Embed Size (px)
Citation preview
Metody detekce a
identifikace MO
se zaměřením na PCR a
její variace
Kamila Zdeňková
Metody detekce a identifikace
MO
rozdělení metod pro mikrobiologické zkoušení
potravin
přehled „rychlých“ metod detekce MO
metody založené na polymerásové řetězové reakci
(PCR)
biočipy (microarrays nebo arrays)
real on time PCR
digitální PCR
normativní postupy zahrnující PCR
Metody pro mikrobiologické
zkoušení potravin
Klasické kultivační metody
metody uvedené v Nařízení Komise (ES) č.2073/2005 v platném znění jsou
metody referenční a jejich použití je nezbytné pro úřední kontrolu potravin
téměř všechny vydány jako ČSN ISO, ČSN EN nebo ČSN EN ISO
vydává a seznam platných norem udržuje ÚNMZ (Úřad pro normalizaci,
metrologii a státní zkušebnictví)
alternativní metody mohou být použity pro ostatní účely a tehdy, pokud byly
validovány postupem podle EN 16140 mezinárodně uznávanými
organizacemi
Rozdělení metod:
Kvalita
Ano či ne
Kvantita
Kolik
Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií
ČSN ISO 21528-2 56 0096
ICS 07.100.01 Únor 2006
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and enumeration
of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony count method
Microbiologie des aliments - Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement de
Enterobacteriaceae -
Partie 2: Méthode par la comptage des colonies
Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Horizontale Verfahren für den Nachweis und für die
Zählung
von Enterobacteriaceae - Teil 2: Koloniezahlverfahren
Tato norma je českou verzí mezinárodní normy ISO 21528-2:2004. Mezinárodní norma ISO 21528-
2:2004 má status české technické normy.
This standard is the Czech version of the International Standard ISO 21528-2:2004. The International
Standard ISO 21528-2:2004 has the status of a Czech Standard.
Nahrazení předchozích norem
Touto normou spolu s ČSN ISO 21528-1 z února 2006 se nahrazuje ČSN ISO 8523 (56 0096) z října
1995 a ČSN ISO 7402 (56 0108) z října 1995.
Česká technická norma
ICS 07.100.01 Únor 2006
Klasické versus rychlé metody
stanovení mikroorganismů
v potravinách
Klasické metody stanovení závazné normy (ČSN, ISO) či standardní operační postupy
(SOP)
dobře charakterizované, akceptované
náročné na materiál a práci
zdlouhavé 2-10 dní
Rychlé metody stanovení doba trvání do 24 h
vhodné pro orientační rozbor většího množství vzorků
náročné na přístrojové vybavení
positivní nález musí být potvrzen normovanou metodou pro daný MO
Přehled metod používaných pro detekci MO
Horizontální metody – ISO
normy
Klasické kultivační metody, ISO normy PCR
Molekulárně-biologické
metody (detekce DNA,
případně RNA)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) a její
variace (multiplex, nested apod.), reversní
transkripce PCR (RT – PCR), sekvenace
PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase
(qPCR), digitální PCR (dPCR)
Genotypizační metody (AFLP, RFLP, PCR-RFLP,
PFGE atd.
Detekce proteinu založené na
interakci antigenu s
protilátkou
ELISA (Enzymová imunoanalýza na pevné fázi )
Imunochromatografická technika na membráně
Imumomagnetická separace
Aglutinace
Imunosenzory
Ostatní metody MALDI-TOF-MS, VIDAS, impedanční metody,
stanovení značeného substrátu (CO2), stanovení
ATP luminiscenčně, Limulův test atd.
Centrální dogma molekulární
biologie
Edited by http://en.wikipedia.org/wiki/File:Centraldogma_nodetails.GIF
I
II
III
I
II
III
Replikace
Transkripce
Translace
• popisuje cestu přenosu informace v biologických systémech
DNA: nositelka dědičnosti
RNA: realizace genetické
informace (čili exprese
genu)
Literature and sources used
Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)
Obrázky: http://www.karymullis.com
Literatura a použité zdroje
Navržena Kary B. Mullisem roku 1983
Nobelovou cenou udělena roku 1993
Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)
in vitro reakce umožňující amplifikaci DNA
katalyzována termostabilní DNA polymerasou
k namnožení cílového úseku používá oligonukleotidových
primerů
Vlastní PCR - cyklické opakování 3 kroků
7272°°CCprodlouprodloužž eneníí primerprimerůů polymerasoupolymerasouELONGACEELONGACE3.3.
50 50 -- 6565°°CCppřř ipojenipojeníí primerprimerůů kk jejich komplementjejich komplementáárnrníím m
úúseksekůů m vm v DNADNA
ANNEALINGANNEALING2.2.
94 94 -- 9696°°CCtepelntepelnéé oddodděě lenleníí vlvlááken ken dvojdvojššrouboviceroubovice DNADNADENATURACEDENATURACE1.1.
