(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1740213 RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 30.03.2005 05774044.1 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 29.02.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/09 EP 1740213 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61K 47/02 (2006.01) A61K 47/10 (2006.01) A61K 47/12 (2006.01) A61K 38/27 (2006.01) A61P 5/02 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Ciekły preparat hormonu wzrostu

(30) Pierwszeństwo:

07.04.2004 EP 04101444

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

10.01.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/02

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

31.08.2012 Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/08

(73) Uprawniony z patentu:

ARES TRADING S.A., Aubonne, CH

(72) Twórca(y) wynalazku:

TUDOR ARVINTE, Riehen, CH KARINE LUET KLEIBER, Saint Julien en Genevois, FR

(74) Pełnomocnik:

PL/E

P 17

4021

3 T3

rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. SKR. POCZT. 168 00-950 WARSZAWA

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 1 740 213

1

Opis

Dziedzina wynalazku

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy ciekłych preparatów hormonu wzrostu (GH), a w szczególności ciekłych

preparatów ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) o udoskonalonej stabilności chemicznej i fizycznej. Ciekłe

preparaty hormonu wzrostu (GH) według niniejszego wynalazku można przechowywać przez dłuższy czas w 5

temperaturze pokojowej. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto procesu wytwarzania takich ciekłych

preparatów GH i ich postaci.

Tło wynalazku

[0002] Ludzki hormon wzrostu (hGH), znany także jako somatropina (INN) lub somatotropina, jest 10

hormonem białkowym wytwarzanym i wydzielanym przez somatotropy przedniego płata przysadki. Ludzki

hormon wzrostu odgrywa kluczową rolę we wzroście somatycznym w dzieciństwie i metabolizmie dorosłych,

przez wpływ na metabolizm białek, węglowodanów i lipidów.

[0003] Ludzki hormon wzrostu jest składającym się ze 191 aminokwasów, jednołańcuchowym polipeptydem

(Bewly i wsp., 1972), posiadającym dwa mostki siarkowe, jeden pomiędzy Cys-53 i Cys-165, tworzący dużą 15

pętlę w cząsteczce oraz drugi pomiędzy Cys-182 i Cys-189, tworzący małą pętlę bliżej końca C. Sekwencja

DNA, która potwierdziła sekwencję aminokwasową została przedstawiona przez Martial i wsp. (1979).

Oczyszczony hGH w swojej zliofilizowanej postaci jest białym, amorficznym proszkiem. Jest z łatwością

rozpuszczalny (stężenia >10 mg/L) w buforach wodnych, o pH w zakresie od 6,5 do 8,5.

[0004] W roztworze hGH występuje głównie w postaci monomeru, z niewielką frakcją dimerów i oligomerów 20

o wyższej masie cząsteczkowej. W określonych warunkach, można zaindukować hGH do tworzenia

większych ilości dimerów, trimerów i wyższych oligomerów.

[0005] Znanych jest szereg pochodnych hGH, w tym naturalnie występujących pochodnych, wariantów i

produktów metabolizmu, produktów degradacji, głównie biosyntetycznego hGH i skonstruowanych

pochodnych hGH wytworzonych metodami genetycznymi. Jednym przykładem naturalnie występującej 25

pochodnej hGH jest GH-V, wariant hormonu wzrostu znaleziony w łożysku. Innych przedstawicieli locus

genu przedstawiono w Chen i wsp. (1989).

[0006] Metionylo-hGH był pierwszą formą hGH, którą można było otrzymać za pomocą technologii

rekombinacji DNA. Związek ten jest w rzeczywistości pochodną hGH posiadającą jedną dodatkową resztę

metioninową na końcu N (Goeddel i wsp., 1979). 30

[0007] Naturalnie występujący wariant hGH, nazywany 20-k-hGH, opisano jako występujący w przysadce

jak również we krwi (Lewis i wsp., 1978; Lewis i wsp., 1980). Związek ten, który utracił 15 reszt

aminokwasowych, od Glu-32 do Gln-46, powstaje w wyniku alternatywnego składania przekaźnikowego

kwasu rybonukleinowego (DeNoto i wsp., 1981). Związek ten ma wiele wspólnych z hGH własności

biologicznych, choć nie wszystkie. 35

[0008] 20-K-hGH jest wytwarzany w przysadce i wydzielany do krwi. Stanowi około 5% hormonu wzrostu

produkowanego u dorosłych i około 20% hormonu wzrostu produkowanego u dzieci. Posiada tę samą

aktywność pobudzającą wzrost jak 22kD hGH i został opisany jako posiadający równą lub większą

aktywność lipolityczną, w porównaniu z formą 22kD hGH. Wiąże się z receptorami hormonu wzrostu z

równym powinowactwem jak hormon 22kD i posiada jedną dziesiątą aktywności mlekopędnej (typu 40

prolaktyny) hormonu 22 kD. W przeciwieństwie do 22kD, 20-k-hGH posiada słabą aktywność antyinsulinową.

EP 1 740 213

2

[0009] Wiele pochodnych hGH powstaje w następstwie proteolitycznych modyfikacji cząsteczki. Pierwotny

szlak metaboliczny hGH wymaga proteolizy. Region hGH wokół reszt 130-150 jest wyjątkowo podatny na

proteolizę i opisano wiele pochodnych posiadających zmiany lub delecje w tym regionie (Thorlacius-Ussing,

!987). Region ten znajduje się w dużej pętli hGH i przecięcie w nim wiązania peptydowego prowadzi do

wytworzenia dwóch łańcuchów, które są połączone mostkami dwusiarczkowymi w Cys-53 i Cys-165. 5

Opisywano, że wiele z tych dwułańcuchowych form posiada podniesioną aktywność biologiczną (Singh i

wsp., 1974). Wiele pochodnych ludzkiego czynnika wzrostu wytworzono sztucznie, za pomocą enzymów. Do

modyfikacji hGH w różnych miejscach cząsteczki stosowano trypsynę i subtylizynę, jak również wiele innych

enzymów (Lewis i wsp., 1977; Graff i wsp, 1982). Jedną z takich pochodnych, nazywaną dwułańcuchowym

białkiem anabolicznym (2-CAP) wytworzono za pomocą kontrolowanej proteolizy hGH, przy użyciu trypsyny 10

(Becker i wsp., 1989). Odkryto, że 2-CAP posiada własności biologiczne znacznie różniące się od

nienaruszonej cząsteczki hGH, tak, że aktywność hGH promująca wzrost była w dużym stopniu zachowana,

a większość efektu na metabolizm węglowodanów była zniesiona.

[0010] W odpowiednich warunkach reszty asparaginowa i glutaminowa są podatne na reakcję deamidacji.

Pokazano, że przysadkowy hGH podlega reakcji tego rodzaju, co prowadzi do przekształcenia jego Asn-152 15

w kwas asparaginowy a także, w mniejszym stopniu, przekształcenia Gln-137 w kwas glutaminowy (Lewis i

wsp., 1981). Wykazano, że deamidowany hGH posiada zmienioną podatność na proteolizę subtylizyną, co

sugeruje, że deamidacja może mieć fizjologiczne znaczenie w kierowaniu proteolitycznym cięciem hGH.

Wiadomo, że biosyntetyczny hGH degraduje w określonych warunkach, co prowadzi do deamidacji w innej

reszcie asparaginowej (Asn-149). Jest to główne miejsce deamidacji, chociaż obserwowano także 20

deamidację w Asn-152 (Becker i wsp., 1988). Nie opisano deamidacji w Gln-137 biosyntetycznego hGH.

[0011] Reszty metioninowe w białkach są podatne na utlenianie, głównie do sulfotlenku. hGH pochodzący

zarówno z przysadki jak i biosyntetyczny podlega sulfoksydacji w Met-14 i Met 125 (Becker i wsp., 1988).

Opisywano także oksydację w Met-170 w hGH pochodzącym z przysadki, ale nie w biosyntetycznym.

Odkryto, że zarówno hGH po deamidacji jak i sulfotlenek hGH w Met-14 wykazują pełną aktywność 25

biologiczną (Becker i wsp., 1988).

[0012] Dzięki zastosowaniu enzymów lub metod genetycznych wytworzono skróconą formę hGH. 2-CAP,

wytworzony za pomocą kontrolowanego działania trypsyny, ma usuniętych osiem pierwszych reszt na końcu

N hGH. Inne skrócone wersje hGH wytworzono przez modyfikację genu poprzedzającą jego ekspresją w

odpowiednim gospodarzu. Usunięto 13 pierwszych reszt w celu uzyskania pochodnej posiadającej 30

odróżniające ją własności biologiczne (Gertler i wsp., 1986), w której łańcuch polipeptydowy nie jest cięty.

[0013] Chociaż pierwotnie ludzki hormon wzrostu był wyizolowany z przysadek zwłok, preparaty te nie były

homogenne elektroforetycznie i w surowicach pacjentów, którym podawano preparaty o czystości rzędu

50%, pojawiały się przeciwciała, przy czym immunogenność przypisywano nieaktywnym składnikom.

