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Résumé
Le stage a été réalisé au sein de la plate forme d’imagerie de l’IBDML à Luminy. Il
avait pour objectif de mettre en place le suivi du fonctionnement des appareils de la
plate forme en utilisant des tests de métrologie.
Les tests métrologiques sont classés en 4 niveaux.
Pour ce stage, des fiches de suivi compilant les résultats des tests métrologiques de
Niveau 1 ont été réalisés. Ces fiches contiennent les résultats des tests suivants :
suivi de la puissance de la source d’illumination
homogénéité du champ d’illumination
coalignement
Ces tests ont été réalisés sur 2 types d’appareil :
un microscope confocal : LSM 510 (Zeiss)
un microscope à champ plein : AxioImager M2 (Zeiss)
En parallèle de ce suivi des appareils, des tests métrologiques ont été effectués pour
des problèmes spécifiques sortant du cadre général et pour valider l’intervention du
SAV sur les différents appareils.
En dehors de l’aspect métrologie, cette expérience m’a aussi permis de me rendre
compte du mode de fonctionnement quotidien d’une plateforme technologique.
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Remerciements
Je remercie dans un premier temps toutes les personnes au sein de l’IBDML pour
leur accueil et pour la bonne ambiance qu’il règne entre les membres des différentes
équipes.
Je tiens à remercier plus particulièrement tous les membres du service imagerie:
Mme Elsa Crudeli pour son aide sur les différents vidéo microscopes de la plate
forme.
M. Claude Moretti pour ses conseils avisés et l’entrain qu’il communique à toute
l’équipe.
M. Fabrice Daian pour son aide lors de l’utilisation de MATLAB que ce soit pour la
formation sur ce logiciel ou la création de programmes originaux.
M. Cédric Matthews pour son expertise et pour son professionnalisme ainsi que pour
sa rigueur et son amour du travail bien fait et non « vite fait ». Je le remercie
également pour son aide à la rédaction et pour les corrections apportées ce rapport.
Je remercie également les membres du service informatique Dominique Brandli, Eric
Rollee et Patrick Dru pour leur disponibilité lors de soucis ou pour leurs conseils
concernant l’informatique.
Pour finir, je tiens à remercier tous les membres des autres équipes pour toutes les
sorties organisées (calanques, laser game, volley…) qui ont participé à mon
intégration dans cette structure.
0.0
Liste d’abréviations
ROI = « Region Of Interest » région d’intérêt délimitée dans une image
AOTF = l’AOTF (accoustical optical tunable filter) est un filtre de la lumière
d’excitation actif pour la lumière d’excitation. Il permet de sélectionner une longueur
d’onde pour la lumière d’excitation et il sert à moduler la puissance de cette lumière.
GSV = (Gray Scale Value) valeur en niveau de gris caractérisant l’intensité
lumineuse d’un pixel. Ces valeurs sont comprises dans une échelle graduée de 0 à
255 pour les images codées en 8 bits. Le O correspond au noir et la valeur 255 est le
blanc pour cette échelle.
Dapi = combinaison de filtres dans le trajet optique pour avoir une lumière
d’excitation dans l’UV et une émission dans le bleu (pic d’excitation du fluorophore =
365nm ; pic d’émission > 397nm).
FITC = combinaison de filtres dans le trajet optique pour obtenir une lumière
d’excitation dans le bleu et une émission dans le vert (pic d’excitation du fluorophore
= 470nm ; pic d’émission = 535nm).
Rhodamine = combinaison de filtres dans le trajet optique pour avoir une lumière
d’excitation dans le vert et une émission dans le rouge (pic d’excitation du
fluorophore = 546nm ; pic d’émission > 590nm).
CV = coefficient de variation. Le CV correspond au rapport de l’écart type sur la
moyenne pour une ROI d’une image. Cet indicateur permet d’évaluer la qualité d’une
image dans le rapport signal sur bruit.
PSF = « point spread function » fonction de dispersion optique d’un système.
Stack = pile d’images. Le stack désigne une suite d’acquisitions successives dans
une même dimension comme une pile d’images dans l’axe Z.
Plugin MetroloJ = Plugin fonctionnant sous Image J qui permet l’analyse de certains
test métrologiques (homogénéité du champ d’illumination, mesure de la PSF,
coalignement, …) développé par M. Fabrice P. Cordelières et M. Cédric Matthews.
1
Sommaire
1. Introduction ..................................................................................................................................................................... 2
1.1. Présentation de la structure d’accueil ............................................................................................................... 2
1.2. Mise en place de la démarche qualité ............................................................................................................... 2
1.3. La métrologie ........................................................................................................................................................ 3
2. Description des tests métrologiques pour l’élaboration des fiches de suivi........................................................... 5
2.1. Description des deux appareils suivis ............................................................................................................... 5
2.2. Les tests métrologiques de niveau 1 ................................................................................................................. 5
2.2.1. Le suivi de la source d’illumination ........................................................................................................... 5
2.2.2. Le test d’homogénéité du champ d’illumination ..................................................................................... 7
2.2.3. Le test de coalignement ............................................................................................................................. 9
2.2.4. Les fiches de suivi de niveau 1 ............................................................................................................... 12
2.3. Test métrologiques de niveau 2 : la mesure de la PSF ................................................................................ 13
2.3.1. Préparation des lames de billes pour les mesures de PSF : .............................................................. 13
2.3.2. Mesure de la PSF ..................................................................................................................................... 14
3. Les tests répondant à une problématique particulière ............................................................................................ 16
3.1. Détermination de l’usure d’un cube de filtre FITC sur un AxioPlan 2 Imaging .......................................... 16
3.2. Test de comparaison de puissance laser sur le LSM 510 ............................................................................ 17
3.2.1. Mesure de la transmission du miroir quadri-bande à l’excitation ...................................................... 18
3.2.2. Transmission du miroir dichroïque quadri-bande à l’émission ........................................................... 18
4. Tests de vérification suite à une intervention du SAV ............................................................................................ 20
4.1. Etude du dysfonctionnement de la diode laser à 405 nm (UV) du LSM 510 META ................................. 20
4.1.1. Contexte ..................................................................................................................................................... 20
4.1.2. Tests réalisés avant l’intervention de Zeiss .......................................................................................... 21
4.1.3. Suivi de la diode laser après l’intervention du SAV ............................................................................. 22
4.2. Test de coalignement sur un microscope à champ plein sans déplacement en Z motorisé ................... 23
5. Développement d’outils d’analyse ............................................................................................................................. 24
5.1. Le Logiciel de programmation MATLAB ......................................................................................................... 24
5.2. Exemple de programme sous MATLAB le « programme billes » .............................................................. 25
6. Cadre de réalisation des tests .................................................................................................................................... 26
6.1. Détermination de la fréquence des tests pour le suivi des appareils .......................................................... 26
6.2. Communication des tests aux utilisateurs ...................................................................................................... 27
6.3. Définition des tolérances pour les tests métrologiques ................................................................................ 28
6.4. Amélioration des connaissances sur les machines utiles pour l’acquisition de nouveaux appareils ..... 28
6.5. Perspectives........................................................................................................................................................ 29
6.6. Conclusion ........................................................................................................................................................... 29
Bibliographie ........................................................................................................................................................................... 30
Annexes
2
1. Introduction
1.1. Présentation de la structure d’accueil
Le service imagerie de l’IBDML (Institut de Biologie de Développement de Marseille-
Luminy) fait partie intégrante de la plate forme d’imagerie PICsL (Plateforme
d’Imagerie Commune du site de Luminy). Cette plateforme regroupe les
équipements présents au sein de l’IBDML et au sein du CIML (Centre d’Immunologie
de Marseille-Luminy), tout deux situés à Luminy. Depuis 2006, cette structure est
labélisée IBiSA (Infrastructures en Biologie Sante et Agronomie) et regroupe un
grand nombre d’instruments optiques.
Le but de mon stage au sein du service imagerie de l’IBDML est de mettre en place
des tests métrologiques sur les différents appareils de la plateforme. La mise en
place de ces tests permet le suivi et l’optimisation des performances des appareils.
1.2. Mise en place de la démarche qualité
Depuis quelques années, il est demandé aux laboratoires de mettre en place une
démarche qualité. Cette recommandation s’applique à toutes les structures et
laboratoires des instituts publics. La mise en place de cette démarche vise à
améliorer le fonctionnement, l’organisation et la lisibilité des différents services au
sein d’un institut. Au sein du service d’imagerie de l’IBDML, cette mise en place de la
démarche qualité est assurée par Elsa Crudeli. La démarche qualité nécessite
notamment la mise en place du suivi des performances des machines de la
plateforme selon des protocoles bien établis et robustes. Ce suivi permet tout
d’abord d’assurer le maintien des performances et de le rendre accessible auprès
des utilisateurs. C’est dans ce contexte que des tests métrologiques sont effectués
sur les différents appareils.
3
1.3. La métrologie
La métrologie est la science des mesures en utilisant des étalons stables. Le groupe
de travail MRCT/RTmfm (Missions Ressources et Compétences
Technologiques/Réseau Technologique Microscopie Photonique de Fluorescence
Multidimensionnelle) a défini 4 niveaux différents de tests métrologiques. Ces
différents niveaux hiérarchisent un ensemble de tests qui rendent compte de seuils
de performance progressif d’un appareil.