TeplotaTeplotaPrPrůů bběě hhFFáázeze
7272°°CCprodlouprodloužž eneníí primerprimerůů polymerasoupolymerasouELONGACEELONGACE3.3.
50 50 -- 6565°°CCppřř ipojenipojeníí primerprimerůů kk jejich komplementjejich komplementáárnrníím m
úúseksekůů m vm v DNADNA
ANNEALINGANNEALING2.2.
94 94 -- 9696°°CCtepelntepelnéé oddodděě lenleníí vlvlááken ken dvojdvojššrouboviceroubovice DNADNADENATURACEDENATURACE1.1.
TeplotaTeplotaPrPrůů bběě hhFFáázeze
Literatura a použité zdroje
Obrázek: Andy Vierstraete (1999)
Denaturace
Nasedání primerů
Prodlužování primerů
Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)
PCR
Literature and sources used
Andy Vierstraete (1999)
.
PCR teoretická účinnost reakce - 100%
teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení
No=1 No=10
n 2 n̂ 1 10
1 2 2 20
2 4 4 40
3 8 8 80
4 16 16 160
5 32 32 320
6 64 64 640
7 128 128 1280
8 256 256 2560
9 512 512 5120
10 1024 1024 10240
15 32768 32768 327680
20 1048576 1048576 10485760
25 33554432 33554432 335544320
30 1073741824 1073741824 10737418240
35 34359738368 34359738368 3,43597E+11
40 1,09951E+12 1,09951E+12 1,09951E+13
N; N=N0*2^n
N = počet molekul
DNA v n-tém
reakčním cyklu
N0 = počet molekul
DNA v 0-tém
reakčním cyklu
(na začátku reakce)
n = počet cyklů
Reakční směs (mastermix, MM)
složka funkce
deionizovaná voda bez DNas, RNas
reakční pufr vhodné prostředí pro polymerasu (iontová
síla, pH)
Mg2+ vazba s nukleotidy – kofaktor polymerasy,
(MgCl2, MgSO4)
dNTP (dCTP, dATP, dTTP,
dGTP)
nukleotidy - stavební kameny polymerace
primer A, primer B synteticky připravené oligonukleotidy o délce
20-25 nukleotidů, ohraničení amplifikovaného
úseku
DNA polymerasa termostabilní DNA polymerasa, polymerace
templát DNA DNA izolovaná z buněk, plazmidová DNA
(genomové knihovny), buněčný extrakt
podrobený lýzi
složka obvyklá koncentrace
v reakční směsi
nízká koncentrace vysoká koncentrace
templát DNA 0,01 ng-1000ng
(plazmid-genomová
DNA)
nízký výtěžek
nízká specifita nasedání
primerů
přítomnost inhibitorů PCR reakce- EDTA, heparin,
(PO4)3-
primer A 0,1-1µM nízký výtěžek nízká specifita nasedání
primerů primer B 0,1-1µM
DNA
polymerasa
0,01-0,05 U/µl nízký výtěžek nízká specifita
Mg2+ 1-5mM
(množství Mg2+ je
přímo úměrné
množství dNTP)
nízký výtěžek nízká přesnost DNA
polymerasy
stabilizace ds DNA –
neúplná renaturace – nižší
výtěžek
stabilizace nespecifické
vazby primerů-nespecifické
Reakční pufr 10mM Tris-HCl,
50mM KCl
pH<7 poškození
templátu
dNTP (dCTP,
dATP, dTTP,
dGTP)
200µM pro každý
nukleotid
vyšší přesnost chybné zařazení
Reakční směs (koncentrace)
Reakční cyklus (teplotní a časový profil)
proces T (°C) t cykly
Počáteční
denaturace
94-95°C 2-5min přerušení vodíkových vazeb (hlavně genomová DNA),
denaturovaná vlákna obsazena primery (nadbytek)
Denaturace 95°C 30s-1min
N=25
-30,
max.
40
teplota dle délky produktu, typu termocycleru, zkumavek
nízká teplota = při ochlazení renaturace
vysoká teplota = tepelné poškození templátu, hlavně u
delších produktů (chyby)
Annealing 50-65°C 1min optimální Ta (teplota annealingu) je blízká tzv. teplotě tání
primerů = teplota 50% disociace duplexu primer/templát
(různé vzorce, záleží na obsahu CG a TA)
oba primery by měly mít podobnou Ta – stejná specifita
nasedání
vysoká teplota = primer nenasedá
nízká teplota = primer nasedá nespecificky
teplota dle množství templátu: dostatek - 20-40s, málo –
déle (musí najít svůj úsek)
Elongace 72°C 45s-3min teplota optimální pro DNA polymerasu , teplota podle délky
fragmentu
Závěrečná
elongace
72°C 5-15 min dokončení nedosyntetizovaných řetězců
hybridizace komplementárních vláken
• Taq DNA polymerasa • termofilní bakterie Thermus aquaticus (nyní rekombinantně)
• aktivní při pokojové teplotě – nutnost pracovat na ledu
• při teplotách nad 90°C je inaktivní, ale při ochlazení se znovu aktivuje
• pouze 5´exonukleasová aktivita (degradace Okazakiho fr.),
nikoliv 3´exonukleasová aktivita (proofreading)
• 1 chyba na 10-20tisíc nukleotidů
• Další typy polymeras • Proofreading polymerasy (3´exonukleázová aktivita) = oprava
• reverzní transkripce (Mn2+) nebo polymerázová aktivita (Mg2+) v
závislosti na přítomných kofaktorech
• Hot start polymerasy = ovlivnění začátku reakce
• Platinum® Taq DNA Polymerasa
DNA polymerasy
Proofreading polymerasy
Tth Thermus thermophilus HB-8
Tma Thermotoga maritima
Deep VentTM Pyrococcus sp.
