BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU

BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU

Bc. Radka Zajícová

BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU

Bc. Radka Zajícová

Obsah

1 Úvod – historický pohled na danou technologii ................................................................. 3

2 Biologická aktivita produktu ............................................................................................... 4

3 Princip technologického procesu ........................................................................................ 5

4 Charakteristika biotechnologického činitele ....................................................................... 5

5 Mechanismy a regulace vzniku produktu ........................................................................... 7

5.1 Biosyntéza ergocorninu ............................................................................................... 7

5.2 Regulace vzniku produktu ........................................................................................... 9

6 Popis technologie a technologického zařízení .................................................................. 10

6.1 Submerzní kultivace .................................................................................................. 10

6.2 Povrchová (stacionární) kultivace ............................................................................. 13

7 Izolace a purifikace konečného preparátu ......................................................................... 14

8 Aplikace preparátu ............................................................................................................ 15

9 Ekonomické aspekty procesu ............................................................................................ 16

10 Seznam použité literatury .............................................................................................. 17

3

1 Úvod – historický pohled na danou technologii Námelové alkaloidy, mezi které ergocornin patří, jsou přirozenými sekundárními

metabolity parazitické houby paličkovice nachové (Claviceps purpurea), která nejčastěji

napadá žito a jednoděložné trávy (1).

Už z přirozeného výskytu námelových alkaloidů plyne první používaný způsob získávání

těchto sloučenin. Jedná se o parazitickou produkci sklerocií na uměle infikovaném žitě. Tento

způsob produkce se v některých případech používá dodnes, ale má značná omezení. Pro tento

typ produkce byly vypěstovány modifikované kmeny především Claviceps purpurea ale i

jiných mikroorganismů (1).

Jelikož parasitická produkce je vázána na roční období, cena byla stále relativně vysoká a

spotřeba vzrůstala, byla snaha vytvořit kmeny vhodné pro saprofytickou produkci na umělých

kultivačních médiích. Problém byl ale v neznalosti biosyntézy alkaloidů, což vedlo

k neúspěchu při pokusu o saprofytickou produkci alkaloidů (2, 3). Byly připraveny kmeny pro

povrchovou kultivaci, ale produkce touto cestou nebyla zavedena, protože buď byl obsah

alkaloidů velmi malý, nebo zařízení pro povrchovou kultivaci značně složité. Proto byla

v padesátých letech minulého století vyvinuta technologie submerzní kultivace v aerovaných,

promíchávaných bioreaktorech, která ale skýtá mnohá úskalí (4). V sedmdesátých letech

Kybal a Vlček vyvinuli relativně jednoduché zařízení pro povrchovou (stacionární) kultivaci,

která ale byla do praxe uvedena jen v případě produkce alkaloidů ergotoxinové skupiny (2).

Technologie Pozitiva Negativa Parazitická produkce

• Propracovanější technologie – někdy jediná možná

• Stále nejčastější způsob produkce

• Vázanost na roční období a podnebí • Bezpečnost ohledně šíření námele

Saprofytická submerzní produkce

• Celoroční provoz • Lepší kontrola podmínek

pro produkci alkaloidů než u parazitického způsobu

• Vysoké pořizovací a provozní náklady • Používání protipěnivých přísad (snižují

produkci) • Vysoké nároky na udržení sterility • Často nižší obsah alkaloidů než u

parazitické produkce • Nestabilita produkčních kmenů

Saprofytická stacionární produkce

• Nízké pořizovací a provozní náklady

• Celoroční provoz

• Možné odlišnosti v jednotlivých kultivačních vacích (každý vak je samostatný reaktor)

Tabulka 1: Klady a zápory používaných technologií

4

2 Biologická aktivita produktu Ergocornin (Obrázek 1) patří do ergotoxinové skupiny peptidických námelových

alkaloidů. Na organismus působí stejně jako ostatní námelové alkaloidy díky podobnosti své

struktury s přirozenými neurotransmitery – serotoninem, dopaminem a noradrenalinem

(Obrázek 2).

