiei de
mucus la nivelul mucoasei digestive, evidentă prin creşterea
numărului şi dimensiunilor celulelor caliciforme de la nivelul
14
intestinului. Această modificare, cel mai probabil o încercare de
adaptare a mucoasei la prezenţa toxicului, a avut drept scop probabil
scăderea absorbției acestuia şi s-a instalat încă din primele zile de
administrare, fiind prezentă şi la puii decedaţi prematur din lotul 3.
Ulterior, această tulburare, predominant fiziologică, s-a complicat cu
o inflamaţie catarală la acest nivel, constatându-se creşterea
numărului de polimorfonucleare şi mononucleare din mucoasă şi
submucoasă. Infiltratul inflamator mixt, a avut intensităţi variabile şi
a interesat în special proventriculul şi duodenul.
Cel mai afectat organ a fost ficatul, leziunile induse fiind distrofia
grasă a hepatocitelor şi vacuolizarea acestora, prin apariţia de
depozite lipide de mari dimensiuni, care au împins nucleul spre
periferie. S-a mai constatat prezenţa în citoplasmă a unui material
eozinofil depozitat în cantităţi variabile, care în coloraţie PAS s-a
dovedit a fi glicogen. Nemaifiind utilizat în arderea lipidelor şi
neputând fi exteriorizat (transportul transmembranar este profund
afectat în intoxicaţie cu AFB1), glicogenul a fost depozitat în
citoplasma celulelor hepatice. Modificările de degenerescenţă grasă
au fost întâlnite şi la nivelul rinichilor, deşi într-o măsură mai mică
decât în ficat. La puii decedaţi în prima săptămână, degenerarea
hepato-renală a fost foarte accentuată, iar la nivelul ficatului s-a
constatat un extins proces de necroză, cu relativ puţine elemente
inflamatorii şi colapsul reţelei de reticulină (evidenţiat prin coloraţia
Gomori). Cel mai probabil, cauza decesului a fost insuficienţa
hepatică fulminantă, care a avut ca substrat histopatologic necroza
extinsă a parenchimului hepatic.
În următoarele două săptămâni experimentale, tabloul lezional
hepatic a prezentat o creştere a elementelor inflamatorii, predominant
mononucleare, dar şi un important proces de fibrogeneză care a
favorizat instalarea în timp a fibrozei hepatice, evidenţiată prin
coloraţia van Gieson. Deşi degenerarea grasă şi necroza
caracterizează leziunile histologice induse de intoxicaţia acută cu
AFB1, la puii supravieţuitori s-a observat într-o proporţie importantă
acest proces de fibrogeneză accelerată, succesiunea inflamaţie –
necroză – fibroză fiind caracteristică la toate speciile animale,
inclusiv la om. Această constatare ridică problema unei eventuale
15
intervenţii patogenice a intoxicaţiei acute cu aflatoxine şi la alte
specii animale, care să contribuie pe termen lung la procesul
cirogenetic.
La nivelul pancreasului, s-a constatat o uşoară creştere în volum
pe seama degenerescenței grăsoase, dar fără aspecte inflamatorii sau
sugestive pentru fibroză la examenul microscopic. Modificările
induse au părut a avea predominant consecinţe funcţionale, fiind
dependente de doza administrată. La dozele mici de (AFB1 2 μg/kgc
şi STC 9 μg/kgc), s-a înregistrat diminuarea secreţiei celulare, fiind
observată diminuarea numărului şi dimensiunilor veziculelor
excretorii de la polul apical, alături de apariţia unor vacuole de natură
lipidică, de dimensiuni şi formă variabile. Efectul a fost invers la
dozele mari, care au declanşat o creştere a activităţii secretorii, cu
reducerea cantitativă şi numerică a vacuolelor citoplasmatice din
celulele acinoase.
Trebuie subliniat că nici una dintre modificările histologice
hepatice constatate nu sunt specifice intoxicaţiei cu micotoxine, orice
toxic hepatic şi unii agenţi infecţioşi fiind capabili să le reproducă.
Această constatare îndepărtează posibilitatea identificării unui
marker histopatologic specific de intoxicaţie cu AFB1, dar subliniază
posibilitatea ca această să acţioneze împreună cu alţi factori, toxine
sau virusuri, pentru producerea aceleiaşi consecinţe: fibroza hepatică.
Sterigmatocistina, ca precursor al aflatoxinei B1, este mai puţin
toxică decât aceasta, şi din acest motiv efectele biologice pe care le
manifestă faţă de organele afectate sunt mai puţin severe. În general,
modificările produse de doza de 90 μg/kgc au fot similare cu cele
determinate de AFB1 în doza de 20 μg/kgc, dar mai atenuate, mai
ales la nivelul componentei de necroză şi fibroză hepatică.
Examenul probelor de ţesut hepatic în microscopie
electronică. Deşi în microscopia optică erau evidente doar leziuni
„obişnuite” de steatoză hepatică, imaginile obţinute în microscopia
electronică au demonstrat că chiar şi dozele mici de micotoxine sunt
capabile să provoace dezintegrarea citoplasmei la marea majoritate a
hepatocitelor, cu distrugerea organitelor celulare, dar fără a afecta
structura nucleului. Imaginile electronomicroscopice au evidenţiat
16
aspectul spongios al citoplasmei hepatocitelor datorat vacuolelor
lipidice, variabile ca dimensiuni şi formă. Organitele celulare s-au
distins cu dificultate în structura citoplasmei, iar schiţa conţinutului
lor a fost foarte greu de observat. Numărul de mitocondrii a fost
crescut, ca şi dimensiunile lor, uneori constituindu-se adevărate
„megamitocondrii”. Reticulul endoplasmic a fost mai puţin afectat de
substanţele toxice ingerate, iar aparatul Golgi a fost redus ca
dimensiuni.
La administrarea de doze mari de AFB1, aceleaşi vacuole au fost
observate şi în structura nucleilor, care au etalat modificări
ireversibile, ei fiind surprinşi adesea omogenizaţi şi în diferite faze
de necrobioză.
Doze mici de sterigmatocistină (9 μg/kgc) au produs în structura
ficatului modificări asemănătoare celor observate la puii care au
ingerat 2 μg/kgc aflatoxină. Citoplasma celulelor hepatice a
prezentat o structură dezintegrată, în care s-a observat un număr
sporit de mitocondrii, ce au avut şi un volum considerabil mai mare
constituindu-se în adevărate megamitocondrii. Sterigmatocistina
administrată în doze mari (90 μg/kgc ), a produs modificări mult mai
severe la nivelul hepatocitelor; s-a observat un proces accentuat de
dezintegrare a citoplasmei, cu formarea de vacuole lipidice şi
creşterea numerică şi dimensională a mitocondriilor. În marea lor
majoritate, nucleii au fost surprinşi în necrobioză.
Aceste profunde modificări structurale explică tulburările
funcţionale ale ficatului, simptomatologia gravă şi decesul unor pui
le-au prezentat pe tot parcursul experimentului.
Se poate afirma că cele două micotoxine acţionează oarecum
identic, la doze similare. Pe fondul unor tulburări metabolice severe,
ele au determinat profunde modificări structurale gastrointestinale,
renale, şi mai ales hepatice. Chiar dacă acestea au fost caracteristice,
anomaliile induse au cuprins atât citoplasma cât şi nucleul,
compromiţând funcţia şi viabilitatea celulelor.
17
Concluzii. 1. Dozele mici de micotoxine au ca efect compromiterea
procesului de creştere al puilor, acesta desfăşurându-se
suboptimal.
2. Dozele mari din micotoxinele administrate afectează grav
dezvoltarea puilor, ducând la hipotrepsie generalizată, cu
inversarea procesului de creştere.
3. Sensibilitatea indivizilor la acţiunea AFB1 este variabilă, rata
deceselor înregistrate în rândul animalelor de experienţă fiind
similară cu cea observată în epidemiile umane de aflatoxicoză
acută.
4. La nivelul tubului digestiv şi pancreasului, modificările
induse sunt uşoare, având predominant un caracter funcţional.
5. AFB1 şi STC determină leziuni de degenerescenţă grasă la
nivelul ficatului şi rinichiului, iar în doză mare produc
necroză hepatică semnificativă şi activează mecanismele
fibrogenetice, ducând la fibroză semnificativă.
6. Dezintegrarea citoplasmei, cu alterarea structurii şi funcţiilor
organitelor celulare apar chiar şi după administrarea de doze
mici de micotoxine.
7. Dozele mari de micotoxine alterează grav şi ireversibil
funcţia celulară, determinând necrobioza nucleilor şi moartea
celulară.
