RSHUiWRUHP a automatickým mikroskopem NOVA Vie · 2 Werfen Czech s.r.o, Praha Cíl Cílem práce je shrnutí zkušeností s automatizací odečtu antinukleárních protilátek (ANA)

Na souborech pacientů jsme prospektivně i retrospektivně hodnotili soupravami INOVA přítomnost ANA protilátek (160 pacientů), resp. ANCA protilátek (70 pacientů), u kterých jsme porovnávali manuální odečet a odečet pomocí automatického mikroskopu NOVA View (INOVA Diagnostics).

Automatický mikroskop NOVA View čte, interpretuje a archivuje IFA obrazy značených skel. Analýza je založená na značení buněk DAPI fluorescenční barvou, která lokalizuje buňky a jádra a pomáhá odlišit pozadí. FITC barva je zodpovědná za standardní imunofluorescenční obraz. Algoritmus rozpoznání typu obrazu automatem na Hep-2 buňkách a buňkách neutrofilů je analogický 3-D holografickému obrázku (píky pod plochou), které přístroj přímo vytváří na základě intenzity fluorescence jednotlivých bodů. Následně navrhuje typ obrazu, který musí být vyhodnocen a potvrzen zkušeným operátorem.

Funkcí autotiter je možné z kalibrační křivky vytvořené pro každý definovaný typ fluorescence na Hep-2 buňkách predikovat konečnou výši titru v případě pozitivních vzorků.

Fialová M. 1, Černotová I.1, Braunová H.1, Poloučková A.2, Luxová Š.1

1 Imunologie a infekční sérologie, synlab czech s.r.o, , Praha 2 Werfen Czech s.r.o, Praha

Cíl

Cílem práce je shrnutí zkušeností s automatizací odečtu antinukleárních protilátek (ANA) a protilátek proti cytoplazmě neutrofilů (ANCA) imunofluorescenční metodou.

Úvod

Hodnocení NIF manuálním způsobem

a automatickým mikroskopem NOVA View

Souprava NOVA Lite® HEp2 ANA Kit with DAPI, INOVA, ref. 708 102 Souprava NOVA Lite® ANCA (Ethanol) Kit with DAPI, INOVA, ref. 708 301 Souprava NOVA Lite® ANCA (Formalin) Kit with DAPI, INOVA, ref. 708 300

Quanta Lyser 160 - automat pro přípravu IFA skel NOVA View - automatický mikroskop pro odečet IFA skel a archivaci výsledků Quanta Link - program pro komunikaci Quanta Lyser, NOVA View, LIS a pro vyhodnocení a archivaci pracovních listů a výsledků

Materiál a metody

Výsledky ANCA

Výsledky ANA

Závěr

Int. 34

Result: 1:80 nukleolární typ

Int. 35

Result: 1:80 jemně zrnitý typ s pozitivní

chromatinovou ploténkou

Int. 37

Result: 1:80 jemně zrnitý typ s pozitivní

chromatinovou ploténkou

Int. 42

Result: 1:80 jemně zrnitý typ

Int. 10

Result: 1:80 NuMA

Tabulka č. 1: Celková shoda v odečtu antinukleárních protilátek (ANA) pomocí automatu NOVA View s vyhodnocením obrazů zkušeným operátorem byla 96,3%. Ze 160 nálezů byly výsledky upraveny pouze v 5 případech. Ve čtyřech případech se jednalo o hraniční intenzitu fluorescence, v jednom případě automat nerozeznal typ fluorescence dělícího aparátu (NuMA).

Tabulka č. 2: Celková shoda v odečtu antinukleárních protilátek (ANA) pomocí automatu NOVA View po vyhodnocení obrazů zkušeným operátorem s odečtem

Tabulka č. 3: Celková shoda v odečtu antinukleárních protilátek (ANA) pomocí automatu NOVA View s odečtem běžným fluorescenčním mikroskopem byla 83,1%. Ze 160 nálezů byly výsledky upraveny ve 27 případech. Z těchto výsledků vyplývá, že kontrola a případná úprava výsledků stanovených automatem Nova View je nutná a zvyšuje shodu mezi automatickým a manuálním odečtem.

