Schema zur Analytik von synth. Peptiden Schema zur Analytik von synth. Peptiden Synthese (manuel, automatisch,

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  • Schema zur Analytik von synth. Peptiden Synthese (manuel, automatisch, parallel)

    Abspaltung (Fällung aus unpolarem Lösungsmittel)

    Gefriertrocknung

    HPLC MS MS/MS Sequenzierung

    Kopplung mit UV, MS

    Aminosäurenanalyse ggf. an chiraler Säule

    Reinheit

    Identität

    Salzgehalt Entantiomerenreinheit

    1

  • Chromatographie

    Peptidsynthese in Lösung

    2

  • Säule hydrophob: SiR3-O-C12H25

    Pumpen

    Laufmittel: Wasser, pH 2; Acetonitril

    Probenaufgabesystem

    Detektor

    Octadecyl‐Phase C18 

    3

  • Wellenlänge [nm]

    Peptid (enthält Tyrosin)

    Peptid (mit Fmoc-Schutzgruppe)

    Peptid (mit Mtr-Schutzgruppe)

    UV-Spektren von Peptiden mit und ohne Schutzgruppen

    220 240 260 280 300 4

  • HPLC eines Roh-Peptides

    Cy3-NPY Cy3-NPY

    220 nm 552 nm

    5

  • Dünnschicht- chromatographie (2-dimensional)

    Detektion mit Ninhydrin- Sprühreagenz

    Ionenaustausch- chromatographie

    Derivatisierung mit Ninhydrin

    Absorption l=570nm

    A

    t [h]

    Derivatisierung

    RP-HPLC/chiraler Säule Detektion im UV, Fluoreszenz

    A

    t [min]

    Aminosäurenanalyse

    Peptid Totalhydrolyse (6N HCl, 24 h, 110 °C)Totalhydrolyse (6N HCl, 24 h, 110 °C)

    Ninhydrin reagiert mit α‐Aminosäuren

    Ruhemanns Violett 6

  • PITC=Phenylisothiocyanat PTC=Phenylthiocarbamoyl ATZ=Anilinothiazolinon PTH=Phenylthiohydantoin

    Sequenzierung nach Edman

    1. Schritt: Kupplung 2. Schritt: Spaltung 3. Schritt: Umwandlung

    N-terminaler Sequenzierungszyklus

    7

  • Phenylisothiocyanat

    (Phenylthiocarbamoylpeptid)

    1. Schritt: Kupplung

    Sequenzierung nach Edman

    8

  • ATZ-Aminosäure (Anilinothiazolinon)

    um eine Aminosäure verkürztes Peptid

    2. Schritt: Spaltung

    Wird mit einem hydrophoben Lösungsmittel extrahiert

    Sequenzierung nach Edman

    (Phenylthiocarbamoylpeptid)

    9

  • Phenylthiohydantoin-Aminosäure

    3. Schritt: Umwandlung (Hydrolyse+ Umlagerung)

    Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure

    Sequenzierung nach Edman

    10

  • W

    min

    Analyse mittels HPLC

    11

  • 12

  • Massenspektrometrie

    Essentielle Eigenschaften von allen MS Verfahren: • Erzeugung von Ionen in der Gas- oder Plasmaphase • Beschleunigung der Ionen in einem elektrischen Feld • Trennung der Ionen entsprechend der m/z Verhältnis

    in einen Massenanalysator • Detektion der Ionen

    13

  • Massenspektrometer

    “soft"

    14

  • MALD-Ionisierung

    • Probe in lichtabsorbierender Matrix • Laserbestrahlung • thermische, photochemische Anregung  Ionisierung

    Matrixassistierte Laserdesorption Ionisations(MALDI)-Massenspektrometrie

    Koichi Tanaka

    Nobel Price in Chemistry 2002 1/4 share

    15

  • Matrix

    2,5-dihydroxybenzoesäure (DHBA) MW 154.12

    -Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) MW 189.17

    Sinapinsäure (SA) 3,5-Dimethoxy-4-hydroxzimtsäure MW 224.21

    266 nm 337 nm 355 nm

    337 nm 355 nm

    266 nm 337 nm 355 nm

    Peptide, Proteine

    Peptide

    Proteine

    16

  • Massenanalysator

    Matrixkristall mit Analyten

    Laser N2 337 nm 3-5 ns Nd:YAG 355 nm 5-15 ns Er:YAG 2.94 μm 90 ns

    MALD-Ionisierung

    pulsed

    17

  • MALDI-TOF-Massenspektrometrie

    Laser

    Probe in

    Matrix

    TOF = T1-T0

    Linsensystem

    T0

    Ionen

    Laser

    Probe in

    TOF = T -T0

    Detektor

    Linsensystem

    T0

    T1 Ionen

    (TOF = Time Of Flight)

    18

  • Vacuum

    MALDI/TOF-Massenspektrometrie

    19

  • MALDI-TOF-Massenspektrometrie

    + +

    Probe + Matrix Ionen mit gleicher Masse verschiedener Geschwindigkeit

    Problem: Peaks sind inhärent breit in MALDI-TOF Spektra (niedrige Massenauflösung)

    Ungleiche Energieverteilung bei der Ionisierung +

    20

  • MALDI-TOF-Massenspektrometrie Methoden zur Kompensation der initialen Geschwindigkeits‐verteilung  der Ionen: • Verzögerte Ionenextration (delayed extraction)

    Das elektrische Feld wird zeitversetzt zum Laser Desorptionsimpuls  eingeschaltet.