Tli Thermococcus litoralis
Pfu Pyrococcus furiosus
Pwo Pyrococcus woesei
„Hot-start PCR“
technika, která snižuje nespecifické amplifikace při přípravě mastermixu při pokojové teplotě
byly vyvinuty specializované enzymatické systémy, které inhibují polymerázovou aktivitu enzymu při pokojové teplotě vazbou protilátky
v přítomnosti kovalentně vázaných inhibitorů
odloučí až po zahřátí enzymu
Platinum® Taq DNA Polymerasa je rekombinantní Taq DNA polymerasa dodávána v komplexu s protilátkou, která inhibuje polymerázovou aktivitu při pokojové
teplotě. DNA polymeráza se aktivuje vysokou teplotou (při 94° C) v průběhu počáteční denaturace PCR
jakmile se polymeráza oddělí od inhibitoru znovu získá svou aktivitu v plném rozsahu
oligonukleotidy o délce 20-25 nukleotidů
bez intramolekulárních komplementárních sekvencí – tvorba
sekundárních struktur
vyrovnaný poměr GC a AT
3´ konce primerů - probíhá od nich syntéza
neměly by být vzájemně komplementární– tvorba a
amplifikace dimerů
na 3´konci by neměl být tymin (nízká specifita párování),
degenerace kodonu
na 3´konci by neměly být více jak dva G či C-vysoká stabilita
(3 vodíkové vazby)-nespecifické produkty (nasednutí i při
nekomplementaritě zbytku)
často na 3´konci tzv. GC svorka (zakončení GC)-zvýšení
účinnosti hybridizace k templátu
3´konec nutná komplementarita k templátu
5´ konce primerů – sekvence nemusí zcela odpovídat
vložení restrikčního místa, detekce mutace, různé značky
Primery
amplifikace ne zcela známé sekvence či sekvence s variabilními
pasážemi = degenerované primery
směs primerů lišící ve variabilním místě
zařazení inosinu (páruje se se všemi bazemi) či tyminu (nízká
specifita k A)
Primery
GAYTST GHGKAG
amplifikace genu
Primer, kterým začíná 5‘-konci řetězce genu a v průběhu PCR
se elonguje ve směru transkripce, se označuje jako kódující
= forward primer (5´primer , upstream primer). Vznikající
sekvence identická se sekvencí kodonového vlákna.
3´primer nasedá na 3´konec genu, nasedá na kodonové (+)
vlákno. Vznikající sekvence identická se sekvencí
antikodonového vlákna.
degenerované primery:
amplifikace ne zcela známé sekvence – na místo neznámého
nukleotidu zařazeno více možných variant = směs primerů lišící
se v dosazené bázi
celkový počet variant – vynásobení
počtu variant na jednotlivých pozicích
případně lze zařadit inosin
(páruje se se všemi bazemi) či tymin
(nízká specifita k A)
Mr - 1 2 3 4 +
1000bp
500bp
100bp
429bp
+
- Detekovaný vzorek*
- Nemodifikovaná plodina (negativní kontrola)
1 0,1% GM plodina
2 0,5% GM plodina
3 1% GM plodina
4 2% GM plodina
+ 5% GM plodina (pozitivní kontrola)
Sm
ěr D
NA
pro
du
ktů
Negativní a pozitivní kontroly se zařazují
z důvodu odhalení případné kontaminace či
technické chyby, která by mohla za konečné
zkreslení výsledků. Z důvodu jistoty u celého
průběhu se obě kontroly řadí mezi vzorky již
na počátku celého testu.
* Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements),
organizace Evropské komise EC JRC, http://www.irmm.jrc.be.
nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je
elektroforesa v agarosovém gelu
interkalační barvivo Ethidium bromid či SYBR Green I
Elektroforetická detekce Analýza délky vzniklých fragmentů
princip molekulového síta
koncentrace agarosy: princip molekulového síta velikost produktu se srovnává se standardem obsahujícím fragmenty DNA známé délky
Doporučená koncenrace agarosového gelu % agarose DNA size range (bp) 0.75 10.000 - 15.000 1.00 500 - 10.000 1.25 300 - 5000 1.5 200 - 4000 2.00 100 - 2500
2.5 50 - 1000
elektroforetická separace v polyakrylamidovém gelu na automatickém sekvenátoru
přesné zjištění délky fragmentů v genotypizační metodě AFLP alespoň jeden primer musí být značen fluorescenční značkou
Analýza PCR produktů
Analýza specifity fragmentu hybridizační analýza=hybridizace s fluorescenčně značenou
sondou DNA (shoda sekvencí)
Southern blot: přenos na membránu – hybridizace se značenou sondou DNA (část sekvence shodná s produktem)
přenos přímo (technika dot blot)=DNA čipy
štěpení restrikčními enzymy restrikční místo uprostřed sekvence
sekvenace PCR produktu přímo (vše se sekvenuje, v případě polymorfismu nejednoznačné)-
příprava jednovláknové DNA asymetrické PCR: různá koncentrace primerů (obvykle 50:1 až 100:1), po
15-20 cyklech dojde k vyčerpání - tvoří se pouze jednovláknový produkt z primeru o vyšší koncentraci
sekvence na tuhé fázi: primer značený biotinem + tuhá fáze pokrytá streptavidinem = navázání
po zaklonování (jednoznačné)
žádaný produkt lze též po elektroforéze „vyříznout“ a po přečištění sekvenovat
PCR produkt má svojí specifickou délku a sekvenci
Multiplex PCR
PCR s násobným množstvím párů primerů
Výhoda:
+ možnost analýzy více parametrů
Nevýhoda:
- zvýšení tvorby nespecifických produktů
- diskriminace delších DNA fragmentů
Příklad multiplex PCR
Detekční limit „duplex“ PCR s primery P35S 1-3´/ P35S 1-5´ a nosT 2-3´/ nosT 2-5´.
Dráha 1: nemodifikovaná sója, dráha 2: 0,1% RR sója, dráha 3: 0,25% RR sója,
dráha 4: 0,5% RR sója, dráha 5: 1% RR sója, dráha 6: 5% RR sója, Nt:
beztemplátová kontrola. Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost
produktů: 101 a 151 bp.
Mr Nt 1 2 3 4 5 6
500 bp 101 bp 151 bp
100 bp
Nested PCR
dvě po sobě následující amplifikační reakce
dva druhy oligonukleotidových primerů - vnitřní a vnější
templát první reakce - DNA extrahovaná z vyšetřovaného vzorku
templát druhé reakce - produkt získaný první amplifikací
+ zvýšení citlivosti
a přesnosti 1. PCR
2. PCR
vnější primery
DNA templát
cílový produkt 1. PCR
vnitřní primery
DNA templát
(cílový produkt 1. PCR)
Cílový produkt 2. PCR
Standardy a kontrola PCR procesu
vhodné zařazení pozitivní, negativní či beztemplátové kontroly PCR
procesu
- negativní kontrola - necílová DNA
Nt beztemplátová kontrola - sterilní voda
+ pozitivní kontrola - ověřená cílová sekvence
negativní nebo beztemplátové kontrola: ověření možné
kontaminace reagencií a používaných pomůcek
pozitivní kontrola: ověření funkčnosti všech kroků
vhodné zařazení beztemplátové kontroly celého procesu
analýzy vzorku, tzn. nejprve je podrobena izolačnímu procesu
společně s analyzovaným vzorkem (beztemplátová kontrola
izolačního procesu) a dále je podrobena všem PCR procesům
jako analyzovaný vzorek
• pro sledovaný MO vznikl jedinečný produkt
(komplementární primery), tzn. nevzniká stejný produkt pro
jiné MO
• detekce patogenních bakterií: nejčastěji identifikace genů
zodpovědných za projevy virulence.
• Listeria spp.: iap gen – při vhodně nastavené reakci tvoří
produkt jen bakterie rodu Listeria, druhová specifita určena
velikostí amplifikovaných produktů
• E. coli O157: rfb gen - pro O157 somatický antigen
stx1, stx2 - geny kódují produkci toxinů
eaeA gen (virulenční faktor intimin), hlyA
(enterohemolysin A)
PCR pro detekci a identifikaci MO
„Analytická“ PCR
Co hledám? Co chci zjistit? Přítomnost specifické sekvence, specifického genu
druhově specifická PCR (např. detekce patogenu – Campylobacter, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes apod.)
