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Mini-Curso Teórico e Prático: Detecção de Ovos de Helmintos em Hortaliças
Segurança Alimentar:
Ranqueamento/ Codex
Alimentarius
(Parte 1) Dra. Regina Maura Bueno Franco
Laboratório de Protozoologia
Depto. de Biologia Animal - I.B.
Universidade Estadual de Campinas
(E-mail: [email protected])
Mini-Curso: Parte 1
• 1. Qual impacto das Doenças Transmitidas por Alimentos?
• 2. Qual a relevância dos Parasitos?
• 3. Panorama de metodologias
• Detecção de Giardia em alfaces
(a experiencia da Unicamp)
• 4. Dificuldades ao detectar Parasitos em Alimentos.
Impacto das Doenças Veiculadas por Alimentos
Uma das principais vias de veiculação de agentes patogênicos ao ser
humano
(CDC, 2012)
Fonte: CDC, Division of Foodborne, Waterborne and Environmental Diseases. Atualizada: em 10/10/2012.
Doenças Veiculadas por Alimentos: Surtos Epidêmicos, EUA (2009-2010)
Nº de Surtos: 1.527
Fonte: Mahon, B. Foodborne Illness: a handy overview. (Medscape. Jan.24, 2011. Acesso: 16/11/2012); FoodNet 2012 DATA (www.cdc.gov). Acesso: 25/05/2013.
Quando considerando causas
de morte/ hospitalizações: 1° - Toxoplasma
gondii Nº de Casos/Doença: 29.444
Nº de Hospitalizações: 1.184
Mortes: 23
Doenças Veiculadas por Alimentos: Cenário nos EUA (2012) e 1998-2008**
Número de Casos**:
Infecções: 19.531 (273.120)
Hospitalizações: 4.563 (9.109)
Mortes: 68 (200)
•**Agentes virais, bacterianos, parasitários, toxinas, príons, etc. •CDC, 28/06/2013
Doenças Veiculadas por Alimentos: Surtos Epidêmicos, EUA (1973 - 2012)
Nº de Surtos: 29.429
Fonte:MMWR 62 (October, 2015); nº 54. Acesso em 28/08/2016.
Nº de Casos/Doença: 729.020
Doenças de Transmissão Alimentar (DTA): Surtos ocorridos de 2000 a 2015 no Brasil
03
Fonte dos Dados: SinamNet/SVS/MS. Acesso em: 13/05/2016.
11.241 surtos
07 surtos
Toxoplasma gondii
Doenças Transmitidas por Alimentos: Cenário Europeu (2011)
Nº de Surtos: 5.648
Fonte: EFSA Journal, 11(4):3129, 2013. Acesso: 25/05/2013.
Nº de Casos: 69.553
Nº de Hospitalizações: 7.125
Mortes: 93
Surtos de DTA – União Européia (2011): Principais Agentes Causadores
Agentes Número (%)
Salmonella 1501 26,6
Toxinas Bacterianas 730 12,9
Campylobacter 598 10,6
Infecções Virais 525 9,3
Escherichia coli,patog. 63 1,1
Outros Agentes* 113 2,0
Outros agentes bacterianos 47 0,8
Parasitos 31 0,5
Yersinia 17 0,3
Desconhecidos 2023 35,8
Total 5648 100
Fonte: EFSA Journal, 11(4) 3129, 2013; CDC atualizado em 28/06/13.
*Toxinas de cogumelos; biotoxinas marinhas
EUA (1998-2008):
Vírus: 45%
Bactérias: 45%
Agentes químicos ou toxinas: 9%
Parasitos: 1%
Total de Surtos: 7998
Com Etiologia Esclarecida: 5059
(63%)
Parasitos e Alimentos: Diferenças Biológicas
Parasitos diferem das bactérias transmitidas por alimentos, pois: Não se multiplicam fora do corpo do hospedeiro:
Exceção: Cryptosporidium
Não são susceptíveis à maioria dos antibióticos que matam as bactérias;
Apresentam formas de resistência (ovos, larvas, cistos e oocistos) resistentes à dessecação, desinfetantes como os derivados do cloro;
Protozoários causam infecção mesmo quando ingeridos pequeno número de cistos e oocistos.
Fonte: Newell DG. et al., Int. J. Food Microbiol., 139:S3-S15, 2010.
Critérios de Importância: Abordagem Multi-Critério (Codex Commitee on Food Hygiene, 2010)
Ranqueamento definido por: 1. Número de casos de DTA ao redor do mundo;
2. Distribuição global de infecções causadas por via alimentar;
3. Severidade (morbidade expressiva);
4. Taxa de fatalidade;
5. Potencial para aumento do número de casos de DTA;
6. Relevância do alimento ou agente parasitário no comércio internacional;
7. Impacto socioeconômico (importância em Saúde Pública).
Crítica: Não leva em consideração variações regionais.