Capitolul 3
Evaluarea gradului de ingestie al micotoxinelor
prin metoda chestionarului alimentar
Scop. Stabilirea frecvenței consumului alimentelor cu risc
major de contaminare directă (cele în care se dezvoltă fungii
toxigeni) şi a celor cu risc de contaminare indirectă (produse de
origine animală) la un lot de pacienţi fără afectare hepatică (martor),
cu ciroză hepatică (CH) şi cu carcinom hepatocelular (CHC). Având
18
în vedere obiceiurile alimentare diferite şi accesul total diferit la
alimente de calitate verificată ale locuitorilor din mediul urban faţă
de cei din mediul rural, s-a urmărit în mod special identificarea
profilului de risc în funcţie de mediul de provenienţă.
Materiale şi metodă. Loturile de studiu. În studiu au fost incluşi 166 de
participanţi, internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi
Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.
Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi
excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat
consimțământul informat de participare la studiu şi au completat
chestionarul de frecvenţă alimentară, după care s-a recoltat sânge şi
urină pentru determinarea probelor biologice.
Toţi participanţii la studiu au primit un formular de
informare succintă asupra originii micotoxinelor, efectului
acestora asupra stării de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea
intoxicaţiei cronice.
Criteriile de includere au fost următoarele:
1. semnarea consimțământului informat
2. absenţa modificărilor importante în stilul de alimentaţie în
ultimul an;
3. stabilirea gradului de afectare hepatică, prin investigaţii
specifice, efectuate în clinică;
4. investigarea completă a funcţiei hepatice şi a etiologiei
afecțiunii hepatice (pentru participanţii cunoscuţi cu CH sau
CHC);
5. completarea corectă şi completă a CFA.
Criteriile de excludere au fost reprezentate de:
1. lipsa unei stadializări corecte a bolii hepatice (care ar fi dus la
dificultăţi de încadrare a pacienţilor în loturile de studiu);
2. declararea unor modificări importante în stilul de alimentaţie,
efectuate în ultimul an;
3. patologie asociată care ar fi determinat dificultăţi în
completarea corectă a chestionarului (boli asociate cu
tulburări ale memoriei).
19
Pe baza criteriilor de excludere, 18 pacienţi care au completat
iniţial chestionarul alimentar şi cărora li s-au recoltat probe biologice
au fost excluşi din studiu, datorită prezenţei afectării hepatice cronice
care nu a putut şi încadrată ca CH sau CHC, făcând imposibilă
încadrarea lor ulterioară în grupele de pacienţi urmărite. La acești pacienţi, nu s-au realizat determinările de micotoxine în lichidele
biologice.
Cei 166 de participanţi rămaşi au fost încadraţi în 3 loturi, după
cum urmează (Fig.1):
1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care
examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi
biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus
prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte
patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.
2. Lotul 2 (CH) – 58 de participanţi (34M, 24F), la care
diagnosticul de CH a fost stabilit pe baza criteriilor:
- anamnestice – decelarea unui factor etiologic (virus, consum
important de alcool), existenţa diagnosticului anterior de CH
(stabilit în IGH sau într-o altă clinică de specialitate);
- clinice – semne de etilism cronic (eritroză facială, hipertrofie
parotidiană bilaterală, contractură Dupuytren), semne cutanate
(icter, steluţe vasculare, eritroză palmară, circulaţie colaterală),
hepatomegalie, splenomegalie, edeme, prezenţa complicaţiilor
cirozei (ascită, encefalopatie hepatică, hemoragie digestivă
superioară, etc);
- imagistice – aspect ecografic nodular al ficatului, semne de
hipertensiune portală, ascită, etc.
- biologice – prezenţa sindroamelor hepatopriv, colestatic, de
hiperreactivitate mezenchimală, hepatocitolitic; evidenţierea
hipersplenismului hematologic; markeri virali pozitivi; indicatori
biologici ai consumului cronic exagerat de alcool (creşterea
izolată a GGT, macrocitoză, raport TGO:TGP>2), probe
biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei, bolii
Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune, etc.
3. Lotul 3 (CHC) – 53 de participanţi (34M, 19F), la care
diagnosticul de CHC a fost stabilit pe baza criteriilor:
20
- anamnestice – diagnosticul anterior de CH (bine argumentat),
decelarea unui factor etiologic cunoscut (virus, alcool),
degradarea recentă a stării clinice la un cirotic anterior
compensat, etc.
- clinice – semne de CH, prezenţa complicaţiilor cirozei recent
instalate, fără un factor precipitant identificabil, apariţia durerii
abdominale, anorexia, scăderea ponderală, prezenţa trombozelor
venoase, etc.
- imagistice – semne de hipertensiune portală, semne de
decompensare a funcţiei hepatice, tromboza venei porte sau a
venelor suprahepatice, nodul hepatic evidenţiat ecografic, la care
2 metode imagistice au evidenţiat hipervascularizaţia de timp
arterial, cu wash-out rapid în faza venoasă);
- biologice – prezenţa sindroamelor de afectare hepatică cronică;
markeri virali pozitivi; creşterea α-fetoproteinei serice (AFP);
probe biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei,
bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune,
etc.
Fig. 1. Structura loturilor de pacienţi
Chestionarul de frecvenţă alimentară. Având în vedere
scopul prezentului studiu – evaluarea aportului alimentar de
micotoxine ca factor de risc în patologia umană, chestionarul de
frecvenţă alimentară cu caracter retrospectiv s-a impus ca fiind
singura metodă viabilă de lucru, datorită multiplelor avantaje pe care
le oferă:
21
- evaluează obiceiurile alimentare pe o perioadă lungă de
timp, necesar pentru ca expunerea la cantităţi mici de
micotoxine să determine alterarea stării de sănătate;
- alimentele posibil contaminate cu micotoxine îndeplinesc
toate condiţiile necesare includerii lor într-un CFA;
- prezenţa micotoxinelor în alimentul finit nu depinde de
modul de preparare al acestuia (care nu este relevat printr-
un CFA);
- permite combinarea datelor de ordin calitativ cu cele de
ordin cantitativ.
Cercetarea extensivă a datelor din literatură nu a dus la
identificarea nici unui model de chestionar alcătuit cu scopul de a
verifica gradul de ingestie a micotoxinelor, care să fie validat
anterior.
Chestionarul administrat pacienţilor a fost unul de tip
calitativ şi a urmărit depistarea obiceiurilor alimentare ale
participanţilor în cursul anului precedent, fiind excluşi pacienţii care
au relatat iniţial modificări semnificative ale dietei în această
perioadă. Întrebările au fost alcătuite în funcţie de grupele de
alimente şi de probabilitatea contaminării acestora cu micotoxine,
fiind grupate după cum urmează:
- alimente cu risc mare de contaminare, în care s-a demonstrat
posibilitatea dezvoltării speciilor de Aspergillus producătoare de
AFB1: porumb şi derivate, condimente, cafea, fructe oleaginoase
(nuci), fructe uscate, cereale, seminţe uleioase uscate;
- alimente cu risc mediu de contaminare, în care micotoxinele
ajung indirect sau sub formă de metaboliţi: carne şi produse din
carne, lactate, ouă.
Chestionarul a urmărit tipul de alimente consumate (calitativ)
şi a cuprins 23 de întrebări cu răspuns unic (de tip „complement
simplu”), structurate pe două domenii:
- referitoare la alimentele cu risc major de contaminare – 11
întrebări;
- referitoare la alimentele cu risc mediu de contaminare – 12
întrebări.
22
Întrebările aparţinând celor două domenii au fost intercalate.
Au existat 6 variante de răspuns (A-E), astfel structurate încât să
releve o diferenţă netă:
- răspunsurile A, B şi C au relevat un consum frecvent (de la
câteva prize pe zi la minim o priză la două zile);
- răspunsurile C, D şi E au relevat un consum rar, de maxim
1-2 prize pe săptămână.
Răspunsul din categoria A-C a fost considerat ca semnificând
un consum frecvent, iar răspunsul din categoria D-F a fost considerat
ca semnificând un consum rar.
Analiza statistică a rezultatelor. Rezultatele înregistrate au
fost introduse într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics
v.19. Semnificaţia statistică a diferenţelor constatate s-a verificat prin
testul χ2 fără corecţie Yates sau testul Fisher-exact (în funcţie de
numărul de cazuri implicate), iar valoarea p<0.05 a fost considerată
cu semnificaţie statistică. Pentru compararea valorilor numerice s-a
folosit testul t-Student, valoarea p<0.05 fiind considerată cu
semnificaţie statistică.
Rezultate şi discuţii.Vârsta medie a pacienţilor din lotul
martor a fost de 52,4±7,6 ani, fără diferenţe semnificative faţă de
pacienţii din lotul cu CH, care au avut o vârstă medie de 54,6±7,1 ani
(p=0.13). Vârsta medie a pacienţilor din lotul cu CHC a fost de
57,8±8 ani, semnificativ mai mare decât în lotul martor (p=0.005)
sau în lotul cu CH (p=0.01).