Obrázek 1: Struktura ergocorninu

Obrázek 2: Srovnání struktury ergolinu a přirozených neurotransmiterů (1)

Přesný mechanismus účinku nebyl dosud objasněn díky obrovské diverzitě

noradrenalinových, dopaminových a serotoninových receptorů a schopnosti alkaloidů působit

na receptory jak agonisticky tak antagonisticky (2).

Většinou bývá používán ve své hydrogenované formě, protože ta je méně toxická než

nehydrogenovaná. Byly popsány účinky dihydroergocorninu na průtok krve periferními

oblastmi a hypertenzi. Průtok krve periferiemi po podání dihydrergocorninu stoupá, zatímco

tlak u hypertoniků klesá. Oba účinky jsou dány dilatací cév (5).

5

U směsi mesylátů hydrogenovaných ergotoxinů byly popsány další pozitivní účinky.

Dihydroergotoxin mesylát posiluje účinek tricyklických antidepresiv (př. Nortryptilin), což

umožňuje použití těchto antidepresiv i u tzv. geriatrické deprese, která bývá často spojena

s nějakou formou stařecké demence. Projevuje se zde tedy další účinek dihydroergotoxinu a

to, že příznivě ovlivňuje průběh stařeckých demencí (6). V mozku dochází ke stimulaci

syntézy proteinů centrálního nervového systému a inhibici adenylcyklázy stimulované

katecholaminy (7).

3 Princip technologického procesu

Pro produkci ergocorninu byly vypracovány dvě technologie – submerzní a povrchová.

Oba technologické procesy začínají zpracováním produkčního kmene získaného

z některého depozitu, kde jsou tyto kmeny uchovávány tak, aby byly zachovány jejich

vlastnosti. Výsledkem zpracování původního materiálu je inokulum, které je vhodné pro další

růst. Inokulem jsou očkována média v Erlenmeyerových nebo podobných baňkách, která jsou

pak po určitou dobu inkubována na třepačkách. Tento proces může proběhnout v jednom či

několika stupních a následně jsou pomnožená mycelia převedena do laboratorních

bioreaktorů, kde pokračuje proces zvětšování měřítka až k produkčním reaktorům nebo jen

k získání dostatečného množství inokula pro povrchovou kultivaci v igelitových vacích.

Žádaný produkt se většinou vyskytuje jak v myceliu, tak v kultivačním médiu. Je tedy

nutné zpracovat obojí. Pro izolaci ergocorninu se používá v obou případech řada extrakcí

pomocí běžných rozpouštědel a produkt je získán většinou jako adukt s posledním

rozpouštědlem, případně je ergocornin v nějaké formě ještě podroben hydrogenaci na

dihydroergocornin.

4 Charakteristika biotechnologického činitele

Bylo popsáno několik desítek fyziologicky izolovaných či geneticky modifikovaných

kmenů, které produkují ergocornin většinou ve směsi a dalšími alkaloidy. Absolutní většina z

nich je modifikací Claviceps purpurea (2). Ne všechny popsané kmeny se hodí pro

průmyslovou kultivaci a produkci ergocorninu. V následujícím přehledu je uvedeno několik

kmenů, u kterých byly popsány technologie.

Kmen OKI No. 88/1972 (8) byl vyšlechtěn ze sklerocií Claviceps purpurea s vysokým

obsahem alkaloidů bez použití mutagenních technik ve třech inokulačních krocích

6

v opakujících se cyklech. Při použití většího množství fosforu, je pro přechod do produkční

fáze nutný přídavek chloridu sodného do média. Přídavek 0,1 – 1% dusičnanu amonného

podpoří růst mikroorganismů a produkci alkaloidů. Nejvyššího obsahu alkaloidů je v kultuře

dosaženo 6. až 7. den kultivace, kdy obsah alkaloidů vztažený k množství biomasy je okolo

30 mg/g. Složení alkaloidů produkovaných tímto kmenem je uvedeno v následující Tabulce 2.