Fonte: Robertson LJ . Et al., Trends in Parasitology, 29(3):101-103, 2013.
Ranqueamento dos Parasitos quanto às DTA: Uma perspectiva global
Posição Agente Parasitário Maiores Categorias de Alimentos Incriminados
1° Taenia solium Carne suína; vegetais frescos
2° Echinococcus granulosus Vegetais frescos
3° Echinococcus multilocularis Vegetais frescos
4° Toxoplasma gondii Carne suína, ovina, caprinos, bovina, de caça, vegetais frescos
5° Cryptosporidium spp. Vegetais, sucos de frutas, leite
6° Entamoeba histolytica Vegetais frescos
7° Trichinella spiralis Carne suína
8° Opisthorchiidae Peixes de água doce (metacercárias encistadas)
9° Ascaris spp. Vegetais frescos
10° Trypanosoma cruzi Suco de frutas
11° Giardia duodenalis Vegetais frescos
12° Fasciola spp. Vegetais frescos (solo encharcado)
13° Cyclospora cayetanensis Frutas silvestres; vegetais folhosos
14° Paragonimus spp. Crustáceos de água doce
Ranqueamento dos Parasitos quanto às DTA: Uma perspectiva global
13
Posição Agente Parasitário Maiores Categorias de Alimentos Incriminados
15° Trichuris trichiura vegetais
16° Trichinella spp. Carne de caça
17° Anisakidae Peixes marinhos, crustáceos e cefalópodes (polvos e lulas)
18° Balantidium coli Vegetais frescos
19° Taenia saginata Carne bovina
20° Toxocara spp. Vegetais frescos
21° Sarcocystis Carne bovina ou suína (dependendo da espécie)
22° Heterophyidae Peixes de água doce e salobra
23° Diphyllobothriidae Peixes marinhos e de água doce
24° Spirometra spp. Rãs, carne de cobras
Fonte: Multicriteria–based Ranking for Risk Management of Foodborne Parasites. 24/10/2012. http:www.fao.org/food/food-safety-quality/a-z-
index/foodborne-parasites/en/ te:
Ranqueamento dos Protozoários e Alimentos Relatados
Posição Protozoário Maiores Categorias de Alimentos Relatados
1° Toxoplasma gondii Carnes suínas, ovina, caprina, bovinos, leite, vegetais, mariscos
2° Cryptosporidium spp. Mariscos, vegetais, frutas cruas, leite, carnes bovinas, água mineral, água.
3° Entamoeba histolytica Frutas e vegetais
4° Trypanosoma cruzi Frutas; cana de açucar
5° Giardia duodenalis Mariscos, frutas, hortaliças, água
6° Cyclospora cayetanensis
Frutas silvestres, hortaliças
7° Balantidium coli água
8° Sarcocystis spp. Carne suína e bovina; vegetais (!?)
Fonte: Newell DG. et al. Foodborne diseases – The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge. Int. J. Food. Microbiol., 139: S3-S15, 2010.
Alimentos e Protozoários: Vias mais comuns de Contaminação
I Oficina de Parasitos em Alimentos,
Unicamp, 28 de maio de 2013
Esterco , fezes de animais;
esgoto
Irrigação com água
contaminada
Manipulação : produtores
rurais
Equipamentos e Utensílios
Contaminados
Água de lavagem contaminada
Contato com superfícies
contaminadas
Manipulação: no preparo
Manipulação dos Alimentos
Cozidos
Exposição a Vetores
Mecânicos
Água de diluição de fungicidas
RMB Franco/Unicamp
Detecção Laboratorial: Cryptosporidium em Alimentos (Europa) - Vegetais
Fonte: Robertson LJ; Chalmers RM. Trends in Parasitology, 29 (1):3-9; 2013.
Foto: Nilson Branco
1. Eluição dos Oocistos a partir da superfície dos Alimentos (glicina 1M; pH 5.5)
2. Concentração e Separação por IMS
3. Detecção por Reação de Imunofluorescencia Direta
Base do Método sendo considerado como “ISO” (International Organization for Standarzation) com 3 etapas, a saber:
Separação Imunomagnética: Anticorpos Magnetizados para Captura de Oo/Cistos
Incubação da Amostra com Microesferas
Magnetizadas
Purificação dos Complexos Cistos+Anticorpos de
Captura+Oocistos
Imã
Dissociação térmica ou ácida
Leitura ou PCR ou ambos
Detecção Laboratorial: Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis e T. gondii em Vegetais
Fonte: Lalonde & Gajadhar. Food and Waterborne Parasitology, v.2 Pag.8-14, 2016.