Din totalul de 166 de participanţi şi 1826 de răspunsuri culese
cu ajutorul chestionarului la întrebările specifice, un procent de
19,87% dintre participanţi au declarat un consum frecvent de
alimente cu risc major de contaminare.
Analizând rezultatele CFA, s-a constatat că în lotul martor s-a
înregistrat cel mai important consum de alimente cu risc maxim de
contaminare, de 22,81% (Fig. 2), în vreme ce alimentele cu risc
mediu ce decontaminare au fost consumate frecvent de circa 50%
dintre pacienţii lotului martor. Acest rezultat este explicabil prin
faptul că un număr important de alimente cu risc major de
23
contaminare (fructele oleaginoase, provenite numai din import;
fructele uscate; semințele uleioase uscate; condimentele de tipul boia
de ardei, paprika, turmeric etc.) nu fac parte din alimentaţia uzuală a
populaţiei, mai ales a celei din mediul rural.
Pacienţii din lotul cu CH au prezentat un nivel similar de
consum frecvent al alimentelor cu risc maxim de contaminare, de
18,97%, fără o diferenţă semnificativă statistic faţă de primul lot,
p=0.09. Ca şi în cazul acestuia, aproximativ 50% au declarat un
consum frecvent de alimente cu risc mediu de contaminare,
alimentele din acest grup fiind în general de origine animală.
Pacienţii din lotul cu hepatocarcinom au consumat alimente
predispuse la contaminarea cu micotoxine cu o frecvenţă de 20,5%,
situându-se între lotul martor şi cel cu CH, dar fără diferenţe statistic
semnificative faţă de aceştia. În acelaşi timp însă, au consumat în
proporţia cea mai mare alimente cu risc mediu de contaminare
aproximativ, 2/3 declarând un consum frecvent al acestora; diferenţa
este înalt semnificativă statistic, atât faţă de lotul martor (p=10-6
), cât
şi faţă de pacienţii cirotici (p=10-4
) (Fig. 6). Aceste diferenţe
importante sunt cel mai probabil efectul prezenţei bolii, confirmând
faptul că prezenţa unei afecţiuni hepatice cronice cunoscute are drept
efect o schimbare a stilului alimentar al pacienţilor. În marea
majoritate a cazurilor, hepatomul s-a dezvoltat pe o ciroză hepatică
preexistentă, care evolua la pacienții respectivi de o perioadă mai
îndelungată.
Cum pentru cei mai mulţi pacienţi ideea de „regim alimentar”
echivalează cu reducerea cantităţii de sare şi creşterea consumului de
vegetale proaspete, este posibil ca mulţi dintre componenţii lotului cu
CHC să fi adoptat o astfel de dietă. Neprezentând nici un risc pentru
contaminarea cu aflatoxine, fructele şi legumele verzi nu au fost
cuprinse în chestionarul administrat pacienţilor. Datele obţinute din
chestionarul alimentar sunt sintetizate în Fig. 2 şi Fig. 3, şi nu
confirmă un rol semnificativ al aportului alimentar de micotoxine,
care să intervină semnificativ în procesul de carcinogeneză hepatică.
24
Fig. 5. Evoluţia frecvenţei consumului de alimente cu Fig. 6. Evoluţia frecvenţei consumului de alimente cu
risc mediu de contaminare la cele trei loturi risc major de contaminare la cele trei loturi
Nu s-au constatat diferenţe semnificative legate de sexul
participanţilor între tipul de alimente consumate, la nici unul dintre
loturi.
La nivelul întregului lot de pacienţi, au existat diferenţe
importante între mediul rural şi cel urban, care nu s-au menţinut însă
la analiza pe loturi (datorită numărului mai mic de subiecţi analizaţi).
Astfel, pacienţii din mediul urban au declarat în proporţie de 57% un
consum de alimente de provenienţă animală (cu risc mediu de
contaminare), comparativ cu cei din mediul rural (50,3%), diferenţa
fiind înalt semnificativă statistic, p=0.0035 (Fig. 7). În opoziţie,
pacienţii din mediul rural au prezentat un consum semnificativ mai
mare de alimente cu risc major de contaminare decât cei din mediul
urban (Fig. 8). Acest fapt poate fi explicat prin particularităţile
culinare specifice celor două zone (cel mai probabil printr-un consum
mai mare de porumb şi derivate – mămăligă, în mediul rural), dar
reprezintă şi o informaţie foarte utilă în vederea instituirii unor
măsuri active de depistare şi combatere a contaminării cu micotoxine
a alimentelor.
Cea mai importantă problemă legată de acurateţea datelor
colectate printr-un chestionar de frecvenţă alimentară este
dependenţa de memoria pacientului. De asemenea, exprimarea
subiectivă a pacientului privind modul său de alimentaţie, precum şi
p=0.17
%
%
25
o serie întreagă de alţi factori de moment (stresul indus de spitalizare,
dispoziţia de moment, gradul de afectare a stării generale determinat
de boala de bază, modul de interacţiune cu personalul medical etc.)
pot influenţa răspunsurile date de pacienţi, crescând gradul de
incertitudine al datelor declarate.
În ceea ce priveşte chestionarul folosit în acest studiu, există
doi importanţi factori de eroare: aproximarea cantităţii de toxine
ingerate (nu cunoaştem ce cantitate de alimente presupus
contaminate s-a consumat şi care era gradul lor de contaminare) şi
însăşi incertitudinea prezenţei contaminării alimentelor consumate.
Metoda are însă şi avantajul că se bazează pe determinarea
obiceiurilor alimentare ale pacientului – iar acestea au tendinţa să fie
stabile în timp. Corelată cu patologia existentă, prezenţa sau absenţa
altor factori de risc şi eventual nivelul de micotoxine în sângele
pacienţilor, se poate dovedi utilă pentru aprecierea globală a stilului
de alimentaţie ca factor de risc pentru patologia urmărită.
Concluzii. 1. Consumul frecvent de alimente cu risc maxim de contaminate cu
micotoxine a fost declarat de 1 din 5 participanţi.
2. CFA nu a confirmat un rol important al micotoxinelor în
producerea hepatocarcinomului, frecvenţa consumului de
alimente cu risc major de contaminare fiind medie la aceşti
pacienţi.
3. Prezenţa bolii hepatice cronice are un impact important asupra
stilului de alimentaţie al pacienţilor.
4. Produsele de origine animală, care au un risc mediu de
contaminare cu micotoxine, sunt consumate mai frecvent în
mediul urban.
5. Pacienţii din mediul rural au un consum semnificativ crescut de
alimente cu risc maxim de contaminare faţă de cei din mediul
urban.
26
Capitolul 4
Determinarea micotoxinelor in produse biologice
provenitede la pacienți cu ciroză hepatică
Scop. Identificarea prezenţei şi dozarea concentraţiei AFB1 şi
STC în produsele biologice (sânge şi urină) provenite de la pacienţi
diagnosticaţi cu ciroză hepatică. În cazul prezenţei acestora, s-au
urmărit corelaţia cu nivelul AFP şi al enzimelor hepatice de citoliză
şi colestază.
Materiale şi metodă.
Loturile de studiu. Studiul a fot efectuat pe un lot de 58 de
pacienţi cirotici, care a fost comparat cu un lot de control de 55 de
pacienţi fără afectare hepatică. Participanţii a studiu au fost recrutaţi
dintre pacienţii internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi
Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.
Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi
excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat
consimțământul informat de participare la studiu, după care li s-a
recoltat sânge şi urină pentru determinarea probelor biologice.
Toţi participanţii la studiu au primit un formular de
informare succintă asupra originii micotoxinelor, efectului
acestora asupra stării de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea
intoxicaţiei cronice.
Criteriile de includere au fost următoarele:
6. semnarea consimțământului informat
7. absenţa modificărilor importante în stilul de alimentaţie în
ultimul an;
27
8. stabilirea gradului de afectare hepatică, prin investigaţii
specifice, efectuate în clinică;
9. investigarea completă a funcţiei hepatice şi a etiologiei
afecțiunii hepatice (pentru participanţii cunoscuţi cu CH sau
CHC);
10. completarea corectă şi completă a CFA.
Criteriile de excludere au fost reprezentate de:
4. lipsa unei stadializări corecte a bolii hepatice (care ar fi dus la
dificultăţi de încadrare a pacienţilor în loturile de studiu);
5. declararea unor modificări importante în stilul de alimentaţie,
efectuate în ultimul an;
6. patologie asociată care ar fi determinat dificultăţi în
completarea corectă a chestionarului (boli asociate cu
tulburări ale memoriei).