Tento kmen je uložen v Národním ústavu pro veřejné zdraví (Orszagos Kozegeszsegugyi

Intezet) v Budapešti v Maďarsku.

Ergokryptinin 5% Ergoconinin 4%

Ergokryptin 30% Ergocornin 28% Ergosin 5% Ergometrinin 4%

Ergometrin 22% Ostatní ve vodě rozpustné alkaloidy

4%

Tabulka 2: Složení alkaloidů produkované kmenem OKI No. 88/1972 (8)

Kmen MNG 00186 (9) byl stejně jako OKI No.88/1972 vyšlechtěn v Maďarsku. Jako

základní materiál byla použita sklerocia Claviceps purpurea sebraná z přirozeně infikovaného

žita. MNG 00186 byl výsledkem opakované selekce a obohacování kmene produkujících

alkaloidy. Selekce probíhala na základě toho, že kolonie produkující alkaloidy jsou na

specifickém médiu fialové na rozdíl od ostatních bílých. Růst tohoto kmene je pomalejší než u

běžně se vyskytující kultury paličkovice a netvoří konidie. Kmen produkuje směs alkaloidů,

z níž 55-60% tvoří ergocornin, 25-30% β-ergokryptin, a malou část tvoří α-ergokryptin.

Kmen je uložen v Maďarské národní sbírce kmenů.

Kmen IMET PA 130 (9) byl připraven mutací a na médiích obsahujících organické nebo

anorganické zdroje dusíku, cukr, organické kyseliny a běžné anorganické soli schopný

produkovat alkaloidy ergotoxinové skupiny a ergometrin. Tento kmen je uložen v Centrálním

institutu pro mikrobiologii a experimentální terapii v Jeně v Německu.

CCM F-725 (10) byl vytvořen mutacemi z kmene CCM F-508, který byl neekonomický

z důvodu malého množství alkaloidů a špatného poměru mezi α a β-ergokryptinem. CCM F-

508 byl postupně vystaven účinku tří mutagenů. Prvním byla kyselina dusičná o koncentraci

0,0030 – 0,0045M, dalším ethylmethansulfonát o koncentraci 0,01M a posledním byl

5-bromuracil ve směsi se sulfathiazolem v poměru 4:1. Tento kmen produkuje směs

7

ergocorninu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu v poměru 6:5:1 a je uložen v Československé

sbírce mikroorganismů J. E. Purkyně v Brně.

5 Mechanismy a regulace vzniku produktu

5.1 Biosyntéza ergocorninu

Při biosyntéze peptidických námelových alkaloidů samostatně vznikají ergolinový a

peptidický skelet, které jsou následně spojeny multienzymovým komplexem.

Biosyntéza kyseliny lysergové je znázorněna na Obrázku 3.

Obrázek 3: Schéma biosyntézy ergolinového skeletu u rodu Claviceps (2)

8

Cyklický skelet tvořený třemi aminokyselinami vzniká v multienzymovém komplexu

d-lysergyl peptidové syntetázy (LPS), která je tvořena dvěma podjednotkami. Aminokyseliny

ani kyselina lyserogová nemohou být do řetězce inkorporovány volné. Proto musí být

aktivovány vazbou přes sirný můstek na protein. V LPS1 podjednotce jsou aktivní místa pro

zabudování aminokyselin do pozice I nebo II (viz. Obrázek 4). Žádná z aminokyselin

nevykazuje výjimečnou afinitu k aktivnímu místu, které slouží k zabudování aminokyseliny

do pozice I. Proto o složení výsledného ergopeptinu rozhoduje pouze složení prostředí, ve

kterém se organismus nachází. Toho se dá využít v řízení kultivačního procesu. Naopak

aktivní místo k zabudování aminokyseliny do pozice dvě značně upřednostňuje L-fenylalanin.