Technologie rekombinacji DNA umożliwiły wytwarzanie nieograniczonej ilości hGH w szeregu różnych 35

układów. Oczyszczanie hGH z pożywki hodowlanej jest ułatwione dzięki obecności jedynie niewielkich ilości

białek zanieczyszczających. W rzeczywistości, wykazano, że hGH można oczyścić na skalę laboratoryjną w

jednym etapie oczyszczania na kolumnie HPLC w odwróconym układzie faz (Hsiung i wsp., 1989).

[0014] Zrekombinowany ludzki hormon wzrostu, rhGH, jest wytwarzany przez Serono International S.A,

jako produkt o nazwie SEROSTIM®, który uzyskał przyspieszoną rejestrację FDA do leczenia utraty masy 40

ciała i wyniszczenia u pacjentów z AIDS. SAIZEN® jest zrekombinowanym ludzkim hormonem wzrostu ze

wskazaniem zastosowania przy niedoborze GH u dzieci, zespole Turner’a u dziewczynek, jak również przy

EP 1 740 213

3

przewlekłej niewydolności nerek u dzieci. PROTROIN®, produkowany przez Genentech, Inc. (South San

Francisco, CA), różni się nieco strukturą od naturalnej sekwencji hGH, ze względu na to, że posiada

dodatkową resztę metioninową na końcu N. Zrekombinowany hGH występuje zazwyczaj na rynku w postaci

fiolek zawierających hGH plus dodatkowe zaróbki, np. glicynę lub mannitol, w formie liofilizowanej.

Dostarczana jest towarzysząca fiolka z rozcieńczalnikiem, pozwalająca pacjentowi na odtworzenie produktu 5

do pożądanego stężenia przed podaniem dawki. Zrekombinowany hGH może występować na rynku w

innych dobrze znanych postaciach, takich jak w wypełnione strzykawki.

[0015] Do tego, aby hGH był dostępny na rynku jako lek konieczne jest przygotowanie jego stabilnych

preparatów. Takie preparaty muszą zachowywać aktywność przez odpowiedni czas przechowywania i być

dopuszczone do podawania pacjentom. 10

[0016] Ludzki GH jest formowany w preparaty wieloma sposobami. Przykładowo, dokument US 5096885

ujawnia stabilny, dopuszczalny farmaceutycznie preparat hGH obejmujący, oprócz hGH, glicynę, mannitol,

bufor i ewentualnie niejonowy środek powierzchniowo czynny, w stosunku molowym hGH : glicyna

wynoszącym 1:50.

[0017] WO 93/19776 ujawnia preparaty GH do iniekcji, obejmujące jako substancję buforową cytrynian i 15

ewentualnie czynniki wzrostu, takie jak insulinopodobne czynniki wzrostu lub czynnik wzrostu naskórkowy,

aminokwasy, takie jak glicyna lub alanina, mannitol lub inne alkohole cukrowe, glicerol i/lub środek

konserwujący, taki jak alkohol benzylowy.

[0018] WO 94/101398 ujawnia preparat GH zawierający hGH, bufor, niejonowy środek powierzchniowo

czynny i ewentualnie mannitol, sól neutralną i/lub środek konserwujący. 20

[0019] EP 0131864 ujawnia wodny roztwór białek o masie cząsteczkowej powyżej 8500 Daltonów, które są

chronione przed adsorpcją na powierzchniach międzyfazowych, denaturacją i wytrącaniem białka, przez

dodanie, jako czynnika stabilizującego, substancji aktywnej powierzchniowo, zawierającej liniowe łańcuchy

polioksyalkilenowe.

[0020] EP 0211601 ujawnia preparat pobudzający wzrost, obejmujący wodną mieszaninę hormonu 25

pobudzającego wzrost oraz kopolimer blokowy, zawierający jednostki polyoksyetyleno-polioksypropylenowe

i w przybliżeniu o masie cząsteczkowej wynoszącej od około 1100 do około 40000, który utrzymuje po

podaniu ciekłość plastyczną hormonu pobudzającego wzrost i jego aktywność biologiczną.

[0021] WO 97/29767 ujawnia ciekły preparat obejmujący hormon wzrostu, bezwodnik cytrynianu

trójsodowego, chlorek sodowy, wodorotlenek sodowy, alkohol benzylowy, Pluronic F-68, gdzie omawiany 30

preparat posiada pH 5,6.

[0022] US 5567677 ujawnia ciekłe preparaty obejmujące ludzki hormon wzrostu, cytrynian sodu, fosforan

sodu, glicynę, mannitol, ewentualnie alkohol benzylowy.

[0023] Preparaty farmaceutyczne hGH mają tendencję do niestabilności, w szczególności w postaci

roztworu. Pojawiają się produkty chemicznej degradacji, jak deamidowane lub sulfoksydowane formy hGH, a 35

dimerowe lub o wyższej masie cząsteczkowej produkty agregacji, mogą wynikać z fizycznej niestabilności

(Becker i wsp., 1988; Becker i wsp., 1987; Pearlman i Nguyen, 1989).

[0024] Ze względu na niestabilność hGH w roztworze, preparaty farmaceutyczne hGH występują zazwyczaj

w postaci zliofilizowanej, która musi być odtworzona przed użyciem. Odtwarzanie prowadzone jest

zazwyczaj przez dodanie farmaceutycznie dopuszczalnego rozcieńczalnika, takiego jak jałowa woda do 40

iniekcji, jałowy roztwór soli fizjologicznej lub odpowiedni jałowy fizjologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik.

EP 1 740 213

4

[0025] Odtworzone roztwory hGH są korzystnie przechowywane w 4ºC w celu zminimalizowania reakcji

chemicznej i fizycznej degradacji, chociaż w takich warunkach przechowywania, w okresie powyżej 14 dni,

pojawia się degradacja.

[0026] Szczególnie korzystny byłby preparat farmaceutyczny hGH dostarczony w postaci ciekłej, w

szczególności taki, który utrzymywałby stabilność hGH bez precypitacji lub agregacji lub innych substancji w 5

postaci cząstek przez dłuższy okres czasu.

[0027] Zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ciekłych preparatów hormonu wzrostu,

w których nie powstają niepożądane substancje w postaci cząstek i które charakteryzuje przedłużony czas

przechowywania.

10

Streszczenie wynalazku

[0028] Pierwszy aspekt wynalazku dotyczy ciekłego preparatu obejmującego:

a) hormon wzrostu lub hormon uwalniający hormon wzrostu (GHRH);

b) sól metali alkalicznych;

c) sól metali ziem alkalicznych lub sól pseudo metali ziem alkalicznych; oraz 15

d) bufor cytrynianowy/fosforanowy, przy czym pH preparatu jest w zakresie 5,5 - 5,8.

[0029] Drugi aspekt wynalazku dotyczy sposobu przygotowania ciekłego preparatu według niniejszego

wynalazku.

[0030] W trzecim aspekcie, wynalazek dotyczy liofilizowanego preparatu, który jest odtwarzany w taki

sposób, że daje nowy ciekły preparat wskazany powyżej. 20

[0031] W trzecim aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania preparatu według wynalazku do podawania

hormonu wzrostu w postaci dawki pojedynczej lub dawki wielokrotnej.

[0032] Czwarty aspekt wynalazku dotyczy postaci ciekłego preparatu według wynalazku.

Szczegółowy opis wynalazku 25

[0033] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ujawniono, że stabilność chemiczną i fizyczną hormonu wzrostu

w ciekłym preparacie można zwiększyć przez specyficzny wybór soli mineralnych. Zatem, uzyskane roztwory

można przechowywać przez dłuższy okres czasu, np. przez około 1 do 52 tygodni, lub 1 do 16, lub 1 do 4

tygodni, korzystnie w temperaturze pokojowej.

[0034] Ponadto ujawniono, że dla kompozycji według zastrz. 1 można uzyskać ulepszoną stabilność 30

hormonu wzrostu w ciekłym preparacie przez dłuższy okres czasu.

[0035] Zatem, wynalazek dotyczy ciekłego preparatu obejmującego:

a) hormon wzrostu lub hormon uwalniający hormon wzrostu;

b) sól metali alkalicznych;

c) sól metali ziem alkalicznych lub sól pseudo metali ziem alkalicznych; oraz 35

d) bufor cytrynianowy/fosforanowy, przy czym pH preparatu jest w zakresie 5,5 -5,8.

[0036] W jednym wykonaniu, ciekłe preparaty według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do

podawania w postaci dawki wielokrotnej, przy czym omawiany preparat można przechowywać w

temperaturze pokojowej przez okres 1 tygodnia lub dłużej.

[0037] Hormon wzrostu do przygotowania według niniejszego wynalazku może pochodzić z dowolnego 40

gatunku, takiego jak bydlęcy, świński, psi lub koci, w zależności od przeznaczenia preparatu.

[0038] Korzystnie następujące substancje można formułować w preparat zgodnie z wynalazkiem:

EP 1 740 213

5

a) ludzki hormon wzrostu;

b) fragment (a), który wykazuje aktywność agonistyczną wobec receptora hGH;

c) wariant (a) lub (b), który ma co najmniej 70% identyczności sekwencji z (a) lub (b) i, który wykazuje

aktywność agonistyczną wobec receptora hGH;

d) wariant (a) lub (b), który jest kodowany przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną 5

sekwencją natywnego DNA kodującego (a) lub (b), w umiarkowanie ostrych warunkach i który

wykazuje aktywność agonistyczną wobec receptora hGH; lub

e) sól lub funkcjonalna pochodna (a) , (b), (c) lub (d), która wykazuje aktywność agonistyczną wobec

receptora hGH.

