Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sаša Ž. Blagojević
“Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch u kulturi in vitro”
MASTER RAD
Niš, 2014
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
“Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch u kulturi in vitro”
MASTER RAD
Student:
Saša Ž. Blagojević
Br. indeksa 69
Mentor:
Dr Dragana D. Stojičić
vanredni profesor
Niš, maj 2014
UNIVERSITY OF NIS
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
“Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch in vitro”
MASTER THESIS
Student:
Saša Ž. Blagojević
No. of index: 69
Mentor:
Dr Dragana D. Stojičić
associate professor
Niš, 2014
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Dragani Stojičić na
ukazanoj pomoći, strpljenju i razumevanju prilikom izrade ovog master rada.
Takođe, veliku zahvalnost dugujem asistentu Svetlani Tošić, na ukazanoj
pomoći pri realizaciji eksperimentalnog dela ovog master rada. Ovaj master
rad rađen je u okviru doktorske disertacije asistenta Svetlane Tošić i sadrži
još uvek nepublikovane rezultate.
Najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima na ukazanom razumevanju,
podršci i pomoći koju su mi pružali tokom godina studija.
SAŽETAK
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch je endemična vrsta Balkanskog poluostrva. Pripada
porodici Lamiaceae. U Mediteranskoj oblasti koristi kao začin i lekovito bilje. U ovom radu
definisani su uslovi pri kojima dolazi do indukcije aksilarnih pupoljaka M. thymifolia,
korišćenjem različitih kombinacija regulatora rastenja iz grupe citokinina (Kin) i auksina
(IAA) na MS hranljivoj podlozi, kao i uticaj različitih tretmana na produkciju biomase.
Najveći broj pupoljaka formirao se na eksplantatima koji su gajeni na MS hranljivoj podlozi
bez regulatora rastenja, a najmanji na podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA. Na MS podlozi
sa 0,57 μM IAA prosečna dužina pupoljaka bila je najveća, a najmanja na kontrolnoj podlozi.
Najveću prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na podlozi sa 3 μM Kin i 0,57 μM
IAA, a najmanju na podlogama sa 0,3 i 1 μM Kin i 0,57 μM IAA. Najviše vrednosti prosečne
suve mase izmerene su kod eksplantata gajenih na podlogama bez hormona i 3 μM Kin i 0,57
μM IAA, a najniže na podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA.
Ključne reči: Micromeria thymifolia, aksilarni pupoljci, kinetin, indol-3-sirćetna kiselina.
ABSTRACT
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is an endemic species of the Balkan Peninsula. It
belongs to family Lamiaceae. It is used as a spice and medicinal herb on the Mediterranean
area. The paper defines the conditions for induction of axillary M. thymifolia buds using
different combinations of plant growth regulators from the group of cytokinins (Kin) and
auxin (IAA) on MS medium nutrient including the effect of different treatments on biomass
production. The largest number of buds was formed on the explants that were cultured on MS
medium nutrient without growth regulators and the lowest on the medium containing 0.1 μM
Kin and 0.57 μM IAA. Average length of buds was the highest on MS medium with 0.57 μM
IAA, while the lowest was on the control medium nutrient. The highest average fresh weight
of explants were cultured on base nutrient containing 3 μM and 0.57 μM Kin IAA, and the
lowest on substrates with 0.3 and 1 μM Kin and 0.57 μM IAA. The highest value of the
average dry weight was measured in explants grown on medium nutrient without hormones
and 3 μM Kin and 0.57 μM IAA and the lowest in medium nutrient containing 0.1 μM Kin
and 0.57 μM IAA.
Keywords: Micromeria thymifolia, axillary buds, kinetin, indol-3-acetic acid.
SADRŽAJ:
1. UVOD 1
1.1. Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch 2
1.2. Kultura in vitro 4
1.2.1. Vegetativno razmnožavanje in vitro 5
1.3. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro 6
1.4. Mikropropagacija 11
2. CILJ RADA 13
3. MATERIJAL I METODE 15
3.1. Biljni material 16
3.2. Hranljiva podloga MS 16
3.3. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia 17
3.4. Metode sterilizacije 18
3.4.1. Sterilizacija biljnog materijala 18
3.4.2. Sterilizacija hranljivih podloga 19
3.4.3. Sterilizacija instrumenata i prostora 19
3.5. Merenje sveže i suve mase biljaka 19
3.6. Statistička analiza 19
4. REZULTATI 20
4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste M. thymifolia 21
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. thymifolia 21
5. DISKUSIJA 32
6. ZAKLJUČAK 35
7. LITERATURA 37
SKRAĆENICE
Kin - 6-furfuril-aminopurin, kinetin
IAA - indol-3-sirćetna kiselina
1
1. UVOD
2
1.1. Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch
Carstvo: Plantae
Razdeo: Magnoliophyta
Klasa: Magnoliopsida
Red: Lamiales
Fam: Lamiaceae (Labiatae)
Rod: Micromeria
Slika 1. Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch je endemična vrsta Balkanskog poluostrva. Poznata
je i kao Satureja thimifolia (Scop.), Melisa alba (Valdst. and Kit.), Calamintha thimifolia
(Scop.) Reichenb. i dr. Obično raste u rascepima razbijenih stena i unutar dubokih pukotina
uglavnom na kršu, ali i na serpentinu, u rasponu od 30 m do 2000 m nadmorske visine (Ristić
et al., 1997). U Mediteranskoj oblasti koristi se kao začin i lekovito bilje (Marin et al., 2013).
Rod Micromeria obuhvata vrste poznate kao aromatične vrste, sa arealom od
Makronezijsko – Mediteranskog regiona do južne Afrike, Indije i Kine (Bräuchler et al.,
2008). U Mediteranskom regionu rod Micromeria obuhvata oko 130 vrsta široko
rasprostranjenih. U flori Srbije i Crne Gore ovaj rod broji 10 vrsta, od kojih su 7 endemične.
Na osnovu morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa, vrste roda Micromeria su
podeljene u tri sekcije: Cymularia, Eumicromeria i Pseudomelissa. Vrste koje naseljavaju
teritoriju Srbije i Crne Gore pripadaju sekcijama Pseudomelissa i Eumicromeria (Slavkovska
et al., 2005).
3
Rod pripada familiji Lamiaceae, podfamiliji Nepetoideae, plemenu Mentheae i smatra se
delom nejasno definisanog "Satureja kompleksa". Mnogi taksonomisti, da bi se prilagodili
očiglednim morfološkim raznolikostima, podelili su ovaj kompleks u nekoliko rodova:
Satureja L., Clinopodium L., Calamintha Mill., Acinos Mill. i Micromeria Benth. Međutim,
ostali taksonomisti spajaju ove grupe u jedan rod Satureja s.l. (Bräuchler et al., 2008).
Familija Lamiaceae (Labiatae) ima kosmopolitsku distribuciju, sadrži oko 236 rodova i
6900 do 7200 vrsta. Od navedenog broja vrsta ove familije, 84 su balkanski endemiti.
Naseljavaju najčešće svetla, sunčana i otvorena staništa kao što su livade, pašnjaci,
kamenjari, pa čak i gornje šumske granice. Javljaju se čak i u šumskim ekosistemima, a
poznate su i korovske, kao i rudimentalne vrste.