Niveau 1 : homogénéité du champ d’illumination, contrôle du coalignement, suivi de
la source d’illumination.
Niveau 2 : stabilité des accessoires périphériques (hygrométrie, température…)
Niveau 3 : mesure de la PSF
Niveau 4 : contrôle de la dérive en x, y et z au cours du temps
Des protocoles de tests correspondants aux différents niveaux ont été créés par le
réseau métrologie RTmFm. Ces tests ont été réalisés en s’inspirant d’articles
concernant la métrologie comme ceux de Robert M. Zucker ou J.M. Zwier. Suite à la
création de procédures de tests métrologiques, ce réseau a mis en place un outil
d’analyse de données sur les images acquises : MetroloJ qui est un plugin
fonctionnant sous le logiciel Image J. Ce plugin permet l’analyse des données issues
des différents tests métrologiques. En Annexe 1, des exemples de rapports créés
par ce logiciel sont présentés. Les données contenues dans ces rapports sont
extraites et permettent l’élaboration des fiches de suivi des différents appareils.
4
L’élaboration des fiches de suivi des tests métrologiques de niveau 1 est l’un des
objectifs principaux de ce stage. La création de ces fiches nécessite une
connaissance des différents appareils de la plateforme et une maitrise des différents
tests métrologiques. La réalisation de cet objectif a aussi fait appel à la création de
procédures d’analyse à l’aide d’outils informatiques existants (MetroloJ) ou à
développer (programme sous MATLAB).
Dans ce rapport seront présentés :
1. Les tests métrologiques pour l’élaboration des fiches de suivi
2. Les tests ciblés répondant à une problématique particulière
3. Les tests effectués lors d’une intervention du SAV
4. Le développement d’outils d’analyse
5. L’implication de la métrologie au sein d’une plateforme d’imagerie ainsi qu’un
bilan de ce stage
Figure 3 : Organigramme du test de suivi de la puissance de la source d’illumination
en sortie d’objectif pour différentes longueurs d’ondes
5
2. Description des tests métrologiques pour l’élaboration des fiches de suivi
2.1. Description des deux appareils suivis
La plateforme d’imagerie étant composée d’un grand nombre d’équipements, deux
appareils ont été choisis pour en effectuer un prototype de suivi. Le LSM 510 et un
AxioImager M2 de ZEISS sont choisis afin d’appliquer les tests métrologiques
respectivement sur un microscope confocal et un microscope à champ plein.
2.2. Les tests métrologiques de niveau 1
2.2.1. Le suivi de la source d’illumination
Ce test à pour but de vérifier la stabilité de la puissance de la source d’illumination
que ce soit sur un microscope à champ plein ou un confocal. La puissance de la
source d’illumination est mesurée en sortie d’objectif x10 à l’aide d’un puissance-
mètre (THORLABS PM100D calibré le 23/04/2009). Les variations de puissance sont
enregistrées sur 2 minutes pour tous les filtres de fluorescence du microscope à
champ plein et pour les raies laser 488, 543 et 633 sur le confocal. Le choix du miroir
dichroïque primaire est adapté en fonction de la raie laser que l’on désire suivre sur
le LSM 510. La procédure pour réaliser ce test est présentée dans la Figure 3 sous
forme d’organigramme. Les données issues de ces tests sont extraites du
puissance-mètre et analysées dans des tableaux Excel pour obtenir les Figures 4 et
5.
Dans la Figure 4, les deux tableaux correspondent aux résultats d’un test de suivi de
la source d’illumination pour les 2 appareils. Le temps t=0 correspond au début du
test et le temps t=2minutes indique la fin du relevé de puissance. Le rapport t=0 sur
t=2minutes correspond à la variation de la puissance sur 2 minutes (100% = pas de
variation sur 2 minutes). Pour le microscope à champ plein AxioImager M2, la
variation de la puissance de la source d’illumination est toujours inférieure à 5% sur 2
minutes quelque soit le filtre utilisé. Ce résultat montre une stabilité de la source
d’illumination de la lampe Fluo sur cet appareil. Pour le confocal LSM 510, une
variation de la puissance laser inférieure à 5% est également observée quelque soit
la raie laser.
Figure 5: Compilation des résultats des tests de suivi de la puissance de la source
d’illumination à différentes dates : (A) graphique pour l’Axio Imager M2, (B) graphique pour le
LSM 510
Figure 4: résultats des tests de suivi de la puissance de la source d’illumination : (A) test du
13/07/2010 sur l’AxioImager M2, (B) test du 2/08/2010 sur le LSM 510
A
A
B
B
6
Dans la Figure 5, les puissances moyennes sur 2 minutes pour le microscope à
champ plein et le confocal à différentes dates sont représentées. Ces puissances
moyennes varient peu au cours du temps à part pour la raie 633 sur le LSM 510.
Une diminution progressive de la puissance de cette raie laser est observée. Cette
diminution pourrait indiquer un vieillissement du laser He-Ne ou un problème
d’alignement sur le banc optique.
La Figure 6 montre les variations normalisées des puissances des différentes raies
lasers pendant deux minutes. Cette normalisation est faite en fixant à 1 la valeur
maximale de la puissance laser pour chaque raie laser. Des variations cycliques de
faibles amplitudes sont observées pour les différentes raies lasers. Ces fluctuations
sont liées aux propriétés de la source d’illumination et/ou au système de régulation
de la puissance laser : l’AOTF*.
Le suivi de la puissance de la source d’illumination permet de contrôler les variations
de puissance de la source d’illumination sur deux échelles de temps différentes :
A court terme pour observer les variations cycliques dues à la nature de la
source d’illumination et du régulateur de la puissance.
A long terme pour voir l’évolution de l’état des sources d’illumination au cours
du temps et/ou de l’alignement de l’ensemble des optiques.
Figure 6 : Variation normalisée de la puissance laser sur 2 minutes pour les
raies 488, 543 et 633 sur le LSM 510 le 2/08/2010
Figure 7: Organigramme du test d’homogénéité de champ avec une lame miroir sur le
confocal et une lame de polymère fluorescent sur le microscope à champ plein
7
2.2.2. Le test d’homogénéité du champ d’illumination
Deux méthodes différentes mais complémentaires pour l’analyse fournie sont
utilisées pour tester l’homogénéité du champ d’illumination :
L’homogénéité de champ en réflexion à l’aide d’une lame miroir pour le
microscope confocal et avec une lame de polymère fluorescent pour le
microscope à champ plein
L’homogénéité de champ avec des billes stables en fluorescence
La Figure 7 détaille les grandes étapes du test pour la première méthode. Les
acquisitions sont réalisées avec la raie 488 sur le confocal et le filtre FITC* sur le
microscope à champ plein.
Les résultats présentés dans la Figure 8 sont des données extraites du rapport
généré par le menu « Generate field illumination report » du plugin MetroloJ sous
Image J. Un rapport complet issu de ce plugin est présenté dans l’Annexe 1. Sur ces
images sont présentées la variation de l’intensité du signal sur le champ
d’observation en prenant pour point de référence le pixel où le signal est maximum.
Ces images seront disponibles pour les utilisateurs s’ils souhaitent corriger leurs
images de l’inhomogénéité du champ d’illumination.
Figure 8 : résultats des tests d’homogénéité de champ ; (A) utilisation de la lame
miroir sur le LSM 510 (B) utilisation de la lame Chroma sur le microscope à champ
plein
A B
Figure 9: Organigramme du test d’homogénéité de champ avec des billes
fluorescentes stables
8
La Figure 9 présente la deuxième méthode utilisant les billes fluorescentes.
Cette méthode permet de confirmer les observations faites avec la première
méthode. Cette méthode consiste à mesurer la différence d’intensité de signal
fluorescent d’un groupe de billes entre le centre du champ d’illumination et sa
périphérie.
La procédure d’analyse se fait manuellement sous Image J pour l’instant mais le
« programme billes » (Cf.5.2) a pour objectif d’automatiser la procédure d’analyse de
ce test.
Sur les images de la Figure 10, la plus grande variation observée est inférieure à
30% entre le centre et la périphérie du champ d’illumination.
A B
Figure 10: résultats des tests d’homogénéité de champ avec des billes
fluorescentes ; (A) test sur le LSM 510, (B) test sur l’AxioImager M2
A B
Figure 11 : suivi de l’homogénéité de champ pour les deux méthodes à différentes
dates; (A) pour le LSM 510, (B) pour l’AxioImager M2
Figure 12: Organigramme du test de coalignement pour un microscope confocal
extrait de la notice d’utilisation du plugin MetroloJ
9
Dans la Figure 11 est présentée la variation de l’homogénéité du champ
d’illumination en fonction du temps mesurée avec les 2 méthodes. Les variations
maximales d’intensité en X et en Y issue des différents tests sont représentées dans
ces graphiques.
