USO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO E USO PRÁCTICO E INTERPRETACIÓN DE LA INTERPRETACIÓN DE LA 

SEROLOGÍA Y PCR EN CAMPOSEROLOGÍA Y PCR EN CAMPO

Roser Dolz Roser Dolz PascualPascual

Joaquín Girón Joaquín Girón SolsonaSolsona

WPSA, WPSA, Valencia, 2014Valencia, 2014

TIPO ESTUDIO TIPO ESTUDIO LABORATORIALLABORATORIAL

TOMA DE MUESTRASTOMA DE MUESTRASLABORATORIALLABORATORIAL

HISTOPATOLÓGICOÓRGANOS

MICROBIOLÓGICO

SEROLÓGICOTIPO DE MUESTRA

MOLECULAR

PARASITOLÓGICO

MÉTODO CONSERVACIÓN

PATOLOGÍA QUE SE PATOLOGÍA QUE SE SOSPECHASOSPECHA

ETIOLOGÍA

PATOGENIAPATOGENIA

PCR Y TÉCNICAS DE PCR Y TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN

BIOLOGÍA MOLECULARBIOLOGÍA MOLECULAR

BIOLOGÍA  MOLECULAR

¿QUÉ DETECTAN LAS ¿QUÉ DETECTAN LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA TÉCNICAS DE BIOLOGÍA 

MOLECULAR?MOLECULAR?

ADNADNMaterial hereditarioADN / ARN

Responsable de la identidad y de laidentidad y de la diversidad de los 

individuos

Su estudio permite la identificación y clasificación de los agentes infecciososde los agentes infecciosos

ADNADNNUCLEÓTIDO

TA

CG

ADENINA GUANINA

CG

GC

A G CT AT

A G C T 

TIMINA CITOSINA 4 pares de basesT C G A

¿QUÉ INFORMACIÓN NOS ¿QUÉ INFORMACIÓN NOS PUEDEN DAR?PUEDEN DAR?

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARTÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARó d d l l é

DETECCIÓN DETECCIÓN  CUANTIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN  TIPIFICACIÓN TIPIFICACIÓN 

Detección y estudio del material genético organismos 

MICROORGANISMOMICROORGANISMO

Ausencia o presencia de 

MICROORGANISMOMICROORGANISMO MICROORGANISMOMICROORGANISMO

Cantidad de genomas  Clasificación en un agente infeccioso (de 

su genoma)presentes en una muestra de un 

determinado organismo

genotipos

Correlación con fenotipo ( t i id d ti )g (patogenicidad, serotipo)

PCR a tiempo real (cuantitativa)

SecuenciaciónPCR( )

FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN Específica

EXTRACCCIÓNEXTRACCCIÓN ADN/ARN

FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRADN/ARN Taq DNA 

POLIMERASANUCLEÓTIDOS (dNTPs)G

TG

AT TA

TCCG

GGGA

C CTT A

PRIMERS

AT

CAC T

T CG GA GG

TACGT G

ATT A

PRIMERS

C A T T A C A TG C A C T A T A

C A T T A C A T25 pares de bases

C A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A

G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A

G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A T

FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN

Específicap

Exponencial

1 PCR  30‐35 CICLOS

X 10 000 000 000X 10.000.000.000

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3

FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR

1 2 3 4 5

225pb

275pb

225pb250pb275pb

70pb

150pb100pb

700pb175pb150pb

100pb70pb

25pb50pb75pb

FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR1000pb800pb700pb600pb500pb

2 3 4 5 6 71 8

500pb400pb300pb

200pb

VENTAJASVENTAJAS INCONVENIENTESINCONVENIENTES

Elevada sensibilidad

Rapidez

Coste

Conservación muestras

Posibilidad tipificar No información de la viabilidad del agente infeccioso

Necesidad información genética del agente infeccioso

CATTTACATGGAGGCSECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN

CAC

CATA T

CATTTACATGGAGGC

CATTCATTTCATTTA

CAT

CATTTACATGCATTTACAT

CATTTACCATTTACAGC

CATTTACATGGAGCATTTACATGGACATTTACATGGCATTTACATG

A TCATTTACATGGAGGCCATTTACATGGAGGCATTTACATGGAGA T

C A T T T A C A T G G A G G C

GC

160 170

G

WPSA C A T T T A C A T G G A G G CANÁLISIS DE SECUENCIASANÁLISIS DE SECUENCIASWPSA C A T T T A C A T G G A G G C

STA- CEPA 1 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 2 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 3 C A T T T A C A T G G A G A C

STB- CEPA 1 C A T T T A C A A A G A G G CSTB- CEPA 2 C A T T T A C A A A G A G G C

STC- CEPA 1 C A T C C A C A T G G A G G CSTC- CEPA 2 C A T C C A C A T G G A G G C

STA-CEPA2STA-CEPA3

WPSASEROTIPO A

STA-CEPA1STB-CEPA1STB-CEPA2STC CEPA1

SEROTIPO B

STC-CEPA1STC-CEPA2

0.005

SEROTIPO C

D78(at)74

ÁRBOL FILOGENÉTICOÁRBOL FILOGENÉTICO

CEPAS ATENUADAS

D78(at)HARBIN

CEF94PBG98(Be-at)