Lamiaceae su zeljaste ili drvenaste (šiblje) vrlo retko drveće ili lijane. Stablo je pretežno
četvoročlano; listovi su dekusirani bez zalistaka, prosti ili na različite načine deljeni. Cvetovi
su grupisani u cimozne cvasti, koje su ujedinjene u kombinovane cvasti, vrlo retko su
pojedinačni cvetovi. Na nadzemnim vegetativnim organima nalaze se žlezdane dlake, često u
obliku glavice ili žlezdane ljuspice.
Cvetovi su zigomorfni, retko aktinomorfni, dvopolni, petočlani, ponegde četvoročlani
usled redukcije članova andreceuma i tučka na dva oplodna listića. Čašica je petočlana ili
petoperna ili dvousnata, trajna i postfloralno razrasta. Krunica je cevasta petoperna uvek više-
manje dvousnata, izuzetno jednousnata. Andreceum se sastoji od četiri dinamična prašnika.
Tučak je sinkarpan, sagrađen od dva oplodna listića; plodnik je nadcvetan dvook i u svakom
okcu po jedan semeni zametak. Plod se sastoji od četiri oraščića ili usled zakržljalosti samo 3
ili jednog oreščića.
Najveći rodovi su Salvia (900), Scutellaria (360), Stachis (300), Plectranthus (300), Hiptis
(280), Teucrium (250), Vitek (250), Thimus (220), i Nepeta (200).
Lamiaceae sadrže eterična ulja vrlo različitog sastava: aromatični alkoholi, fenoli, terpeni,
ketoni, aldehidi (Tatić & Blečić, 1984).
Značajan broj vrsta ove familije poseduje širok spektar biološki aktivnih supstanci, koje
mogu biti od velike važnosti u nekoliko oblasti pa se često koriste u tradicionalnoj medicini
(Bezić et al., 2013).
4
Neki od prestavnika ove familije koji su poznati u narodu: lavanda, zalfija, ruzmarin,
bosiljak, grčki origano, majčina dušica, timijan, matičnjak, trava iva, dobričica, mrtva
kopriva, nana, srdačica i dr.
1.2. Kultura in vitro
Kultura biljnog tkiva predstavlja poseban način proizvodnje novih individua u
laboratorijskim uslovima in vitro. Naime, iz jednog jedinog primerka, donetog sa prirodnog
staništa, moguće je iz vegetativnih delova biljke (lista, stabla, korena) proizvesti stotine, pa i
hiljade novih jedinki u laboratorijskim uslovima, i posle toga ih vratiti na prirodna staništa.
Dakle, kultura in vitro je postupak koji podrazumeva rastenje vrlo sitnih organa, delova tkiva
ili izolovanih ćelija u aseptičnim odnosno sterilnim uslovima. Bez sumnje, to je proces
kloniranja, jer sve proizvedene biljke predstavljaju matične kopije razmnoženog majčinskog
uzorka.
Na ovaj način moguće je efikasno zaštititi i obnoviti genofond retkih i ugroženih biljaka,
ali istovremeno, ovom biotehnologijom se otvaraju velike mogućnosti u farmaciji, šumarstvu
i hortikulturi, čime se bitno smanjuje pritisak na prirodne populacije biljaka koje su od
značaja za pomenute privredne grane.
Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu pojedine organe,
embrione ili celu biljku je izraz njihove totipotencije (sposobnost biljnih ćelija da se in vitro
dediferenciraju, dele, i da regenerišu pojedine organe, embrione ili, pak, celu biljku) i
plastičnosti (sposobnost biljke da menja svoj program rastenja, metabolizma i razvića u
zavisnosti od uslova sredine).
1.2.1. Vegetativno razmnožavanje in vitro
Metoda kulture tkiva omogućava regeneraciju biljaka iz izolovanih biljnih organa, tkiva i
pojedinačnih ćelija, u uslovima in vitro, na sterilnoj hranljivoj podlozi. Postavljanjem
izolovanih biljnih delova na odgovarajuće hranljive podloge, dolazi do dediferencijacije
ćelija već diferenciranih tkiva, a zatim i regeneracije kompletnih biljaka.
5
Prednosti vegetativnog razmnožavanja in vitro:
Razmnožavanje in vitro je mnogo brže od razmnožavanja in vivo;
Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in vivo;
Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo, jer su
oslobođene patogena i infekcija bakterijama i gljivama;
In vitro omogućava razmnožavanje samo zdravih biljaka;
Vegetativno razmnožavanje in vitro se može započeti sa vrlo malo biljnog materijala
kao početnog eksplantata;
Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju
određenih kultura;
Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih
biljnih vrsta.
Nedostaci vegetativnog razmnožavanja in vitro:
U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska;
Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro;
Prenos biljaka iz in vitro u in vivo uslove je ponekad težak i mukotrpan posao;
Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;
U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je teška.
Vegetativna propagacija obuhvata sledeće načine razmnožavanja:
Permanentna kultura pupoljaka - mikropropagacija.
Formiranje pupoljaka de novo - organogeneza.
Razviće embriona iz somatskih ćelija - somatska embriogeneza.
Razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog gametofita bez oplođenja -
androgeneza, odnosno ginogeneza.
Somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije, i da fuzijom daju novi
organizam - somatska hibridizacija.
6
1.3. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro
Gajenje kultura in vitro podrazumeva kontrolu brojnih relevantnih činilaca, od izbora
eksplantata i uspostavljanja aseptičnih uslova, manipulacije razvića u kulturi putem
definisanja sastava hranljive podloge, posebno balansa hormona, do kontrole spoljašnjih
faktora sredine, kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.
Nužni zahtevi pri kultivisanju biljnih kultura su:
Odgovarajuće tkivo (neka tkiva su pogodnija za kultivaciju od drugih);
Pogodna hranljiva podloga za gajenje, koja mora sadržati izvor energije i neorganskih
soli u količini koja je neophodna za normalno rastenje i razviće biljnih ćelija, organa i
tkiva;
Regulatori rastenja (za biljke su najznačajniji auksini i citokinini);
Aseptični (sterilni) uslovi rada;
Česta subkultivacija (pasažiranje).
Uspešnost kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava same podloge, koja bi trebalo
da zadovolji nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi. No, bez obzira na različitost
hranljivih podloga, zajedničko za sve je da one moraju da sadrže sledeće:
vodu;
agar;
mineralne soli;
ugljene hidrate;
vitamine;
regulatore rastenja.
Voda
95% hranljive podloge predstavlja voda, zbog toga je neophodno posebnu pažnju posveti
kvalitetu vode. Za istraživačke ciljeve najčešće se preporučuje destilovana voda, a za
istraživanja na protoplastima, ćelijama i meristemima, voda koja je dva puta destilovana
(bidestilovana voda). Za kulturu in vitro koristi se i dejonizovana voda, ali se mora imati na
umu da ona može da sadrži organske kontaminante, pa čak i mikroorganizme. Destilovanu
7
vodu najbolje je čuvati u polietilenskim bocama, zbog toga što staklo može da sadrži tragove
olova, kalijuma, arsena, koji mogu biti rastvoreni u vodi (Marić, 1995).
Agar
Agar je derivat morskih algi, koji se dobija u obliku peleta, a koji se može koristiti kao
gelirajući agens kod većine hranljivih podloga. Agar je polisaharid velike molekularne mase,
čija je sposobnost da gelira (vezuje) podloge. Iako je prirodni proizvod, neophodno je da
bude prečišćen kako se u njemu ne bi nalazile toksične materije (Marić, 1995).