Pe baza criteriilor de excludere, 18 pacienţi cărora li s-au recoltat
iniţial probe biologice au fost excluşi din studiu, datorită prezenţei
afectării hepatice cronice, dar care nu a putut şi încadrată ca CH. La
acești pacienţi, nu s-au realizat determinările de micotoxine în
lichidele biologice.
Structura celor 2 loturi a fost următoarea (Fig.1):
1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care
examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi
biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus
prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte
patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.
2. Lotul 2 (CH) – 58 de participanţi (34M, 24F), la care
diagnosticul de CH a fost stabilit pe baza criteriilor:
- anamnestice – decelarea unui factor etiologic (virus, consum
important de alcool), existenţa diagnosticului anterior de CH
(stabilit în IGH sau într-o altă clinică de specialitate);
- clinice – semne de etilism cronic (eritroză facială, hipertrofie
parotidiană bilaterală, contractură Dupuytren), semne cutanate
(icter, steluţe vasculare, eritroză palmară, circulaţie colaterală),
hepatomegalie, splenomegalie, edeme, prezenţa complicaţiilor
cirozei (ascită, encefalopatie hepatică, hemoragie digestivă
superioară etc);
28
- imagistice – aspect ecografic nodular al ficatului, semne de
hipertensiune portală, ascită etc.
- biologice – prezenţa sindroamelor hepatopriv, colestatic, de
hiperreactivitate mezenchimală, hepatocitolitic; evidenţierea
hipersplenismului hematologic; markeri virali pozitivi; indicatori
biologici ai consumului cronic exagerat de alcool (creşterea
izolată a GGT, macrocitoză, raport TGO:TGP>2), probe
biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei ereditare,
bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune
etc.
Determinarea parametrilor biologici. Recoltarea probelor
biologice s-a efectuat în dimineaţa primei zile de spitalizare, odată cu
probele biologice recoltate pentru evaluarea obişnuită a pacientului
internat. Recoltarea s-a făcut „a jeun”, practic la maxim două ore de
la internare, astfel încât rezultatele dozărilor micotoxicologice să
ofere detalii privind ingestia de micotoxine anterioară internării, şi nu
cea petrecută în timpul spitalizării.
De la toţi pacienţii au fost recoltate 20 ml de sânge periferic
pe EDTA şi 100 ml de urină în recipient steril. Determinările
biologice uzuale au fost efectuate în cadrul laboratorului de analize
medicale SYNEVO Iaşi, acreditat RENAR, probele determinate fiind
următoarele:
- enzimele de citoliză hepatică (TGP, TGO) şi de colestază
(FA, GGT) – folosind metoda chimiei umede, pe analizor Hitachi;
- AFP – folosind ca metodă de dozare
electrochemiluminiscenţa pe analizor Modular E 170;
- markerii virali hepatici (Ac VHC, Ag HBs, Ac HBc, Ac
VHD) – determinaţi prin electrochemiluminiscenţă pe analizor
Modular E 170, cu confirmarea rezultatelor slab pozitive sau
echivoce prin metoda Imunoblot (Western blotting).
Determinarea micotoxinelor. Detecţia micotoxinelor în
sângele şi urina pacienţilor s-a efectuat prin metoda HPLC,
considerată la momentul actual standardul de aur pentru
determinările cantitative ale micotoxinelor în substraturi variate.
Determinările s-au efectuat în cadrul laboratorului de cromatografie
29
al Facultăţii de Farmacie a Universităţii de Medicină şi Farmacie
„Gr. T. Popa” Iaşi.
Probele de sânge recoltate au fost centrifugate la temperatura
camerei folosind o centrifugă de tip Nahita 2600 6x15ml, timp de 15
minute la 4000 rotaţii/minut. Plasma a fost apoi separată în eprubete
sterile şi păstrată la temperatura de – 200C până la efectuarea
determinărilor propriu-zise. Probele de urină au fost congelate la –
200C, până la efectuarea determinărilor micotoxicologice.
Principiile metodei de lucru au fost descrise detaliat în partea
generală, în cele ce urmează fiind prezentate materialele folosite şi
aspectele specifice al determinărilor efectuate pe produse biologice.
Materiale folosite:
- balanţă analitică XA 110;
- baie de ultrasunete Ultra-Sonic RA-U3;
- micro-seringă Hamilton;
- cromatograf de lichide HP 1090 Series II, echipat cu detector cu
multidiode UV-VIS şi detector
de fluorescenţă;
- coloană cromatografică Zorbax C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm);
- standard aflatoxină B1 şi sterigmatocistină (Sigma-Aldrich);
- coloane SPE C18 (Lida, Manufacturing Corp.);
- hârtie de filtru cantitativă (Schleicher & Schuell MicroScience);
- acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Haën);
- cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich);
- metanol Chromasolv R (puritate HPLC, Riedel de Haën)
- acid acetic glacial 99,99% (Sigma-Aldrich);
- sulfat de sodiu (A.C.S. Reagent, Sigma-Aldrich);
- apă (puritate HPLC, Merck);
- fază mobilă, reprezentată de un amestec acetonitril:apă:acid acetic
în raport de 99:99:2.
Tehnica de lucru. Probele de analizat au fost reprezentate de
5 ml de plasmă şi 50 ml de urină, care au fost procesate în mai multe
etape:
- datorită provenienţei probei de analizat (lichid biologic, cu un bogat
şi variat conţinut organic, în mare majoritate proteine), s-a procedat
la o etapă intermediară – precipitarea proteinelor cu acetonitril,
30
urmată de purificarea produsului rezultat (extragerea resturilor de
acetonitril) care s-a făcut cu izo-octan pur;
- extracţia s-a efectuat utilizând un amestec de cloroform:bicarbonat
de Na 3% (raport 80:20) cu care proba rezultată din purificare se
mixează, fiind apoi filtrată prin hârtie de filtru cantitativă;
- purificarea s-a făcut prin trecerea filtratului prin coloana SPE C18,
precondiţionată prin spălarea succesivă cu metanol (4 ml) şi,
respectiv, apă distilată (4 ml);
- micotoxinele au fost apoi eluate de pe coloană, prin spălarea cu un
volum de 4 ml de metanol, la o viteză de 2 ml/min;
- faza organică obţinută se evaporă la sec, iar reziduul obţinut se reia
cu un volum de 1 ml de fază mobilă (amestec acetonitril:apă:acid
acetic în raport de 99:99:2) şi se supune analizei HPLC.
Pentru analiza HPLC s-a utilizat cromatograful de lichide tip
HP 1090 Series II, echipat cu detector cu multidiode UV-VIS şi
detector de fluorescenţă cu detecţie simultană în UV la 251 nm
(excitaţie la 228 nm şi emisie la 423 nm) prevăzut cu o coloană C18
tip Zorbax (15 cm x 4,5 mm, 5 µm). Volumul probei de analizat
injectate a fost de 20 µl, iar debitul fazei mobile a fost de 0,7 ml/min.
În paralel, s-au lucrat probe îmbogăţite cu cantităţi cunoscute
de AFB1 şi STC, pentru stabilirea randamentului de extracţie.
Validarea rezultatelor a necesitat parcurgerea unor etape
intermediare, cu atât mai necesare cu cât probele supuse analizei erau
lichide biologice, a căror compoziţie este extrem de variată şi
complexă.
Determinarea specificităţii metodei pentru detectarea
AFB1 şi STC. În acest scop, s-au analizat mai multe probe conţinând
soluţii de AFB1 şi STC în concentraţii cunoscute, solventul fiind
reprezentat de faza mobilă utilizată în determinările ulterioare
(amestec acetonitril:apă:acid acetic în raport de 99:99:2).
Scopul acestei etape a constat în demonstrarea absenţei
interferențelor cromatografice din partea fazei mobile, precum şi
determinarea timpului de retenţie pentru cele două micotoxine în
condiţiile folosite.
31
Cromatogramele înregistrate folosind doar faza mobilă nu au
prezentat picuri de retenţie a componentelor folosite, demonstrând
astfel utilitatea acesteia.
S-a trecut apoi la trasarea curbelor pentru micotoxinele
studiate în stare pură şi în concentraţii cunoscute, pentru a se stabili
timpul de retenţie al acestora.
S-au folosit soluţii standard de AFB1 şi de STC în
concentraţie de 4 ng/ml (Sigma-Aldrich), celelalte condiţii fiind
similare cu cele efectuate pentru studiul probelor (injectare de 20 µl,
debit de 0,7 ml/min). Cromatogramele obţinute au evidenţiat picuri
clare date de cele două micotoxine, timpul de retenţie al AFB1 fiind
de 12 min (Fig. 2), iar pentru STC – de 6 minute (Fig. 3).