Do pozice III je u rodu Claviceps vždy inkorporován L-prolin. (2)

Obrázek 4: Substráty inkorporované do d-lysergylpeptidlaktámu d-lysergylpeptid syntetázou

a jejich relativní afinity. (2)

Podjednodka LPS2 aktivuje kyselinu lysergovou a začíná tak syntézu cyklického

tripeptidu. Na následujícím obrázku (Obrázek 5) je znázorněno schéma funkce LPS při

biosyntéze ergotaminu. Pro syntézu ergocorninu, pak stačí eliminovat L-fenylalanin

z prostředí a nahradit jej valinem.

9

Takto vytvořený laktám je následně oxidován pomocí oxygenáz čímž vzniká

hydroxylová skupina a poslední otevřený kruh v peptidické části se samovolně uzavře. (2)

Obrázek 5: Schéma syntetických kroků katalyzovaných LPS. Levý horní roh každého

diagramu znázorňuje aktivní místo LPS2, ostatní pak aktivní místa LPS1.(2)

5.2 Regulace vzniku produktu Primární metabolismus je vždy úzce specifikovaný, protože jakákoli chyba ve stavebních

kamenech organismu by mohla mít fatální důsledky. Zato sekundární metabolity, které nemají

přímou souvislost se životaschopností organismu, mají značně volnější regulaci, a proto

konečným výsledkem bývá často směs různých sloučenin. Stejně tak je to i u divokých kmenů

Claviceps. V případě, že žádaným produktem je pouze několik vybraných sloučenin, je nutný

zásah do syntetického systému mikroorganismu a regulace vzniku produktu pomocí složení

kultivačního média (1).

10

Z uhlíkatých zdrojů je nutné používat složitější cukry, které jsou mikroorganismem hůře

metabolizovány, protože syntéza alkaloidů buď v růstové fázi neprobíhá, nebo jen

v minimální míře. Použít jako substrát glukózu není vhodné z důvodu katabolické represe. Pro

dobré využití sacharózy je nutné do kultivačního média přidat sekundární zdroj uhlíku –

například některý intermediát citrátového nebo glyoxalátového cyklu (2).

Pro většinu sekundárních produktů je malý obsah anorganického fosforu v médiu

stimulujícím prvkem. Fosfor je během prvních dní kultivace akumulován v myceliu, kde

zastavuje růst a nastartuje produkci alkaloidů. Naopak vyšší obsah fosforu může vyvolat

degradaci vzniklých alkaloidů (2).

V médiu musí být také přítomen vhodný zdroj dusíku. Tento prvek je důležitý jak pro

růst, tak pro syntézu alkaloidů. Problémem může být nalezení vhodného zdroje pro oba dva

procesy (2).

Dále je syntézu produktu možné ovlivnit přídavkem prekurzorů do média, pH, teplotou a

množstvím kyslíku v reaktoru. V případě ergocorninu je možné do kultivačního média

přidávat malé množství valinu (9).

6 Popis technologie a technologického zařízení

6.1 Submerzní kultivace

Submerzní produkce ergocorninu je podstatně běžnější než stacionární kultivace a proto

je popsáno několik technologií, které mají mnoho společných rysů.

Technologie popsaná Wackem a dalšími (8) používá produkční kmen OKI No. 88/1972

popsaný výše. Tento kmen je po 30 dní kultivován na pevném kultivačním médiu SB 010 o

složení popsaném v Tabulce 3. Vznikne souvislá vrstva mycelia, která je po oddělení

z agarového povrchu suspendována a homogenizována ve vodě. Do 750ml Erlenmeyerových

baněk, které obsahují po 200 ml SC 100 média, je přidáno po 20 ml suspenze získané

v předchozím kroku a baňky jsou 6 dní protřepávány při teplotě 24°C. Šestý den jsou baňky

po dvou použity jako inokulum pro tři 10l bioreaktory, z nichž každý je naplněn 6l sterilního

SB 101 média. V těchto reaktorech probíhá dalších pět dní kultivace při 25°C s rychlostí

aerace 0,5l vzduchu/l.min a mícháním 240 ot./min . Na konci tohoto období je obsah všech tří

reaktorů spojen (18l) a použit jako inokulum pro produkční průmyslový reaktor o objemu

300l, který obsahuje 200l sterilního SC 101 kapalného média. Reaktor je míchán rychlostí

11

300 ot/min a provzdušňován rychlostí 9m3 vzduchu za hodinu. Kultivace probíhá šest dní při

teplotě 25°C, přičemž mezi 55 a 60 hodinou kultivace je pH udržováno na hodnotě 4,5

pomocí přídavku hydroxidu amonného. Po ukončení kultivace je obsah alkaloidů 1246 mg/L,

z čehož 646 mg/L tvoří směs ergocorninu a ergokryptinu.