deteguji délku fragmentu, mohu ověřit restrikčním štěpením
více dvojic primerů – multiplex PCR
Detekce tet(O) – gen rezistence k
tetracyklinu v bakterii
Campylobacter
A-100bp marker, 1-4-kmeny
rezistentní k tetracyklinu
5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu
10-beztemplátová kontrola
1000bp 500bp
559bp
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nt
typizace a identifikace bakterií na úrovni kmenů: důležité parametry
při diagnostice i léčbě onemocnění a zároveň při monitorování
epidemiologie infekcí (např. zeměpisné rozšíření, zdroj nákazy,
hostitelská specifita, patogenita, virulence)
dva typizační systémy:
1. Fenotypizace Biochemické testy
2. Genotypizace: 1. metody založené na porovnávání získaných vzorů DNA fragmentů,
které využívají rozdílnosti ve velikosti fragmentů DNA získaných buď
amplifikací genomové části DNA nebo jejich štěpením specifickými
restrikčními endonukleasami, či kombinací obojího (např. AFLP,
RFLP, PFGE, Rep-PCR)
2. metody založené na sekvenci, kdy jsou bakteriální kmeny rozlišeny
na základě polymorfismů v DNA (např. SLST, MLST)
3. metody založené na hybridizaci DNA s próbami o známé sekvenci
Typizace MO
fenotypový typizační systém spočívá v určení bakteriálního fenotypu na
základě koloniální morfologie na různých růstových médiích, biochemických
testů, sérologie, citlivosti ke „killer“ toxinům, patogenitě a citlivosti k různým
druhům antibiotik apod. V některých případech však není fenotypová
typizace dostatečně účinná při určování blízce příbuzných bakteriálních
kmenů
genotypizace využívá rozlišení bakteriálních kmenů na základě zkoumání
jejich genetického materiálu a získaný genetický profil je unikátní (můžeme
jej přirovnat např. k otisku prstu, tzv. DNA fingerprint)
Typizace MO
analyzovat rozdíly mezi různými DNA v rámci druhu = genotypizace
(fingerprinting)
DNA fingerprinting náhodným primerem
štěpení DNA, připojení adaptérů, z kterých vedeno PCR
1200bp
1000bp
800bp
500bp
1517bp
500bp
750bp
1000bp
1500bp
2000bp
3000bp
4000bp
A 1 2 3 4 5 6 7 8 B 9 10 11 12 B
REP PCR
38bp dlouhý
úsek s 6
degenerovanými
pozicemi
(sekvencemi)
srovnání
vzniklých profilů
PFGE (pulsed – field gel electrophoresis) elektroforetická technika používaná při dělení velkých molekul DNA (10 kbp –
10 Mbp)
při klasické gelové elektroforese v konstantním elektrickém poli je možné
účinně dělit fragmenty DNA do velikosti zhruba 20 kbp, protože nad touto
hranicí fragmenty DNA vykazují stejnou pohyblivost a není možné je od sebe
rozlišit
aplikace střídavého elektrického pole ve třech různých směrech (posun vždy
o 120 °), umožňuje účinné rozdělení i velkých fragmentů DNA
principem této metody je opět štěpení genomové DNA restrikční
endonukleasou (tentokrát však lyse buněk a štěpení DNA probíhá in situ v
agarosových bločcích připravených smícháním bakteriální suspenze s
rozpuštěnou agarosou)
volena méně často štěpící RE, poskytující menší počet dlouhých fragmentů
rozdělením fragmentů pomocí PFGE a obarvením gelu (např. v roztoku
ethidiumbromidu) opět u jednotlivých kmenů získáme různé vzory bandů
(profilů), jež mezi sebou
velmi dobrá reprodukovatelnost a diskriminační schopnost = metoda
považována za tzv. zlatý standard v oblasti genotypizačních metod
Pulsní gelová elektroforesa
(Pulsed–field gel electrophoresis, PFGE)
• mohou být rozděleny molekuly 10 Mb v agarosovém gelu
• gel je vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v
časových intervalech periodicky mění
• DNA periodicky mění svůj směr migrace (nutná reorientace molekuly) díky
změnám orientace elektrického pole
CHEF
• contour-clamped homogenous electrical field
• úhel 120° nebo 106°, také 90°pro 200-300 kb
http://www.currentprotocols.com/protocol/mb0205b
Výhody a nevýhody PCR
Výhody
+ nízká mez detekce 0,001% až 0,5% GMO či jednotky cílového MO
+ možnost sériových analýz
+ možnost analýz několika parametrů v jedné reakci (multiplex PCR)
+ malé reakční objemy (nižší cena stanovení)
+ možnost analýz potravinářských surovin i technologicky
opracovaných potravin
Nevýhody - nemožnost kvantifikace pomocí klasické metody PCR
- některé sekvence podléhají patentovému zákonu (v běžné praxi
jsou nedostupné pro návrh primerů)
- poměrně vysoká cena základního vybavení
- malé reakční objemy (náročné na zkušenost experimentátora a
výběr vhodných podmínek reakce)
- neschopnost odlišit živé a mrtvé buňky MO
RNA v buňce
Chromosomal DNA Messenger RNA (mRNA) Ribosomes with ribosomal RNA
Bacterial
cell
multiple RNA copies for every one DNA
copy, depending on the state of the cell
Small RNAs