Pe parcursul studiului s-au folosit soluţii standard ale
micotoxinelor. Deşi acestea sunt recunoscute ca structuri stabile din
punct de vedere chimic, datorită păstrării lor timp mai îndelungat la
temperatura camerei, s-a considerat necesar verificarea stabilităţii
acestora în soluţiile folosite.
Soluţiile standard au fost desfăcute şi păstrate la temperatura
camerei timp de 10 zile. Proba a fost supusă analizei HPLC prin
metoda descrisă mai sus iniţial şi în zilele 2, 3 şi 10 de păstrare, cu
verificarea ratei de regăsire a acesteia în soluţie.
Aria picului înregistrat de soluţia standard de AFB1 şi STC
sunt redate în tabelele 1 şi 2.
Aria medie de detecţie a AFB1 pe parcursul perioadei
urmărite a fost de 32,45 mm2, cu o deviaţie standard de 1,3379 şi o
deviaţie standard relativă de 4,1230%, mult sub limita de 10%,
considerată variaţie nesemnificativă. Aria medie de detecţie a STC
pe parcursul perioadei urmărite a fost de 35,7 mm2,deviaţia standard
fiind de 0,7958 şi o deviaţie standard relativă de 1,1562%, de
asemenea mult sub limita admisă.
S-a demonstrat astfel stabilitatea soluţiei de AFB1 şi STC în
condiții de păstrare la întuneric şi la temperatura camerei, pentru cel
puţin 10 zile de la deschiderea recipientului original.
Linearitate, limita de detecţie şi limita de cuantificare
Pentru studiul linearității au fost analizate şase serii de soluţii,
pentru fiecare cromatogramă a fost calculată aria picului
32
corespunzător AFB1 şi STC, iar valoarea ariei medie a fost
reprezentată grafic funcţie de concentraţie. Prin analiză statistică au
fost calculate ecuaţia dreptei de regresie, coeficientul de corelaţie (r)
şi eroarea standard de regresie (SE). Folosind panta dreptei de
regresie şi eroarea standard a acestei drepte s-au calculat valorile
limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare.
Figura 4. Dreapta de calibrare a AFB1
Deoarece cantitatea de AFB1 din probe este mică, ecuaţia
curbei de calibrare a fost calculată pentru concentraţii cuprinse între
9,765625 şi 39,0625 ng/ml. După calculul statistic s-a obţinut ecuaţia
curbei de calibrare:
Arie pic = panta x concentraţia + 7,325
Valoarea coeficientului de corelaţie (r) este 0,9983 iar eroarea
standard a curbei de regresie (SE) este 1,3229431474665. Folosind
aceste valori s-au calculat limita de detecţie (LD) şi limita de
cuantificare (LQ) cu formulele (1) şi (2):
(1) LD = 3 x SE/panta = 3,69 ng/ml
(2) LQ = 10 x SE/panta = 12,31 ng/ml.
Folosind o metodologie similară, pentru STC s-au obţinut:
(1) LD = 1,71 ng/ml
(2) LQ = 5,13 ng/ml.
Precizia şi exactitatea. Prima etapă în determinarea preciziei
o reprezintă studiul preciziei sistemului. Astfel, o soluţie AFB1 de
concentraţie de 20 ng/ml a fost analizată de cinci ori.
33
Deviaţia relativă standard (RSD %) a fost calculată ca fiind
8,6912%, valoare corespunzătoare pentru concentraţii în probă de
ordinul ng, ceea ce indică precizia metodei folosite.
Precizia şi exactitatea metodei au fost determinate prin
calcularea valorii medii a 3 determinări la trei concentraţii diferite în
jurul valorii de interes – 39.0625 ng/ml, 19.53125 ng/ml şi respectiv,
9.765625 ng/ml (concentraţia urmărită ± 50%). Întregul experiment a
fost realizat în zile diferite, de către altă persoană, cu scopul de a
obţine informaţii despre robusteţea metodei. Utilizând ecuaţia curbei
de calibrare şi ariile picurilor au fost calculate concentraţiile pentru
fiecare probă. A fost determinată regăsirea ca procent din valoarea
concentraţiei teoretice, regăsirea medie şi precizia metodei exprimată
prin deviaţia standard relativă din regăsirea calculată.
După prelucrarea statistică a ambelor seturi de determinări a
rezultat o valoare de 16,9629 % a deviaţiei standard relative ceea ce
demonstrează precizia metodei, regăsirea medie fiind de 99,2% (pe
intervalul 61,6 – 126,1%), ceea ce demonstrează exactitatea metodei.
Determinarea preciziei determinării STC a fost făcută
analizând o soluţie de STC de concentraţie 10 ng/ml de cinci ori,
rezultând o deviaţie relativă standard de 7,7602%, corespunzătoare
pentru nivelul de concentraţie testată.
Pentru precizia şi exactitatea metodei de determinare, s-a
folosit aceeaşi procedură ca şi pentru AFB1, determinându-se de câte
trei ori, în 2 zile diferite, de către persoane diferite, ariile picurilor
unor probe de concentraţii cunoscute, la STC fiind folosite soluţii de
11,8553 ng/ml ±50% (respectiv, 5,92675 ng/ml şi 17,78295 ng/ml).
După prelucrarea statistică a ambelor seturi de determinări a
rezultat o valoare de 12,6819 % a deviaţiei standard şi o regăsire
medie de 99,4% (pe intervalul 72,7 – 118,5%); precizia şi exactitatea
metodei au fost astfel determinate ca fiind corespunzătoare.
Analiza statistică a rezultatelor. Datele au fost introduse
într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics v.19. Rezultatele
au fost exprimate ca media ± deviaţie standard (DS), iar diferenţele
între loturi au fost comparate folosind testul t-Student; valoarea
p<0.05 a fost considerată cu semnificaţie statistică. Corelaţia dintre
rezultatele obţinute a fost stabilită prin testul Pearson, fiind
34
considerate semnificative valori ale coeficientului de corelaţie (r)
peste aflate între intervalele -1 – -0.3 şi 0.3 – 1. Corelaţia pozitivă a
fost considerată slabă pentru r=0,3-0,5, medie pentru r=0.5-0.7 şi
puternică la r>0.7; valori corespondente au fost considerate şi pentru
corelaţia negativă. Pentru compararea frecvențelor cu care un
eveniment intervine, s-a folosit testul Fisher-exact sau χ2 cu corecţie
Yates, valoarea p<0.05 fiind considerată semnificativă statistic.
Rezultate şi discuţii.
Etiologia cirozei hepatice. Etiologia CH a fost reprezentată
în principal de VHC - 18 cazuri, urmată de combinaţia virus şi alcool
- 16 cazuri (5 VHB şi 11 VHC), alcool - 12 cazuri şi VHB - 8 cazuri
(Fig. 5). În 4 cazuri (7%), etiologia cirozei nu a putut fi determinată,
pacientul infirmând un consum semnificativ de alcool şi nefiind
detectate alte etiologii posibile. În aceste cazuri, investigaţiile
paraclinice nu au confirmat hepatita autoimună, hemocromatoza
ereditară, boala Wilson sau deficitul de α1-antitripsină. Un pacient
era în tratament cronic de 2 ani cu Amiodaronă 200 mg/zi pentru
fibrilaţie atrială paroxistică (redusă chimic), fără a exista evidenţe
între boala hepatică cronică, decelată anterior iniţierii tratamentului
antiaritmic, şi prezenţa fibrozei hepatice. În cazul celorlalţi pacienţi,
anamneza a exclus consumul unor medicamente sau alte toxice
hepatice cu posibilă implicare în etiologia cirozei.
Fig. 5. Etiologia CH la pacienţii din lotul de studiu
Frecvenţa detectării micotoxinelor în produsele biologice
la cele 2 loturi. În lotul martor, din cele 210 probe biologice
analizate, 14 (6,66%) au fost testate pozitive, reprezentând: 6 probe
de sânge cu AFB1, 4 probe de sânge cu STC şi 4 probe de urină cu
STC. AFB1 nu a fost detectată în urina lotului martor.
În lotul cu CH, au fost detectate pozitiv 28 de probe de sânge
(22 pentru AFB1 şi 6 pentru STC) şi 26 de probe de urină (10 pentru
35
AFB1 şi 16 pentru STC) din totalul de 232 de probe analizate
(23,27%).
Verificarea semnificaţiei statistice a diferenţelor s-a făcut prin
testul Fisher-exact (datorită numărului mic de probe pozitive), iar
rezultatele constatate au relevat că diferenţele sunt înalt semnificative
statistic (Tabelul 6), cu excepţia AFB1 în sânge, la care numărul
probelor depistate pozitiv în ambele loturi a fost egal.