SB 010 SC 100 Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina citronová 10,0g Dusičnan amonný 10,0g Síran hořečnatý 0,3g Dusičnan vápenatý 1,0g Dihydrofosforečnan draselný 0,5g Dihydrofosforečnan draselný

0,25g Chlorid sodný

10,0g

Síran hořečnatý 0,25g Hydroxid amonný do pH 5,2 Hydroxid amonný do pH 5,2 voda zbytek do 1000ml Vláknitý agar 25,0g voda zbytek do 1000ml

SB 101 SC 101 (l) Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina citronová 10,0g Dusičnan amonný 1,0g Chlorid sodný 10,0g Dusičnan vápenatý 1,0g Dusičnan amonný 1,0g Dihydrofosforečnan draselný

0,5g Dihydrofosforečnan draselný

0,3g

Síran hořečnatý 0,3g Síran hořečnatý do pH 5,2

Chlorid sodný 10,0g Hydroxid amonný Hydroxid amonný do pH 5,2 Voda zbytek do 1000ml voda zbytek do 1000ml Tabulka 3: Složení kultivačních médií I.

Další technologie byla popsána Wackem et al. v roce 1983 (9) a pro produkci

ergocorninu používá jiný produkční kmen a to MNG 00186. Pro kultivaci je použita 25 dní

stará kultura MNG 00186 rostoucí na St agar (Blake) médiu, která je seškrábnuta a

homogenizována ve 100ml fyziologického roztoku. V třílitrové kuželové baňce s jedním

litrem GK kultivačního média je pak tato suspenze použita jako inokulum. Baňka je pak 44

hodin protřepávána při teplotě 24°C. Poté je obsah baňky převeden do 15l laboratorního

bioreaktoru, který obsahuje 10l TC-54 média. Kultivace probíhá při teplotě 24°C po tři dny

při míchání 240 ot./min a aeraci 0,25 l/l/min. Výsledná kultura je použita pro inokulaci 100l

St média v 150l reaktoru, který umožňuje rychlé přidávání prekurzorů. Následujících 6 dní

probíhá kultivace při 22°C, aeraci 0,35l/l/min a rychlosti míchání 150 ot./min. Druhý, třetí a

pátý den je do reaktoru přidáno po 100g valinu a 20g isoleucinu. Na konci šestého dne je

v reaktoru obsaženo 320mg/L ergocorninu, 60mg/L α-ergokryptinu a 160mg/L β-

ergokryptinu. Složení použitých kultivačních médií je uvedeno v Tabulce 4.

12

St agar médium (Blake) St Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina jantarová 10,0g Dusičnan amonný 1,0g Dusičnan amonný 1,0g Dihydrofosforečnan draselný

0,25g Dihydrofosforečnan draselný

0,25g

Síran hořečnatý 0,25g Síran hořečnatý 0,25g Chlorid sodný 1,0g Chlorid sodný 1,0g Hydroxid amonný do pH 5,2 - 5,3 Hydroxid amonný do pH 5,2 - 5,3 Práškový agar 25,0g voda zbytek do 1000ml voda zbytek do 1000ml

GK TC-54 Trypcasin 7,0g Sacharóza 100,0g Kyselina citronova 4,1g Kyselina citronová 10,0g Dihydrofosforečnan draselný

0,3g Chlorid sodný

10,0g

Síran hořečnatý 0,3g Dihydrofosforečnan draselný 0,5g Hydroxid amonný do pH 5,7 – 5,8 Síran hořečnatý 0,5g voda zbytek do 840ml Hydroxid amonný do pH 5,7 – 5,8 Voda zbytek do 1000ml Tabulka 4: Složení kultivačních médií II.