    • Ionenspiegeln (Reflektoren) Elektrisches Gegenfeld angeschlossen an die Driftstrecke

    Schärfere Peaks

    21

  • Kein elektrisches Feld, Ionen streuen.

    + + +

    Ionen mit gleicher Masse, unterschiedlicher Geschwindigkeit

    Feld angelegt, langsame Ionen beschleunigen mehr als die Schnelleren

    0 V.

    0 V.

    + + +

    Langsame Ionen erreichen die Schnellen

    20 kV.

    20 kV.

    0 V.

    0 V. + + +

    MALDI-TOF-Massenspektrometrie

    Delayed extraction

    1.

    2.

    3.

    22

  • MALDI-TOF-Massenspektrometrie

    Reflektor

    23

  • TOF: Time-of-flight

    • Trennung der Ionen aufgrund unterschiedlicher Flugzeit bei  vorgegebenem Weg t = f (   2m/z     )

    • Reflektor und Delayed Extraction (DE): erhöhen  Genauigkeit und Empfindlichkeit

    24

  • MALDI-TOF von Angiotensin: M+H+theor. 1046.54

    25

  • MALDI-TOF von recombinant SERPINA12 / Vaspin

    26

  • Elektrospray-Ionisierung

    Spray Elektrospray

    27

  • Elektrospray-Ionisierung

    28

  • Elektrospray-Ionisierung

    Verdampfung des Lösungsmittels

    29

  • Elektrospray-Ionisierung

    • protonenhaltige Lösung der Probe • Zerstäubung im Hochspannungsfeld • Lösungsmittel verdunstet • Zerfall der Molekülcluster in vielfachgeladene Ionen: [M+nH]n+ oder [M‐nH]n‐

    John B. Fenn

    Nobel Price in Chemistry 2002 1/4 share

    30

  • Interface zwischen ESI-Quelle und Quadrupole

    Atmosphärendruck Hochvakuum

    Vorvakuum

    31

  • Quadrupol-Filter

    -

    -

    +

    +

    -

    - +

    +

    32

  • Quadrupol-Filter

    33

  • Quadrupol-Detektion

    • Massentrennung durch Schwingung der Ionen in einem  hochfrequenten elektrischen Feld (Kombination von Radiofrequenzspannung V und  Gleichspannung U)

    • V/U konstant  nur ein m/z‐Ion stabil • Veränderung der Amplitude  Spektrum 

    34

  • ESI-MS von Neurotensin 1673,5

    35

  • 36

  • MALDI gegen ESI

    MALDI ESI Analyte in matrix Analyte in solution Sample bombardment with  laser to desolvate ions

    Dissolved charged sample  desolvated, “cold ions”

    Ionization takes place through  the matrix

    Ions are brought to the gas  phase

    Ionization in vacuum Spray in atmospheric pressure Generates ion pulses Generates a continuous current

    Historically coupled to: TOF analyzer Quadrupole analyzer

    37

  • ESI-MS-MS: Tandem-Massenspektrometrie

    Sequenzierung mittels Massenspektrometrie

    38

  • Fragmentierung der Peptidbindung

    39

  • 40

  • Sequenzierung von Peptiden mit MS

    41

  • 200 400 600 800 1000 1200 1400 0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    10

    11

    Abs. Int. * 1000 a H M K* b H M K* y R P S F S P K* M H

    110.050 a 1

    138.060 b 1

    175.075 y 1

    H 241.060

    a 2

    269.054 b 2

    272.117 y 2

    595.190 a 3

    623.188 b 3

    359.112 y 3

    K*

    506.189 y 4

    P

    593.178 y 5

    926.408 a 6

    690.248 y 6

    F

    1044.330 y 7

    1175.506 y 8

    1312.655 y 9

    R

    KP y7b4

    PS y6b5

    SF y5b6

    KPS y7b5

    PSF y6b6

    PSFSP y6b8

    42

  • m /z 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    Abs. Int . * 1000

    1115.602 43-50

    1129.658 295-301

    1217.607 356-363

    1219.688 280-285

    1306.669 51-61

    1312.657 216-224

    1335.719 346-355

    1687.998 59-70

    1690.871 29-40

    1938.011 349-363 1975.054

    29-42

    1989.058 331-345

    2002.250 47-61

    2159.129 29-42

    2350.269 216-232

    2392.279 216-232

    2533.375 321-340

    2979.637 322-345

    3149.689 150-175

    43

  • Schema zur Analytik von Peptiden Synthese (manuel, automatisch, parallel)

    Abspaltung (Fällung aus Lösungsmittel)

    Gefriertrocknung

    HPLC MS MS/MS Sequenzierung

    Kopplung mit UV,