[0039] Korzystny według niniejszego wynalazku jest preparat obejmujący ludzki hormon wzrostu. 10

[0040] Użyty w niniejszym wynalazku termin „ludzki hormon wzrostu” lub „hGH” obejmuje pochodne

naturalnie występujące lub syntetyczne, jak wspomniano powyżej, w tym, bez ograniczania, ludzki hormon

wzrostu, zarówno 20kD jak 22kD, GH-V oraz innych przedstawicieli locus genu hormonu wzrostu, jak

szczegółowo opisano w części pt. „Tło wynalazku”.

[0041] hGH może być naturalnie występującym ludzkim hormonem wzrostu lub może być korzystnie 15

zrekombinowanym hGH. Zrekombinowany GH można wytwarzać w dowolnym gospodarzu, zarówno

prokariotycznym jak eukariotycznym. Szczególnie przydatnym do wytwarzania hGH gospodarzem jest, na

przykład, E. coli. Drożdże, owady lub komórki ssacze są kolejnymi przydatnymi gospodarzami do

wytwarzania zrekombinowanego hormonu wzrostu. Korzystnie, hGH jest wytwarzany w komórkach ludzkich

lub zwierzęcych, np. komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). 20

[0042] W użytym tu znaczeniu, termin „hGH’ lub „hormon wzrostu” obejmuje także funkcjonalne pochodne,

fragmenty, warianty, analogi lub sole hormonu wzrostu, które zachowują aktywność biologiczną, tzn. które

działają jako agoniści wobec receptora hormonu wzrostu. Innymi słowy, są zdolne do wiązania receptora

hormonu wzrostu w celu zainicjowania aktywności przekazywania sygnału przez ten receptor.

[0043] W użytym tu znaczeniu, termin „funkcjonalne pochodne” lub „chemiczne pochodne” dotyczy 25

pochodnych, które można przygotować wykorzystując grupy funkcyjne, występujące jako łańcuchy boczne

na resztach grup znajdujących się na końcach N lub C, sposobami znanymi w dziedzinie, i są włączone do

wynalazku dopóty, dopóki pozostają farmaceutycznie dopuszczalne i nie zaburzają aktywności biologicznej

hGH, jak tu opisano, tzn. zdolności wiązania receptora hGH i inicjowania aktywności przekazywania sygnału

przez ten receptor oraz nie nadają właściwości toksycznych zawierającym je kompozycjom. Pochodne mogą 30

posiadać cząstki chemiczne, takie jak reszty węglowodanowe lub fosforanowe, pod warunkiem, że

pochodne takie zachowują aktywność biologiczną hGH i pozostają farmaceutycznie dopuszczalnymi.

[0044] Przykładowo, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup

karboksylowych, powstałe w wyniku reakcji z amoniakiem, lub pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi

aminami, pochodne N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych utworzone z 35

ugrupowaniami acylowymi (np. grupy alkanoilowe lub karbocykliczne aroilowe) lub pochodne O-acylowe

wolnych grup hydroksylowych (np. tych z reszt serylowych lub treonylowych) tworzonych z ugrupowaniami

acylowymi. Pochodne takie mogą także, przykładowo, obejmować łańcuchy boczne z glikolu

polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i zwiększać odporność cząsteczki na działanie

płynów ustrojowych. 40

[0045] Hormon wzrostu, będący pochodną lub kombinacją z czynnikiem kompleksującym może być

długotrwały. Zatem, korzystne wykonanie według wynalazku dotyczy PEGylowanych wersji ludzkiego

EP 1 740 213

6

hormonu wzrostu. Hormony wzrostu wytworzone przy użyciu inżynierii genetycznej, tak aby wykazywały

długi okres aktywności w organizmie także są przykładami pochodnych hGH mieszczącymi się w zakresie

niniejszego wynalazku.

[0046] Wyizolowano i opisano hGH acetylowany na końcu N (Lewis i wsp., 1979). Nie jest jasne czy

acylacja pełni rolę regulacyjną czy jest po prostu sztucznym następstwem procesu oczyszczania. Jednakże, 5

oczekuje się, że cząsteczka ta wykazuje aktywność GH podobnie do innych pochodnych hGH. Zatem, w

korzystnym wykonaniu, wynalazek dotyczy ludzkiego hormonu wzrostu, który jest acetylowany na końcu N.

[0047] Korzystnie, preparat według wynalazku obejmuje dimer ludzkiego hormonu wzrostu

wyselekcjonowany z grupy składającej się z dimeru dwusiarczkowego, połączonego międzyłańcuchowymi

mostkami dwusiarczkowymi, dimeru nieodwracalnie połączonego wiązaniem kowalencyjnym, nie będącym 10

mostkiem dwusiarczkowym, dimeru niepołączonego wiązaniem kowalencyjnym lub ich mieszanin.

[0048] Użyty tu termin „sole”, dotyczy zarówno soli grup karboksylowych jak soli addycyjnych grup

aminowych z kwasami cząsteczki hGH lub jej analogów. Sole grup karboksylowych można tworzyć

sposobami znanymi w dziedzinie i obejmują one sole nieorganiczne, przykładowo, sole sodu, wapnia,

amonu, żelaza i cynku i im podobne, oraz sole zasad organicznych, jak te tworzone, przykładowo, z 15

aminami, takimi jak trietyloamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i im podobnymi. Sole addycyjne z

kwasami obejmują, przykładowo, sole z kwasami mineralnymi, takimi jak kwas chlorowodorowy lub kwas

siarkowy oraz sole z kwasami organicznymi, takimi jak, przykładowo, kwas octowy lub kwas szczawiowy.

Oczywiście, każda z takich soli musi zachowywać aktywność biologiczną hGH odpowiednią według

niniejszego wynalazku, tzn. zdolność do wiązania receptora hGH i inicjowania aktywności przekazywania 20

sygnału przez ten receptor.

[0049] W dalszym korzystnym wykonaniu, wynalazek dotyczy fragmentu ludzkiego hormonu wzrostu.

[0050] „Fragment” hormonu wzrostu według niniejszego wynalazku dotyczy dowolnego podzbioru

cząsteczki, który jest krótszym peptydem, zachowującym pożądaną aktywność biologiczną. Fragmenty

można z łatwością przygotować przez usunięcie aminokwasów z dowolnego końca cząsteczki hGH i 25

przetestowanie uzyskanego produktu pod kątem własności jako agonisty receptora hGH. Znane są proteazy

usuwające jednorazowo po jednym aminokwasie zarówno z końca N jak końca C polipeptydu, a zatem

oznaczenie fragmentów, które zachowały pożądaną aktywność biologiczną wymaga tylko przeprowadzenia

rutynowych doświadczeń.

[0051] Korzystnie, fragmenty hGH według niniejszego wynalazku mogą posiadać wewnętrzne delecje, 30

dopóty, dopóki delecja nie zaburza aktywności biologicznej hGH, tzn. wiązania receptora hGH i inicjowania

aktywności przekazywania sygnału przez ten receptor. Korzystny fragment według wynalazku nie posiada

15 aminokwasów, od kwasu glutaminowego (Glu) 32 do kwasu glutaminowego 46.

[0052] Fragmenty hGH mogą dalej być skrócone na końcu C lub N. Według niniejszego wynalazku,

korzystne są także skrócone hGH, bez pierwszych ośmiu reszt na końcu N lub pierwszych 13 reszt na końcu 35

N ludzkiego hormonu wzrostu.

[0053] Opisano krótki fragment hGH z końca C, który zachował aktywność biologiczną hGH, patrz patent

US 5869452. Zatem, korzystne jest według wynalazku zastosowanie fragmentu końca C z hGH. Fragment

hGH177-191, obejmujący co najmniej reszty aminokwasowe 177 do 191 z hGH (LRIVQCRSVEGSCGF) jest

szczególnie korzystny według niniejszego wynalazku. Ponadto, korzystne są pochodne tego peptydu, takie 40

jak warianty peptydowe opisane w patencie US 6335319 lub WO99/12969, np. peptydy cykliczne.

EP 1 740 213

7

[0054] Dodatkowo, polipeptyd, który posiada taką aktywność agonisty wobec receptora hGH, czy to hGH,

analog lub wariant, sól, funkcjonalna pochodna lub ich fragment, może także zawierać dodatkowe reszty

aminokwasowe otaczające polipeptyd hGH. Dopóty, dopóki rdzeń polipeptydu uzyskanej cząsteczki

zachowuje zdolność bycia agonistą receptora hGH, przeprowadzenie rutynowych doświadczeń może

określić czy dowolne otaczające reszty zaburzają jego podstawowe i nowe cechy charakterystyczne, tzn 5

cechy charakterystyczne tego rdzenia polipeptydu jako agonisty receptora.