Patent společnost VER Arzneimittelwerk Dresden z roku 1978 (9) popisuje technologii

založenou na produkčním kmeni uloženém pod číslem IMET PA 130. Tento kmen je opět

modifikací Claviceps Purpurea. Základní materiál pro přípravu inokulí je uchováván

v uzavřených konzervách, kde jsou uloženy spory lyofilizované v odstředěném mléku. Obsah

konzervy je suspendován v 5% sladině a přenesen na pevné kultivační médium (SC1)

obsažené v průmyslových úzkohrdlých skleněných lahvičkách o objemu 500ml. Po 14 dnech

inkubace při teplotě 24°C každá lahvička obsahovuje 3x109 spor, které lze uchovávat po dobu

10 měsíců při teplotě 4°C. Takto připravené inokulum je použito pro naočkování dvou

ocelových 18l bioreaktorů, z nichž každý obsahuje 10l kultivačního média A (LCA).

Kultivace zde probíhá 7 dní za míchání 360 ot./min a aeraci 2,5 l vzduchu/min. Podíly

vytvořené v těchto reaktorech jsou spojeny a použity jako inokulum pro 180l kultivačního

média B (LCB) obsaženého v 250l bioreaktoru ze speciální oceli. Po pěti dnech míchání

rychlostí 160 ot./min a aeraci 0,5l vzduchu/l.min, je kultura převedena do 2000l nerezového

bioreaktoru, který obsahuje 1400l kultivačního roztoku C (LCC). Zde probíhá kultivace 7 dní

za míchání rychlostí 160 ot./min a aerací 0,6l/l/min. V případě nutnosti je do všech reaktorů

přidávána protipěnivá přísada. Sedmý den kultivace je celkové množství alkaloidů 2430mg/L,

z čehož 1150mg/L tvoří egocornin.

13

SC1 LCA Sacharóza 3% Sacharóza 10% Dusičnan sodný 0,3% Citrát amonný 1,5% Dihydrofosforečnan draselný 0,1% Dihydrofosforečnan draselný 0,05% Síran hořečnatý – heptahydrát 0,05% Síran hořečnatý 0,03% Chlorid draselný 0,05% Síran železnatý 0,001% Síran železnatý – heptahydrát 0,001% Síran zinečnatý 0,0004% Corn steep 1% Agar 3% pH 6,8 - 6,9

LCB LCC Sachazóza 10% Sacharóza 20% Kyselina citronová 1,4% Kyselina citronová 1,75% Hydroxid amonný (25%) 1,0% Chlorid draselný 0,02% Dusičnan vápenatý 0,05% Dihydrofosforečnan draselný 0,075% Dihydrogenfosforečnan draselný

0,025% Síran hořečnatý

0,03%

Chlorid draselný 0,01% Síran železnatý 0,003% Síran hořečnatý 0,03% Síran zinečnatý 0,0012% Síran železnatý 0,001% Hydroxid amonný do pH 5,3 Síran zinečnatý 0,0004% pH 5,5 Tabulka 5: Složení kultivačních médií III

6.2 Povrchová (stacionární) kultivace

Zařízení pro stacionární kultivaci bylo patentováno J. Kybalem a V. Vlčkem v roce 1974

(4). Kultivace se provádí na povrchu kapalného média, které je obsaženo ve sterilních

igelitových vacích. Používá se kmen s označením CCM F-725 (10).

