Helle Järv

3. märts 2018

Eesti Bioanalüütikute Ühingu mikrobioloogia koolituspäev

SEENED KLIINILISES MATERJALIS-

MIKS JA KUIDAS UURIDA?

PATOGEENSED SEENED

bro

nh

/ tr

ahh

ea

karv

ad

koe

tükk

küü

ne

d

liikv

or

Liig

ese

-ve

de

lik

luu

üd

i

nah

k

röga

silm

asa

rvke

st

siin

us/

n

inaõ

õs

tup

eka

be

uri

in

veri

Aspergillusx x x x x x x x

Candidax x x x x x x x x x x x x

Cryptococcusx x x x x x x x x x

Dermatofüüdidx x x

FusariumX x x x x x x

MucormycosisX x x x x x

Kust me midagi otsime?

2

PATOGEENSED SEENED

• Materjali kogumise tehnika

• Materjali transport

• Söötmete valik

• Külvi tehnika

• Inkubeerimise temperatuur ja aeg, kaua külvi kasvatame

• Tulemuse interpreteerimine

Mis mõjutab uuringu edukust ja lõplikku vastust?

PATOGEENSED SEENED

Materjali transportb

ron

h/

trah

he

a

karv

ad

koe

tükk

küü

ne

d

liikv

or

Liig

ese

-ve

de

lik

luu

üd

i

nah

k

röga

silm

asa

rvke

st

siin

us/

nin

aõõ

s

tup

eka

be

uri

in

veri

Aeg ≤2h TT; >2 h 4◦C

≤72 hTT

≤15 min TT; >15min TT

≤72 hTT

≤2 h TT

≤2hTT

≤15 min TT; >15min TT

≤72 hTT

≤2h TT; >2 h 4◦C

≤15 min TT; >15min TT

≤2h TT; >2 h 4◦C

≤2h TT; >2 h 4◦C

≤2h TT; >2 h 4◦C

≤2 h

Tempera-tuur

TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT

Märkused

Väg

a st

abiil

ne

;kü

lmu

tam

ine

Väg

a st

abiil

ne

;kü

lmu

tam

ine

Mit

te k

un

agi

külm

uta

da

Väg

a st

abiil

ne

;kü

lmu

tam

ine

Soo

vitu

sed

sõ

ltu

vad

ver

ekü

lvi

süst

eem

ist

TT- toatemperatuur Manual of clinical microbiology 11th Ed, Vol 2. 2015 ASM Press

PATOGEENSED SEENED

Clinical Infectious Diseases 2013

PATOGEENSED SEENED

Silm

Kõrv

Alumised hingamisteed

PATOGEENSED SEENED

Haruldased patogeenid

PATOGEENSED SEENED

Clinical Infectious Diseases 2013

Verekülv

PATOGEENSED SEENED

Kolme tüüpi uuringumaterjalid

• Kehavedelikud ja eritised - üldjuhul seente avastamiseks

kontsentreerime

• Tampoonid transportsöötmes

• Meditsiinilised instrumendid, kunstmaterjalid jms, millel uurime biofilmi

PATOGEENSED SEENED

Patsiendile ja arstile muutub kõik lihtsamaks – vedelsöötmega külvisüsteem

Laborile muutub kõik lihtsamaks: kahte tüüpi uuringumaterjalid –

vedelsööde ja jm kehavedelikud ning biofilmi uuringud

Vedelsöötmega transportsüsteemi eelised

• Sobib täisautomaat mikrobioloogia laboritele

WASP -Walk Away Specimen Processor

• Sobib automaatsetele värvimis-mikroskopeerimis

süsteemidele

• Sobib patogeenide DNA sekveneerimiseks

• Molekulaarsed testid (PCR-põhised) patogeenide

määramiseks

• Sobib mikrobioloogiliseks kultuuriks

Kas asi mis kõlbab kõigeks ei kõlba äkki

mitte millekski?

Patogeensed seened ja vedelsööde ???

Fontana et al. How the liquid based media can change the workflow in the Microbiology Laboratories. Advances in Microbiology 2013, 3, 504-510.

VEDELSÖÖTMEGA TRANSPORTSÜSTEEMID

Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???

• Turul alates aastast 2008

• Uuringud seente suhtes puudusid kuni viimase ajani

Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???

VEDELSÖÖTMEGA TRANSPORTSÜSTEEMID

Tulemused

• ESwab on sobiv transportsüsteem patogeensete seentele

• Stabiilne vähemalt 48 h toatemperatuuril ja +4◦C

• Kliinilise materjaliga uuringud puuduvad

Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???