• Životnost mRNA v buňce je velmi nízká
• u bakterií 1 až 6 minut, kvasinky okolo 20 minut
• mRNA je v živé buňce neustále syntetizována a
degradována
mRNA cDNA amplifikace genu (PCR)
PCR kombinované s reverzní transkripcí
(RT-PCR, Reverse transcription PCR)
Reverzní transkripce
Použitelné pro izolaci genu z mRNA – např. eukaryotní
organismy, poté cDNA (nejsou v ní obsaženy introny)
reakce, která amplifikuje RNA namísto DNA
zejména mRNA: kontrola exprese, rozlišení živých a mrtvých buněk
počátečním krokem je izolace celkové RNA nebo mRNA z vzorku, pomocí nukleas jsou odstraněny zbytky DNA, následně je pomocí reverzní transkriptasy přepsána templátová mRNA do cDNA a ta je poté podrobena PCR
http://cmapspublic2.ihmc.us/rid=1KGLS64P4-151J1FG-16Y3/12.0-DNA%20RECOMBINANT%20TECHNOLOGY%20_suraya Literatura a použité zdroje
RT-PCR
LIVE BacLight™ Bacterial
Gram Stain Kit
LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial
Viability Kit
LIVE/DEAD® Reduced
Biohazard Cell Viability Kit
#1
LIVE/DEAD® Yeast Viability
Kit
Cíl Bakterie Kvasinky
Výsledek Živé G+ se barví zeleně a
živé G- se barví červeně
Odlišné zbarvení je založeno na propustnosti membrán. Živé buňky se barví hlavně
zeleně a mrvé buňky převážně červeně (proniknou
obě barviva)
Aktivní buněčné
vakuoly se barví
oranžově, živé i mrvé
buněčné stěny modře
Fluorescenční látky
SYTO® 9 SYTO® 9 SYTO® 10 FUN® 1
Hexidium iodid
Promidium iodid
Ethidium homodimer-2
Calcofluor White M2R
Standardní filtry
FITC FITC FITC FITC
Texas Red® Texas Red® Texas Red® DAPI
Ex/Em (nm) 480/500 480/500 484/505 488/560–610
480/625 536/617 535/624 365/440
Odlišení živých/mrtvých buňky - kity
http://lib.jiangnan.edu.cn/asm/254-Introduce.htm
Fluorescence - aplikace
Koncentrace a kvalita DNA
Převážně spektrofotometricky
[ng/ml]
A260/A280 ratio: indicates pollution proteins, in pure DNA is
1.8 to 2.0
A260/A230 ratio: less than 1.8 indicates the presence of
organic contaminants - (poly) phenols, thiocyanates,
carbohydrates, urea, etc., in a clean DNA is in the range 1.8-2.0
(-2, 2)
Horizontální agarosová elektroforesa
Lambda/HindIII marker
Detekce specifického genu
Detekce tet(O) – gen rezistence k
tetracyklinu v bakterii
Campylobacter
A-100bp marker, 1-4-kmeny
rezistentní k tetracyklinu
5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu
10-beztemplátová kontrola
1000bp 500bp
559bp
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nt
PCR detekce - reálný vzorek
účinnost izolace DNA z potravinové matrice
účinnost PCR detekce=citlivost (závislost signálu na výchozím
množství templátu)
DETEKČNÍ LIMIT!!!!
L. monocytogenes 1kb 103 104 105 106
1003 bp
593 bp
Primery
komplementární
k Listeria spp.
Primery komplementární
k Listeria monocytogenes
BAX® system Q7
validovaný systém pro
detekci potravinových
patogenů
komerční kit pro izolaci DNA
a PCR reakci
validované schéma zkoušky
(izolace DNA z malých
objemů po pomnožení)
detekce specifického
produktu pomocí křivky tání
(případně též Real-Time
PCR aplikace)
Salmonella
Listeria monocytogenes
Genus Listeria
Enterobacter sakazakii
E. coli O157:H7
Staphylococcus aureus Real-time
Campylobacter jejuni/coli/lariReal-time
Vibrio cholerae/
parahaemolyticus/vulnificus Real-time
Yeast and molds
http://www2.dupont.com/DuPont_Home/
en_US/index.html
BAX® system Q7
Provedení
Není nutné použít izolovanou DNA
Vzorek PCR Detekce a analýza Teplotní lyze Příprava vzorku
Lyofilizované reagencie (tableta)
DNA-Polymerase
Primery
Nukleotidy
Pufr
Barvička
Pozitivní kontrola: interní
Kmen Výsledek Analýza křivky tání
Izolát z masa -
E. coli
(CCM 3954) -
Avirulentní
EC 4787
O157:H7
(pasážovaná)
-
Avirulentní
EC 4787
O157:H7
+
T [°C]
T [°C]
T [°C]
T [°C]
Biočipy (microarrays nebo arrays)
kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu (např. sklo, plast nebo křemíkový čip)
až tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím
založeno na klasické technologii hybridizace DNA
imobilizované DNA fragmenty (sondy) mohou být kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy
DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně
NK bývají izolovány z buněk, RNA je převedena na cDNA nebo cRNA, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik
řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče, detekce je prováděna buď stříbrem, chemiluminiscenčně (pro DIG značku) nebo přímo fluorescenčně
Biočipy (microarrays nebo arrays)
Navázaný cílový fragment
Imobilizovaný DNA fragment
Pevný povrch
Počítačový model prost. uspořádání na DNA biočipu. Převzato z http://www.npaci.edu/online/v4.12/dnachip_nhor_clip.jpg.