[0055] Przykładem takiego wariantu GH, który jest korzystny według niniejszego wynalazku, jest

metionylowany ludzki hormon wzrostu (Met-hGH), który posiada dodatkową resztę metioniny na końcu N

ludzkiego hormonu wzrostu.

[0056] Warianty hGH, korzystne według wynalazku, obejmują metionylowany hGH, który jest ludzkim 10

hormonem wzrostu posiadającym dodatkową resztę metioninową na swoim końcu N. Kolejny korzystny

wariant ludzkiego hormonu wzrostu nie posiada 15 reszt aminokwasowych od Glu32 do Glu46.

[0057] „Wariant” ludzkiego hormonu wzrostu według niniejszego wynalazku dotyczy cząsteczki, która jest

zasadniczo podobna do całego białka, bądź jego fragmentu. Wariant można także nazywać „muteiną”.

Wariantem może być np. izoforma hGH, taka jak wariant wytworzony dzięki alternatywnemu składaniu 15

mRNA. Warianty (poli)peptydów można tradycyjnie wytworzyć za pomocą bezpośredniej syntezy chemicznej

wariantu peptydu, przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie. Oczywiście, wariant ludzkiego hormonu

wzrostu będzie miał co najmniej podobną aktywność wiązania receptora hGH i inicjowania przekazywania

sygnału jak hGH i oczekuje się, że będzie zatem posiadać aktywność podobną do hGH.

[0058] Sekwencje aminokwasowe wariantów ludzkiego hormonu wzrostu można wytworzyć przez 20

wprowadzenie mutacji do cząsteczek DNA, które kodują syntetyzowane pochodne ludzkiego hormonu

wzrostu. Warianty takie obejmują, przykładowo, delecje lub insercje lub podstawienia reszt w sekwencji

aminokwasowej. Można wytworzyć także dowolną kombinację delecji, insercji i substytucji w celu uzyskania

końcowego konstruktu, pod warunkiem, że końcowy produkt posiada pożądaną aktywność. Oczywiście,

mutacje wprowadzone do DNA kodującego wariant peptydu nie mogą zmieniać ramki odczytu. 25

[0059] Na poziomie genetycznym, warianty te można wytworzyć za pomocą ukierunkowanej mutagenezy

(jak zilustrowano w Adelman i wsp., 1983) nukleotydów w DNA kodującym cząsteczkę peptydu, wytwarzając

tym samym DNA kodujący wariant, a następnie ekspresji DNA w hodowli zrekombinowanych komórek.

Warianty wykazują zazwyczaj aktywność biologiczną co najmniej tej samej jakości co peptyd nie będący

wariantem. 30

[0060] „Analog” ludzkiego czynnika wzrostu według niniejszego wynalazku odnosi się do cząsteczki nie

będącej naturalną, która jest zasadniczo podobna do całej cząsteczki lub jej aktywnego fragmentu. Analog

ludzkiego hormonu wzrostu przydatny w niniejszym wynalazku będzie wykazywać aktywność GH.

[0061] Rodzaje podstawień, do wprowadzenia w ludzkim hormonie wzrostu według niniejszego wynalazku

można określić na podstawie analizy częstości zmian aminokwasowych widzianych pomiędzy białkami 35

homologicznymi, pochodzącymi z różnych gatunków. Na podstawie takiej analizy, podstawienia

konserwatywne można zdefiniować jako zmiany w obrębie następujących pięciu grup:

I. Reszty małe, alifatyczne, niepolarne lub słabo polarne:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II. Reszty polarne o ładunku ujemnym i ich amidy: 40

Asp, Asn, Glu, Gln

III. Reszty polarne o ładunku dodatnim:

EP 1 740 213

8

His, Arg, Lys

IV. Reszty duże, alifatyczne, niepolarne:

Met, Leu, Ile, Val, Cys

V. Reszty duże, aromatyczne:

Phe, Try, Trp 5

[0062] W obrębie powyższych grup, następujące podstawienia są uważane za „wysoce konserwatywne”:

Asp/Glu

His/Arg/Lys

Phe/Tyr/Trp

Met/Leu/Ile/Val 10

[0063] Podstawienia semikonserwatywne są zdefiniowane jako zmiany pomiędzy dwiema grupami (I)-(IV)

powyżej, które są ograniczone do supergrupy (A), obejmującej (I), (II) i (III) powyżej lub do supergrupy (B),

obejmującej (IV) i (V) powyżej. Podstawienia nie są ograniczone do genetycznie kodowanych czy nawet

występujących naturalnie aminokwasów. Kiedy epitop jest wytwarzany za pomocą syntezy peptydu,

pożądany aminokwas można zastosować bezpośrednio. Ewentualnie, genetycznie kodowany aminokwas 15

można modyfikować dzięki jego reakcji z organicznym czynnikiem derywatyzującym, który jest zdolny do

reakcji z wybranym łańcuchami bocznymi lub resztami znajdującymi się na końcu peptydu.

[0064] Reszty cysteinylowe najczęściej są poddawane reakcji z alfa-halooctanami (i odpowiadającymi im

aminami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid, z wytworzeniem pochodnych

karboksymetylowych lub karboksyamidometylowych. Reszty cysteinylowe są także derywatyzowane dzięki 20

reakcji z bromotrifluoroacetonem, kwasem alfa-bromo-beta-(5-imidazoilo)propionowym, fosforanem

chloroacetylowym, N-alkilomaleinoimidami, disiarczkiem 3-nitro-2-pirydylu, disiarczkiem metylo-2-pirydylu, p-

cholorortęciobenzoesanem, 2-chlorortęcio-4-nitrofenolem lub chloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolem.

[0065] Reszty histydylowe są derywatyzowane w reakcji z pirowęglanem dietylu przy pH 5,5-7,0, ponieważ

czynnik ten jest specyficzny odpowiednio wobec histydynylowego łańcucha bocznego. Przydatny jest także 25

bromek parabromofenacylu; reakcja jest korzystnie przeprowadzana w 0,1 M kakodylanie sodu przy pH 6,0.

[0066] Reszty lizynylowe oraz reszty na końcu aminowym są poddawane reakcji z bezwodnikiem

bursztynowym lub bezwodnikami innych kwasów karboksylowych. Derywatyzacja tymi czynnikami wpływa

na odwrócenie ładunku reszt lizynylowych. Inne przydatne odczynniki derywatyzujące reszty alfa-

aminokwasowe obejmują estry imidowe, takie jak pikolinoimidan metylowy; fosforan pirydoksalowy, 30

pirydoksal; chloroborowodorek, kwas trójnitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomocznik, 2,4-pentanodion; oraz

reakcję z glioksylanem katalizowaną transaminazą.

[0067] Reszty arginylowe są modyfikowane w reakcji z jednym lub większą liczbą konwencjonalnych

odczynników, a wśród nich fenyloglioksalem; 2,3-butanodionem; oraz ninhydryną. Derywatyzacja reszt

argininowych wymaga prowadzenia reakcji w warunkach alkalicznych ze względu na wysoką wartość pKa 35

funkcyjnej grupy guanidynowej. Ponadto, odczynniki te mogą reagować z grupami lizyny, jak również z

grupą epsilon-aminową argininy.

[0068] Intensywnie badano specyficzną modyfikację samych reszt tyrozylowych, ze szczególnym

uwzględnieniem wprowadzania znaczników widmowych do reszt tyrozynowych w reakcji z diazoniowymi

związkami aromatycznymi lub tetranitrometanem. Powszechnie do tworzenia O-acetylotyrozylowych 40

cząsteczek i pochodnych ε-nitrowych stosowane są, odpowiednio, N-acetyloimidazol i tetranitrometan.

EP 1 740 213

9

[0069] Karboksylowe grupy boczne (reszty aspartylowa i glutamylowa) są modyfikowane selektywnie w

reakcji z karbodiimidami (R’N-C-N-R’), takimi jak 1-cykloheksylo-3-[2-morfolinylo-(4-etylo)]karbodiimid lub 1-

etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylowa i glutamylowa są

przekształcane do reszt asparaginylowej i glutaminylowej w reakcji z jonami amonowymi.

[0070] Reszty glutaminylowe i asparaginylowe często są poddawane deamidacji w wyniku której powstają 5

odpowiednie reszty glutamylowe i aspartylowe. Ewentualnie, reszty te poddawane są deamidacji w

warunkach umiarkowanie kwaśnych. Każda z tych reszt mieści się w zakresie tego wynalazku.

[0071] Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białkach, do zastosowania przy uzyskiwaniu

analogów hGH do użycia według niniejszego wynalazku obejmują etapy dowolnych znanych metod, takie jak

zaprezentowane w patentach US RE 33653; 4959314; 4588585 i 4737462 dla Mark i wsp.; 5116943 dla 10

Koths i wsp.; 4965195 dla Namen i wsp.; oraz 5017691 dla Lee i wsp. oraz białka postawione lizyną w

patencie US 4904584 (Shaw i wsp.). Ponadto warianty hormonu wzrostu opisano np. w patencie US

6143523 (Cunningham i wsp.).