Mineralne soli
Mineralne soli su važan faktor iz sastava hranljive podloge. Optimalne koncentracije
mineralnih soli u hranljivoj podlozi osiguravaju maksimalnu brzinu rastenja kulture
(Vinterhalter & Vinterhalter, 1996). Makroelementi, neophodni su u koncentraciji većoj 0.5
mmol/l. Neophodni makroelementi su: N, K, P, Ca, S, Mg. Mikroelementi neophodni su u
koncentraciji manjoj od 0.5 mmol/l. Neophodni mikroelementi su Fe, Mn, Cu, Zn, I, Mo, Co.
Ugljeni hidrati
Šećer je veoma važna komponenta u svakoj hranljivoj podlozi i njegovo prisustvo u
hranljivoj podlozi je važno za rastenje i razviće in vitro, jer je fotosinteza nedovoljna, zbog
toga što se rastenje obavlja u uslovima nepogodnim za fotosintezu ili u mraku. U kulturi in
vitro obično se koristi koncentracija 1-5 % disaharida saharoze, jer se ovaj šećer i sintetiše i
prirodno transportuje u biljci. Glukoza i fruktoza se takođe koriste, u manjoj meri, i u
posebnim uslovima i maltoza (Marić, 1995).
Vitamini
Jedan ili mali broj sledećih vitamina se ponekad koriste u in vitro kulturama. To su:
inozitol (koncentracija u podlozi 100-200 mg/l-1
);
vitamin B1 ili tiamin ( 0.1-5.0 mg/l-1
);
pantoteinska kiselina ili Ca-pantoteat (0.5-2.5 mg/l-1
);
vitamin M ili folna kiselina ( 0.1-0.5 mg/l-1
);
vitamin B2 ili riboflavin (0.1-10 mg/l-1
);
vitamin C ili askorbinska kiselina (1-100 mg/l-1
);
vitamin PP ili nikotinska kiselina (niacin, 0.1-5 mg/l-1
);
8
vitamin B6 ili piridoksin (0.1-1 mg/l-1
);
vitamin H ili biotin (0.01-1.0 mg/l-1
);
vitamin E ili tokoferol (1-50 mg/l-1
), (Marić, 1995).
Regulatori rastenja (biljni hormoni)
Biljni hormoni su organski sastojci koje prirodno sintetišu više biljke, koji primenjeni u
relativno malim količinama utiču na rastenje i razviće biljaka. Pored ovih prirodnih sastojaka
sintetisane su i sintetičke komponente, koje po funkciji odgovaraju prirodnim hormonima.
Sintetički hormoni se nazivaju regulatori rastenja.
Hormoni imaju ključnu ulogu u regulaciji rastenja biljnih kultura in vitro, jer kontrolišu ne
samo brzinu rastenja jednog organa ili tkiva, već svojim balansom mogu izazvati
diferenciranje organa, odnosno mogu da usmere i usklade rastenje kompleksnih struktura,
kao što su izdanci ili embrioni (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996).
Auksini: IAA, IBA, NAA ili 2,4-D se često dodaju hranljivim podlogama. Prouzrokuju
izduživanje ćelija i bubrenje tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa) i obrazovanje
adventivnih korenova, inhibiciju obrazovanja adventivnih i bočnih izdanaka, a često i
embriogenezu u suspenzionim kulturama. Pri niskim koncentracijama auksina preovladava
obrazovanje adventivnih korena, dok visoke koncentracije auksina sprečavaju obrazovanje
korena i dolazi do obrazovanja kalusa.
Citokinini se često koriste za stimulaciju rastenja i razvića. Najviše se koriste kinetin
(prvi citokinin izolovan iz autoklavirane sperme haringe), BA, 2iP i PBA. Oni obično
pokreću deobu ćelija, naročito ako se dodaju zajedno sa auksinima. U većim
koncentracijama (1-10 mg/l) mogu indukovati obrazovanje adventivnih izdanaka, ali se
obrazovanje korenova u tom slučaju zaustavlja. Citokinini pokreću obrazovanje pomoćnih
(bočnih) izdanaka uz smanjenje apikalne dominacije, a usporavaju i starenje (Marić,
1995). Prirodni citokinin koji se nalazi u biljkama je zeatin (Vinterhalter & Vinterhalter,
1996).
Važno je napomenuti da odnos koncentracija auksina i citokinina određuje razvoj biljne
kulture. Veća koncentracija auksina (manja koncentracija citokinina) indukuje razvoj
korenova. Veća koncentracija citokinina (manja koncentracija auksina) indukuje razvoj
izdanaka. Jednaka koncentracija ovih hormona indukuje razvoj kalusa.
Giberelini su grupa biljnih hormona koja se generalno slabo koristi u in vitro kulturi
viših biljaka. Ovi hormoni indukuju izduživanje internodija i rastenje meristema ili
9
pupoljaka in vitro. Giberelini obično inhibiraju obrazovanje adventivnih korena, kao i
obrazovanje adventivnih izdanaka.
Abscisinska kiselina (ABA) i etilen su hormoni koji se katkad označavaju
inhibitorima, jer vrše negativan uticaj na kulturu in vitro. Oni takođe regulišu rastenje, ali
tako što se njima rastenje završava. ABA reguliše dormanciju pupoljaka i semena, reguliše
rastenje u lošim (stres) uslovima, a posebno odavanje vode kroz stome. Etilen izaziva
starenje, dozrevanje plodova i opadanje plodova i listova.
pH vrednost (koncentracija vodonikovih jona)
Malo se zna u vezi uticaja pH hranljive podloge na rastenje in vitro. Pretpostavlja se da pH
u granicama između 5,0 i 6,5 pogoduje rastenju, jer niske vrednosti pH (niže od 4,5), kao i
visoke vrednosti (više od 7,0), osim u određenim situacijama, zaustavljaju rastenje i razviće
in vitro.
Osmotski potencijal
Osmotski potencijal jedne hranljive podloge je zbir osmotskih potencijala agara i drugih
sastojaka (minerali, šećeri itd.). Ako je osmotski potencijal veći od 3x105 Pascala (=3 bara),
zaustavljaju se rastenje i obrazovanje organa, usled prestanka uzimanja vode. Osmotski
pritisak može se lako podići na normalnu vrednost, dodavanjem mannitol-a, koji predstavlja
fizioloski neaktivnu supstancu (Marić, 1995).
Svetlost i temperatura kao spoljašnji faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro
Svetlost je izuzetno važan faktor jer reguliše rastenje biljnih kultura in vitro na više načina,
i to preko dužine dana, intenziteta zračenja kao i spektralnog sastava. Obično se bira dužina
dana između 14 h i 16 h, mada se koristi i neprekidno osvetljenje (Marić, 1995).
Temperatura se obično održava na konstantnoj vrednosti 24-26 0C, zavisno od
eksperimentalnih vrsta. Niža temperatura se koristi za lukovičaste vrste (oko 18 0C), a viša za
tropske vrste (28-29 0C), (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996).
Sterilizacija hranljive podloge
Važno je napomenuti da se kultura in vitro uvek uspostavlja u aseptičnim (sterilnim)
uslovima, kako ne bi došlo do razvoja gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće
biljaka.