Une variation de moins de 25% est obtenue dans la dimension du champ
d’observation de l’objectif x10, pour le test avec les billes fluorescentes que ce soit
en X ou en Y confirmant une bonne homogénéité du champ d’illumination pour les 2
appareils conformément à un article de Zucker de 2006 (Quality Assessment of
Confocal Microscopy Slide Based Systems: Performance).Dans le cas de la mesure
effectuée en réflexion, on observe une grande variabilité à différentes dates que l’on
ne retrouve pas dans la méthode de mesure utilisant des billes fluorescentes. Nous
pensons que cette divergence pourrait être liée à un problème de planéité lors du
repositionnement de la lame miroir au renouvellement de l’expérience. Un test de
planéité reste donc à réaliser. Il est à noter que des tests de planéité sont en cours
d’élaboration pour garantir l’horizontalité de la lame sur son support.
2.2.3. Le test de coalignement
Le test de coalignement est effectué afin de vérifier l’alignement entre les différentes
voies optiques d’un appareil. Ce test est extrêmement important car il est un
préalable à la mesure de colocalisation fréquemment utilisée en biologie. La
procédure détaillée de ce test est présentée dans la Figure 12.
Ce test consiste à effectuer un Z-stack sur 1 bille d’une lame test (Lame spherotech
Rainbow FPS 10057, diamètre des billes =10µm) pour les longueurs d’onde utilisées
classiquement pour les expériences de colocalisation. Dans notre cas, les couples
de longueurs d’onde d’excitation et d’émission suivis sont :
Microscope confocal Microscope à champ plein
λ excitation λ émission λ excitation λ émission
488 520 365 (Dapi) 420
543 570 470 (FITC) 520
633 670 546 (Rhodamine) 620
Figure 13: résultats des tests de coalignement sur 3 canaux ; (tab A) sur le LSM 510,
(tab B) sur l’AxioImager M2
Figure 14: suivi des résultats des tests de coalignement sur 3 canaux en fonction du
temps sur le LSM 510
tab A tab B
10
L’onglet coalignement report du plugin MetroloJ donne en sortie la position du centre
de gravité de la bille par voie lumineuse (pixel où se trouve le maximum d’intensité)
ainsi que la distance entre ces centres de gravité. Ce rapport fournit aussi les
résolutions optiques théoriques calculées à partir de l’ouverture numérique de
l’objectif et des longueurs d’onde d’émission. Un rapport de coalignement est
présenté dans l’Annexe 1.
Les coordonnées de la position des centres de gravité de la bille pour les différentes
longueurs d’onde d’émission à un temps donné sont présentées dans la Figure 13. Il
figure aussi dans ces tableaux le rapport entre les distances mesurées entre les
centres de gravité des différentes voies optiques et les résolutions optiques
théoriques calculées. Il a été fixé de façon empirique que si le rapport entre les
centres de gravité des différentes voies optiques et les résolutions optiques
théoriques est supérieure à 2 le test de coalignement ne sera pas validé. Nous
observons un rapport qui est inférieur à 2 pour les deux appareils.
Les Figures 14 et 15 montrent le suivi des distances entre les centres de gravité des
différents canaux en fonction du temps pour les 2 appareils.
Pour le LSM 510, dans la Figure 14, les distances entre les centres de gravité des
différents canaux se révèlent faibles : 1,5 µm pour la distance la plus élevée entre la
raie 543 et la raie 633 le 10/05/2010.
Les écarts de position entre les centres de gravité peuvent être du aux aberrations
chromatiques. L’ampleur de ces aberrations est en relation avec la correction
effectuée par l’objectif. Les objectifs Apochromatiques sont ceux qui corrigent le
mieux les aberrations chromatiques et ce sont ceux qui ont été choisis pour les tests
de coalignement.
Pour l’AxioImager M2, dans la Figure 15, une grande variabilité des distances
mesurées à différentes dates est observée entre les différents canaux. Les canaux
FITC et Rhodamine sont co-alignés car la distance entre les centres de gravité de
ces canaux reste dans un intervalle de valeurs conforme à nos exigences.
Figure 16: variation de la distance entre les centres de gravité des canaux
DAPI et Rhodamine pour les axes X, Y et Z en fonction du temps
Figure 15 : suivi des résultats des tests de coalignement sur 3 canaux en fonction du
temps sur l’AxioImager M2
11
Dans la Figure 15, un problème de stabilité de la distance mesurée entre le Dapi et
la Rhodamine et entre le Dapi et le FITC est révélé. Il semble donc qu’un problème
vienne du chemin optique incluant la combinaison de filtres pour le Dapi, une étude
plus approfondie est donc menée.
Dans la Figure 16 est présentée la variation au cours du temps entre les 2 filtres
ayant les longueurs d’onde en émission les plus éloignées, pour les tests de
coalignement sur l’AxioImager M2, que sont le DAPI et la Rhodamine. Ce graphique
montre que le problème de coalignement provient d’un décalage en Z car les canaux
DAPI et Rhodamine sont co-alignés dans les axes X et Y.
Ce décalage en Z serait probablement du au fait que l’objectif x40 installé sur cet
appareil n’est pas bien corrigé des aberrations chromatiques pour les longueurs
d’onde proche de l’UV. Cependant, la fluctuation observée n’est pas explicable. Ce
test est donc à adapter pour avoir des mesures de coalignement non biaisées sur cet
appareil.
Pour conclure sur ce test, nous pouvons confirmer que le LSM 510 permet des mises
en évidences de co-localisation de marqueurs fluorescents sans biais que ce soit en
X, Y ou Z. Par contre, L’AxioImager M2, en l’état, avec l’objectif 40x (40x plan
néofluar ph3 dic 3) ne sera pas adapté pour montrer que des marqueurs fluorescents
sont co-localisés dans l’axe Z.
Fiche de suivi de niveau N1 du LSM 510 (salle 926) n°SIP 41146 Dernière mesure le 2/08/2010
Suivi de la mesure de puissance des raies laser 488,543 et 633
Evolution au cours du temps des différentes raies lasers avec les dichroïques primaires adaptés
Variation de la puissance des différents lasers en mW sur 2 minutes
Les mesures de puissance laser sont effectuées 20 minutes après l’allumage des lasers, en sortie d’objectif x10 et avec l’AOTF réglé à 100%
Suivi de l’homogénéité de champ pour la raie laser 488
Variation maximale de l’intensité du centre à la périphérie en fonction du temps pour les axes X et Y
Homogénéité avec une lame miroir
Masque de correction :
Homogénéité avec des billes fluorescentes
Suivi du coalignement pour les raies laser 488, 543 et 633
Suivie de la distance normalisée entre les canaux au cours du temps
Projection des 3 canaux sur les différents axes
Utilisation de l’objectif x63 pour les tests de coalignement
Personne ayant réalisé les tests : Mise en place le :
Corrélation entre les 2 méthodes : Moyenne
Figure 17: Fiche de suivi de niveau 1 du confocal LSM 510
12
2.2.4. Les fiches de suivi de niveau 1
Les procédures des différents tests métrologiques de Niveau 1 ont été détaillées
précédemment. A partir des résultats extraits de ces tests, des fiches récapitulatives
sont créées. Ces fiches de suivi ont pour but de compiler tous les résultats obtenus
et de les rendre visibles et compréhensibles pour les utilisateurs des appareils.
Les fiches de suivi de niveau 1 pour le LSM 510 et l’AxioImager M2 sont présentées
dans les Figures 17 et 18. Sous l’inscription masque de correction sera disponible le
lien de l’image originale correspondant au test d’homogénéité de champ. Un
programme sera développé par la suite permettant à l’utilisateur de corriger les
variations d’homogénéité du champ d’illumination sur ses propres images.
Les 2 fiches de suivi possèdent la même présentation générale :
Dans la colonne de gauche sont regroupés les résultats cumulés des
différents tests métrologiques à différentes dates.
Dans la colonne de droite sont placés les résultats des tests à un temps
donné (les derniers tests réalisés sur l’appareil avant la rédaction de la fiche).
Dans l’entête sont regroupés : le nom de l’appareil, le niveau de la fiche de suivi,
le numéro SIP qui correspond au numéro d’identification de l’instrument ainsi que
la date du dernier relevé de mesure. Tous les résultats des tests à un temps
donné correspondent aux tests effectués à cette date.
En haut se situent les résultats des tests portant sur la puissance de la source
d’illumination.
Au milieu, les tests concernant l’homogénéité du champ d’illumination.
En bas, les résultats des tests de coalignement.
En pied de page figure le logo de l’IBDML, le nom de la personne ayant réalisée
les tests et la date où la fiche de suivi a été mise en place.
Cette disposition devra rester identique pour les prochaines fiches de suivi de niveau
1 des autres appareils de la plate forme pour garder une cohérence et améliorer la
lisibilité des fiches par les utilisateurs.