[0072] Wśród substancji, które wiążą się z receptorem ludzkiego hormonu wzrostu i inicjują aktywność

przekazywania sygnału przez ten receptor do użycia według niniejszego wynalazku znajdują się wszystkie 15

znane w literaturze analogi i mimetyki hormonu wzrostu, takie jak, przykładowo, te ujawnione w patentach

US 5851992; 5849704; 5849700; 5849535; 5843453; 5834598; 5688666;5654010; 5635604; 5633352;

5597709; oraz 5534617.

[0073] Korzystnie, wariant lub analog hGH będzie posiadał sekwencję rdzenia, taką samą jak ta z sekwencji

natywnej lub jej biologicznie aktywnego fragmentu, która posiada sekwencję aminokwasową o co najmniej 20

70% identyczności z natywną sekwencją aminokwasową i zachowuje jej biologiczna aktywność. Korzystniej,

sekwencja taka posiada co najmniej 80% identyczności, co najmniej 90% identyczności lub korzystniej co

najmniej 95% identyczności z sekwencją natywną.

[0074] „Identyczność” odzwierciedla związek pomiędzy dwiema lub większą liczbą sekwencji

polipeptydowych albo dwiema lub większą liczbą sekwencji polinukleotydowych, określony dzięki 25

porównaniu sekwencji. Zasadniczo, identyczność dotyczy dokładnego dopasowania nukleotydu do

nukleotydu lub aminokwasu do aminokwasu, odpowiednio, w dwóch sekwencjach polinukleotydowych lub

polipeptydowych, na porównywanej długości sekwencji.

[0075] Dla sekwencji, które nie są dokładnie dopasowane do siebie, można określić „% identyczności”.

Zasadniczo, dwie porównywane sekwencje są tak przyrównywane do siebie, aby uzyskać maksimum 30

korelacji pomiędzy nimi. Może to obejmować wprowadzenie „luk” do jednej lub obu sekwencji, w celu

zwiększenia stopnia przyrównania. % identyczności można określić na całej długości każdej porównywanej

sekwencji (tak zwane przyrównanie globalne), co jest szczególnie dogodne dla sekwencji o tej samej lub

podobnej długości, lub na krótszych, zdefiniowanych długościach (tak zwane przyrównanie lokalne), co jest

dogodne dla sekwencji o nierównych długościach. 35

[0076] Metody porównywania identyczności i homologii dwóch lub większej liczby sekwencji są dobrze

znane w dziedzinie. Zatem, przykładowo, do określenia % identyczności pomiędzy dwoma polinukleotydami

i % identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami polipeptydowymi można zastosować programy dostępne

w Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 9.1 (Devereux J i wsp., 1984), przykładowo, programy

BESTFIT i GAP. BESTFIT wykorzystuje algorytm „homologii lokalnej” według Smith i Waterman (1981) i 40

wyszukuje pojedynczy region największego podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami. W dziedzinie

znane są dobrze także inne programy do określania identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy

EP 1 740 213

10

sekwencjami; przykładowo, rodzina programów BLAST (Altschul SF i wsp., 1990, Altschul SF i wsp., 1997,

dostępne przez stronę główną w NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson WR, 1990; Pearson

1988).

[0077] Korzystnymi zmianami prowadzącymi do powstania wariantów i mutein według niniejszego

wynalazku są zmiany znane jako podstawienia „konserwatywne”. Konserwatywne podstawienia 5

aminokwasów polipeptydów lub białek hormonu wzrostu mogą obejmować aminokwasy synonimiczne, w

grupach posiadających wystarczająco podobne właściwości fizyko-chemiczne, tak, że podstawienia

pomiędzy przedstawicielami grupy będą zabezpieczać biologiczną funkcję cząsteczki (Grantham, 1974).

Jest jasne, że do zdefiniowanych powyżej sekwencji można wprowadzać insercje i delecje aminokwasów

bez zmiany ich funkcji, w szczególności jeśli insercje i delecje obejmują jedynie niewielką liczbę 10

aminokwasów, np. poniżej trzydziestu i korzystnie poniżej dziesięciu, oraz nie usuwają lub zastępują

aminokwasów krytycznych dla funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny

wytworzone dzięki takim delecjom i/lub insercjom wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

[0078] Analogi i warianty według niniejszego wynalazku można także określić za pomocą procedur

przedstawionych poniżej. DNA sekwencji natywnej jest znane w dziedzinie i opisane w literaturze (Martial i 15

wsp., 1979). Do zakresu niniejszego wynalazku należą także polipeptydy kodowane przez dowolny kwas

nukleinowy, taki jak DNA lub RNA, który hybrydyzuje z komplementarnym natywnym DNA lub RNA, w

warunkach wysokiej ostrości lub umiarkowanej ostrości, dopóty, dopóki zachowują biologiczną aktywność

sekwencji natywnej.

[0079] Warunki ostrości są funkcją temperatury stosowanej w doświadczeniu hybrydyzacyjnym, molarności 20

kationów monowalentnych i zawartości procentowej formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym. W celu

określenia stopnia ostrości dla dowolnego danego zestawu warunków, należy najpierw zastosować równanie

Meinkoth i wsp. (1984) dla określenia stabilności hybryd o 100% identyczności wyrażonej jako Tm hybrydy

DNA-DNA:

Tm = 81,5ºC + 16,6 (logM) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% form.) – 500/L, 25

gdzie M jest molarnością kationów monowalentnych, %GC jest zawartością procentową nukleotydów G i C w

DNA, % form. jest zawartością procentową formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym, a L jest długością

hybrydy podaną w parach zasad. Dla każdego 1ºC redukcji Tm wobec tej obliczonej dla hybrydy o 100%

identyczności, liczba dopuszczalnych niedopasowań wzrasta o około 1%. Zatem, jeśli Tm zastosowana dla

dowolnego danego doświadczenia hybrydyzacyjnego, przy określonych stężeniach soli i formamidu, wynosi 30

10ºC poniżej Tm obliczonej dla 100% hybrydy według równania Meinkoth, hybrydyzacja zajdzie nawet jeśli

występuje do około 10% niedopasowań.

[0080] W użytym tu znaczeniu, warunkami wysokiej ostrości są te, które tolerują do około 15% dywergencji

sekwencji, podczas gdy warunkami umiarkowanej ostrości są te, które tolerują do około 20% dywergencji

sekwencji. Bez ograniczania, przykładowo w warunkach ostrości wysokiej (12-15ºC poniżej Tm obliczonej 35

dla hybrydy) i umiarkowanej (15-20ºC poniżej Tm obliczonej dla hybrydy) stosowany jest roztwór płuczący

2X SSC (standardowy roztwór cytrynianu i soli fizjologicznej) oraz 0,5% SDS w odpowiedniej temperaturze,

poniżej Tm hybrydy. Ostateczna ostrość warunków jest przede wszystkim zależna od warunków płukania, w

szczególności jeśli zastosowane warunki hybrydyzacji pozwalają na tworzenie mniej stabilnych hybryd

jednocześnie z hybrydami stabilnymi. Warunki płukania o wyższej ostrości usuwają następnie hybrydy mniej 40

stabilne. Powszechną hybrydyzacją, którą można zastosować z opisanymi powyżej warunkami płukania, od

wyższej ostrości do umiarkowanej ostrości, jest hybrydyzacja w roztworze 6 x SSC (lub 6 x SSPE), 5 x

EP 1 740 213

11

odczynnik Denhardt’a, 0,5% SDS, 100 µg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy

łososia w temp. w przybliżeniu 20ºC do 25ºC poniżej Tm. Jeśli stosowane są sondy mieszane, korzystne jest

użycie chlorku tertrametyloamonowego (TMAC) zamiast SSC (Ausubel, 1987-1998).

[0081] Ponieważ, niniejszy wynalazek dostarcza metod rekombinacji w celu wytworzenia pochodnych

ludzkiego hormonu wzrostu, pochodne te można także wytwarzać klasycznymi metodami syntezy białka, 5

które są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.

[0082] Preparat według wynalazku obejmuje glikol polietyleno-polipropylenowy. Polimer ten jest

niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym. Środek powierzchniowo czynny może być tu także

nazywany „surfaktantem” lub „czynnikiem powierzchniowo czynnym”. W jeszcze kolejnym korzystnym

wykonaniu, preparat obejmuje glikol polietyleno-polipropylenowy w stężeniu w zakresie od 0,5 do 5 mg/ml 10

lub 1 do 2 mg/ml lub 1,5 mg/ml.

[0083] W korzystnym preparacie, środek powierzchniowo czynny jest poliolem typu Pluronic, takim jak

przykładowo F68. Pluronic F68 jest wysoce korzystny według niniejszego wynalazku.

[0084] Dzięki spreparowaniu GH z środkiem powierzchniowo czynnym Pluronic® F68 (BASF, znanym także

jako Poloxamer 188) uzyskano stabilny preparat, w którym nie występuje problem precypitacji, tworzenia 15

agregatów lub wytwarzania innych rodzajów cząstek stałych.

[0085] Pluronic F68 jest kopolimerem blokowym składającym się z tlenku etylenu (EO) i tlenku propylenu

(PO). Blok tlenku propylenu (PO) umieszczony jest kanapkowo pomiędzy dwoma blokami tlenku etylenu

(EO).