10
Sterilizacija hranljive podloge se može odvijati na više načina:
Fizičkim uništavanjem mikroorganizama zračenjem, i to UV-svetlom ili γ-zračenjem;
Autoklaviranjem (sterilizacija vrućom parom pod povišenim pritiskom);
Fizičkim odstranjivanjem mikroorganizama filtriranjem (rastvori, tečne podloge, itd.,
prolaze kroz membranu filtra, a čestice, mikroorganizmi i virusi, koji su krupniji od
prečnika otvora na filtru koji se koristi, se uklanjaju);
Hemijskim uništavanjem mikroorganizama(etilen-hlorid, Na-hipohlorit, K-hipohlorit,
Ca-hipohlorit ili, raznim antibioticima).
Sterilizacija biljnog materijala
Slično sterilizaciji hranljive podloge i hemijska sterilizacija biljnog materijala odvija se
pomoću raznih hemijskih jedinjenja i to:
Alkoholom (najbolje je koristiti 70 % alkohol, jer 96 % alkohol suviše dehidrira biljno
tkivo);
Varikina;
K-hipohlorit, Ca-hipohlorit (u slučaju da je biljno tkivo previše osetljivo na
sterilizaciju varikinom);
Sublimat ili živin hlorid (HgCl2) rastvoren u česmenskoj vodi.
Subkultivacija (pasažiranje)
Pasažiranje je prenošenje kultura (eksplantata) sa stare, istrošene podloge na svežu. Izvodi
se u sterilnim uslovima. Period od inicijacije kulture ili subkulture do njenog prebacivanja na
novu podlogu se naziva pasaž.
Subkultivacija može biti neophodna iz više razloga:
Iscrpljenost hranljive podloge;
Isušivanje hranljive podloge (što vodi suviše visokoj koncentraciji soli i šećera);
Naraslost materijala do punjenja posude za gajenje kulture;
Potreba da se materijal dalje razmnožava;
Pojava mrke i/ili crne boje u agaru (biljna tkiva ponekad otpuštaju toksične supstance
u toku prvih nedelja kultivacije, koje prodiru u agar ili tečnu podlogu);
Kada podloga postane tečna zbog smanjivanja pH od strane biljke.
11
1.4. Mikropropagacija
Mikropropagacija je postupak u kojem se za kultivisanje biljaka u in vitro uslovima koriste
isključivo izdanci stabla osovinskog porekla, vršni i pazušni pupoljci (Vinterhalter &
Vinterhalter, 1996).
U širem smislu termin mikropropagacija označava svaki način razmnožavanja biljaka u
kulturi in vitro.
U užem smislu označava razmnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih
pupoljaka, koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih
primordija.
Faze mikropropagacije:
Faza 0: Izbor majke biljke i njena priprema
Pre nego se počne sa mikropropagacijom treba pažljivo odabrati majku biljku, koja treba
da je tipičan predstavnik vrste i bez ikakvih vidljivih simptoma bolesti. To je početna faza
koja uključuje sve postupke pre početka uvođenja biljke u kulturu in vitro, tj. preparativne
procedure.
Faza 1: Uspostavljanje aseptične kulture
Ova faza je, u stvari, prva faza klonskog razmnožavanja. Ona obuhvata: dobijanje
aseptične kulture odabranog biljnog materijala tj. sterilnu izolaciju dela biljke kojeg želimo
klonirati (meristem, list, tučak, koren i dr.); celokupnu sterilizaciju posuđa, pribora, prostora;
pripremanje i sterilizaciju hranljivih podloga.
Faza 2: Produkcija (razmnožavanje) propagula
Osnovni cilj ove faze jeste produkcija tj. umnožavanje kloniranih biljka (ili novih mladica,
izdanaka ili propagula), koje su, kad se odvoje od kulture, sposobne da nastave rastenje i da
daju kompletnu biljku.
Faza 3: Priprema za rast u prirodnom okruženju
Izdanci ili biljke dobijene u fazi 2 su male i nesposobne za rast i samoodržavanje u zemlji
ili kompostu. Stoga faza 3 podrazumeva korake neophodne za individualan rast biljaka,
sposobnih za fotosintezu i preživljavanje bez dodatka ugljenih hidrata. Ova faza
podrazumeva zakorenjivanje izdanaka in vitro pre presađivanja u zemlju.
Faza 4: Priprema i prenos biljaka u uslove spoljašnje sredine
Prenos biljaka iz in vitro u ex vitro uslove je veoma važan. Ako se ne obavi pažljivo,
transfer može da rezultira velikim gubitkom propagiranog materijala. Sam prelaz sa uslova in
12
vitro na uslove spoljašnje sredine (ex vitro) predstavlja fiziološki stres koji brojne vrste teško
preživljavaju, pa je ovo kritična faza u klonskom razmnožavanju biljaka. Pošto se svi
postupci u ovoj fazi moraju odvijati postepeno, da bi se biljkama dalo vremena da ojačaju i
adaptiraju se na uslove spoljašnje sredine, oni su nazvani aklimatizacija.
Mikropropagacija se koristi za razmnožavanje sledećih grupa biljaka:
lekovitih biljaka, radi obezbeđivanja sirovina za industrijsku preradu;
elitnih primeraka šumskog drveća, čije su osobine visoko cenjene;
dvodomih vrsta, kada je za određivanje pola biljke potrebno da prođe i nekoliko
godina.
13
2. CILJ RADA
14
Cilj ovog rada bio je:
Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. thymifolia i ispitivanje
uticaja različitih kombinacija regulatora rastenja iz grupe citokinina i auksina na
indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka;
Ispitivanje uticaja auksina i citokinina na produkciju biomase eksplantata M. thymifolia;
Statistička obrada dobijenih rezultata;
Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećim podacima iz literature.
15
3. MATERIJAL I METODE
16
3.1. Biljni material
Biljni materijal Micromeria thymifolia koji je korišćen tokom ovog eksperimentalnog rada
uzet je sa lokaliteta u zapadnoj Srbiji, u klisuri Belog Rzava kod Kotromana. Biljke su
uzorkovane u vegetativnoj fazi. Vrsta M. thymifolia uvedena je u kulturu in vitro od strane
autora Stojišić i Tošić (2014, nepublikovani rezultat). Za razmnožavanje i gajenje u uslovima
in vitro, kao eksplantati korišćeni su nodalni segmenti ove biljne vrste. Eksplantati koji su
korišćeni su bili približno iste veličine. Vršni pupoljci nisu korišćeni kao eksplantat. Na
svaku hranljivu podlogu postavljano je po 30 eksplantata. Korišćena je hranljiva podloga MS
(Murashige and Skoog, 1962) sa različitim koncentracijama regulatora rastenja – citokinina
(Kin) i auksina (IAA).