P2(at)

7480

54

20

99 P2(at)AV-14-08-5

HIPRAGUMBORO-CH/80CU-1(at)

HIPRAGUMBORO-GM97

38

54

3345

B G D

VARIANTES

HIPRAGUMBORO-GM97Int/228E(TW)

VARIANT-E(Usvar)DEL-E(USvar)

GLS(USvar)

100

100

72

24 BAJO GRADO ATENUACIÓN

VARIANTES AMERICANAS

CLÁSICAS Y CLÁSICAS

GLS(USvar)GZ29112

VARIANT-A(USvar)STC(UScl)BURSAVAC(vac)

99

99

45

72

CLÁSICAS Y CLÁSICAS DE VIRULENCIA INTERMEDIA

BURSAVAC(vac)52/70(cl)

Cu-1wt(Gcl)BURSINE2(vac)

BURSINEPLUS(vac)100

100

40

40

vvIBDV

BURSINEPLUS(vac)849VB(BEvv)

UK661(UKvv)HK46(HKvv)

D6948(NLvv)66

98

99

D6948(NLvv)OKYM(Jvv)

NETHERLANDSvv3137

66

0.005

NL-L1449K-04NL-L1449T-04NL-L1449T-04FR-L1450L-05FR-L1450T-05

CASO 364

89

99

100

CASO 3BEAUDETTEM41-M21883Spain/96/334H120-M21970Spain/98/308100

100

56

100

42

64

Spain/98/3084/91-pathogenic4/91attenuatedUK/7/91UK/3/91UK-1233-95

100

100

99

38 UK-1233-95FR-85131-85FR-CR88061-88Spain/00/336IR-3654-VM-Spain/92/3525

10

44

100

Spain/92/35Spain/98/328

Spain/04/221Spain/05/866

Spain/99/316It-497-02-DQ901377

100

73

79

100

QUK-L633-04-DQ901376Italy-02-AJ457137Spain/00/337

ARK99-CU-T2

57

94

79

100

37

E l d di t i éti B1648HOLTEGRAY

JMKD3896D207

100

51

35

51

Escala de distancia genética

Cambios nucleotídicos/posiciónD207D274

D146674

100

0.05

VENTAJASVENTAJAS

Máxima precisión en la caracterización 

Relativa rapidez (comparación con métodos clásicos deRelativa rapidez (comparación con métodos clásicos de tipificación)

ió d d l d d ió dComparación con cepas de todo el mundo y detección de cepas nuevas.

INCONVENIENTESINCONVENIENTES

C tCoste

Análisis de resultados es costosa y complejo

No aplicable de forma sencilla a organismos más complejos (bacterias o virus de genomas complejos)

¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ELECCIÓN?ELECCIÓN?

Detección y estudio del material genético organismos 

N i i l l S d ti á tNo es necesario aislar el microorganismo para su 

detección

Se puede estimar un carácter fenotípico (virulencia, serotipo) a partir deldetección serotipo) a partir del 

genotipo

Microorganismos de  Microorganismos que gaislamiento difícil o lento 

Vi

g qrequieran una clasificación

IA – HPAIV/LPAIVVirus

Mycoplasma

IA  HPAIV/LPAIVIBV, FAdV, TRT – Serotipo

IBDV – Virulencia

¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR ¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR LAS MUESTRAS?LAS MUESTRAS?

Detección y estudio del material genético organismos 

E ll f d l f d d l t lEn aquellas fases de la enfermedad en que el agente causal esté presente en las aves/tejidos

INFECCIÓN AGUDAINFECCIÓN AGUDA INFECCIÓN CRÓNICAINFECCIÓN CRÓNICA

Muestreo se puede retrasar en el tiempo, dado que el 

l á

Muestreo temprano en la fase aguda de la enfermedad ( d lí ) agente causal estará 

durante más tiempo infectando el ave

(presencia de signos clínicos)

infectando el ave

¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN ¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN 

CONSERVAR?CONSERVAR?

Se deben tomar muestras de los tejidos u órganos diana donde el agente causal se replique o cree persistenciadonde el agente causal se replique o cree persistencia

1.‐ Tejido diana

2.‐ Hisopo sin medio de transportep p

3.‐ Tarjetas FTA  (inactivación del organismo)(inactivación del organismo)

R f i ió /C l ióRefrigeración/Congelación

Selección adecuada de la muestra

Orientar sospecha

Historia clínica (vacunaciones)

SEROLOGÍASEROLOGÍA

G R A C I A S G R À C I E S T H A N K Y O UG R A C I A S G R À C I E S