Tabelul 6. Semnificaţie statistică a diferenței între numerele de probe
pozitive la cele 2 loturi (test Fisher-exact)
Lot AFB1s STCs AFB1u STCu Total
M 6 4 0 4 14
CH 6 22 10 16 54
p 0.9225 0.0002 0.0013 0.0067 <0.0001 AFB1s=AFB1 în sânge; AFB1u=AFB1 în urină;
STCs=STC în sânge; STCu=STC în urină;
În concluzie, numărul de probe depistate pozitiv în lotul cu
CH este semnificativ mai mare la pacienţii cu CH decât la martor, în
majoritatea situaţiilor.
Nivelul AFP înregistrat la cele 2 loturi. Valoarea
considerată normală de către laborator pentru AFP prin metodă
folosită (electrochemiluminiscenţă) a fost de sub 7 ng/ml. Pacienţii
din lotul martor au avut o valoare medie de 4,42±3,25 ng/ml,
încadrându-se sub acest prag. Pacienţii din lotul cu CH au avut o
valoare a AFP ușor crescută, de 12,63±22,49 ng/ml (dar cu mari
variaţii între pacienţi, cea mai mare valoare înregistrată fiind de
155,3 ng/ml), diferenţa fiind înalt semnificativă statistic.
Tabel 7. Nivelele enzimelor hepatice (UI/L ± STDEV) şi AFP (ng/ml ± STDEV) la cele două loturi
TGP TGO FA GGT AFP
M 28,21±23,23 33,06±24,02 142,51±70,42 47,78±30,73
4,42±3,25
36
CH 70,32±56,02 85,60±67,54 172,25±95,80 157,52±262,4
12,63±22,49
t-
Test 0.0000 0.0000 0.0319 0.0013
0.0042
Nivelul de micotoxine înregistrat la cele 2 loturi.
Concentraţia maximă de AFB1 în sânge a fost de 8,33 ng/ml la lotul
martor, şi de 25,68 ng/ml la lotul cu CH. Pentru STC, s-au înregistrat
valori maxime în sânge de 3,8 ng/ml la lotul martor şi de 2,81 ng/ml
la lotul cu CH (dar frecvenţa probelor pozitive în acest lot a fost mult
mai mare decât la martor).
În urină, AFB1 nu a fost detectată în primul lot, iar la cirotici
a avut o concentraţie maximă de 13,77 ng/ml. STC a fost detectată în
sângele a 4 pacienţi din lotul martor şi 16 din lotul cu CH, unde a
prezentat o valoare maximă de 39,06 ng/ml.
Valorile medii ale AFB1 şi STC au fost mai mari la lotul de
cirotici faţă de lotul martor în toate cazurile, cu semnificaţie statistică
în cazul STCs (p=0.0037) şi AFB1u (p=0.0029) (Tabelul 8).
Tabelul 8. Valorile înregistrate pentru AFB1 şi STC la loturile de studiu Lot
AFB1s STCs AFB1u STCu
Ma
rto
r
Media
(ng/ml) 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049
STDEV 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249
CH
Media (ng/ml)
1,6777 0,6265 1,2016 1,0531
STDEV 5,506002 1,665573 3,177855 5,288908
t-Test (p) 0,151933 0,003757 0,002983 0,072264
Corelaţia dinte enzimele hepatice şi nivelul micotoxinelor
S-a încercat stabilirea unor corelaţii între concentraţiile de
micotoxine dozate în lichidele biologice ale pacienţilor şi unii
parametri ai funcţiei hepatice, n scopul verificării unor eventuale
interdependenţe. S-a efectuat testul de corelaţie Pearson, care nu a
relevat existenţa vreunei corelaţii semnificative statistic a AFB1 sau
STC cu enzimele hepatice sau de colestază, atât la lotul martor
(Tabel 9), cât şi la cel cu ciroză hepatică (Tabel 10).
37
După cum se observă din tabele, în aproape toate cazurile
indicele de corelaţie r nu depășește valoarea ±0,3, indicând absenţa
unei corelaţii statistic semnificative. Acest lucru indică absenţa unui
rol important al micotoxinelor determinate în sânge şi urină la
pacienţii studiaţi cu sindroamele hepatice de citoliză şi colestază, pe
care aparent nu le influenţează. Singura excepţie o reprezintă
corelaţia pozitivă slabă dintre TGO şi STC urinară la pacienţii cu CH
(r=0.3872), care ar indica o corelaţie pozitivă slabă între aceşti 2
parametri, fără însă a fi susţinută de alte date.
Corelaţia dintre nivelul micotoxinelor şi nivelul AFP
Ca şi nivelul AFB, concentraţia de micotoxine este mai mare
la pacienţii cu CH comparativ cu martorul, valorile fiind semnificativ
statistice pentru ambii parametri. Având în vedere că efectul
carcinogenetic hepatic este clar demonstrat pentru AFB1, s-a
verificat existenţa unei posibile conexiuni între prezenţa acesteia şi
AFP – marker biologic larg utilizat ca indicator al procesului de
proliferare malignă hepatică.
Tabelele 11 şi 12 redau relaţia existentă între aceşti parametri,
ca rezultat al testului de corelaţie Pearson.
Tabelul 11. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul martor
AFP AFB1s AFB1u STCs STCu
Media (ng/ml) 4,42 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049
STDV 3,25 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249
Corelaţie (r) -0,003 #DIV/0!* 0,1010 -0,0011 *parametru nedeterminabil, datorită absenţei AFB1 în urină la lotul martor
Tabelul 5 Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul cu CH
AFP AFB1s AFB1u STCs STCu
Media (ng/ml) 12,63 1,6777 0,6265 1,2016 1,0531
STDV 22,49 5,506002 1,665573 3,177855 5,288908
Corelaţia (r) -0,1603 -0,1603 -0,0597 0,03959
38
După cum se observă, nu există o corelaţie între nivelul de
micotoxine serice şi urinare şi nivelul AFP, atât la lotul martor cât şi
la lotul de pacienţi cirotici.
Concluzii. 1. Principalele etiologii ale cirozei hepatice au fost VHC, alcoolul şi
asocierea acestuia cu hepatita cronică virală.
2. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1 şi
STC din produse biologice.
3. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele biologice
la aproape un sfert din cazurile de CH studiate.
4. Frecvenţa detectării micotoxinelor a fost semnificativ mai mare
la pacienţii cirotici comparativ cu martorul.
5. Enzimele de citoliză hepatică şi de colestază, precum şi AFP,
sunt semnificativ mai mari la pacienţii cirotici studiaţi decât la
pacienţii din lotul martor.
6. Nu există corelaţii semnificative între enzimele hepatice sau AFP
şi nivelul de micotoxine detectate la toţi participanţii la studiu.
CAPITOLUL 5
Determinarea micotoxinelor in produse biologice
provenite de la pacienți cu carcinom hepatocelular
Scop. Identificarea prezenţei şi dozarea concentraţiei AFB1 şi
STC în produsele biologice (sânge şi urină) provenite de la pacienţi
diagnosticaţi cu CHC, precum şi verificarea existenţei unei corelaţii
ale acestora cu nivelul AFP şi al enzimelor hepatice de citoliză şi
colestază.
Materiale şi metodă.
Loturile de studiu. Studiul a fot efectuat pe un lot de 53 de
pacienţi cu CHC, care a fost comparat cu un lot de control de 55 de
39
pacienţi fără afectare hepatică. Participanţii a studiu au fost recrutaţi
dintre pacienţii internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi
Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.
Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi
excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat
consimțământul informat de participare la studiu, după care li s-a
recoltat sânge şi urină pentru determinarea probelor biologice.
Toţi participanţii la studiu au primit un formular de informare
succintă asupra originii micotoxinelor, efectului acestora asupra stării
de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea intoxicaţiei cronice.
Criteriile de includere şi de excludere au fost similare cu cele
pentru lotul cu CH, fiind prezentate anterior (pag. 29).
Structura celor 2 loturi a fost următoarea:
1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care
examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi
biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus
prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte
patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.
2. Lotul 2 (CHC) – 53 de participanţi (34M, 19F), la care
diagnosticul de CHC a fost stabilit pe baza criteriilor:
- anamnestice – diagnosticul anterior de CH (bine argumentat),
decelarea unui factor etiologic cunoscut (virus, alcool),
degradarea recentă a stării clinice la un cirotic anterior
compensat, etc.
- clinice – semne de CH, prezenţa complicaţiilor cirozei recent
instalate, fără un factor precipitant identificabil, apariţia durerii
abdominale, anorexia, scăderea ponderală, prezenţa trombozelor
venoase, etc.