3.2. Hranljiva podloga MS
Hranljiva podloga (medijum) predstavlja smešu agara, šećera, mineralnih soli, vitamina,
inozitola, aminokiselina, kofaktora i hormona (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996). Osnovna
hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu bila je Murashige, T. and Skoog, F. (1962) –
MS podloga. Ova hranljiva podloga ima određeni sastav makro, mikro-mineralnih soli i
organskih dodataka. Sastav MS podloge prikazan je u tabelama:
Tabela 1. Sastav makro-mineralnih soli MS hranljive podloge
Makro mineralne soli MS (mg/l)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2 2H2O 440
MgSO4 7H2O 370
KH2PO4 170
17
Tabela 2. Sastav mikro-mineralnih soli MS hranljive podloge
Mikro mineralne soli MS (mg/l)
Mn SO4 4H2O 22.3
Zn SO4 7H2O 8.6
H3BO3 6.2
KJ 0.83
NaMoO4 2H2O 0.25
CuSO4 5 H2O 0.025
CoCl2 6 H2O 0.025
FeSO4 7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
Tabela 3. Sastav organskih dodataka MS hranljive podloge
Organski dodaci MS (mg/l)
vitamin B1 0.4
vitamin B6 0.5
nikotinska kiselina 0.5
glicin 2.0
(g/l)
mioinozitol 0,1
saharoza 30,0
agar 0,7
3.3. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria thymifolia
Radi ispitivanja uticaja regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka u osnovnu
hranljivu podlogu MS dodati su kinetin (Kin) u rasponu koncentracija od 0,1 μM do 30 μM i
indol-3-sirćetna kiselina (IAA) u koncentraciji 0,57 μM. Kontrola nije sadržala regulatore
rastenja. Korišćene kombinacije regulatora rastenja su prikazane u tabeli 4.
18
Tabela 4. Sadržaj hormona u hranljivim podlogama za indukciju aksilarnih pupoljaka M.
thymifolia
Hranljiva podloga 1 2 3 4 5 6 7 8
kinetin (μM) 0 0 0,1 0,3 1 3 10 30
IAA (μM) 0 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
Eksplantati su postavljani u staklene teglice (5×5×12 cm). Svaka od pripremljenih
hranljivih podloga bila je razlivena u po 3 teglice. Teglice su sadržale po 30-35 ml hranljive
podloge, bile su zatvorene metalnim zatvaračima koji su na sredini imali otvor kroz koji je
provučena vata, zbog boljeg provetravanja, a zadržavanja aseptičnosti kulture. U svaku
teglicu postavljeno je po 10 eksplantata, na taj način je na svaki tretman postavljeno po 30
eksplantata. Kulture su gajene u komori za rastenje na temperaturi 21 ± 2 °C, sa
fotoperiodom od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Nakon 28 dana utvrđen je broj pupoljaka,
njihova dužina, izmerena je sveža masa biljaka, a nakon sušenja i njihova suva masa.
Dobijeni podaci su obrađeni statistički.
3.4. Metode sterilizacije
Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju ili uništavaju svi oblici
mikroorganizama. Metode sterilizacije se dele na fizičke i hemijske. Fizičke metode
sterilizacije obuhvataju sterilizaciju toplotom, zračenjem i mehaničku sterilizaciju
(filtriranje). Među hemijskim sredstavima koja se primenjuju za sterilizaciju treba spomenuti
etilen-oksid, koji se koristi samo u te svrhe, dok se ostala hemijska sredstva primenjuju
prvenstveno za dezinfekciju (Marić, 1995).
3.4.1. Sterilizacija biljnog materijala
Sterilizacija nodalnih segmenata (eksplantata) Micromeria thymifolia obavljena je 30% -
nim rastvorom varikine (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g aktivnog
hlora/l) u trajanju od 25 minuta. Nakon sterilizacije eksplantati su tri puta isprani sterilnom
destilovanom vodom. U cilju eliminacije gljivične infekcije eksplantati su 24 časa potapani u
19
sterilni rastvor nistatina (0,05%), a zatim isprani sterilnom destilovanom vodom tri puta.
Ovako pripremljeni sterilisani eksplantati su postavljani na sterilisanu podlogu.
3.4.2. Sterilizacija hranljivih podloga
Sterilizacija hranljivih podloga vrši se vodenom parom pod pritiskom u autoklavu. Hranljive
podloge se autoklaviraju na temperaturi od 120 °C, i pritisku od 1 bara 30 minuta.
3.4.3. Sterilizacija instrumenata i prostora
Instrumenti (pincete, skalpeli, makaze i dr.) se sterilišu iskuvavanjem u destilovanoj vodi
30 minuta. Nakon iskuvavanja prebacuju se u alkohol, a neposredno pre upotrebe se sterilišu
opaljivanjem na plamenu špiritusne lampe. Instrumenti se mogu sterilisati i u suvom
sterilizatoru na temperaturi od 160 do 180 °C, u trajanju od 1 do 2 sata. U suvom sterilizatoru
se mogu sterilisati predmeti od stakla i porculana. Pre sterilizacije u suvom sterilizatoru
objekti moraju biti stavljeni u metalne kutije ili zavijeni u hartiju, kako nakon sterilizacije ne
bi došlo do kontaminacije.
Radna prostorija i površine se sterilišu UV lampama, najmanje dva sata pre početka rada.
Radne površine se takođe dezinfikuju alkoholom.
3.5. Merenje sveže i suve mase biljaka
Sveža masa biljaka merena je odmah nakon utvrđivanja broja pupoljaka i njihove dužine.
Suva masa je merena nakon nekoliko dana sušenja biljnog materijala. Sva merenja su
obavljena na automatskoj analitičkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg. Dobijeni podaci su
nakon toga statistički obrađeni.
3.6. Statistička analiza
Obrada podataka je urađena statističko - grafičkim paketom Statgraphics, procedura
ANOVA i test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki
parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su
različitim slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.
20
4. REZULTATI
21
4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste Micromeria thymifolia
M. thymifolia je uvedena u kulturu in vitro od strane autora Stojičić i Tošić (nepublikovani
rezultat, 2014). Biljke iz prirode su izdeljene na nodalne segmente, a zatim su ovi segmenti
sterilisani i postavljeni na hranljivu podlogu MS bez regulatora rastenja. Na ovoj podlozi
eksplantati su proveli 4 nedelje. Tokom trajanja ove faze eliminisani su eksplantati koji su
bili zaraženi bakterijskom ili gljivičnom infekcijom, kao i oni koji su bili zahvaćeni
nekrozom. Preostali zdrav i nezaražen materijal je nakon 4 nedelja prenet na svežu hranljivu
podlogu. Ovaj biljni materijal bio je primarni eksplantat koji je korišćen za indukciju
aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. thymifolia.
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria thymifolia
Nodalni eksplantati M. thymifolia su postavljeni na podlogu sa različitim koncentracijama
citokinina kinetina (0,1 – 30 μM) i konstantnom koncentracijom auksina indol-3-sirćetne
kiseline (0,57 μM). Jedna grupa eksplantata postavljena je na podlogu sa indol-3-sirćetnom
kiselinom (0,57 μM) bez citokinina. Kontrolni eksplantati gajeni su na podlozi MS bez
regulatora rastenja. Tokom 4 nedelje, koliko su eksplantati gajeni na induktivnoj podlozi,
došlo je do formiranja velikog broja aksilarnih pupoljaka na svim eksplantatima bez obzira na
koncentraciju korišćenih regulatora rastenja. Tabela 5. prikazuje prosečan broj pupoljaka po
eksplantatu i prosečnu dužinu formiranih pupoljaka.