Literatura a použité zdroje
Kvantifikace NK pomocí PCR
PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qPCR, angl. Real on Time PCR)
monitorování vznikajícího produktu v průběhu celého amplifikačního procesu
qRT PCR je nejpřesnější a nejvýhodnější v současné době dostupná kvantitativní metoda
vysoká pořizovací cena nástrojů
interkalační barviva - (např. SYBR green I, Ethidium bromid) = levnější
fluorescenčně značené sondy - přesnější
Prahový detekční cyklus CT (threshold cycle) – nejnižší
cyklus ve kterém hodnota fluorescence měřeného vzorku
vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí
CT
Amplifikační křivka
Vzorek 1: 106 kopií cílového úseku
vzorek 2: 105 kopií cílového úseku
vzorek 3: 104 kopií cílového úseku
vzorek 4: 103 kopií cílového úseku
vzorek 5: 102 kopií cílového úseku
zelená přímka znázorňuje mezní hodnotu pozadí
beztemplátová
kontrola
Ct Počet cyklů
Flu
ore
scen
cere
po
rtér
u(
Rn
)
Vzorek1 2 3 4 5
beztemplátová
kontrola
Ct Počet cyklů
Flu
ore
scen
cere
po
rtér
u(
Rn
)
Vzorek1 2 3 4 5
beztemplátová
kontrola
Ct Počet cyklů
Flu
ore
scen
cere
po
rtér
u(
Rn
)
beztemplátová
kontrola
Ct Počet cyklů
Flu
ore
scen
cere
po
rtér
u(
Rn
)
Vzorek1 2 3 4 5
PCR teoretická účinnost reakce - 100%
teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení
No=1 No=10
n 2 n̂ 1 10
1 2 2 20
2 4 4 40
3 8 8 80
4 16 16 160
5 32 32 320
6 64 64 640
7 128 128 1280
8 256 256 2560
9 512 512 5120
10 1024 1024 10240
15 32768 32768 327680
20 1048576 1048576 10485760
25 33554432 33554432 335544320
30 1073741824 1073741824 10737418240
35 34359738368 34359738368 3,43597E+11
40 1,09951E+12 1,09951E+12 1,09951E+13
N; N=N0*2 n̂
N = počet molekul
DNA v n-tém
reakčním cyklu
N0 = počet molekul
DNA v 0-tém
reakčním cyklu
(na začátku reakce)
n = počet cyklů
N = N0 (2)n
Skutečná amplifikační účinnost
reakce
N = N0 (1+E)n
N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu
N0= počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu
(na začátku reakce)
E = amplifikační účinnost reakce <0,1>
n = počet cyklů
SYBR Green I Systém
SYBR Green I (SG I) interkaluje do malého žlábku dsDNA
fluorescence SG I se po navázání do dsDNA zvýší až
1000-krát
delší amplikony = vyšší fluorescenční signál
detekce veškeré dsDNA = nižší specifičnost systému
nutnost pečlivého výběru reakčních podmínek
nutná analysa křivek tání
cenově dostupnější než detekce pomocí fluorescenčně
značených sond
SYBR Green I
upraveno dle www.biochem.roche.com/lightcycler
a) b) c)
a) prostředí reakce po teplotní denaturaci
b) nasednutí primerů a vazba barviva
c) prodlužování primerů
Křivka
tání
Nahoře: Křivky tání.
Dole: Záporná derivace
fluorescence dělená
derivací teploty
Kalibrační a disociační křivka
Fluorescenční rezonanční přenos
energie (FRET, angl. Fluorescence
Resonance Energy Transfer)
fluorofor je excitován pomocí vhodné vlnové délky
energie z „dárce“ (donoru) je přenesena na druhý fluorofor
(akceptor)
excitovaný akceptor emituje světlo s „vyšší“ vlnovou délkou
Zdroj
1
2
1< 2
Real on Time PCR
přesná, rychlá, univerzální metoda
vhodná pro sériové analýzy
vysoké pořizovací náklady
Digitální PCR (dPCR) Rozdělení analyzovaného vzorku do velkého počtu separátních reakčních
„komor“
Literatura a použité zdroje
http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013
Digitální PCR (dPCR)
dosažené pomocí 1) čipu (dynamické čipy (mikrofluidika), OpenArray®)
2) maličkých kapiček nanolitrové velikosti (ang. doplet)
teplotní protokol jako u klasického PCR
fluorescenční detekce umožněna použitím Taqman hydrolyzačních sond (end-point PCR, nárůst fluorescence)
kvantifikace je provedena odečtem fluorescence velkého počtu individuálních reakcí (komor) na konci amplifikační reakce
počítají se jednotlivé „komůrky“ + positivní (detekce fluorescence, tzn. obsahuje cílový úsek)
- negativní (nedetekuje se fluorescence, tzn. neobsahuje cílový úsek)
používá se statistické vyhodnocení pomocí Poissonovo rozdělení (zákon vzácných jevů)
počet cílových úseků průměrně připadající na jednu reakční komoru = - ln (1 – počet pozitivních komůrek/ celkový počet analyzovaných komůrek)
Digitální PCR (dPCR)
absolutní kvantifikace
přítomnost cílového úseku je měřena přímo (není potřeba porovnání
se standardní křivkou)
jednoduché porovnání výsledků získaných z jednotlivých PCR běhů
(dPCR počítá přímo cílové úseky, není ovlivněno různými použitými
přístroji, standardní křivkou či zkušenostmi experimentátora).