Zrnitý Centroméra

Nukleolární Jaderné tečky

Homogenní

Obrázek č. 1: ANA - příklady námi naměřených obrazů a 3-D holografických obrázků, pomocí nichž Nova View rozpoznává typ fluorescence. NOVA View rozpoznává 5 typů fluorescence. Cut-off 48 LIU (light intensity units).

Obrázek č. 2: ANCA ethanolem fixované neutrofily - příklady námi naměřených obrazů. NOVA View rozpoznává 2 typů fluorescence. Cut-off 37 LIU pro ethanol, 30 LIU pro formalín.

Obrázek č. 3: a) buňky značené DAPI fluorescenční barvou, která lokalizuje buňky a jádra a pomáhá odlišit pozadí, b) buňky značené DAPI i FITC fluorescenční barvou (kombinovaný obraz), c) buňky značené FITC fluorescenční barvou (standardní imunofluorescenční obraz)

a) b) c)

c-ANCA p-ANCA

Specifikace manuálního mikroskopu • mikroskop Olympus BX51 • kolimátor: modulární,

pohybem stolku • objektivy: 20x a 40x zvětšení • vlnová délka: FITC 490 nm

Metodický postup

Identifikace reagencií i jednotlivých jamek (ID pacienta, titrace)

Příprava skel pomocí automatu

Quanta Lyser 160

Čtení obrazů a ukládání do programu pro automatické hodnocení

Automatické hodnocení typu fluorescence, archivace obrazů

Vytvoření výsledkového

reportu

Export naměřených dat do Quanta Link, kde dochází k vlastní úpravě operátorem, validaci výsledků, exportu do LIS, k exportu dalších požadavků (př. následné titrace) do Quanta Lyseru nebo k exportu do atlasu IFA obrazů

Software NOVA View

Specifikace NOVA View • mikroskop Olympus IX83 • fotoaparát Kappa Zelos 285GV • kolimátor: pE2 modulární • objektivy: 10x a 40x zvětšení,

odečítá na 40x zvětšení • vlnová délka: DAPI 455nm,

FITC 490 nm

Int. 61

Result: 1:80 jemně zrnitý typ s

pozitivní chromatinovou ploténkou

Int. 64



Int. 92


Int. 42


Int. 174



běžným fluorescenčním mikroskopem byla 85,0%. Ze 160 nálezů byly pozitivní výsledky z automatu (upravené operátorem) odečteny manuálním mikroskopem v 5 případech jako negativní a v 8 případech jako hraniční, se stejným typem fluorescence. Podobně tomu bylo tak i v opačném případě. Negativní výsledky z automatu (upravené operátorem) byly odečteny manuálním mikroskopem ve 4 případech jako pozitivní a v 6 případech jako hraniční. Ve všech případech se jednalo změnu v 0,5 - 1,0 titru.

Tabulka č. 4: Výčet jednotlivých typů fluorescence stanovených NOVA View vs. typů fluorescence po úpravě operátorem. Z výsledků vyplývá vysoká shoda hodnocení negativních nálezů a obrazů nukleolární , centromérové a zrnité fluorescence. V případě jaderných teček je snížená shoda způsobená malým počtem obrazů zastoupených v souboru. V případě homogenního typu fluorescence je nižší shoda v důsledku toho, že software nerozlišuje obrazy jemně zrnité fluorescence s pozitivní chromatinovou ploténkou a díky pozitivitě dělících buněk uzavírá obraz jako homogenní. Obrazy označené jako neurčitý typ fluorescence (19% výsledků ze souboru) byly ve většině případů operátorem rozeznané jako jemně zrnitý typ s pozitivní chromatinovou ploténkou, jemně zrnitý typ fluorescence nebo jiné méně četné nebo překryvné obrazy. Tato skutečnost ukazuje na nutnost validace výsledků zkušeným operátorem.

Tabulka č. 6: Celková shoda (shoda a ± 1 titr) ve vypočteném a skutečném titru byla 76,3%.