Fiche de suivi de niveau N1 de l’AxioImager M2 salle 730 n°SIP 50245 Dernière mesure le 13/07/2010
Suivi de la mesure de puissance de la lampe à mercure
Evolution au cours du temps de la puissance de la lampe mercure en mW pour les différents canaux
Variation de la puissance de la lampe mercure en mW pour les différents canaux sur deux minutes
Suivi de l’homogénéité de champ pour le filtre FITC
Variation maximale de l’intensité du centre à la périphérie en fonction du temps pour les axes X et Y
Homogénéité avec une lame chroma
Masque de correction :
Homogénéité avec des billes fluorescentes
Suivi des canaux DAPI, FITC et Rhodamine et test de coalignement
Suivi de la distance entre les canaux au cours du temps
Projection des 3 canaux sur les différents axes
Personne ayant réalisé les tests : Mise en place le :
Utilisation de l’objectif x10 pour les
tests d’homogénéité de champs
Corrélation entre les 2 méthodes : bonne
Utilisation de l’objectif x40 pour les tests de coalignement
Mesures de puissances réalisées, 20 minutes après
l’allumage de la lampe, en sortie d’objectif x10
Figure18 : Fiche de suivi de niveau 1 du microscope à champ plein AxioImager M2
13
2.3. Test métrologiques de niveau 2 : la mesure de la PSF
La PSF* (Point Spread Function) ou fonction de dispersion optique d’un système
consiste à imager un objet ponctuel d’un diamètre inférieur à la résolution optique du
système sur lequel la mesure est effectuée. La PSF permet d’extraire les valeurs de
résolutions en X, Y et Z d’un appareil optique.
La mesure de PSF a tout d’abord été réalisée avec des lames commerciales mais
ces tests ne se sont pas avérés concluants. Une mauvaise fixation des billes aux
lames rendait la réalisation de mesure de PSF impossible à cause de leurs mobilités.
2.3.1. Préparation des lames de billes pour les mesures de PSF :
Matériel utilisé :
Solution de billes Invitrogen T7284 (d=0,1 µm)
Milieu de montage (P7220 Component Molecular Probes)
Lame porte objet recouverte de polylysine et lamelle d’épaisseur 0,17mm
Une dilution en cascade jusqu’au 1/10000e dans de l’eau distillée est effectuée avec
la solution de billes. La dilution au 100e possède la meilleure dispersion des billes
après observation des différentes dilutions au microscope. C’est cette dilution qui est
choisie pour la préparation des lames de billes.
2 lots de lames sont réalisés en triple :
1er lot de lames 2e lot de lames
dépôt d’une goutte de solution de
billes (< 1µL) sur la lamelle, étaler la
goutte avec une lamelle, laissé
sécher 5-10 minutes
Dépôt sur la lame du milieu de
montage (P7220 Component
molecular probes)
Montage lame-lamelle avec du vernis
dépôt d’une goutte de solution de
billes (< 1µL) sur la lame, étaler la
goutte avec une lamelle, laissé
sécher 5-10 minutes
Dépôt sur la lame du milieu de
montage (P7220 Component
molecular probes)
Montage lame-lamelle avec du vernis
Figure 19: Organigramme du test de la mesure de PSF sur le confocal LSM 510 extrait
de la notice d’utilisation du plugin MetroloJ
14
Une présence importante d’agrégats est observée dans les lames du lot 2 par
rapport au lot 1 lors de la mise au point sur les lames. Les mesures de PSF
s’effectueront essentiellement sur les lames du lot 1 (dépôt de la solution de billes
sur la lamelle) qui présentent de meilleures conditions pour réaliser des mesures de
PSF.
2.3.2. Mesure de la PSF
La procédure détaillée pour effectuer des mesures de PSF sur le LSM 510 est
décrite dans la Figure 19. Sur l’AxioImager M2, la procédure consiste à :
faire la mise au point sur la bille avec l’objectif controlé (x40) et le filtre FITC
ajuster le temps d’exposition pour ne pas avoir de pixel saturés
faire un Z-stack avec une taille des pas en Z inférieur au diamètre de la bille
(0,1µm)
Le Z stack est sur-échantillonné afin d’avoir un recouvrement des différents Z et
d’améliorer le rapport signal sur bruit sur l’ensemble de la PSF.
La Figure 20 présente les projections du Z-stack de la bille de 0,1µm. Ces
projections sont extraites du rapport issu du programme MetroloJ « generate PSF
report ». Cette figure permet de se rendre compte de la déformation d’une source
ponctuelle traversant l’optique d’un appareil. Un rapport complet d’une mesure de
PSF issu du programme MetroloJ est présenté dans l’Annexe 1.
La mesure de la PSF se fait par l’intermédiaire de la FWHM (Full Width at Half
Maximum) qui est la largeur du pic à mi-hauteur de l’intensité maximale. La
régression pour la mesure de la FWHM est calculée par le programme MetroloJ pour
les différents axes ainsi que les valeurs de résolution théoriques à partir de
l’ouverture numérique de l’objectif et de la longueur d’onde d’émission.
Figure 20: Projection d’un Z-stack selon les différents axes d’une bille de 0,1µm de
diamètre pour : (A) le LSM 510, (B) l’AxioImager M2
A B
Figure 21: mesure de FWHM calculée par le programme MetroloJ
pour ; (A) le LSM 510, (B) l’AxioImager M2
Figure 22: mesure de FWHM calculée par le programme MetroloJ
pour ; (A) le LSM 510, (B) l’AxioImager M2
15
Dans la Figure 21, les valeurs des FWHM pour le LSM 510 selon les différents axes
sont présentées. Le rapport FWHM sur FWHM théorique permet de déterminer
l’écart entre la valeur mesurée et la valeur théorique. Pour cet appareil, ce rapport
est inférieur à 2 sauf selon l’axe Y où le rapport atteint 2,02.
La Figure 22 présente les mesures de FWHM expérimentales et théoriques ainsi
que le rapport entre les deux sur l’AxioImager M2. Les valeurs du rapport sont toutes
inférieures à 2 que ce soit pour l’axe X, Y ou Z.
Si le rapport entre la valeur théorique de la FWHM et la valeur expérimentale est
supérieur à 2, l’écart entre les deux valeurs est considéré comme trop important ce
qui indique une mauvaise résolution du système optique vérifié.
Les deux appareils testés ont des valeurs comprises dans les tolérances pour le test
de PSF.
Figure 23 : Organigramme d’un test pour déterminer l’usure d’un cube de filtre fluorescent
16
3. Les tests répondant à une problématique particulière
Ces tests font suite à des observations émises par des utilisateurs et permettent
d’évaluer des problèmes spécifiques sur les différents instruments de la plate forme.
Cela permet l’identification de l’origine d’un problème ou la mise en évidence d’une
pièce défectueuse.
Dans cette partie, deux tests seront abordés : le premier concernant l’évaluation de
l’usure de filtre sur un microscope à champ plein et le deuxième portant sur
l’évaluation des performances d’un miroir dichroïque sur un microscope confocal. La
description de 2 miroirs dichroïques et d’un cube de filtre fluorescent est faite dans
l’Annexe 2.
3.1. Détermination de l’usure d’un cube de filtre FITC sur un AxioPlan 2 Imaging
Ce test a pour point de départ la remarque faite par un utilisateur qui observait un
signal très faible sur ces échantillons en utilisant une bande d’excitation dans le bleu
et une bande d’émission dans le vert. Le cube de filtre FITC permet de réaliser ce
type d’acquisition. Un test a donc été réalisé pour déterminer l’origine du problème.
Pour ce test, un cube de filtre FITC neuf ayant les mêmes caractéristiques que le
cube de filtres supposé usé est utilisé. Ce cube de filtre neuf est utilisé comme
référence. La procédure de ce test est détaillée dans la Figure 23.
L’intégralité du rapport de ce test est présentée dans la Figure 24. Ce rapport
conclut qu’une perte d’environ 40% du signal lors de l’utilisation du cube de filtre usé
par rapport au cube de filtre neuf. Le filtre devra être remplacé.
Suivi du filtre FITC sur l’Axioplan 2 Imaging (salle 1023)
Méthode et résultats :
Mise au point sur une lame de bille fluorescente de diamètre 10µm avec l’objectif x20 à
l’aide d’un filtre FITC de référence ayant les mêmes caractéristiques spectrales que le filtre testé
(figure 2).
On détermine le temps d’exposition afin d’être en dessous de la saturation et on mesure la
moyenne d’intensité de régions d’intérêts (ROI) localisées sur différentes billes du champ
d’observation.
On conserve les paramètres d’acquisition identique (temps d’exposition, position en Z,
champ d’observation) et on remplace le filtre FITC « contrôle » par le filtre FITC présent actuellement
sur l’appareil. L’image correspondante est la figure 1.
Les deux images sont analysées sous Image J où l’on trace des ROI circulaires sur 5 billes et l’on
compare les moyennes d’intensité de ces ROI. La variation d’intensité est mesurée avec le filtre FITC
de référence de la façon suivante : x 100.
Ces variations entre les 2 images sont consignées dans la figure 3.
Suite à cette étude, nous avons remarqué une perte d’intensité de l’ordre de 40% du filtre FITC
installé sur l’appareil par rapport au filtre FITC de référence. Cette perte d’intensité est due à l’usure
des filtres constituant le cube de filtre FITC en place sur l’appareil. Le cube de filtre FITC est donc à
changer sur cet appareil.