20

1. Hydrofob o pożądanej masie cząsteczkowej jest wytwarzany za pomocą kontrolowanego dodawania

tlenku propylenu do dwóch grup hydroksylowych glikolu propylenowego; oraz

2. Tlenek etylenu jest dodawany tak, aby hydrofob umieścić w kanapce pomiędzy grupami hydrofilowymi.

[0086] W Pluronic F68 zawartość procentowa polioksyetylenu (hydrofilowy) wynosi 80%, a masa

cząsteczkowa hydrofoba (polioksypropylenu) wynosi w przybliżeniu 1967 Da. 25

[0087] Typowe własności preparatu Pluronic F68 przedstawiono poniżej:

Średnia masa cząsteczkowa: 8400;

Punkt topnienia/rozlewania: 52ºC;

Postać fizyczna przy 20ºC: stała;

Lepkość (Brookfield) cps: 1000 [ciekły w 25ºC, pasty w 60ºC i ciała stałe w 77ºC] 30

Napięcie powierzchniowe, dyn/cm w 25ºC;

stężenie 0,1%: 50,3

stężenie 0,01%: 51,2

stężenie 0,001%: 53,6

Napięcie międzyfazowe, dyn/cm w 25ºC w stosunku do Nujol; 35

stężenie 0,1%: 19,8

stężenie 0,01%: 24,0

stężenie 0,001%: 26,0

Test zwilżania Draves, sekundy w 25ºC

EP 1 740 213

12

stężenie 1,0%: >360

stężenie 0,1%: >360

Wysokość piany

[0088]

Test Ross-Miles, 0,1%, mm w 50ºC: 35 5

Test Ross-Miles, 0,1%, mm w 26ºC: 40

Dynamiczna, 0,1%, mm przy 400 ml/min: >600

Punkt zmętnienia w roztworze wodnym, ºC

[0089]

stężenie 1,0%: >100 10

stężenie 10%: >100

HLB (równowaga hydrofilowo-lipofilowa): 29

[0090] W preparatach według wynalazku można także stosować inne polimery posiadające własności

Pluronic F68.

[0091] Glikol polietyleno-polipropylenowy można stosować w stężeniu w zakresie od 0,5 do 5 mg/ml lub 1 15

do 2 mg/ml lub 1,5 mg/ml.

[0092] Specjalista w dziedzinie doceni, że oprócz glikolu polietyleno-polipropylenowego można zastosować

jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych.

[0093] Preparat według wynalazku obejmuje dalej środek stabilizujący. Środek stabilizujący może także

działać jako środek izotonizujący. 20

[0094] „Środek izotonizujący” jest związkiem, który jest tolerowany fizjologicznie i nadaje odpowiednią

toniczność preparatowi, w celu uniemożliwienia przepływu wody przez błony komórkowe będące w kontakcie

z preparatem. Do celów tych powszechnie stosowane są takie związki jak gliceryna, w znanych stężeniach.

Inne dogodne środki obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, aminokwasy lub białka (np. glicynę lub

albuminę), sole (np. chlorek sodowy) oraz cukry (np. dekstrozę, sacharozę i laktozę). 25

[0095] Środki stabilizujące (stabilizatory) lub środki izotonizujące, które można korzystnie zastosować

według niniejszego wynalazku obejmują cukry nieredukujące, w tym sacharozę, trehalozę, sorbozę,

melezytozę i rafinozę. Mannitol, ksylitol, erytrytol, treitol, sorbitol i glicerol.

[0096] W korzystnym wykonaniu, środkiem stabilizującym lub izotonizującym jest sacharoza.

[0097] W dalszym korzystnym wykonaniu, preparat posiada sacharozę w stężeniu w zakresie od 10 mg/ml 30

do 100 mg/ml lub 20 mg/ml do 80 mg/ml lub około 60 mg/ml.

[0098] Preparaty według niniejszego wynalazku zawierają sól metali alkalicznych, w tym NaCl, KCl,

Na2SO4, Na2CO3. W korzystnym wykonaniu solą metali alkalicznych jest NaCl lub Na2SO4.

[0099] Preparaty według niniejszego wynalazku zawierają ponadto sól metali ziem alkalicznych, w tym

CaCl2, MgCl2, MgSO4, NH4CO3. W korzystnym wykonaniu solą metali ziem alkalicznych jest MgCl2. 35

[0100] Preparaty według wynalazku ponadto obejmują bufor cytrynianowo/fosforanowy. Bufor

cytrynianowo/fosforanowy, który można zastosować według niniejszego wynalazku może być np. buforem

cytrynianu sodu/fosforanu sodu.

[0101] Termin „bufor” lub „bufor fizjologicznie dopuszczalny” odnosi się do roztworów związków, znanych

jako bezpieczne do zastosowań w preparatach farmaceutycznych oraz weterynaryjnych i posiadających 40

wpływ na utrzymywanie oraz kontrolowanie pH preparatu, w pożądanym dla preparatu zakresie pH.

EP 1 740 213

13

[0102] Korzystne jest, aby preparaty według niniejszego wynalazku obejmowały bufor

cytrynianowy/fosforanowy w stężeniu w zakresie od 1 do 100 mM lub od 5 do 50 mM lub od 10 do 20 mM.

[0103] Preparaty według wynalazku są ciekłe i obejmują zatem rozcieńczalnik wodny.

[0104] Termin „rozcieńczalnik wodny” odnosi się do ciekłego rozpuszczalnika, który zawiera wodę. Układy

rozpuszczalników wodnych mogą składać się rozpuszczalników mieszalnych, wyłącznie z wody lub mogą 5

składać się z wody jak również jednego lub większej liczby rozpuszczalników i mogą zawierać rozpuszczone

substancje rozpuszczalne, takie jak cukry, bufory, sole i inne zaróbki.

[0105] Preparat może także obejmować jeden lub większą liczbę rozpuszczalników innych niż woda.

Powszechnie stosowanymi rozpuszczalnikami innymi niż woda są alkohole organiczne o krótkich

łańcuchach, takie jak metanol, etanol, propanol, ketony o krótkich łańcuchach, takie jak aceton, alkohole 10

polihydroksylowe, takie jak glicerol.

[0106] Preparat według wynalazku dalej korzystnie obejmuje środek konserwujący. Dodanie środka

konserwującego jest szczególnie korzystne jeśli hormon wzrostu ma służyć do podawania w dawce

wielokrotnej.

[0107] „Środek konserwujący” jest związkiem, który można włączyć do preparatu w celu zasadniczej 15

redukcji działania w nim bakterii, co ułatwia wytworzenie preparatu, przykładowo, do wielokrotnego użycia.

Przykłady możliwych środków konserwujących obejmują chlorek amonowy oktadecylodimetylobenzylu,

chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy (mieszanina chlorków alkilobenzylodimetyloamoniwych, w

których grupy alkilowe są związkami o długim łańcuchu) oraz chlorek benzetoniowy. Inne rodzaje środków

konserwujących obejmują alkohole aromatyczne, takie jak fenol, butyl i alkohol benzylowy, paraben alkilowy, 20

taki jak paraben metylowy lub propylowy, katechol, rezorcynol, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol.

[0108] Środek konserwujący może być także bakteriostatykiem. Termin „bakteriostatyk” odnosi się do

związku lub kompozycji dodawanych do preparatu w celu działania jako środek przeciwbakteryjny. Preparat

GH według niniejszego wynalazku, zawierający środek konserwujący korzystnie pozostaje w zgodzie ze

statutowymi i regulacyjnymi rekomendacjami dla skuteczności środka konserwującego w komercyjnym 25

produkcie do wielokrotnego użycia (wielokrotnego dawkowania). Przykłady bakteriostatyków obejmują fenol,

m-krezol, p-krezol, o-krezol, chlorokrezol, alkohol benzylowy, paraben alkilowy (paraben metylowy, etylowy,

propylowy, butylowy lub im podobne), chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy, dehydrooctan sodowy i

timerosal.

[0109] Korzystnie środek konserwujący jest obecny w stężeniu w zakresie od 1 do 10 mg/ml lub 2 do 5 30

mg/ml lub 3 mg/ml.

[0110] Korzystnym środkiem konserwującym jest fenol.

[0111] W drugim aspekcie, wynalazek dotyczy procesu wytwarzania ciekłego preparatu obejmującego etap

przygotowania roztworu wodnego składników preparatu według niniejszego wynalazku.

[0112] Wynalazek dalej dotyczy procesu wytwarzania ciekłego preparatu obejmującego etap umieszczenia 35

z góry określonej ilości preparatu w jałowym pojemniku. Zazwyczaj, taka ilość mieści się w zakresie

mililitrowym.

[0113] Ciekłe preparaty hGH do podawania terapeutycznego można także przygotowywać przez połączenie

hGH i czynników stabilizujących o pożądanym stopniu czystości z fizjologicznie dopuszczalnymi zaróbkami,

buforami lub środkami konserwującymi (Remnington’s Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, wyd. Osoll A. 40

(1980). Dopuszczalnymi zaróbkami są te, które nie są toksyczne dla pacjenta w wykorzystywanych

EP 1 740 213

14

stężeniach i dawkach i zawierają np. bufory, środki konserwujące, przeciwutleniacze, modyfikatory pH i

toniczności.