160 negativní hraniční pozitivní

negativní 53 1 5

hraniční 0 0 0

pozitivní 0 0 101

NOVA View úprava operátorem

NO

VA

Vie

w

au

tom

at


negativní 43 6 4

hraniční 0 0 1

pozitivní 5 8 93

NO

VA

a V

iew

úp

rav

a

op

erá

tore

m

Mikroskop manuální odečet


negativní 44 6 9

hraniční 0 0 0

pozitivní 4 8 89

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t Mikroskop manuální odečet

Int. 107

Result: ANCA ethanol jaderná, ANCA fomalín negativní,

MPO Bioplex < 0,2 negativní, PR3 Bioplex <0,2 negativní,

ANA IF 1:3200 centroméra

Int. 259

Result: ANCA ethanol jaderná, ANCA fomalín negativní,

MPO Bioplex 1,8 pozitivní, PR3 Bioplex <0,2 negativní,

ANA IF 1:3200 centroméra

Int. 93

Result: ANCA formalín jaderná,

ANCA ethanol jaderná, (Int. 1979)

MPO Bioplex < 0,2 negativní, PR3 Bioplex <0,2 negativní,

ANA IF 1:800 jemně zrnitý typ s pozitivní chromatinovou

ploténkou, 1:800 pozitivní cytoplazma (AMA)

Int. 67

Result: ANCA formalín cytoplazmatická,

ANCA ethanol jaderná, (Int. 349)

MPO Bioplex 2,0 pozitivní, PR3 Bioplex <0,2 negativní,

ANA IF 1:200 jemně zrnitý typ s pozitivní chromatinovou

ploténkou

Tabulka č. 1 a č. 2: Celková shoda v odečtu ANCA protilátek pomocí automatu NOVA View a vyhodnocením obrazů zkušeným operátorem byla 93,5%. Ze 140 nálezů byly výsledky upraveny pouze ve 2 případech na ethanolem fixovaných neutrofilech a v 17 případech na formalínem fixovaných neutrofilech. Ve většině případů se jednalo o úpravy automatem nerozpoznaných obrazů na

formalínem fixovaných neutrofilech. V jednom případě, byl automatem označený pozitivní obraz s jaderným typem fluorescence na formalínem fixovaných neutrofilech přehodnocen jako negativní. V případě negativních vzorků byla shoda 100%.

70 negativní cytoplazmatická jaderná

neg 23 0 0

Unrecognized 0 0 2

Cytoplasmic 0 7 0

Nuclear 0 0 38

NOVA View úprava operátorem Tab. č. 1ETHANOL

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t 70 negativní cytoplazmatická jaderná

neg 44 0 0

Unrecognized 8 6 2

Cytoplasmic 0 7 0

Nuclear 1 0 2

FORMALÍN NOVA View úprava operátorem Tab. č. 2

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t


neg 19 0 4

Unrecognized 0 0 2

Cytoplasmic 1 6 0

Nuclear 0 0 38

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t

Mikroskop manuální odečet Tab. č. 3ETHANOL


neg 42 2 0

Unrecognized 5 9 2

Cytoplasmic 0 7 0

Nuclear 2 0 1

FORMALÍN Mikroskop manuální odečet Tab. č . 4

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t

Tabulka č. 3 a č. 4: Celková shoda v odečtu ANCA protilátek pomocí automatu NOVA View a odečtem běžným fluorescenčním mikroskopem byla 90,0%. Nejčastěji byly neshodné obrazy na formalínem fixovaných neutrofilech, které automat vyhodnotil jako nerozpoznané. V těchto případech se většinou intenzita fluorescence pohybovala těsně nad hranicí cut-off.

Tabulka č. 5 a č. 6: Celková shoda v odečtu ANCA protilátek pomocí automatu NOVA View po vyhodnocení obrazů zkušeným operátorem a odečtem běžným fluorescenčním mikroskopem byla 87,1%. Větší shoda (90,0%) byla při odečtu na ethanolem fixovaných neutrofilech.


neg 47 6 0

Cytoplasmic 0 11 2

Nuclear 2 1 1NO

VA

Vie

w ú

pra

va

op

erá

tore

m

Mikroskop manuální odečet Tab. č. 6FORMALÍN

• Shoda v hodnocení imunofluorescenčních obrazů na Hep-2 buňkách a fixovaných neutrofilech pomocí automatu NOVA View / po úpravě zkušeným operátorem / odečtem běžným fluorescenčním mikroskopem byla velmi vysoká. Pohybovala se v rozmezí 79,7 - 93,5 % podle typu vyšetření.