Tabela 5. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka M. thymifolia
Tretman Prosečan broj pupoljaka po
eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka
(mm)
1 Bez hormona 8,84 ± 0,86c 4,32 ± 0,34
a
2 0,57 μM IAA 6,87 ± 0,56ab
5,99 ± 0,43c
3 0,57 μM IAA + 0,1 μM Kin 5,32 ± 0,52a 4,38 ± 0,28
a
4 0,57 μM IAA + 0,3 μM Kin 5,46 ± 0,49a 4,35 ± 0,28
a
5 0,57 μM IAA + 1 μM Kin 6,00 ± 0,57ab
4,74 ± 0,31ab
6 0,57 μM IAA + 3 μM Kin 7,78 ± 0,90bc
5,02 ± 0,36abc
7 0,57 μM IAA + 10 μM Kin 5,89 ± 0,55a 4,74 ± 0,32
ab
8 0,57 μM IAA + 30 μM Kin 6,47 ± 0,78ab
5,65 ± 0,49bc
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti
p0.05
22
Biljke M. thymifolia su uspešno rasle na hranljivoj MS podlozi bez regulatora rastenja. Na
eksplanatatima gajenim na ovoj podlozi, koja služi kao kontrolna podloga, prosečno je bilo
formirano 8,84 pupoljaka po eksplantatu, sa prosečnom dužinom 4,32 mm (Tab. 5). Naime,
na hranljivoj MS podlozi bez regulatora rastenja je postignut najveći prosečan broj pupoljaka
sa najmanjom prosečnom dužinom po eksplantatu. Eksplantati su bili vitalni, razgranati,
zelene boje, većina je bila dugih internodija sa velikim brojem pupoljaka (Sl. 2, 3).
Slika 2. M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja
Slika 3. Eksplantati M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja
Na eksplantatima koji su gajeni na podlozi MS sa 0,57 μM indol-3-sirćetne kiseline (IAA)
prosečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka bio je 6,87 a njihova prosečna dužina 5,99 mm
(Tab. 5). U poređenju sa kontrolom (MS bez hormona) doslo je do smanjenja broja
formiranih pupoljaka, dok je njihova dužina bila veća. Na ovoj podlozi je postignuta najveća
23
prosečna dužina pupoljaka na eksplantatima. Primećena je raznolikost u izgledu i dužini
eksplantata, tako da se mogu uočiti žbunaste forme biljaka ali i one sa znatno izduženim
internodijama (Sl. 4, 5).
Slika 4. M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,57 μM IAA
Slika 5. Eksplantat M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,57 μM IAA
Najmanji prosečan broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je na MS podlozi sa 0,1 μM
kinetina i 0,57 μM IAA. Prosečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka po eksplantatu bio je
5,32 a njihova prosečna dužina bila je 4,38 mm (Tab. 5). Niske koncentracije citokinina i
auksina dovele su do značajnog smanjenja broja formiranih pupoljaka a takođe uticale su da
pupoljci imaju i manju dužinu. Eksplantati su bili zdravi, sa krupnim tamnozelenim listovima
(Sl. 6, 7).
24
Slika 6. M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA
Slika 7. Eksplantat M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA
Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 0,3 μM kinetina i 0,57 μM IAA prosečno je bilo
formirano 5,46 aksilarnih pupoljaka sa prosečnom dužinom 4,35 mm (Tab. 5). Primećuje se
da se sa povećanjem koncentracije kinetina povećava broj pupoljaka po eksplantatu. Dužina
pupoljaka se takođe povećava u odnosu na prosečnu dužinu pupoljaka na kontrolnoj podlozi.
Eksplantati na ovoj podlozi se izrazito razlikuju od biljaka koje su gajene na kontrolnoj
podlozi, biljke su kratke, žbunaste, skraćenih internodija. Listovi koji dodiruju hranljivu
podlogu ili su blizu nje, imaju tamne mrlje što je znak pojave nekroze tkiva (Sl. 8, 9).
25
Slika 8. M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,3 μM Kin i 0,57 μM IAA
Slika 9. Eksplantat M. thymifolia na MS hranljivoj podlozi sa 0,3 μM Kin i 0,57 μM IAA
Gajenjem eksplantata M. thymifolia na podlozi sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA formirano
je prosečno 6,00 aksilarnih pupoljaka po eksplantatu, prosečna dužina pupoljaka formiranih
na ovim eksplantatima bila je 4,74 mm (Tab. 5). Većina eksplantata gajenih na ovoj podlozi
bili su kratki, žbunaste forme, skraćenih internodija (Sl. 10, 11).
26
Slika 10. M. thymifolia na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Slika 11. Eksplantat M. thymifolia na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Na hranljivoj podlozi sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA prosečan broj pupoljaka po
eksplantatu bio je 7,78 a njihova prosečna dužina 5,02 mm (Tab. 5). U poređenju sa
prethodnom podlogom, došlo je do povećanja u broju i dužini pupoljaka. Većina eksplantata
bila je patuljaste forme sa krupnim gusto zbijenim listovima (Sl. 12, 13).
27
Slika 12. M. thymifolia na podlozi MS sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Slika 13. Eksplantat M. thymifolia na podlozi MS sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA prosečno je
formirano 5,89 aksilarnih pupoljaka, što je manje nego kod kontrole. Prosečna dužina
pupoljaka bila je 4,74 mm što je veća dužina nego kod kontrolnih eksplantata (Tab. 5). Svi
eksplantati su bili vitalni, žbunasti, zelene boje sa sporadičnom pojavom nekroze koja se
javlja na najstarijim listovima (Sl. 14, 15).
28
Slika 14. M. thymifolia na podlozi MS sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Slika 15. Eksplantat M. thymifolia na podlozi MS sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Na podlozi sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA prosečno je formirano 6,47 aksilarnih
pupoljaka, čija je prosečna dužina bila 5,65 mm (Tab. 5). Eksplantati su bili vitalni sa
izduženim internodijama, svetlo zelene boje i sa pojavom nekroze na najstarijim listovima
(Sl. 16, 17).
29
Slika 16. M. thymifolia na podlozi MS sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Slika 17. Eksplantat M. thymifolia na podlozi MS sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Dobijeni rezultati su predstavljeni u histogramu 1 gde se jasnije može videti odnos između
korišćenih regulatora rastenja sa jedne strane i broja pupoljaka i njihove dužine sa druge
strane.
30
Histogram 1. Delovanje regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka
Micromeria thymifolia
Nakon formiranja aksilarnih pupoljaka na svim eksplantatima posle 4 nedelje, neposredno
pre merenja broja i dužine pupoljaka, eksplantati M. thymifolia su mereni kako bi se utvrdila
njihova sveža masa. Nekoliko dana nakon merenja broja i dužine aksilarnih pupoljaka i
sušenja na vazduhu eksplantati su mereni kako bi se utvrdila njihova suva masa. Rezultati
merenja prikazani su u tabeli 6.
Tabela 6. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia
Tretman Prosečna sveža masa
(mg)
Prosečna suva masa
(mg)
1 Bez hormona 0,075 ± 0,0072bc
0,0095 ± 0,0008c
2 0,57 μM IAA 0,064 ± 0,0048ab
0,0071 ± 0,0006ab
3 0,57 μM IAA + 0,1 μM Kin 0,054 ± 0,0040a 0,0063 ± 0,0005
a
4 0,57 μM IAA + 0,3 μM Kin 0,052 ± 0,0038a 0,0064 ± 0,0004
a
5 0,57 μM IAA + 1 μM Kin 0,052 ± 0,0036a 0,0070 ± 0,0004
a
6 0,57 μM IAA + 3 μM Kin 0,082 ± 0,0097c 0,0093 ± 0,0011
c
7 0,57 μM IAA + 10 μM Kin 0,074 ± 0,0070bc
0,0089 ± 0,0010bc
8 0,57 μM IAA + 30 μM Kin 0,064 ± 0,0063abc
0,0073 ± 0,0009abc
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti
p0.05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Bez hormona
0,57 μM IAA 0,57 μM IAA + 0,1 μM Kin
0,57 μM IAA + 0,3 μM Kin
0,57 μM IAA + 1 μM Kin
0,57 μM IAA + 3 μM Kin
0,57 μM IAA + 10 μM Kin
0,57 μM IAA + 30 μM Kin
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka (mm)
31
Na hranljivoj podlozi sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA prosečna sveža masa je bila najveća
od 0,082 mg, najmanja prosečna sveža masa je na hranljivim podlogama sa 0,3 μM kinetina i
0,57 μM IAA i 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA od 0,052 mg (Tab. 6).