[0114] Ciekłe preparaty hormonu wzrostu mogą także zawierać, jeśli jest to pożądane, jeden lub większą

liczbę zaróbek stabilizujących. Dodatkowe zaróbki stabilizujące mogą zawierać, przykładowo, aminokwasy,

takie jak glicyna lub alanina, mannitol lub inne alkohole cukrowe lub glicerol. Dodatkowo, ciekłe preparaty 5

mogą zawierać inne czynniki, takie jak insulinopodobne czynniki wzrostu lub białka wiążące IGF.

[0115] Zwiększona stabilność hGH, dostarczona przez przygotowany preparat według niniejszego

wynalazku pozwala na szersze stosowanie preparatów hGH, które mogą być bardziej stężone niż te

powszechnie stosowane.

[0116] Termin „stabilność” odnosi się do fizycznej, chemicznej i konformacyjnej stabilności preparatów 10

hormonu wzrostu według niniejszego wynalazku (w tym utrzymywania potencjału biologicznego).

Niestabilność preparatu białkowego może być wywołana degradacją chemiczną lub powstawaniem

produktów agregacji cząsteczek białkowych, co tworzy struktury wyższego rzędu, deglikozylacją,

modyfikacją glikozylacji, deamidacją, utlenianiem lub dowolną inną modyfikacją struktury, która redukuje co

najmniej jedną aktywność biologiczną polipeptydu GH objętego niniejszym wynalazkiem. 15

[0117] W dziedzinie znane są auto-iniektory, takie jak ten nazywany Easyject®, który jest szczególnie

przydatny do podawania hGH. Można także stosować podawanie bezigłowe w powiązaniu z niniejszym

wynalazkiem, przy użyciu urządzeń znanych w dziedzinie.

[0118] Dalszy aspekt według niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej

preparat według wynalazku. Kompozycje mieszczące się w zakresie tego wynalazku zawierają wszystkie 20

kompozycje obejmujące co najmniej jeden ludzki hormon wzrostu lub jego pochodną, analog lub wariant

według niniejszego wynalazku, w ilości skutecznej to osiągnięcia jego zamierzonego celu. Kiedy potrzeby

osobnika są zmienne, określenie optymalnych zakresów skutecznych ilości każdego ze składników należy

do specjalistów w dziedzinie. Typowe dawki obejmują około 0,001 do około 0,1 mg/kg masy ciała na dzień.

Stosowaną wobec pacjenta terapię hGH można przeprowadzać jednocześnie z innymi terapiami, 25

wskazanymi przy danej chorobie.

[0119] Ciekły preparat według niniejszego wynalazku można uzyskać przez rekonstytucję próbki

zliofilizowanego hormonu wzrostu w stosownym rozcieńczalniku (np. wodzie do iniekcji), tak, aby preparat

zawiera przedstawione powyżej zaróbki.

[0120] Termin „podawać” lub „podawanie” oznacza wprowadzanie preparatu według niniejszego wynalazku 30

do ciała pacjenta potrzebującego tego preparatu do leczenia choroby lub stanu.

[0121] W korzystnym wykonaniu według wynalazku, hGH jest podawany w dawkach dziennych

wynoszących 0,1 do 10 mg lub około 0,5 do 6 mg. W jednym wykonaniu dawka dzienna wynosi około 0,15-

0,3 mg hGH na dzień, korzystnie podawana w zastrzyku podskórnym. W dalszym wykonaniu,

potrzebującemu pacjentowi podawana jest dawka wynosząca około 1 mg ludzkiego hormonu wzrostu na 35

dzień.

[0122] W dalszym wykonaniu, hGH jest podawany w zmiennych dawkach, gdzie pierwsza dawka jest

wyższa od drugiej dawki. Korzystnie, pierwsza dawka wynosi około 1 mg, a druga dawka około 0,5 mg.

Tygodniowe dawki wynoszą korzystnie około 6 mg lub 5 mg lub 4,5 mg, w zależności od potrzeb pacjenta.

[0123] Termin „pacjent” oznacza ssaka leczonego ze względu na chorobę lub stan. Pacjentami mogą być, 40

bez ograniczania, ludzie, owce, świnie, konie, bydło, króliki i im podobne.

EP 1 740 213

15

[0124] Preparat według niniejszego wynalazku jest odpowiedni dla wielu różnych reżimów podawania.

Przykładowo, podawanie może być pozajelitowe, drogami takimi jak podskórna, dożylna, domięśniowa,

doustna, w postaci aerozolu, przezskórna, dooponowa lub doodbytnicza. Podawane dawkowane zależy od

wieku, zdrowia i masy odbiorcy, rodzaju wcześniejszego i równoległego leczenia, o ile ma to miejsce,

częstości leczenia oraz natury pożądanego efektu. 5

[0125] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, korzystną drogą podawania jest droga podskórna i domięśniowa.

[0126] Rozumiane jest, że odpowiednia dawka kompozycji lub preparatu według niniejszego wynalazku

będzie zależna od wieku, zdrowia i masy odbiorcy, rodzaju równoległego leczenia, o ile ma to miejsce,

częstości leczenia oraz natury pożądanego efektu. Chociaż najkorzystniejsze dawkowanie może być

dopasowane do indywidualnych potrzeb, co jest zrozumiałe i możliwe do określenia przez specjalistów w 10

dziedzinie, bez przeprowadzania doświadczeń. Zazwyczaj wymaga to przystosowania standardowej dawki,

np. redukcji dawki, jeśli pacjent posiada niską masę ciała.

[0127] Całkowita dawka wymagana podczas każdego leczenia może być podawana w wielu dawkach

(„dawka wielokrotna”) lub w postaci jednej dawki („dawka pojedyncza”).

[0128] Wyrażenie „stosowanie dawki wielokrotnej” obejmuje stosowanie jednej fiolki, ampułki, kartridża z 15

preparatem GH do więcej niż jednej iniekcji, przykładowo do 2, 3, 4, 5, 6 lub większej liczby iniekcji. Iniekcje

mogą być rozdzielone w czasie, przykładowo, przez okres 6, 12, 24, 48 lub 72 godzin.

[0129] Wynalazek dalej dotyczy zastosowania preparatu według niniejszego wynalazku do podania w

dawce pojedyncza. W alternatywnym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania preparatu według

niniejszego wynalazku do podania w dawce wielokrotnej. 20

[0130] Typowo preparaty hGH w dawce wielokrotnej z Serono (Saizen) zawierają 1,33, 3,33 lub 8 mg hGH.

[0131] Typowo preparaty hGH w dawce wielokrotnej z Lilly (Humatrope) zawierają 6, 12 lub 24 mg hGH.

[0132] Typowo preparaty hGH w dawce wielokrotnej z Pfizera (Genotropin) zawierają 5 lub 12 mg hGH.

[0133] Typowo preparaty hGH w dawce wielokrotnej z Novo Nordisk (Genotropin) zawierają 5, 10 lub 15

mg hGH. 25

[0134] Zatem, w typowych preparatach ilość hGH dostarczana w fiolce wynosi 1,33, 3,33, 5, 6, 8, 10, 12, 15

lub 24 mg.

[0135] Kompozycje mogą być dostarczone same lub w połączeniu z innymi terapeutykami skierowanymi

wobec choroby lub innych jej objawów.

[0136] Preparaty hGH według niniejszego wynalazku można udostępniać w fiolkach. Termin „fiolka” odnosi 30

się do szeroko rozumianego zbiornika odpowiedniego do utrzymywania GH w postaci stałej lub ciekłej, w

stanie jałowym. Przykłady fiolki w użytym tu znaczeniu obejmują ampułki, kartridże, blistery lub inne takie

zbiorniki dogodne do dostarczania GH pacjentowi przez strzykawkę, pompę (w tym osmotyczną), cewnik,

plaster z lekiem wchłaniającym się przez skórę, spreje do podawania przez płuca lub przez śluzówkę. Fiolki

stosowne do pakowania produktów do podawania pozajelitowo, przez płuca, przez śluzówkę lub przez skórę 35

są dobrze znane i uznawane w dziedzinie.

[0137] Zwiększona stabilność preparatów hGH pozwala na ich dłuższe przechowywanie w odpowiedniej

temperaturze, takiej jak temp. zamrożenia (np. w -20ºC) lub powyżej temp. zamrożenia, korzystnie 2-8ºC,

korzystniej +5ºC, lub nawet w temperaturze pokojowej, np. +25ºC.

[0138] Preparaty hGH do podawania in vivo muszą być jałowe. Mogą być one z łatwością wykonane przez 40

filtrację przez jałowe błony filtracyjne.

EP 1 740 213

16

[0139] Terapeutyczne ciekłe preparaty hGH zasadniczo są umieszczane w zbiornikach posiadających

jałowy otwór dostępu, przykładowo, torebka z roztworem dożylnym lub fiolka posiadająca zatyczkę, którą

można przekłuć igłą ze strzykawki do iniekcji podskórnych.