• Nejnižší shoda v případě ANA IF obrazů byla mezi homogenní a jemně zrnitou IF s pozitivní chromatinovou ploténkou. Vzhledem k pravděpodobné přítomnosti anti-DSF 70 protilátek by bylo zajímavé srovnání IF obrazů po vysycení vzorků sér DSF 70.

• V případě ANCA IF je nevýhodou menší počet neutrofilů na digitálních obrázcích. Nejnižší shoda obrazů byla při odečítání na formalínem fixovaných neutrofilech. Bylo by vhodné rozšířit studii vyšetřením pozitivních nebo neurčitých vzorků na přítomnost anti-MPO a anti-PR3, popř. širší typizaci ANCA.

• Přestože je nutná validace výsledků zkušeným operátorem, vzdálený přístup k systému umožňuje z různých přístupových míst a kdykoliv i průběžně vyhodnocovat, konzultovat a odesílat IFA obrazy.

• Automatizace odečtu imunofluorescenčních obrazů umožňuje standardizaci a zvyšuje objektivizaci odečtů. Z hodnot intenzity fluorescence lze metodu kvantitativně verifikovat (reprodukovatelnost a opakovatelnost).

• Digitalizace IFA obrazů umožňuje jejich archivaci, sledování jednotlivých nálezů pacientů v čase, porovnání nálezů různých typů vyšetření vzájemně nebo s atlasem IFA obrazů. Systém je možné využívat k edukaci, proškolování, konzultaci sporných obrazů.

• Komunikace automatu s laboratorním informačním systémem zamezuje přepisové chyby, umožňuje snadno zadávat doplňující vyšetření.

1:80 1:320

1:2560

1:1280 1:640 1:160

1:80 1:320 1:1280 1:640 1:160

Autotiter: 1:1280

Odečtený titr: 1:1280

Autotiter: 1:2520

Odečtený titr: 1:2520

Celkem

160

Ho

mo

gen

ní

Ho

mo

gen

ní až jem

ně

zrn

itý s

po

zit

ivn

í

ch

rom

ati

no

vo

u

plo

tén

ko

u

Jem

ně z

rnit

ý s

po

zit

ivn

í

ch

rom

ati

no

vo

u

plo

tén

ko

u/D

SF

70

Jem

ně z

rnit

ý

Hru

bě z

rnit

ý

Zrn

itý

Nu

kle

olá

rní

Sm

íšen

ý t

yp

: zrn

itý,

nu

kle

olá

rní

Sm

íšen

ý t

yp

: jem

ně

zrn

itý s

po

zit

ivn

í

ch

rom

ati

no

vo

u

plo

tén

ko

u, n

ukle

olá

rní

Sm

íšen

ý t

yp

: jem

ně

zrn

itý, n

ukle

olá

rní

Cen

tro

méra

NU

MA

Mn

oh

očetn

é jad

ern

é

tečky

Sm

íšen

ý t

yp

: jem

ně

zrn

itý s

po

zit

ivn

í

ch

rom

ati

no

vo

u

plo

tén

ko

u, m

no

ho

četn

é

jad

ern

é t

ečky

Oje

din

ělé

jad

ern

é t

ečky

PC

NA

neg

ati

vn

í

Shoda [% ]

Homogeneous 44 7 1 31 4 1 18,2

Specled 10 1 1 7 1 80,0

Nucleolar 7 6 1 85,7

Dots 2 1 1 50,0

Unrecognized 31 13 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,0

Centromere 7 1 6 85,7

neg 59 1 2 1 53 93,2

NO

VA

Vie

w a

uto

ma

t

Typ fluorescence

NOVA View úpravy operátorem

Typ

flu

ore

scen

ce


neg 19 0 4

Cytoplasmic 1 6 0

Nuclear 2 0 38

ETHANOL Mikroskop manuální odečet Tab. č. 5

NO

VA

Vie

w ú

pra

va

op

erá

tore

m

Celkem

38 Homogenous Speckled Nuckleolar Centromere Dots

Shoda 7 3 1 1 1 0

± jeden titr 22 15 4 1 0 1

Neshoda 9 2 1 3 3 0

Autotiter

Typ fluorescence

http://cz.werfen.com/

Documents

RSHUiWRUHP a automatickým mikroskopem NOVA Vie · 2 Werfen Czech s.r.o, Praha Cíl Cílem práce je shrnutí zkušeností s automatizací odečtu antinukleárních protilátek (ANA)