Foto: Nilson Branco
2. Água de lavagem dos vegetais: concentrada por centrifugação 2000 x g/15min.
3. 3 mL do sedimento: Flutuação com solução saturada de sacarose (sp. gr. 1,26)
4. Líquido flutuado recuperado: extração do DNA dos protozoários (inibidores: pectina, fenóis, etc)
35 ± 0,5 g de folhas: Lavadas com glicina (1M; pH 5,.5) em Agitador ou Stomacher.
Detection of Cryptosporidium oocysts on spinach plants utilizing an LSCM and
fluorescein-labeled monoclonal antibodies.
Macarisin D et al. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76:555-
559
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2. Investigação da Ocorrência de cistos de Giardia em hortaliças da Regional Agrícola de Campinas
• Levantamento Censitário de Unidades de Produção Agrícola (UPA) do “cinturão verde” de Campinas:
- 808 Unidades de Produção Agrícola;
- Área total: 39.267 hectares.
21
Ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em hortaliças da RMC.
• 15 UPAs sorteadas para inclusão no estudo (G.P.S.); características:
• 100% aplicavam adubação natural (“cama de frango”);
• 80% dos proprietários cursaram ensino médio;
• 100% irrigavam com sistema de aspersão convencional semi-portátil; 33% contavam com fossa séptica;
• 93% havia a presença de animais (aves e cães); coleta de lixo em 26%.
22
Delineamento do Estudo
• 1. Coleta de Hortaliças - 2 anos consecutivos, sendo:
• Meses de fevereiro, março, abril: sazonalidade de Cryptosporidium
• Junho, julho e agosto: estiagem e uso das águas de irrigação:
• Alface (Lactuca sativa L. – Fam. Asteraceae);
• Rúcula (Eruca sativa L. – Fam. Brassicaceae)
• 2. Análise Parasitológica das Águas de Irrigação:
• reservatórios e poços;
• Técnica de filtração em membranas (47 mm)
• 3. Questionário estruturado sobre condições sanitárias nas UPAs
Material e Método: Água de Irrigação
• Metodologia: Técnica de Filtração em Membranas (4L/min.), com membranas de ésteres mistos de celulose: 3 µm de porosidade nominal.
• Eluição dos organismos-alvo com Tween 80 (0,1%) a partir da superfície da membrana; centrifugo-concentração (1050 x g; 10 min.)
• Visualização com Anticorpos monoclonais anti-Cryptosporidium e anti-Giardia - Reação de Imunofluorescencia Direta.
24
Metodologia para Detecção de Cistos de Giardia em alface e rúcula
Solução de Tween 80 (0,1%) para Eluição:
Literatura:
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Ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em hortaliças da RMC: Resultados
• Analisadas 60 alfaces e 60 rúculas: - Cryptosporidium: não detectado;
- 1º e 3º períodos de colheita: 20 % e 13,3% das UPAs com alfaces contendo cistos.
- 2º e 4º períodos de colheita: ambos os protozoários não foram detectados.
-Densidade de parasitos: - 180 a 230 cistos/50 g de alface - 180 cistos/50 g de rúcula
- Método de Faust: não revelou a presença de parasitos nas hortaliças;
- Água de irrigação: não houve detecção dos protozoários nas 60 amostras examinadas.
I Oficina de Parasitos em Alimentos,
Unicamp, 28 de maio de 2013
Dificuldades nas Investigações de Surtos: Fatores Influenciadores
Tamanho do pellet;
Fluorescência residual de muitas das sujidades presentes no líquido de eluição dos vegetais;
Microscopia é demorada e trabalhosa
Organismos-like: necessidade de um microscopista bem treinado;
Longo período de incubação das protozooses (ex: Cryptosporidium – 7 dias): investigações retrospectivas
DESAFIOS: Parasitologia aplicada a Área de Alimentos
I Oficina de Parasitos em Alimentos,
Unicamp, 28 de maio de 2013
Dificuldades na Obtenção das
Amostras
Métodos de Detecção:
Necessidade de Padronização
Interferentes:
Composição da matriz
alimentar; sujidades
Ações em Saúde Pública
Diagnóstico Ambiental
Detecção dos Casos
Re-Valorização da Parasitologia
Avanços na Legislação
OBRIGADA!
• Agradecimentos aos meus Orientandos: • Nilson Branco (Mestre)
• Mirna Pereira (Doutora)
• Diego A. G. Leal (Doutorando)
• Maurício Durigan (Bolsista IC– CNPq; Doutorando)
• Romeu Cantusio Neto (Doutor)
I Oficina de Parasitos em Alimentos,
Unicamp, 28 de maio de 2013
Profa. Regina Maura Bueno Franco E-mail: [email protected]