[0140] Zatem, dalszy aspekt według wynalazku dotyczy postaci ciekłego preparatu według wynalazku,

hermetycznie zamkniętego w warunkach jałowych w zbiorniku odpowiednim do przechowywania przed 5

użyciem.

[0141] Preparaty według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia niedoboru GH u dzieci, utraty

masy ciała lub wyniszczenia u pacjentów AIDS, zespołu Turner’a u dziewczynek, jak również przewlekłej

niewydolności nerek u dzieci.

[0142] Wyżej opisany wynalazek łatwiej będzie zrozumieć w odniesieniu do przedstawionego poniżej 10

przykładu, obrazującego zarys badania klinicznego, który jest wprowadzony w celu zilustrowania a nie

ograniczenia niniejszego wynalazku.

Przykład

[0143] Następujące 2 preparaty zostały oszacowane pod kątem ich stabilności: 15

Preparat A

[0144]

Składniki Preparat A

r-hGH (mg/ml) 8,0

Fosforan cytrynian sodu pH 5,8 (mM) 5,0

Siarczan sodu (mM) 100,0

Chlorek magnezu (mM) 50

Fenol (mg/ml) 3,0

Preparat Pluronic F68 (mg/ml) 1,5

Preparat B

[0145] 20

Składniki Preparat B

r-hGH (mg/ml) 8,0

Fosforan cytrynian sodu pH 5,57 (mM) 5,0

Chlorek sodu (mM) 171,0

Chlorek magnezu (mM) 5

Fenol (mg/ml) 3,0

Preparat Pluronic F68 (mg/ml) 0,2

[0146] Chemiczną stabilność preparatów A i B oszacowano po przechowywaniu próbek w temperaturze

40ºC przez przedłużony okres czasu, tzn. po 3 tygodniach.

[0147] Stabilność hGH określano za pomocą RP-HPLC (HPLC w odwróconym układzie faz). Tym samym,

ilość niezmienionego, nieuszkodzonego hormonu wzrostu była oceniona na podstawie stopnia zmiany w 25

głównym piku ludzkiego hormonu wzrostu. Innymi słowy, stopień zmiany został określony na podstawie

zmiany głównego pika ludzkiego hormonu wzrostu i obliczony jako udział procentowy niezmienionego r-hGH

względem pika odpowiadającego czasowi zero.

EP 1 740 213

17

Wyniki

Preparat A

[0148]

Po przechowywaniu próbki przez 1 miesiąc w 40ºC, główny pik mierzony dla r-hGH stanowi 62% pika

odpowiadającego czasowi zero (tj. 62% niezmienionego r-hGH znaleziono po 1 miesiącu 5

przechowywania w 40ºC).

Po przechowywaniu próbki przez 1 miesiąc w temperaturze pokojowej (25ºC), główny pik mierzony dla r-

hGH stanowi 91% pika odpowiadającego czasowi zero (tj. 91% niezmienionego r-hGH znaleziono po 1

miesiącu przechowywania w 25ºC).

10

Preparat B

[0149] Po przechowywaniu próbki przez 3 tygodnie w 40ºC, główny pik mierzony dla r-hGH stanowi 69%

pika odpowiadającego czasowi zero (tj. 69% niezmienionego r-hGH znaleziono po 3 tygodniach

przechowywania w 40ºC).

15

Literatura

[0150]

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990

2. Altschul S F et at, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

3. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New 20

York,

1987-1998)

4. Becker et al, Biotechnol. Appl. Biochem. 10:326 (1988)

5. Bewly et al, Int. J. Peptide and Protein Res. 4:281-287 (1972)

6. Chen et al, Genomics 4:479-497 (1989) 25

7. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395,1984.

8. Gertler et al, Endocrinology 118:720 (1986)

9. Goeddel et al Nature, 281:544 (1979)

10. Graff et al, J. Biol. Chem. 257:2365 (1982)

11. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). 30

12. Hsiung et al, Biotechnology 7:267 (1989)

13. Lewis et al, Endocrinology 101:1587 (1977)

14. Lewis et al, J. Biol. Chem. 253:2679 (1978)

15. Lewis et al, Endocrinology 104:1256 (1979)

16. Lewis et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 92:511 (1980) 35

17. Lewis et al, J. Biol. Chem. 256:11645 (1981)

18. Martial et al, Science 205:602-607 (1979)

19. Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports.Anal Biochem. 1984

May 1; 138(2):267-84.

20. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990 40

21. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988

EP 1 740 213

18

22. Pearlman and Nguyen (1989), In D. Marshak and D. Liu (eds), Therapeutic Peptides and Proteins,

Formulations, Delivery and Targeting, Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour

Laboratory, Cold SpringHarbour, New York, str. 23-30

23. Singh et al, Endocrinology 94:883 (1974)

24. Smith et al, Science 260:1640-1643 (1998) 5

25. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489,

1981

26. Thorlacius-Ussing, Neuroendocrinology 43:233 (1987)

27. WO 93/19776

28. WO 94/101398 10

29. EP-0131864

30. EP-0211601

31. WO 97/29767

32. US-5,567,677

15

Zastrzeżenia patentowe

1. Ciekły preparat obejmujący:

a) hormon wzrostu lub hormon uwalniający hormon wzrostu (GHRH), który stymuluje uwalnianie lub nasila

aktywność endogennego hGH;

b) sól metali alkalicznych; 20

c) sól metali ziem alkalicznych lub sól pseudo metali ziem alkalicznych; oraz

d) bufor cytrynianowy/fosforanowy, przy czym pH preparatu jest w zakresie 5,5 -5,8.

2. Preparat według zastrz. 1, w którym hormon wzrostu jest ludzkim hormonem wzrostu.

3. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-2, w którym sól metali alkalicznych jest wybrana z grupy

składającej się z NaCl, KCl, Na2SO4, Na2CO3. 25

4. Preparat według zastrz. 3, w którym solą metali alkalicznych jest NaCl lub Na2SO4.

5. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-4, w którym sól metali ziem alkalicznych jest wybrana z grupy

składającej się z CaCl2, MgCl2, MgSO4, NH4CO3.

6. Preparat według zastrz. 5, w którym solą metali ziem alkalicznych jest MgCl2.

7. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-6, w którym bufor jest buforem cytrynianu sodu/fosforanu sodu. 30

8. Preparat według zastrz. 7, w którym bufor ma stężenie w zakresie od 1 do 100 mM lub od 5 do 50 mM lub

od 10 do 20 mM.

9. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-8, obejmujący ponadto środek powierzchniowo czynny.

10. Preparat według zastrz. 9, w którym środek powierzchniowo czynny jest glikolem polietyleno-

polipropylenowym. 35

11. Preparat według zastrz. 10, w którym środek powierzchniowo czynny stanowi Pluronic F68.

12. Preparat według zastrz. 10 lub 11 obejmujący glikol polietyleno-polipropylenowy w stężeniu w zakresie

od 0,5 do 5 mg/ml lub 1 do 2 mg/ml lub 1,5 mg/ml.

13. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-12, obejmujący ponadto środek stabilizujący.

14. Preparat według zastrz. 13, w którym środkiem stabilizującym jest sacharoza. 40

15. Preparat według zastrz. 14 obejmujący sacharozę w stężeniu w zakresie od 10 mg/ml do 100 mg/ml lub

20 mg/ml do 80 mg/ml lub około 60 mg/ml.

EP 1 740 213

19

16. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-15, obejmujący ponadto środek konserwujący.

17. Preparat według zastrz. 16, obejmujący środek konserwujący w stężeniu w zakresie od 1 do 10 mg/ml

lub 2 do 5 mg/ml lub 3 mg/ml.

18. Preparat według zastrz. 16 lub 17, w którym środkiem konserwującym jest fenol.

19. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-18 o pH 5,8 i składający się z r-hGH, cytrynianu sodu/fosforanu 5

sodu, Na2SO4, MgCl2, fenolu, Pluronic F68 i ewentualnie wody do iniekcji.

20. Preparat według dowolnego z zastrz. 1-18 o pH 5,8 i składający się z r-hGH, cytrynianu sodu/fosforanu

sodu, NaCl, MgCl2, fenolu, Pluronic F68 i ewentualnie wody do iniekcji.

21. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca preparat według dowolnego z zastrz. 1 do 20.

22. Postać ciekłego preparatu określonego w dowolnym z zastrz. 1 do 20 hermetycznie zamkniętego w 10

warunkach jałowych w zbiorniku odpowiednim do przechowywania przed użyciem.

23. Zastosowanie preparatu według dowolnego z zastrz. 1 do 20 do wytworzenia leku do leczenia niedoboru

GH u dzieci, utraty masy ciała lub wyniszczenia u pacjentów z AIDS, zespołu Turner’a u dziewczynek, jak

również przewlekłej niewydolności nerek u dzieci.

24. Zastosowanie preparatu według zastrz. 23, przy czym lek jest przeznaczony do podawania w 15

pojedynczej dawce.

25. Zastosowanie preparatu według zastrz. 23, przy czym lek jest przeznaczony do podania w dawce

wielokrotnej.

EP 1 740 213

20

ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE

Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i

nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej

tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym

względzie.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

Literatura nie patentowa, cytowana w opisie