Fait le : 9/05/2010 Par : Cédric Matthews, Elsa Crudeli et Davy Soleilhet
Figure 1 : Image de la lame de bille
au x20 avec le filtre FITC à tester
Figure 2 : Image de la lame de bille
au x20 avec le filtre FITC de référence
Figure 3 : figure 1 où sont ajoutés
les variations d’intensité avec pour
référence la figure 2
Figure 24: Rapport du test concernant l’usure d’un cube de filtre FITC sur l’AxioPlan 2 Imaging
17
3.2. Test de comparaison de puissance laser sur le LSM 510
Dans le trajet optique constitutif d’un microscope confocal, deux types de miroir sont
placés : les miroirs dichroïques primaires et les miroirs dichroïques secondaires
présentés dans la Figure 25. Les miroirs dichroïques dits primaires séparent les
faisceaux d’excitations de l’émission de fluorescence alors que le miroir dichroïque
secondaire sépare les émissions de fluorescence en fonction des longueurs d’ondes.
Les caractéristiques d’un miroir dichroïque bi-bande et quadri-bande sont présentées
dans l’Annexe 2.
La présence du miroir dichroïque primaire quadri-bande* (HFT UV, 488, 543, 633)
dans le trajet optique sur le LSM 510 provoque une diminution observable du signal
fluorescent par rapport aux miroirs dichroïques primaire mono* (488) ou bi-bande*
(488,543). Cette observation est faite avec les mêmes paramètres d’acquisition où la
seule différence est le miroir dichroïque primaire utilisé. L’étude suivante s’intéresse
aux capacités de transmission du miroir dichroïque primaire quadri-bande du
confocal LSM 510.
Le miroir quadri-bande est important car il est indispensable pour faire des
acquisitions sur des échantillons multimarqués.
Pour déterminer si la variation du signal fluorescent est normale, un autre confocal
présent sur le site, le LSM 510 META, disposant du même miroir dichroïque quadri-
bande est utilisé en comparatif.
Figure 26: comparaison de la puissance laser en sortie d’objectif x10 avec le miroir
dichroïque HFT UV, 488, 543, 633 entre le LSM 510 et le LSM 510 META
Figure 25 : schéma simplifié du trajet de la lumière pour les confocaux montrant
le positionnement des miroirs dichroïques primaires et secondaires
tab 1
tab 2
tab 3
18
Cette étude se fait en deux étapes :
3.2.1. Mesure de la transmission du miroir quadri-bande à l’excitation
Ce test est réalisé en effectuant un test de puissance laser (Cf. 2.2.1) sur les 2
appareils que sont le LSM 510 et le LSM 510 META. La mesure de puissance laser
en sortie d’objectif avec le miroir dichroïque primaire 20/80 est choisie comme
référence sur les 2 appareils. Il est à noter que le miroir dichroïque 20/80 est utilisé
pour les opérations de maintenance et donne normalement peu de fluctuation entre
différents microscopes.
Les AOTF* des 2 appareils pour les raies 488 et 543 sont réglés pour avoir la même
puissance laser en sortie d’objectif x10 sur les deux microscopes confocaux.
En gardant les mêmes réglages d’AOTF et paramètres d’acquisition, une mesure de
la puissance laser est effectuée après avoir remplacé le 20/80 par le quadri-bande
dans le trajet optique.
Dans la Figure 26 (tab 3), les résultats de ces tests sont compilés. Pour la raie 488,
une perte de 20% de la puissance laser est observée et une perte de 30% pour la
raie 543. Ces résultats montrent que le miroir dichroïque quadri-bande installé sur le
LSM 510 transmet moins bien la lumière d’excitation que celui monté sur le LSM 510
META.
3.2.2. Transmission du miroir dichroïque quadri-bande à l’émission
Ce test a pour originalité d’utiliser une raie laser (514nm) présente dans le système
pour évaluer la transmission de cette onde à travers un miroir dichroïque qui a la
propriété de laisser passer cette longueur d’onde. Une acquisition en réflexion sur
une lame miroir avec la raie laser à 514 nm est effectuée sur les miroirs dichroïques
primaires 20/80, qui sert de référence, et le miroir dichroïque quadri-bande. Les
valeurs de puissance laser sont égales en sortie d’objectif.
Figure 28: comparaison des moyennes d’intensité mesurées sur une ROI pour les miroirs
dichroïques HFT UV, 488, 543, 633 et 20/80 entre le LSM 510 et le LSM 510 META pour
la raie 514
80% 75%
A B
Figure 27 : courbes de transmission des miroirs dichroïques primaires fournis par Zeiss ;
(A) pour le miroir 20/80, (B) pour le miroir quadri-bande
19
Les caractéristiques de transmission des miroirs dichroïques en fonction de la
longueur d’onde sont connues pour une lumière d’excitation à 514 nm :
Le 20/80 laisse passer 75% de la lumière à 514 nm : Figure 27 (A)
Le quadri-bande laisse passer 80% de la lumière à 514 nm : Figure 27 (B)
Ces informations permettent de déterminer les moyennes théoriques calculées dans
la Figure 28. La moyenne théorique du quadri-bande correspond à la moyenne
d’intensité mesurée sur le 20/80 multiplié par 1,05 pour compenser la variation de
transmission de la lumière entre les 2 dichroïques.
Pour le LSM 510 META, la moyenne d’intensité théorique et la moyenne d’intensité
mesurée sont quasi identiques (rapport de 102%) indiquant que le miroir dichroïque
quadri-bande installé sur cet appareil répond aux caractéristiques communiquées par
Zeiss.
Pour le LSM 510, le même rapport est de 59% indiquant une perte de transmission
du signal d’environ 40% par rapport à la valeur de moyenne d’intensité attendue.
La perte de signal observée lors des acquisitions a pu être évaluée quantitativement
grâce a ces tests. Le miroir dichroïque HFT UV, 488, 543, 633 du LSM 510 ne
respecte pas les spécifications du constructeur et provoquent la diminution du signal
détecté en émission de fluorescence. Ceci s’avère important car ce miroir dichroïque
permet la réalisation d’acquisitions séquentielles ou simultanées quand plusieurs
raies lasers sont utilisées.
Pour compenser la faible transmission de l’émission de fluorescence, l’utilisateur est
obligé d’exciter plus fortement son échantillon en augmentant la puissance laser
provoquant ainsi un photoblanchiment de son échantillon.
En rassemblant les données du 3.2.1 et 3.2.2, on en conclut que le miroir dichroïque
quadri-bande installé sur le confocal 510 est défectueux dans ses propriétés de
réflexion de la lumière à l’excitation et dans ses propriétés de transmission.
20
4. Tests de vérification suite à une intervention du SAV
Pour des dysfonctionnements ne pouvant être pris en charge par le service imagerie,
un recours au SAV du fabricant de l’appareil est effectué.
Dans ce contexte, l’utilisation de la métrologie intervient en deux temps :
En amont, elle permet de mettre en évidence un problème récurent remarqué
par les utilisateurs ou par le service imagerie. Un test est effectué sur
l’appareil et un rapport contenant les données issues de ce test est envoyé au
SAV. Cette procédure permet le ciblage du problème et facilite ainsi le travail
du SAV en sachant sur quel domaine ils doivent intervenir.
En aval, la métrologie est utilisée pour contrôler l’intervention du SAV. Ce suivi
permet de valider ou non l’intervention du SAV. Il permet aussi de déterminer
les valeurs de référence pour un instrument car les valeurs issues des tests
après une visite du SAV sont celles acceptées par le constructeur pour son
appareil.
L’utilisation des tests métrologiques visent à améliorer l’intervention SAV des
différents fabricants. La réalisation de ces tests permet l’établissement de diagnostics
des pannes et assurent aux utilisateurs la résolution des problèmes suite à
l’intervention du SAV.
4.1. Etude du dysfonctionnement de la diode laser à 405 nm (UV) du LSM 510
META
4.1.1. Contexte
Dès le mois d’avril 2010, il a été remarqué par les utilisateurs des problèmes pour les
acquisitions avec un marquage DAPI* sur le confocal LSM 510 META.
Suite aux observations, plusieurs hypothèses peuvent expliquer le
dysfonctionnement de la diode UV :
Un problème lié à la diode laser en elle-même
Un problème lié à l’AOTF (pilotage électronique, alignement à l’entrée de l’AOTF)
Un désalignement de la fibre optique de la diode 405
Un problème de couplage de la fibre à l’entrée de la tête confocale
Figure 30: Suivi de la puissance laser de la diode 405 en sortie d’objectif x10 sur le
confocal LSM 510 META pendant 4H20
Figure 29: Suivi de la puissance laser de la diode 405 en sortie d’objectif x10 sur le
confocal LSM 510 META
Tab 1
21
4.1.2. Tests réalisés avant l’intervention de Zeiss
En premier lieu, un test de puissance laser en sortie d’objectif x10 est réalisé. Ce test
permet de déterminer si la diode 405 nm fonctionne correctement. Pour ce test, la
méthode est la même que celle appliquée pour le test de suivi de la source
d’illumination (Cf.2.2.1). Un suivi est effectué sur 45 minutes. Les résultats de cette
expérience sont présentés dans la Figure 29. Une augmentation de la puissance
laser est observée sur cette figure. Des relevés ponctuels à 3 et 5 heures sont faits à
la suite de ce relevé en continu sur 45 minutes et sont présentés dans le tableau 1
de la Figure 29.