Najveća prosečna suva masa zabeležena je na podlogama sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA
od 0,0093 mg i MS bez hormona od 0,0095 mg. Najmanja prosečna suva masa je na podlozi
0,1 μM kinetina i 0,57 μM IAA od 0,0063 mg (Tab. 6).
32
5. DISKUSIJA
33
Na osnovu dobijenih rezultata, vrsta Micromeria thymifolia je uspešno uvedena u kulturu
in vitro. Definisani su uslovi pod kojima, korišćenjem različitih regulatora rastenja, dolazi do
indukcije aksilarnih pupoljaka kao i njihove multiplikacije i elongacije. Dakle,
mikropropagacija M. thymifolia je bila uspešna.
Gajenjem eksplantata M. thymifolia na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja došlo
je do formiranja prosečno 8,84 pupoljaka po eksplantatu. Naime, na ovoj podlozi je postignut
najveći prosečan broj pupoljaka. Slični rezultati dobijeni su kod vrste Salvia brachyodon gde
je došlo do formiranja većeg broja aksilarnih pupoljaka kada su oni gajeni na podlozi bez
hormona (Mišić et al., 2006).
Na hranljivoj podlozi kojoj je dodat samo auksin (IAA), prosečan broj pupoljaka po
eksplantatu bio je 6,87 što je manje nego na kontrolnoj podlozi. Drugačiji rezultati dobijeni
su ispitivanjem vrste Mentha piperita, gde su auksini primenjeni bez citokinina imali
stimulativan efekat (Sujana & Naidu, 2011).
Konstantna koncentracija IAA i rastuća koncentracija kinetina indukovala je manji broj
pupoljaka po eksplanatatu u poređenju sa kontrolom. Niske koncentracije auksina i različite
koncentracije citokinina su imale inhibitorni uticaj na indukciju i razviće aksilarnih
pupoljaka.
Ravishankar i Venkataraman (1988) su izvestili o indukciji multipnih izdanka kod Mentha
piperita pod uticajem kinetina, ali je utvrđen spori rast eksplantata. Iako kinetin indukuje
multipne izdanke, u ovom ispitivanju reakcija je bila slabija (Ghanti et al., 2004).
Micropropagcionim protokolom Petroselinum crispum upotrebom kinetina je dobijena niska
stopa proliferacije (Vandemoortele et al. 1996). Takođe, kod vrste Agastache rugosa
upotreba kinetina je rezultirala manjim brojem kraćih izdanaka sa bledo zelenom bojom
kalusa (Zielinska et al., 2011). Inhibitorno dejstvo citokinina na indukciju i razviće aksilarnih
pupoljaka javilo se kod vrste Mentha arvensis (Akram et al., 2007) i Ocimum
kilimandscharicum (Saha et al., 2010; Sharma et al., 2013).
Stimulativni efekat niske koncentracije auksina i različitih koncentracija citokinina na
indukciju aksilarnih pupoljaka je zabeležen kod različitih vrsta biljaka: Salvia officinalis
(Ioja-Boldura et al., 2010; Irina, 2008), Ocimum americanum (Kumar & Jhanwar, 2013),
34
Ocimum basilicum (Gopal et al., 2014), Scutellaria baicalensis (Stojakowska et al., 1999),
Lupinus ferensis (Nation et al., 1992).
Dužina pupoljaka formiranih na eksplantatima M. thymifolia bila je najveća kada su
eksplantati gajeni na hranljivoj podlozi kojoj je dodat samo auksin (0,57 μM IAA) gde je
iznosila 5,99 mm. Ovakvi rezultati su suprotni od rezultata dobijenih ispitivanjem drugih
vrsta iz familije Lamiaceae, gde su hormoni imali inhibitoran uticaj (Mišić et al., 2006). Kod
vrsta Ocimum sanctum (Singh & Sehgal, 1999) i Nepeta rtanjensis (Mišić et al., 2005) dužina
pupoljaka gajenih na podlozi bez regulatora rastenja bila je najveća.
Analiziran je i uticaj različitih tretmana na biomasu Micromeria thymifolia. Najveću
prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na podlozi sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA,
dok su najmanju imali eksplantati gajeni na podlogama sa 0,3 i 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA.
Najveća prosečna suva masa bila je kod eksplantata gajenih na podlozi bez hormona i podlozi
sa 3 μM kinetina i 0,57 μM IAA. Najmanja prosečna suva masa zabeležena je kod
eksplantata na podlozi sa 0,1 μM kinetina i 0,57 μM IAA.
35
6. ZAKLJUČAK
36
In vitro kultura Micromeria thymifolia je uspešno uspostavljena. Gajenjem nodalnih
eksplanatata na hranljivoj podlozi sa različitim koncentracijama citokinina i malom dozom
auksina indukovani su brojni aksilarni pupoljci. Indukcija najvećeg broja aksilarnih pupoljaka
(8,84) dobijena je gajenjem nodalnih eksplantata na MS hranljivoj podlozi bez regulatora
rastenja. Prisustvo auksina i citokinina je smanjivalo broj pupoljaka po eksplantatu. Najveća
dužina pupoljaka (5,99 mm) dobijena je na eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 0,57
μM IAA. Dakle, prisustvo citokinina je smanjivalo dužinu pupoljaka.
Mikropropagacija Micromeria thymifolia omogućava dobijanje velikog broja biljaka od
početno male količine biljnog materijala. Biljke dobijene ovim protokolom u kulturi in vitro,
mogu se koristiti za prenos na prirodna staništa u cilju povećanja brojnosti ove endemične
vrste, sprečavanja njenog nestanka kao i komercijalne proizvodnje i distribucije etarskih ulja.
37
7. LITERATURA
38
1. Akram M., Afrasiab H., Mahmood S., Aftab F., (2007): Monoterpene contents in in
vitro cultures and field-grown plants of Japanese mint Mentha arvensis L. Pak. j.
biochem. mol. biol., 74-79.
2. Bezić N., Dunkić V., Vuko E.: Antiphytoviral Activity of Essential Oils of Some
Lamiaceae Species and There Most Important Compounds on CMV and TMV.
Formatex, 2013.
3. Bräuchler C., Ryding O., Heubl G., (2008): The genus Micromeria (Lamiaceae), a
synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.
4. Ghanti K., Kaviraj C. P., Venugopal R. B., Jabeen F. T. Z., Rao S., (2004): Rapid
pegeneration of Mentha piperita L. From shoot tip and nodal explants. Indian
Journal of Biotechnology. Vol. 3, pp 594-598.