Sterilní kultivační pytel je naplněn médiem a sterilizován a ochlazen na přijatelnou

teplotu. Poté je horní část vaku propíchnuta dutou kovovou jehlou a vak je částečně naplněn

sterilním vzduchem. Tato jehla je nahrazena kovovou či skleněnou trubičkou o průměru

odpovídajícím velikosti vaku a lehce zúženým koncem, která je napojena na zdroj inokula. Po

inokulaci zůstává trubička na místě a slouží jako přívod kyslíku při kultivaci. Plyny vznikající

při kultivaci jsou odváděny podobnou trubičkou případně lépe několika děrami v horní části

pytle. Jakýkoliv způsob odvodu odpadních plynů musí zajistit mírný přetlak v kultivačním

pytli, aby byla zachována sterilita. Kultivační vaky jsou uloženy v policích, které jim

poskytují oporu a zároveň je pod dnem police chladicí potrubí, které odvádí teplo uvolňované

při utilizaci uhlíkatých zdrojů. Jelikož jsou tyto police skládány na sebe, dochází k chlazení

kultivačních vaků ze spod i ze shora. Kultivační vaky jsou na konci kultivace likvidovány. Na

Obrázku 6 je znázorněno zařízení pro stacionární kultivaci.

14

Obrázek 6 : Průmyslové uspořádání povrchové kultivace (4) : 1) Dmychadlo, 2)měřič průtoku vzduchu,

3) třícestný kohout s kontrolním ventilem, 4) vzduchový filtr, 5) kultivační vak v polici, 6) by-pass ventil, 7) duplikátor pro

přípravu kultivačního média, 8) manipulační stolek, 9) transportér, 10) měřicí ventil

7 Izolace a purifikace konečného preparátu

Veškeré průmyslové izolace alkaloidů jsou založeny na extrakce v systému rozpouštědel,

z nichž některá, která jsou použita ve starších patentech, nejsou dnes použitelná pro

průmyslovou výrobu (např. ethery, některá chlorovaná rozpouštědla) (11).

Liší se izolace ze stacionární a submerzní kultivace. V případě stacionární kultivace

ergocorninu je zpracováváno pouze mycelium, protože peptidické námelové alkaloidy

v tomto případě téměř nepřechází do média. U submerzní kultivace se díky střihovému napětí

a dalšímu namáhání mycelia dostává do média nezanedbatelná část peptidických alkaloidů a

tudíž je nutné zpracovat celá obsah bioreaktoru (2).

V patentu publikovaném Wackem a dalšími v roce 1975 (8) je popsán systém rozpouštědel

chloroform-isopropylalkohol, chloroform- metanol, metanol-voda a chromatografie na

alumině.

15

Izolace produktu popsaná společností VER Arzneimittelwerk Dresden (9) počítá se

zpracováním média a mycelia odděleně. Kultivační médium je po ukončení kultivace

naředěno stejným množstvím vody a zfiltrováno.

Zpracování filtrátu začíná úpravou pH na 8,5 pomocí 25% hydroxidu amonného. Takto

upravený filtrát je extrahován ethylacetátem na dvoustupňovém protiproudém extraktoru.

Extrakt je pak na vakuové odparce opařen na dvacetinu svého původního objemu, smísen

s dvojnásobným objemovým množstvím chloroformu a ponechán 15h při 4°C. Z roztoku

vypadnou krystalky ergometrin-chloroformového aduktu, které jsou odděleny filtrací. Ve

filtrátu se nachází ergotoxin, který je z něj získán ve formě krystalického ergotoxin-

benzenového aduktu. Filtrát je zpracován pomocí aluminy a ethylacetátu v kolonovém nebo

míchaném uspořádání, ethylacetátový podíl je odpařen a k odparku přidán benzen na 15h při

4°C. Ergotoxin-benzenový adukt je pak zpracován buď kyselinou ethansulfonovou v ethanolu

na ethansulfonát, nebo hydrogenací v dioxanu na Ra-Ni na dihydroergotoxin-bázi, z níž je

opět vytvořen ethansulfonát pomocí kyseliny ethansolfonové.