Ces relevés ponctuels montrent que la valeur de la puissance laser tend vers un
plateau. La durée entre ces relevés ponctuels ne permet pas de déterminer au bout
de combien de temps elle atteint le plateau.
Dans la Figure 30, la même expérience est réalisée sauf que la mesure de
puissance laser se fait en continu pendant 4H20 où le début du relevé coïncide avec
l’allumage de la diode laser. La stabilisation de la puissance de la diode laser 405 nm
apparait 2H30 après l’allumage de la diode laser. Cette stabilisation de la puissance
laser est anormale car elle doit s’opérer quelques minutes après la mise sous
tension.
Suite à ce constat, une intervention du SAV a eu lieu où un réalignement de la diode
laser 405 nm a été effectué. Ensuite, une mesure de la puissance de la diode laser
en sortie d’objectif a été effectuée. En fin d’intervention, un suivi de la puissance
laser en sortie d’objectif a été effectué pour contrôler la stabilité de la puissance laser
au cours du temps.
Intervention de Zeiss le 5/07/2010
Figure 31 : Suivi de la puissance laser de la diode 405 en sorite d’objectif x10
sur le confocal LSM 510 META à différentes dates
Figure 32 : Processus qualité pour un test ciblé sur un appareil
22
4.1.3. Suivi de la diode laser après l’intervention du SAV
En concertation avec le technicien, une série de mesures de puissance de la diode
laser en sortie d’objectif a été réalisée. Les résultats de ces tests sont présentés
dans la Figure 31.
La puissance laser diminue depuis l’intervention de Zeiss sur le LSM 510 META pour
atteindre un niveau plus bas que celui avant l’intervention.
La diode laser fonctionne correctement car immédiatement après le réalignement fait
par le technicien de Zeiss, des valeurs de puissance laser attendues sont obtenues.
(Figure 31).
Le dysfonctionnement de la diode laser UV 405 nm n’a pas été réglé suite à
l’intervention du SAV de Zeiss.
Cette étude permet de montrer l’implication de la métrologie lors d’un recours au
SAV d’un fabricant de l’un des appareils de la plateforme d’imagerie que ce soit pour
le diagnostic d’un problème ou le suivi d’un appareil après l’intervention du SAV.
La démarche effectuée pour ce test s’inscrit dans un processus qualité montré dans
la Figure 32 où le retour de satisfaction et l’amélioration du processus sont mis en
application.
Suivi du coalignement sur l’Axioplan 2 (salle 112)
Méthode et résultats :
Cet appareil ne dispose pas de déplacement en Z. il est donc nécessaire d’effectuer un test particulier pour suivre le coalignement des différents canaux.
Pour cela, nous utilisons des lames de billes possédant un cœur et un anneau qui émettent dans des plages de longueurs d’onde différentes. Pour suivre le coalignement des canaux Dapi, GFP et Rhodamine, nous faisons une acquisition pour les différents canaux sur une même bille (Focalcheck F24633 de 6µm de diamètre). Cette bille a pour caractéristique d’avoir un centre excitable par le canal Dapi et un anneau en périphérie excitable par le canal GFP et à moindre mesure par le canal Rhodamine.
Ces acquisitions sont réalisées avec l’objectif x40, en réglant le focus où l’intensité du signal est maximale et avec un temps d’exposition juste en dessous la saturation. Ces acquisitions sont présentées dans les Figures 1, 2 et 3.
Les ROI linéaires présentent sur les 3 figures précédentes sont identiques et une mesure de l’intensité du signal le long de ces ROI est faite pour les différents canaux. Les résultats de cette étude sont détaillés dans la figure 4.
On observe un décalage de 0,34 µm entre le centre de la bille observé avec le canal Dapi et le centre de l’anneau observé avec les filtres GFP et Rhodamine. Cette distance étant inférieure à 0,5 µm, on peut donc valider ce test de coalignement sur cet appareil.
Fait le : 20/07/2010 Par : Cédric Matthews et Davy Soleilhet
Figure 4 : (A) profil d’intensité pour les différents canaux le
long des ROI tracées sur les figures 1,2 et 3. (B) Tableau où
sont extraites les distances des pics d’intensité à partir de la
figure 4 (A).
Figure 1 : image avec le filtre Dapi Figure 3 : image avec le filtre Rhodamine Figure 2 : image avec le filtre GFP
Figure 33 : rapport du test de coalignement sur un microscope à champ plein Axioplan 2 qui
ne possède pas de platine motorisée en Z
23
4.2. Test de coalignement sur un microscope à champ plein sans déplacement en
Z motorisé
Ce test de coalignement est effectué suite à une intervention du SAV pour réaligner
les différentes voies optiques sur un microscope à champ plein : l’Axioplan 2.
Ce microscope à champ plein ne possède ni de platine motorisée ni de tourelle
d’objectifs pour le déplacement en Z. Le test de coalignement (Cf.2.2.3) nécessite
un déplacement en Z pour obtenir la position des barycentres des différentes
longueurs d’onde d’émission. Le coalignement entre les voies Dapi, FITC et
Rhodamine peut être suivi en X et Y grâce à une autre méthode.
Cette méthode consiste à utiliser des billes fluorescentes qui possèdent un cœur et
un anneau en périphérie excitable à des longueurs d’onde différentes et émettant
respectivement à différentes longueurs d’ondes.
Le décentrage entre le cœur et l’anneau périphérique est déterminé et permet de
mesurer le coalignement en X et Y. La procédure détaillée de ce test est décrite dans
la Figure 33. Cette figure est le rapport comprenant la méthode et les résultats de ce
test de coalignement.
La distance entre le centre du cœur et de l’anneau est de 0,34 µm. Cette distance
est inférieure à 0,5 µm. Ce rapport montre un coalignement compris dans nos
tolérances pour le Dapi, FITC et Rhodamine en X et Y.
L’obtention d’une mesure de coalignement peut se faire selon plusieurs méthodes
selon les caractéristiques de l’appareil. Les spécificités techniques d’un appareil
doivent être prises en compte pour le choix des tests métrologiques.
.
Figure 34: Interface du Logiciel MATLAB
24
5. Développement d’outils d’analyse
La mise en place du suivi des performances des appareils sur la plate forme
d’imagerie de l’IBDML nécessite un grand nombre de tests métrologiques. L’analyse
des données issues des tests de niveau 1 se fait principalement à l’aide du plugin
MetroloJ dans Image J.
Deux contraintes principales sont à respecter pour l’analyse des données issues des
tests métrologiques :
La première est de posséder des outils d’analyse simples, utilisables par le
plus grand nombre d’utilisateurs. Ces outils doivent limiter les choix des
utilisateurs en leur demandant les paramètres essentiels à l’analyse comme
les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, l’ouverture numérique de
l’objectif... Le but étant de limiter l’intervention de l’utilisateur afin d’avoir des
analyses reproductibles.
La deuxième est la contrainte de temps. La plateforme d’Imagerie de l’IBDML
comprenant un grand nombre d’appareils, il est donc fondamental
d’automatiser au maximum les procédures d’analyse des données pour les
différents tests métrologiques.
Le plugin MetroloJ n’est pas utilisable pour tous les tests métrologiques, la réalisation
de programme sous MATLAB est donc favorisée au sein de la plate forme.
5.1. Le Logiciel de programmation MATLAB
MATLAB est un logiciel de programmation puissant utilisé par une grande
communauté d’utilisateurs dans de nombreux domaines. Ce logiciel permet la
création d’algorithmes ainsi que l’interface utilisateur permettant la réalisation de
programmes d’analyse. L’interface utilisateur est montrée dans la Figure 34.
MATLAB dispose d’une toolbox imagerie comprenant un grand nombre de fonction
permettant le traitement d’images sous forme de matrices. Ce logiciel est donc utilisé
au sein du service imagerie pour le développement de programmes spécifiques que
ce soit suite à une demande d’un utilisateur ou pour la réalisation d’outils d’analyses
pour les tests métrologiques.
Figure 36: 2e écran du programme
bille
Figure 35 : 1er écran du programme
bille
25
5.2. Exemple de programme sous MATLAB le « programme billes »
Les tests d’homogénéité du champ d’illumination avec des billes de fluorescentes
(Cf.2.2.2) ne peuvent pas être analysés avec le plugin MetroloJ sous Image J.
Jusqu’alors, une procédure manuelle avec Image J est effectuée pour analyser ces
tests.