- imagistice – semne de hipertensiune portală, semne de
decompensare a funcţiei hepatice, tromboza venei porte sau a
venelor suprahepatice, nodul hepatic evidenţiat ecografic, la care
două metode imagistice au evidenţiat hipervascularizaţia de timp
arterial, cu wash-out rapid în faza venoasă;
- biologice – prezenţa sindroamelor de afectare hepatică cronică;
markeri virali pozitivi; creşterea α-fetoproteinei serice (AFP);
probe biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei,
40
bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune,
etc.
Determinarea parametrilor biologici.
Recoltarea probelor biologice şi parametrii evaluaţi au fost
identici cu cei folosiţi pentru determinările din capitolul anterior,
fiind descrise în detaliu (pag. 30-31).
Determinarea micotoxinelor.
Detecţia micotoxinelor în sângele şi urina pacienţilor s-a
efectuat prin metoda HPLC, în cadrul laboratorului de cromatografie
al Facultăţii de Farmacie a Universităţii de Medicină şi Farmacie
„Gr. T. Popa” Iaşi.
Materialele folosite, metodele de calibrare şi tehnica de lucru
au fost identice cu cele folosite la lotul cu CH, fiind descrie în detaliu
anterior (pag. 31-36).
Analiza statistică a rezultatelor. Datele au fost introduse
într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics v.19. S-au folosit
testul t-Student; testul Pearson, testul Fisher-exact şi testul χ2 cu
corecţie Yates; valoarea p<0.05 a fost considerată semnificativă
statistic.
Rezultate şi discuţii. Etiologia hepatocarcinomului. Etiologia CH a fost
reprezentată în principal de VHC - 17 cazuri, urmată de combinaţia
virus şi alcool - 15 cazuri (7 VHB şi 8 VHC), alcool - 10 cazuri şi
VHB - 10 cazuri (Fig. 5). În 2 cazuri (4%), etiologia CHC nu a putut
fi determinată, apariţia tumorii înregistrându-se la pacienţi fără CH
diagnosticată anterior şi care nu prezentau semne clinio-biologice de
ciroză nici la internarea pe parcursul căreia a fost diagnosticat
hepatomul. S-au efectuat investigaţiile paraclinice complexe, care nu
au confirmat hepatita autoimună, hemocromatoza ereditară, boala
Wilson sau deficitul de α1-antitripsină. Anamneza riguroasă a exclus
41
consumul semnificativ de alcool, de medicamente sau alte toxice
hepatice cu posibilă implicare în etiologia cirozei.
Frecvenţa detectării micotoxinelor în produsele biologice
la cele 2 loturi. În lotul martor, din cele 210 probe biologice
analizate, 14 (6,66%) au fost testate pozitive, reprezentând: 6 probe
de sânge cu AFB1, 4 probe de sânge cu STC şi 4 probe de urină cu
STC. AFB1 nu a fost detectată în urina lotului martor.
În lotul cu CHC, au fost detectate pozitiv 70 de probe de
sânge (33,01%) din totalul de 212 probe analizate, cel mai frecvent
fiind detectată STC în sânge (28 de probe pozitive) şi în urină (17
probe), urmată de AFB1 urinară (15 probe) şi serică (10 probe).
Verificarea semnificaţiei statistice a diferenţelor s-a făcut prin
testul Fisher-exact rezultatele constatate au relevat că diferenţele sunt
înalt semnificative statistic (Tabelul 6), cu excepţia AFB1 în sânge,
la care numărul diferenţa a fost nesemnificativă.
Tabelul 6. Semnificaţie statistică a diferenței între numerele de probe pozitive
la cele 2 loturi (test Fisher-exact)
Lot AFB1s STCs AFB1u STCu Total
M 6 4 0 4 14
CHC 10 28 15 17 70
p 0.2868 <0.0001 <0.0001 0.0014 <0.0001 AFB1s=AFB1 în sânge; AFB1u=AFB1 în urină;
STCs=STC în sânge; STCu=STC în urină;
În concluzie, numărul de probe depistate pozitiv în lotul cu
CHC este semnificativ mai mare decât la martor, în majoritatea
situaţiilor.
Nivelul enzimelor hepatice înregistrate la cele 2 loturi
Valorile considerate normale de laborator pentru
determinările enzimelor de citoliză hepatică au fost: TGP < 40 UI/L
şi TGO < 40 UI/L. Pacienţii din lotul martor au prezentat o valoare
medie normală a transaminazelor, în timp ce pacienţii cu hepatom au
prezentat o creştere importantă a acestor valori peste valoarea
normală, diferenţele fiind semnificative statistic (Tabelul 7). Gradul
42
de dispersie a fost însă foarte accentuat, fapt evidenţiat printr-o
valoare crescută a STDEV comparativ cu media.
De asemenea, pacienţii cu CHC au prezentat nivele
semnificativ mai mari ale FA şi GGT comparativ cu lotul martor,
ambele enzime de colestază fiind semnificativ mai crescute decât
valoarea considerată normală de către laborator: FA = 40 – 129 UI/L;
GGT<61 UI/L (Tabel 7).
Nivelul AFP înregistrat la cele 2 loturi. Valoarea
considerată normală de către laborator pentru AFP prin metodă
folosită (electrochemiluminiscenţă) a fost de sub 7 ng/ml. Pacienţii
din lotul martor au avut o valoare medie de 4,42±3,25 ng/ml,
încadrându-se sub acest prag. Pacienţii din lotul cu CHC au avut o
valoare a AFP mult crescută, media fiind de 1123,94±2020,31 ng/ml.
Diferenţa faţă de martor este înalt semnificativă statistic (p<0.0001).
De remarcat că AFP a înregistrat valori de peste 200 ng/ml,
considerate actual diagnostice pentru CHC, în prezenţa unei tumori
hepatice decelabile ecografic, doar în 27 de cazuri (51%), fapt care
confirmă sensibilitatea insuficientă a determinării AFP ca unic
marker tumoral hepatic.
Tabel 7. Nivelele enzimelor hepatice (UI/L ± STDEV) şi AFP (ng/ml ± STDEV) la cele două loturi
TGP TGO FA GGT
AFP
M 28,21±23,23 33,06±24,02 142,51±70,42 47,78±30,73 4,42±3,25
CHC 93,85±91,74 134,49±73,86 194,50±151,84 282,76±265,72 1123,94±2020,31
t-Test 0.0000 0.0000 0.0001 0.0000
0.0000
Nivelul de micotoxine înregistrat la cele 2 loturi
Concentraţia maximă de AFB1 în sânge a fost de 8,33 ng/ml
la lotul martor, şi de 126,93 ng/ml (!) la lotul cu CHC. Cea mai mare
concentraţie s-a înregistrat la un pacient cu hepatocarcinom dezvoltat
pe un ficat cu CH compensată, infectat cronic cu VHB. Pentru STC,
s-au înregistrat valori maxime în sânge de 3,8 ng/ml la lotul martor şi
de 2,02 ng/ml la lotul cu CHC, frecvenţa probelor pozitive pentru
STC la pacienţii cu CHC fiind cea mai mare dintre toţi pacienţii luați în studiu (28 probe pozitive de sânge, 17 de urină).
43
În urină, AFB1 nu a fost detectată în primul lot, iar dintre
pacienţii cu hepatom, s-a înregistrat o concentraţie maximă de 56,39
ng/ml. În total, STC a fost detectată în urina a 17 pacienţi din lotul
cu CHC, unde a prezentat o valoare maximă de 9,39 ng/ml.
Valorile medii ale AFB1 şi STC au fost mai mari la lotul de
pacienţi cu hepatom faţă de lotul martor în toate cazurile, diferenţa
fiind semnificativă statistic (Tabelul 8).
Tabelul 8. Valorile înregistrate pentru AFB1 şi STC la loturile de studiu
Lot AFB1s STCs AFB1u STCu
Marto
r
Media
(ng/ml) 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049
STDE
V 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249
CHC
Media
(ng/ml) 13,52605 0,453332 6,203066 0,9963
STDE
V 37,2658 0,626671 16,49542 2,749464
t-Test (p) 0,006631 <0.000001 0,003132 0,004337
Corelaţia dinte enzimele hepatice şi nivelul micotoxinelor
La lotul martor, indicele de corelaţie r nu depășește valoarea
±0,3, indicând absenţa unei corelaţii statistic semnificative. La lotul
cu CHC apar corelaţii semnificative multiple ale enzimelor de
citoliză hepatică şi colestază cu valorile micotoxinelor, cele mai
multe dintre ele fiind însă slabe (r = 0,03 – 0,5). Enzimele de citoliză
hepatică de corelează negativ cu valorile AFB1 serice, în timp ce
GGT se corelează negativ cu micotoxinele urinare. Singura corelaţie
puternică este între FA şi AFB1s (r=0,69), dar FA se corelează
negativ cu STCs. În general, se observă corelaţii negative ale
transaminazelor cu micotoxinele, sugerând că prezenţa acestora este
mai importantă la pacienţii la care transaminazele sunt mai mici
(posibil, cu un stadiu avansat al bolii hepatice, pacienţii respectivi
fiind diagnosticaţi cu CHC pe CH).