relativní kvantifikace provedena poměrem absolutních kvantifikací
dvou cílových úseků
vhodné i pro kvantifikaci nízké koncentrace cílového úseku ve
vysokém množství doprovodné nukleové kyseliny
citlivější než real on time PCR
Digitální PCR (dPCR)
Rozdělení vzorku do komůrek zmenšuje (odstraňuje?) efekt
přítomnosti inhibitorů amplifikační reakce. Vzorek, který by
nemusel být vhodný pro kvantifikaci pomocí qPCR může být
spolehlivě kvantifikován pomocí dPCR.
Sestavy (angl. Arrays)
1. Dynamické čipy pro genotypování a genovou expresi (Fluidigm
BioMarkTM)
2. OpenArray® Real-Time PCR Systém (Life Technologie, Applied
Biosystems)
• Droplet digital PCR (ddPCR)
1. Biorad QX100
Díly A-E představují sérii ředění
analyzovaného vzorku cDNA (1:1)
Díl F je negativní kontrola
Každý díl obsahuje 765 komůrek
(individuální PCR reakce)
Černá políčka – negativní signál
Červená políčka – pozitivní signál
(detekce fluorescence)
Sloupec označený „Estimated“:
odhad kopií cílového úseku určený
pomocí qPCR
Sloupec označený „Biomark“: odhad
kopií cílového úseku pomocí dPCR
Literatura a použité zdroje
http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013
OpenArray® Real-Time PCR Systém
• Kombinace OpenArray® Real-Time PCR Instrument a OpenArray® AccuFill™ Systém (Applied Biosystems – life technologies)
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/PCR/real-time-pcr/real-time-pcr-applications/digital-pcr.html, 13.1.2013.
Literatura a použité zdroje
Kapkový digitální systém PCR (ddPCR)
http://www.gene-quantification.de/digital-1.html, 28.04.2013 a
http://www.labdd.com/a/yixuejianyan/fenzishengwuxue/23106.html, 29.04.2013.
• Kapkový digitální systém PCR angl. Droplet digital PCR (ddPCR)
• vzorek a olej vytvoří emulzi • až 20000 kapiček („komůrek“) v analyzovaném vzorku
Literatura a použité zdroje
1. Přístroj 2. přístroj 3. přístroj „emulgátor“ PCR termální cycler angl. droplet reader
Ředění analyzovaného vzorku
Využití PCR v potravinářské
mikrobiologii analytické PCR
kvalitativní detekce a identifikace potravinových patogenů (rodově a druhově specifická PCR)
další studium jednotlivých kmenů
detekce specifických genů (např. genů pro rezistenci k antibiotikům)
detekce genových mutací
genotypizační metody
reverzní transkripce=studium exprese genů
kvantitativní PCR (Real on Time PCR a digfitální PCR
kvantitativní detekce potravinových patogenů
Normativní postupy zahrnující PCR
ČSN P CEN/TS
15790
Krmiva- Typizace PCR probiotických druhů Saccharomyces cerevisiae (kvasinky)
ČSN EN ISO
22174
Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu
mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Všeobecná ustanovení a definice
ČSN P CEN/TS
20836
Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu
mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Zkoušení výkonnosti termocyklérů
ČSN EN ISO
20837
Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR k průkazu a kvantifikaci mikroorganismů působících
onemocnění z potravin – požadavky na přípravu vzorku ke kvalitativnímu průkazu
ČSN EN ISO
20838
Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu
mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Požadavky k amplifikaci a průkazu
pro kvalitativní metody
ČSN EN ISO
22118
Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR k průkazu a kvantifikaci mikroorganismů působících
onemocnění z potravin – Charakteristiky metody
ČSN EN ISO
22119
Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR v reálném čase k průkazu mikroorganismů
působících onemocnění z potravin – Všeobecné požadavky a definice
ČSN P CEN/TS
15634-2
Potraviny - Detekce potravinových alergenů molekulárně biologickými metodami - Část
2: Celer (Apium graveolens) - Kvalitativní stanovení specifické sekvence DNA pomocí
PCR v reálném čase v tepelně opracovaných uzeninách