Les points principaux de cette démarche sont :
Isoler le groupe de billes d’intérêt sur les différentes images
Créer un stack à partir de ces différentes images
Projeter ce stack sur un même plan
Mesurer l’intensité d’une ROI similaire sur les différents groupes de billes
Calculer les variations d’intensité entre le groupe de billes au centre et les
autres en périphérie
Insérer des zones de textes où l’on inscrit les variations d’intensité pour les
différents groupes de billes et ajouter l’échelle
La réalisation de cette démarche s’avère longue. Une étude sur la réalisation d’un
programme sous MATLAB effectuant ces opérations de façon automatique a été
entreprise : « le programme billes ».Un cahier des charges a été établi pour ce projet
en collaboration avec Fabrice Daian responsable du développement logiciel au sein
de la plateforme. Ce cahier des charges (Annexe 3) détaille les fonctionnalités et les
données en sortie que l’on souhaite pour ce programme.
Dans les Figures 35 et 36, l’interface du programme bille est présenté. Lors de la
rédaction de ce rapport, le programme billes était en cours de finalisation. Le code
source du programme était terminé mais pas l’interface utilisateur. Seulement
quelques captures d’écran sont donc présentées dans ce rapport. Dans la Figure 35
est présenté le premier écran où l’utilisateur choisi les images qu’ils souhaitent
analyser. Dans la Figure 36, le deuxième écran est présenté où l’utilisateur doit
rentrer ces caractéristiques d’acquisition et peut observer les images qu’il a choisi en
miniatures.
26
6. Cadre de réalisation des tests
6.1. Détermination de la fréquence des tests pour le suivi des appareils
Pour réaliser les fiches de suivi, un grand nombre de tests métrologiques à été
réalisé afin d’obtenir une quantité importante de données. Par la suite, la périodicité
des tests métrologiques doit être déterminée en prenant plusieurs paramètres en
considérations :
Le niveau d’exigence fixé pour un appareil
Selon le type d’applications réalisées sur un appareil, le niveau d’exigence est
différent. La fréquence du suivi des appareils dépend donc du type d’instrument et du
type d’expérience réalisée.
L’utilisation des appareils.
Le suivi d’un appareil doit dépendre de l’utilisation de celui-ci. Ce paramètre peut être
suivi grâce aux statistiques générées automatiquement sur les systèmes de
réservation en ligne des différents appareils.
Le temps des tests et analyses
La réalisation d’une fiche de suivi pour un appareil demande un certain temps. Cela
nécessite la réalisation des tests sur les appareils, l’exploitation des données
recueillies ainsi que la mise en forme de ces données en vue de les incorporer dans
les fiches de suivi.
27
6.2. Communication des tests aux utilisateurs
La création des fiches de suivi n’est pas seulement utile pour le service imagerie, elle
permet aux utilisateurs de connaitre les performances d’un appareil au moment de la
réalisation de leurs acquisitions.
Les utilisateurs pourront accéder aux fiches de suivi de deux façons :
La première étant l’affichage de la fiche de suivi à coté du poste d’acquisition.
La deuxième étant l’affichage de la fiche de suivi quand un utilisateur accède
à sa session. Chaque utilisateur doit s’identifier lorsqu’il utilise un appareil.
Pendant cette étape obligatoire d’identification, la fiche de suivi de l’appareil
sera visible.
Les images brutes des tests sont archivées et l’utilisateur pourra en faire la demande
auprès du service imagerie.
Pour les tests répondant à une problématique particulière, les résultats des tests
métrologiques seront communiqués à l’équipe concernée. Un exemple de rapport est
présenté (Cf.3) et contient la méthodologie du test, les résultats du test, une
conclusion et l’action entreprise par le service imagerie dans le cas d’une panne
avérée.
28
6.3. Définition des tolérances pour les tests métrologiques
Les valeurs de tolérances sont établies de différentes façons. Elles restent
généralement empiriques car les données sont rarement fournies par les industriels :
Tolérances fixées dans la littérature
Les tolérances pour les tests d’homogénéité du champ d’illumination, il est établi
qu’une variation de plus de 25% de l’intensité du signal sur le champ d’illumination
est trop importante pour considérer que le champ d’illumination est homogène. Cette
mesure est faite avec un microscope à champ plein équipé d’un objectif x10 avec
une procédure similaire à celle effectuée dans la Figure 9.
Études statistiques menées sur les différents appareils de la plateforme
Des études statistiques sont effectuées avec les données des différents tests
métrologiques afin de déterminer des intervalles de confiances propres à chaque
type de tests sur les appareils.
Tolérances données par le constructeur
Ces données sont très rarement fournies par les constructeurs. Ceci pose souvent
un problème car les tolérances que nous fixons pour certains tests ne sont pas
acceptées par le fournisseur.
6.4. Amélioration des connaissances sur les machines utiles pour l’acquisition de
nouveaux appareils
Une fois les tolérances déterminées (Cf. paragraphe précédent) sur un type
d’appareil, ces données pourront être utiles lors de la rédaction d’un appel d’offre
pour fixer des exigences de l’appareil à acquérir en complément des besoins
scientifiques des utilisateurs. Au moment de l’installation d’un appareil, les mesures
effectuées servent de référence et elles sont comparées aux exigences du cahier
des charges. Cette démarche assure une amélioration constante au cours du temps
de la qualité des appareils mis en fonctionnement dans une plateforme scientifique.
29
6.5. Perspectives
L’activité métrologie au sein du service imagerie de l’IBDML étendra progressivement
le suivi, sous forme de fiche de suivi, à la totalité du parc d’équipement constituant la
plateforme.
Une fois les tests métrologiques de niveau 1 mis en place sur les différents appareils
de la plateforme, l’introduction des tests de niveau 2, 3 et 4 sera effectuée.
Ces tests nécessiteront l’utilisation d’appareils spécifiques de mesure pour mesurer
la stabilité des accessoires périphériques et évaluer les conditions
environnementales d’acquisition. Un autre test concernant la mesure de
l’horizontalité d’une lame sur un microscope sera mis en place.
La mise en place de ces nouveaux tests demandera la création d’outils d’analyses
spécifiques car il n’existe pas à l’heure actuelle de logiciel pour ce type de tests.
Après, le suivi devra être fait sur la microscopie non linéaire. A cet effet, ces tests
métrologiques devront être adaptés aux spécificités de la technologie du biphoton.
6.6. Conclusion
Lors de ce stage, l’objectif principal consistant à élaborer le suivi d’un microscope à
champ plein et d’un microscope confocal à été rempli. Pour parvenir à remplir cet
objectif, la maitrise des différents tests métrologiques de niveau 1 à été nécessaire.
La métrologie sur les appareils optiques fait le lien entre plusieurs disciplines. Des
connaissances en optiques sont essentielles pour l’élaboration de tests et pour la
compréhension du fonctionnement des différents appareils. Les statistiques, la
programmation sous ImageJ ou Matlab et l’analyse des images sont nécessaires
pour l’exploitation des données des tests.
La métrologie est aussi une partie de la démarche contrôle qualité ce qui oblige à
structurer en hiérarchisant les procédures de tests.
L’ensemble de cette démarche doit être intégrée dans un arbre décisionnel qui
permettra de mieux structurer la hiérarchie de succession des tests. A chaque
embranchement de l’arbre décisionnel les mesures devront être comprises dans des
intervalles de confiance établis pour un test donné.
30
Bibliographie
Robert M. Zucker and Owen T. Price (1999) Practical confocal microscopy and the
evaluation of system performance. Methods 18, 447-458
Robert M. Zucker and Owen Price (2001) Evaluation of confocal microscopy : system
performance. Wiley-Liss, Inc. Cytometry 44:273–294
Robert M. Zucker (2006) Quality assessment of confocal microscopy slide based
systems: performance. International society for analytical cytology cytometry. Part A
69A:659–676.
31
Annexe 1 : rapports de MetroloJ pour les différents tests métrologiques
Dans cette annexe sont regroupées les fiches de rapport à partir desquelles sont
extraites les données des tests métrologiques. Le plugin MetroloJ comprend
plusieurs onglets où chaque onglet correspond à un programme permettant l’analyse
d’un test métrologique. MetroloJ permet l’analyse :
des tests d’homogénéité du champ d’illumination
des tests de coalignement pour 2 ou 3 canaux
des mesures du Coefficient de Variation (C.V.)
des mesures de PSF
des mesures de résolution axiale
Dans cette annexe sont présentées les fiches de rapports utilisées pour analyser les
tests métrologiques de niveau 1 ainsi que les mesures de PSF. Les fiches de rapport
présentées par la suite sont les analyses des tests du 2/08/2010 sur le LSM 510 qui
ont servi à l’élaboration de la fiche de suivi de cet appareil :
Rapport du test de champ d’illumination
Rapport du test de coalignement
Rapport d’une mesure de PSF
Chaque rapport d’analyse comporte 2 pages. Dans la première page se trouve les
paramètres d’analyse utilisés comme l’ouverture numérique de l’objectif, les
longueurs d’onde d’excitation ou d’émission, le type de microscope…
Dans la deuxième page sont regroupées les valeurs chiffrées des tests.
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35
Annexe 2 : description des miroirs dichroïques et d’un cube de filtre de fluorescence
Cette annexe décrit le fonctionnement des miroirs dichroïques qui est un élément
important dans les chemins optiques des appareils.
La Figure 1 montre la séparation entre la lumière d’excitation et la lumière émise.