Corelaţia dintre nivelul micotoxinelor şi nivelul AFP. Ca
şi nivelul AFB, concentraţia de micotoxine este mai mare la pacienţii
cu CHC comparativ cu martorul, valorile fiind semnificativ statistice
pentru ambii parametri. Având în vedere că efectul carcinogenetic
44
hepatic este clar demonstrat pentru AFB1, s-a verificat existenţa
unei posibile conexiuni între prezenţa acesteia şi AFP – marker
biologic larg utilizat ca indicator al procesului de proliferare malignă
hepatică (Tab. 11 şi 12). Tabelul 11. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul martor
AFP AFB1s AFB1u STCs STCu
Media (ng/ml) 4,42 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049
STDV 3,25 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249
Corelaţie (r) -0,003 #DIV/0!* 0,1010 -0,0011 *parametru nedeterminabil, datorită absenţei AFB1 în urină la lotul martor
Tabelul 12. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul cu CHC
AFP AFB1s AFB1u STCs STCu
Media 1002,0900 14,3400 0,4200 7,3100 1,1500
STDV 1519,2700 37,8504 0,5980 17,5033 2,9261
Corelaţie (r) -0,3020 0,8402 -0,3643 0,9429
Dacă la lotul martor nu există nici o corelaţie semnificativă
între AFP şi micotoxine, la pacienţii cu CHC toate valorile obţinute
sunt corelate cu aceasta. Astfel, se observă că micotoxinele serice se
corelează semnificativ (deşi slab) cu AFP, demonstrând că la
pacienţii la care aceasta este crescută, prezenţa lor în sânge ar scădea.
Cum pacienţii cu AFP crescută tind să aibă u funcţie hepatică mai
alterată (se cunoaşte că valoare AFP este corelată cu dimensiunile
CHC), este posibil ca această scădere a lor în sânge să fie consecinţa
alterării funcţiei hepatice, cu preluare hepatică şi metabolizare
scăzută la acest nivel. O altă posibilă interpretare a rezultatelor ar fi o
legătură directă între nivelul crescut de micotoxine urinare şi
creşterea AFP, respectiv contribuţia aflatoxinelor, ingerate în
cantităţi semnificative (deoarece pot fi găsite integrale în urină, fără a
fi complet transformate la primul pasaj hepatic) la procesul
carcinogenetic hepatic. Prezenţa acestor toxine puternice în cantităţi
semnificative în sângele pacienţilor la internarea în spital, deci
practic după ingestia de alimente la domiciliu, ridică problema
45
existenţei unu grad foarte înalt de contaminare a acestor pacienţi
posibil cu rol în generarea bolii hepatice cronice.
Concluzii. 1. Principalele etiologii ale hepatocarcinomului au fost VHC,
alcoolul şi asocierea acestuia cu hepatita cronică virală.
2. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1 şi
STC din produse biologice la pacienţii cu CHC, contribuind
la precizarea etiopatogeniei bolii.
3. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele
biologice la peste 1/3 din cazurile de CHC studiate, într-o
proporţie mult crescută faţă de lotul martor.
4. Enzimele de citoliză hepatică şi de colestază, precum şi AFP,
sunt semnificativ mai mari la pacienţii cu hepatocarcinom
studiaţi decât la pacienţii din lotul martor.
5. Există unele corelaţii semnificative între enzimele hepatice şi
nivelul de micotoxine detectate pacienţii cu CHC, dar sunt
slabe şi inconsistente.
6. Există o asociere clară între creşterea AFP şi prezenţa masivă
a micotoxinelor în urină la pacienţii cu CHC.
7. Este posibilă existenţa unui important deficit de metabolizare
hepatică a AFB1 şi STC la pacienții cu CHC.
CONCLUZII FINALE
1. Potenţialul carcinogenetic hepatic al aflatoxinei B1 este clar
demonstrat
2. O proporţie semnificativă din cirozele hepatice şi
hepatocarcinoame nu au o etiologie bine precizată
3. VHC a fost cea mai frecventă etiologie a cirozei şi
hepatocarcinom
4. Circa 10% din cazurile de hepatocarcinom diagnosticate sunt
de etiologie neprecizată.
46
5. Dozele mici de micotoxine compromit procesul de creştere al
animalelor de experienţă
6. AFB1 şi STC în doză mare produc necroză hepatică
semnificativă şi activează mecanismele fibrogenetice, ducând
la fibroză semnificativă.
7. Dezintegrarea citoplasmei, cu alterarea structurii şi funcţiilor
organitelor celulare apar chiar şi după
8. Consumul frecvent de alimente cu risc maxim de contaminate
cu micotoxine a fost declarat de 1 din 5 participanţi.
9. CFA nu a confirmat un rol important al micotoxinelor în
producerea hepatocarcinomului
10. Profilul de risc al pacienţilor este diferit, în funcţie de mediul
d provenienţă
11. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1
şi STC din produse biologice.
12. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele
biologice la aproape un sfert din cazurile de CH şi CHC
studiate.
13. Frecvenţa detectării micotoxinelor a fost semnificativ mai
mare la ciroze şi hepatocarcinoame comparativ cu martorul.
14. Există o asociere clară între creşterea AFP şi prezenţa masivă
a micotoxinelor în urină la pacienţii cu CHC.
15. Este posibilă existenţa unui important deficit de metabolizare
hepatică a AFB1 şi STC la pacienții cu CHC.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. 1
http://www who int/healthinfo/global_burden_disease/en/
(accesat în mai 2011)
2. 2http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_
report/profiles/rou.pdf (accesat în mai 2011)
3. 3 Yu MW, Lien JP, Liaw YP, Chen CJ. Effects of multiple risk
factors for hepatocellular carcinoma on formation of aflatoxin B1-
DNA adducts. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention
1996; 5:613-619
47
4. 4
El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma:
epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology
2007; 132:2557–2576
5. 5 Singal A, Volk ML, Waljee A et al. Meta analysis: surveillance
with ultrasound for early stage hepatocellular carcinoma in patients
with cirrhosis. Aliment Pharmacol Ther 2009; 30:37–47
6. 6 Mulcahy N. Diabetes is the leading cause of attributable cases of
hepatocellular carcinoma.
http://www.medscape.com/viewarticle/720925
(accesat în mai 2011)
7. 7 Chen CH, Hu FC, Huang GT et al. Applicability of staging
systems for patients with hepatocellular carcinoma is dependent on
treatment method: analysis of 2010 Taiwanese patients. Eur J
Cancer 2009; 45:1630–1639
8. 8 Wu HC, Wang Q, Yang HI et al. Aflatoxin B1 exposure, hepatitis
B virus infection and hepatocellular carcinoma in Taiwan. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev. 2009; 18(3):846-853
9. 9 Miron L et al. Micotoxinele hepatonefro-toxice (aflatoxine,
ochratoxinele, sterigmatocistina, citrinina) factori de risc pentru
sănătatea omului şi a animalelor; studii epidemiologice,
morfoclinice şi de strategie preventivă. Raport final proiect CEEX
147/2006 (anul finalizării: 2008); pag. 3-5
10. 10 Bulea D, Şpac A, Dorneanu V. HPLC determination of
ochratoxin A in roasted coffee beans. Fungi & Mycotoxins 2008;
2(1):157-163
11. 11 International Agency for Research on Cancer (IARC). Some
Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents,
Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins. IARC
Monographs evaluation of carcinogenic risks to human 1993; 56:
245-540
12. 12 Fattovich G, Troffolini T, Zagni I, Donato F. Hepatocellular
carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.
Gastroenterology 2004;127:S35–S50
13. 13 Yarru LP, Settivari LS, Antoniou E, Ledoux DR, Rottinghaus
GE. Toxicological and gene expression analysis of the impact o
aflatoxin B1 on hepatic function of male broiler chicks. Molecular,
cellular and developmental biology 2008; 88:360-371
48
14. 14
Devegowda G, Ravikiran D. Mycotoxins and eggshell quality:
cracking the problem. World Mycotoxin Journal 2008; 1(2): 203-
208
15. 15 Jones FT, Hagler WH, Hamilton PB. Association of low levels of
aflatoxin in feed with productibility losses in commercial broiler
operations. Poultry Science 2010; 61:861-868