PATOGEENSED SEENED

Mikroskoopia

• Fluorestsents-mikroskoopia

+ KOH+optical brightner Calcofluor white v

Blankofluor™

• Faas-kontrast mikroskoopia

• Histoloogilised värvimismeetodid

PAS, H&E, Grocott

PATOGEENSED SEENED

Cryptococcus neoformans

• Kiiruuring nn. India ink v China ink + liikvor; visualiseerib seene polüsahhariidkapsli

• Calcoflour white

Mikroskoopia

PATOGEENSED SEENED

• Esmaskülv

Söötme valik sõltub külvatavast materjalist

Üldjuhul valitakse mittesteriilsete materjalide esmaskülviks antibiootikumiga sööde

Steriilsete materjalide korral ALATI kombineeritud antibiootikumita (1-2 söödet) ja antibiootikumiga sööde

Universaalne sööde: Saboraud dextrose agar

Dimorfsetele seentele sobib rohkem BHI (Brain Heart Infusion agar + sheep blood)

Söötme valik mikrobioloogiliseks külviks

PATOGEENSED SEENED

Selektiivne sööde: Chromagar Candida, Dermasel (Sabouraud agar + tsükloheksimiid), Mycosel (+Ph indikaator), õliga rikastatud SAB (lipofiilsetele Malassezia spp. pärmidele)

Selektiivne sööde on õigustatud esmaskülviks materjalidest, kust oodata mitut erinevat seeneliiki (uriin, ülemised hingamisteed – röga, siinus, kurk; tupekaabe); lihtsustab tunduvalt isoleerimist/identifitseerimist

Tsükloheksimiidiga söötmele ei tohi külvata materjale, millest otsitakse hallitusseeni.

Kasutatakse valdavalt ainult dermatofüütide selektiivseks kasvatamiseks

• Isoleerimine/identifitseerimine

Sööde valitakse vastavalt seenesugukonna v -perekonna ökoloogilisele nõudlusele – Maltextract agar, Potato dextrose agar, Corn meal agar, Oatmeal agar etc

Söötme valik mikrobioloogiliseks külviks

PATOGEENSED SEENED

• Petri tass vs suletud konteiner längagariga

Längagarit on soovitav kasutada kui potentsiaalselt võib tegu olla 3. ohuklassi patogeeniga

• Materjali külv nn. „bed side“ kui uuringumaterjali väga vähe (N: silma sarvkesta v klaaskeha uuring). Labor väljastab sobiva söötme raviasutusele ning selgitab inokuleerimise tehnikat

• Materjali töötlus enne külvi (segamine, tsentrifuugimine, sonikeerimine)

• Kirurgiliselt eemaldatud kunstmaterjalid, mida uuritakse seene-biofilmile: kraapida steriilsetes tingimustes materjali pinnalt uuringumaterjal mikroskoopiaks/külviks v „pesta“ läbi vedelsöötmega

• Külv seene avastamiseks – külvame võimalikult suures hulgas (100-200 μl söötmeplaadile) ja võimalikult kontsentreeritud materjali (liikvor, punktaat vms.)

• Külv seene hulga määramiseks – saame väga ligikaudse hinnangu, kas üldse on mõttekas

(NB! vedelsöötmega transportsüsteem)

Suundumus, et ei korreleeru v korreleerub nõrgalt olukorraga haiguskoldes ning pole vajalik; poolkvantitatiivne külvitehnika pigem erinevate liikide isoleerimise hõlbustamiseks

Külvi tehnika

PATOGEENSED SEENED

• Optimaalne temperatuur 30◦C

• Inkubeerimise aeg sõltub oodatavast patogeenist

Külvid Candida spp. avastamiseks – 72 h

Külve hinnatakse iga päev

Hallitusseente avastamiseks – 7 päeva

Külve hinnatakse iga päev

Dermatofüütide ja endeemsete dimorfsete seente avastamiseks – 3-6 nädalat

Külve hinnatakse iga 2-3 päeva järel esimesed 2 nädalat ning hiljem kord nädalas

Külvide inkubeerimise temperatuur ja aeg

PATOGEENSED SEENED

• Kõik seened samastada liigi tasemel (klassikaliste morfoloogiliste meetoditega, MALDI TOF, DNA sekveneerimine)

• Iga seen võib olla patogeen – kõik sõltub peremeesorganismist e patsiendist

• Kõik kliinilisest materjalist isoleeritud dermatofüüdid on patogeenid

• Kõiki teisi seeni kliinilises materjalis tuleb interpreteerida kooskõlas kliinilise leiuga;

hallitusseened pigem vastata kui mitte – raviarst uurib edasi…

• Meie teadmised patogeenidest täienevad iga päevaga

Külvide interpreteerimine

PATOGEENSED SEENED

Kuidas määrata seent? Vaata ja sa näed.

• Tee hea preparaat

• Kasuta binokulaarmikroskoopi

• Mõõda

PATOGEENSED SEENED

Diagnioosini jõudmine on meeskonnatöö

Seened on ilusad!

Emericella nidulans (Aspergillus nidulans)