Les deux miroirs présentés ont une capacité différente à transmettre la lumière
d’émission car le miroir quadri-bande la transmet à 80% et le miroir bi-bande à 85%.
On se rend compte sur cette figure que la séparation entre la lumière d’excitation et
la lumière d’émission n’est pas totale : 15 à 20 % de la lumière d’excitation traverse
les miroirs dichroïques selon la longueur d’onde.
La Figure 2 dévoile la structure d’un cube de
filtre de fluorescence monté sur la plupart des
microscopes à champ plein. Il est constitué
d’un filtre d’excitation qui sélectionne une plage
de longueur d’onde de la source d’illumination,
d’un miroir dichroïque séparant la lumière
d’excitation de la lumière d’émission et d’un
filtre d’excitation qui sélectionne une plage de
longueur d’onde d’émission.
Le choix des filtres et miroirs dichroïques est essentiel doit être adaptée au type de
marquage de l’échantillon pour réaliser des acquisitions de qualité.
Figure 2 : cube de filtre similaire
à ceux installés sur le microscope
à champ plein AxioImager M2
44 79 05 HFT UV/488/543/633 (Prototyp)T-u-pol
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
350 400 450 500 550 600 650 700 750
44 79 15 Farbteiler 488/543, Prototyp
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
480 530 580 630 680
488 543 633 488 543
Figure 1 : courbes de transmission de 2 miroirs dichroïques primaire : un miroir
bi-bande (A) et un miroir quadri-bande (B) avec les raies lasers d’excitation
UV
A B
36
Annexe 3 : Cahier des charges du « Programme Billes »
I. Introduction
A. Contexte Afin de répondre à la mise en place de la démarche qualité sur la plate forme d’imagerie de l’IBDML,
de nombreux tests de métrologie sont mis en place. Ces tests ont pour but d’assurer aux utilisateurs
des instruments d’imagerie, un suivie des performances des instruments et le maintien de celles-ci à
un niveau optimal. L’un de ces tests est le suivi de l’homogénéité d’illumination du champ
d’observation en faisant des images d’un groupe de billes situées à différentes positions sur le
champ.
B. Historique La majorité de ces tests métrologiques sont analysées manuellement à l’aide du logiciel Image J et ce
procédé nécessite un temps conséquent. L’automatisation de l’analyse des résultats est
indispensable afin de pouvoir réaliser le suivi du grand nombre d’instruments présent sur la plate
forme d’imagerie de l’IBDML.
II. Description de la demande
A. Les objectifs L’objectif du projet billes est de créer un programme simple d’utilisation permettant de fournir aux
utilisateurs des informations sur l’homogénéité de champs d’une image contenant des billes
fluorescentes.
B. Produit du projet Le projet bille consiste en la réalisation d’un programme permettant l’automatisation de l’analyse
des tests de métrologie d’homogénéité de champ sur différents types d’instruments optiques.
L’homogénéité de champ est mesurée en demandant à l’utilisateur de faire varier la position des
deux diagonales et des deux médianes passant par les billes fluorescentes des images.
Cet outil doit analyser les profils d’intensité le long des deux diagonales et des deux médianes sur
une image au format .tif (voir .lsm ou .zvi) en niveau de gris. En sortie, il devra restituer les profils
d’intensité ainsi que les valeurs d’intensités maximales pour les différents groupes de billes présents
sur l’image.
Ce programme devra être simple à utiliser et développé en MATLAB. Les résultats devront être
faciles à interpréter sous forme de graphique et de tableau de valeurs.
C. Fonction du produit Charger les 9 images en TIF en niveau de gris correspondant au neuf positions du groupe de
billes.
Charger l’image en TIF correspondant à la 2e image du groupe de bille au centre.
37
Demander à l’utilisateur de délimiter des ROI (« region of interest ») autour des groupes de
billes d’intérêt sur les 10 images.
Mettre les 9 premières ROI issues des différentes positions des billes sur un même plan.
Afficher l’image des 9 groupes de billes sur le même plan.
Demander à l’utilisateur de déterminer la position des diagonales et des médianes (voire
l’épaisseur)
Calculer les profils d’intensité le long des diagonales et des médianes tracées précédemment
par l’utilisateur.
Comparer la valeur maximale d’intensité du groupe de billes au centre par rapport aux
valeurs d’intensité maximale des autres groupes de billes.
Affiche les valeurs GSV (Gray Scale Value) pour les différents groupes de billes sous forme de
tableau avec la variation d’intensité par rapport au centre ainsi que la valeur brute en niveau
de gris.
Calculer l’échelle qui sera soit fournie par l’utilisateur ou récupérer dans les images.
Générer un rapport en .pdf où figure (Annexe 1 : exemple de feuille de rapport) :
Le type de microscopie (widefield ou confocal).
La longueur d’onde utilisée pour l’acquisition des images.
L’ouverture numérique de l’objectif.
La taille de l’image.
L’image où se trouve les différents groupes de billes avec à coté de chaque groupe de
bille la variation d’intensité lumineuse par rapport au centre (avec l’échelle).
Le tableau de valeurs où figurent les valeurs maximales d’intensité des différents groupes
de billes ainsi que leur variation par rapport au groupe de bille du centre.
La date et l’heure de l’exécution du programme.
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D. Cascade des actions de l’utilisateur pour l’utilisation du
programme billes
E. Critères d’acceptabilité et de réception Le programme sera accepté et pourra être réceptionné lorsque les conditions suivantes seront
remplies :
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Le logiciel fonctionne et applique les différentes fonctions attendues pour afficher le rapport
de données à l’utilisateur.
Le logiciel a subi une période de beta test pour différents groupes d’images avec des billes.
Le programme est installé et fonctionnel sur les postes informatiques souhaités.
Le mode d’emploi, le descriptif des différentes fonctions, les conditions d’utilisations sont
accessibles pour les utilisateurs.
La formation au personnel du service imagerie de l’IBDML à été effectuée.
III. Description des contraintes
A. Contraintes de délais Ce logiciel doit être réalisé avant le 20 septembre2010. Cette date doit être respecté impérativement
car la personne en charge de ce projet n’est présente que jusqu’à cette date.
B. Autres contraintes Ce programme doit être réalisé sous le logiciel MATLAB car le laboratoire possède des licences de ce
logiciel et que la politique actuelle de l’institut favorise le développement avec MATLAB.
IV. Déroulement du projet
A. Planification Le planning des différentes grandes étapes du projet est présenté ci-dessous :
Le planning détaillé où est contenu le descriptif des grandes étapes du projet se trouve dans
l’Annexe 2.
B. Ressources Le laboratoire fournit un poste informatique ou MATLAB est installé et un informaticien spécialisé
dans la programmation sous MATLAB afin de faciliter la conception du programme.
Le laboratoire fournit également toutes les images de billes au format .tif pour permettre
l’élaboration du logiciel.
C. Evolution future du logiciel Une fois le logiciel fonctionnel, des améliorations pourront être effectuées. La dérive en z sera un
élément important à vérifier. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer une comparaison des diamètres
maximums d’une bille issue de chaque groupe de bille. Cette vérification permettra de déterminer si
le Z est resté constant pendant la prise des différentes acquisitions ou si la platine est bien
horizontale.
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Une autre évolution du logiciel sera de déterminer les positions des diagonales et médianes
automatiquement sans l’intervention de l’utilisateur. Le but étant de limiter l’intervention de
l’utilisateur afin d’obtenir des résultats avec une procédure identique pour des analyses différentes.
Ces améliorations futures devront être prises en compte lors de l’élaboration de ce logiciel.
V. Annexes
Annexe 1
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Annexe 2 : Planning détaillé du projet billes
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Annexe 4 : la classification des lasers
La plateforme d’imagerie de l’IBDML dispose d’instruments optiques possédant des
lasers comme les microscopes confocaux. Ces lasers peuvent être un facteur de
risque pour l’utilisateur même si les lasers ne sont pas accessibles pour eux. Il est
néanmoins important de connaitre les risques pour les différents types de laser
surtout pour les membres du service imagerie qui, pendant des opérations de
maintenance, peuvent être exposés directement aux faisceaux laser.
Les Lasers sont classés en fonction de leur dangerosité. Il existe 4 classes :
Classe 1 : sans danger.
Classe 2 : possible fatigue visuelle en exposition répétée.
Classe 3A : à travers un système optique, leur vision est dangereuse.
Classe 3B : la vision directe est toujours dangereuse.
Classe 4 : dispositif de haute puissance (> 0,5 milliwatts dans le visible).
Les lasers utilisés dans les microscopes mono et bi-photonique appartiennent à la
classe 3B et à la classe 4. Les utilisateurs ne sont pas autorisés à intervenir sur les
bancs optiques des confocaux vu la dangerosité de ces lasers. Les opérations de
maintenance ne peuvent se faire que par des membres du service imagerie ou des
personnes ayant les qualifications nécessaires pour travailler sur ces classes de
laser. La manipulation des lasers se fera avec des lunettes de protection spécifique
pour les lasers en faisant attention que ces lunettes protègent bien les yeux de la
plage de longueur d’onde du laser.