Mycelium je tři hodiny extrahováno acetonem při 20°C. Po filtraci je vodno-acetonový

extrakt okyselen kyselinou fosforečnou na pH 2-3 a extrahován petroletherem a směsí

petrolether-xylen (1:1), U těžké fáze je upraveno 25% hydroxidem amonným pH na 8-9a je

extrahována ethylacetátem. Acetátová fáze je promyta vodou v poměru 1:1, odpařena při

30°C na vakuové odparce na desetinu objemu, zreagována s dvojnásobným objemovým

množstvím chloroformu a umístěna do 4°C přes noc. Suspenze je odfiltrována a filtrát je

odpařen na desetinu objemu stejně jako v předchozím kroku. Odpařený filtrát je přečištěn na

aluminové koloně ethylacetátem. Eluát je odpařen a rozpuštěn v toluenu a krystalován při

teplotě 4°C za zisku ergotoxin-toluenového aduktu.

8 Aplikace preparátu

K léčbě se používá především hydrogenovaný semisyntetický analog –

dihydroergocornin a to v ekvimolární směsi s dalšími alkaloidy ergotoxinové skupiny ve

formě soli. Dihydroergotoxin mesylát je ekvimolární směs dihydroergocorninu,

dihydroergocristinu a dihydroergokryptinů (α:β 2:1) (6). Používá se na léčbu stařeckých

demencí př. Alzheimerova choroba), periferního i centrálního prokrvení a při vysokém

nitroočním tlaku. Použití dihydroergotoxinu u stařeckých demencí je značně kontroverzní,

16

protože v posledních letech byla provedena kontrolovaná studie, ve které nebyl zpozorován

rozdíl mezi léčbou placebem a dihydroergotoxinem.

9 Ekonomické aspekty procesu Saprofytická produkce dlouho nebyla schopná konkurovat tradiční parazitické produkci

námelových alkaloidů. V posledních letech se situace obrací díky pokrokům v molekulární

genetice, genetickém inženýrství a biochemii, což ale nic nemění na finanční náročnosti

kultivačního procesu.

Saprofytická submerzní kultivace je náročná jak na pořizovací, tak na provozní náklady.

Zařízení pro tento typ produkce musí být z vysoce kvalitních slitin a možností sterilizace jak

kultivačních médií tak zařízení samotného. Všechny dnes používané technologie jsou řízeny

především výpočetními systémy, které rovněž představují nemalou investici. Přibližně stejnou

nebo vyšší investici představují náklady na downstream procesy.

Provozní náklady se skládají především z nákladů na sterilizační páru a elektrickou

energii nutnou pro chod celého zařízení, z čehož největší zátěž představují příkony míchacích

elektromotorů. Jelikož jsou celé technologie řízeny softwarem, je zde úspora na lidské síle.

Saprofytická povrchová kultivace není tak náročná na pořizovací náklady co se kultivace

samotné týče, ale náklady na downstream procesy se od submerzní kultivace příliš neliší.

17

10 Seznam použité literatury 1. Řehaček Z., Sajdl P.: Ergot Alkaloids. Chemistry, Biological Effects, Biotechnology,

Academia, Praha, 1990

2. V knize: Ergot – The Genus Claviceps (Křen V., Cvak L. ed.) , Harwood Academic

Publishers, Amsterodam, 1999

3. Kybal J., Protiva J., et al. (SPOFA): US Patent 3110651; 1963

4. Kybal J., Vlček V.: Biotechnology and Bioengineering 1976, 18, 1713-1718

5. Hayes D.W., Wakim K.G. et al.: The Effects of Dihydroergocornine on the

Cirkulation in the Extremities of Man, 1948

6. Griffith R.W., Singer J. (Sandoz, Inc.): US Patent 4593031; 1986

7. Udvardy Nagy née Cserey Pechány E., Budai M., et al.( Richter Gedeon Vegyeszeti

Gyar RT): US Patent 4390625; 1983

8. Wack G., Nagy L. et al.(Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 3884762;

1975

9. Wack G., Kiss J. et al. (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 4369252;

1983

10. Borowski E., Braun K. et al. (VEB Arzneimittelwerk Dresden): US Patent 4086141;

1978

11. Strnadová K., Kybal J. et al. (SPOFA): US Patent 4447540; 1984

12. Cvak L., Holan J. et al. (IVAX Pharmaceuticals s.r.o.): US Patent US 2007/0161795

A1; 2007