5. Gopal G. V., Repalle S., Talluri V. R., Ronda S. R., Allu P. R., (2014): In vitro
Propagation and GC-MS Studies of Ocimum basilicum Linn. var. pilosum (Willd.)
Benth. British Biotechnology Journal, 4(1): 96-107.
6. Ioja-Boldura O., Radu F., Popescu S., Borozan A.: Regeneration, Micropropagation,
Callus Cultures and Somatic Embryogenesis of Common Sage (Salvia officinalis
L.). Bulletin UASVM Horticulture, 67(1), 2010.
7. Irina G., (2008): Effects of Different Plant Hormones on Salvia officinalis Cultivated
in vitro. International Journal of Botany, 4(4): 430-436.
8. Kumar A., Jhanwar B., (2013): In Vitro Micropropagation of Ocimum americanum
(L.): A Wild But Important Medicinal Plant. J. Pharm. Bioanal. Sci., 2(3): 29-32.
9. Marić M., (1995): Kultura biljnih tkiva. ‘Dragančić’, Beograd (20-66).
10. Marin M., Jasnić N., Ascensão L., (2013): Histochemical, micromorphology and
ultrastructural investigation in glandular trichomes of Micromeria thymifolia.
Botanica Serbica, 37(1): 49-53.
11. Mišić D., Ghalawenji N. A., Grubišić D., Konjević R.: Micropropagation and
reintroduction of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević, an endemic and critically
endangered perennial of Serbia. - Phyton 45: 9-20, 2005.
39
12. Mišić D., Grubišić D., Konjević R., (2006): Micropropagation of Salvia brachyodon
through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476(4).
13. Murashige, T., Skoog, F., 1962: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio
Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.
14. Nation R. G., Janick J., Simon J. E., (1992): Estimation of Outcrossing in Basil.
Hortscience, 27(11): 1221-1222.
15. Ravishankar G. A., Venkataraman, (1988): Rapid multiplication of plants from
cultures of axillary bud of Mentha piperita. Philipp J Sci, 117: 121-130.
16. Ristić N., Palić R., Kitić D., Stojanović G., (1997): The fatty acids from some plants of
Micromeria genus. The scientific journal Facta Universitatis, 1(4): 53-56.
17. Saha S., Dey T., Ghosh P., (2010): Micropropagation of Ocimum kilimandscharicum
Guerke (Labiatae). Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 52/2 50–58.
18. Sharma N. K., Vandana T., Kumar M., Kumar H., (2013): In vitro regeneration of
Ocimum killimandscharicum L.: A camphor yielding medicinal plant. Journal of Cell
and Tissue Research, 13(3): 3937-3942.
19. Singh N.K., Sehgal C.B.: Micropropagation of ‘Holy Basil’ (Ocimum sanctum Linn.)
from young inflorescences of mature plants. - Plant Growth Regul. 29: 161-166, 1999.
20. Slavkovska V., Couladis M., Bojovic S., Tzakou O., Pavlovic M., Lakusic B., Jancic R.,
(2005): Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria
Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255: 1–15.
21. Stojakowska A., Malarz J., Kohlmünzer S., (1999): Micropropagation of Scutellaria
baicalensis Georgi. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 68(2): 103-107.
22. Sujana P., Naidu C. V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on High
Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) – An
Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology, 3(5): 14-18.
23. Tatić B., Blečić V., (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka. Univerzitetski
udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 314 - 316.
40
24. Vandemoortele J. L., Billard J. P., Boucaud J., Gaspar T.: Micropropagation of parsley
through axillary shoot proliferation. - Plant Cell Tissue Organ Cult. 44: 25-30, 1996.
25. Vinterhalter D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.
Axial, P.O., Beograd (15-54).
26. Zielinska S., Piatczak E., Kalemba D., Matkowski A., (2011): Influence of plant
growth regulators on volatiles produced by in vitro grown shoots of Agastache
rugosa (Fischer & C.A.Meyer) O. Kuntze. Plant Cell Tiss Organ Cult, 107: 161–167.
41
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Saša Blagojević rođen je 30. 03. 1988. godine u Leskovcu. Završio je osnovnu školu „Bora
Stankovic“ u Bunuškom Čifluku (matična škola u Vučju), nakon toga 2003. godine upisuje
trgovinsko – ugostiteljsku školu u Lekovcu na smeru trgovinski tehničar.
Godine 2007. započinje osnovne akademske studije na Prirodno - matematičkom fakultetu,
Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju, koje završava 2011. godine sa
zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za biologiju i
ekologiju, odsek Biologija, koje završava 2014. godine.
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Саша Благојевић
Ментор, МН: Драгана Стојичић
Наслов рада, НР: “Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch у култури in vitro”
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2014.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 49 стр. ; 17 слика, 6 табелa, 1 хистограм
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: биологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria thymifolia, кинетин, аксиларни пупољци
УДК 57.084:582.929.4
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch је ендемична врста Балканског
полуострва. Припада породици Lamiaceae. У Медитеранској области
користи се као зачин и лековито биље. У овом раду дефинисани су
услови при којима долази до индукције аксиларних пупољака M.
thymifolia, коришћењем различитих комбинација регулатора растења из
групе цитокинина (Kin) и ауксина (IAA) на MS хранљивој подлози, као
и утицај различитих третмана на продукцију биомасе. Највећи број
пупољака формирао се на експлантатима који су гајени на MS
хранљивој подлози без регулатора растења, а најмањи на подлози са
0,1 μM Kin и 0,57 μM IAA. На MS подлози са 0,57 μM IAA просечна
дужина пупољака била је највећа, а најмања на контролној подлози.
Највећу просечну свежу масу имали су експлантати гајени на подлози
са 3 μM Kin и 0,57 μM IAA, а најмању на подлогама са 0,3 и 1 μM Kin и
0,57 μM IAA. Највише вредности просечне суве масе измерене су код
експлантата гајених на подлогама без хормона и 3 μM Kin и 0,57 μM
IAA, а најниже на подлози са 0,1 μM Kin и 0,57 μM IAA.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
Члан:
Члан, ментор:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Saša Blagojević
Mentor, MN: Dragana Stojičić
Title, TI: “Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch in vitro”
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2014
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
49 p. ; 17 figures, 2 tables, 1 histogram
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: biology
Subject/Key words, S/KW: Micromeria thymifolia, kinetinе, axillary buds
UC 57.084:582.929.4
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is an endemic species of the Balkan
Peninsula. It belongs to family Lamiaceae. It is used as a spice and
medicinal herb on the Mediterranean area. The paper defines the conditions
for induction of axillary M. thymifolia buds using different combinations of
plant growth regulators from the group of cytokinins (Kin) and auxin (IAA)
on MS medium nutrient including the effect of different treatments on
biomass production. The largest number of buds was formed on the explants
that were cultured on MS medium nutrient without growth regulators and
the lowest on the medium containing 0.1 μM Kin and 0.57 μM IAA.
Average length of buds was the highest on MS medium with 0.57 μM IAA,
while the lowest was on the control medium nutrient. The highest average
fresh weight of explants were cultured on base nutrient containing 3 μM and
0.57 μM Kin IAA, and the lowest on substrates with 0.3 and 1 μM Kin and
0.57 μM IAA. The highest value of the average dry weight was measured in
explants grown on medium nutrient without hormones and 3 μM Kin and
0.57 μM IAA and the lowest in medium nutrient containing 0.1 μM Kin and
0.57 μM IAA.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
