Upload
vutuyen
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Selección de detectores en cromatografía de
líquido masas
Manuel Gayo
Responsable de Ventas Easy Choice
ACOPLAMIENTO DE DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASAS
Tiempo
Inte
nsi
dad
La identificación se basa en
• Tiempo de Retención
• Peso Molecular (nominal o “exacto”)
• Información Estructural
•MS/MSn : Relación específica entre Precursor y Fragmentos
(proporciona excelente información estructural)
Las Técnicas de Ionización API suelen proporcionar poca Fragmentación
[M-B] + [M+H]
+ [M-A]
+
A B
LC/MS proporciona :
Selectividad / Información Estructural
Full Scan CID MS/MS of m/z 359 using Ramped CID Voltage
136.8
146.7
160.7170.7 186.7196.7
212.8
222.8
236.9252.9
266.9
276.9
287.0
295.0
305.0
313.1
323.1
341.1
+MS/MS(359), 2.2-2.8min (#151-#171)
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
Full Scan CID MS/MS of m/z 359 using Ramped CID Voltage
136.8
146.7
160.7170.7 186.7196.7
212.8
222.8
236.9252.9
266.9
276.9
287.0
295.0
305.0
313.1
323.1
341.1
+MS/MS(359), 2.2-2.8min (#151-#171)
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 m/z
300 400 500 600 700 800 900 1000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
m/z-->
Abundance
603639
903
987
<- [M+NH ] 4
+
Triolein (C18:1,[cis]-9) MW 884.781 C57H104O6
Selectividad & M
Inform. Estructural
2.- Técnicas de ionización en LC/MS:
Aplicabilidad relativa de las técnicas de ionización
LC/MS
Pe
so
Mo
lec
ula
r
Polaridad del analito/
Solubilidad en Agua
API-
Electrospray
APCI 1000
100,000
10,000
no polar muy polar
GC/MS
API-Electrospray: • La técnica de ionización más suave.
• Ideal también para compuestos lábiles.
• Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.
• Válida para compuestos de baja-media a muy
alta polaridad que se puedan ionizar en solución.
• Mediante la formación de iones con múltiples
cargas, permite el análisis de compuestos de muy
elevado peso molecular.
APCI: • Válida para compuestos de baja a alta polaridad;
no se requiere que estén ionizados en solución.
• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad
y peso molecular intermedios.
• Técnica que complementa a API - Electrospray
para el análisis de analitos poco polares.
APPI: • Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad;
no requiere que estén ionizados en solución.
• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
• Posibilita el análisis de compuestos apolares.
Las interfases LC/MS tipo API (Electrospray
/APCI) son hoy en día las más utilizadas
APPI
Fuente de ionización API Electrospray
Zona
SEPARACION
IONES
Zona
NEBULIZACION
E IONIZACION
Zona
FOCALIZACION
Zona
DETECCION
Cámara de
Nebulización a
Presión
Atmosférica
Nebulizador HPLC
+ + +
+
+
+ + + +
N2
N2
+
+ + +
Capilar
Zona de
FRAGMENTACION
(CID)
“Skimmers”
Octopolo
Lentes Cuadrupolo
N2
Dínodo de Alta
Energía (HED)
Electromultiplicador
(EM)
+
Gas de
secado
ESI
Zonas
Diseño Ortogonal de la Fuente de Iones API – Electrospray
Evaporación Límite
Rayleig
Alcanzado
Explosión
Coulomb
Iónes Analito
Desolvatado Evaporación
+
-
+ +
-
+
+
+ + +
+
+
+ + + +
- - -
- -
- +
+ +
+
+ + + +
+ + +
- - -
- - - +
+ +
+
+ + + +
+ +
+ - - -
- - -
+
+ + + +
+ + +
- - -
- -
+ + +
+ +
+
- - - -
+ + + +
+ + - - - -
+ +
+ + +
+ - -
-
-
+ + + +
+
+ - -
-
-
+
+ + + +
+ - - - -
+
+ + + +
+ - - -
+
+
+ + +
+
+
+ + + +
- - -
- -
- + + + + + +
+ +
+ + +
- -
- - - + + +
+
+ + + +
+ + +
- - -
- - -
+
+
+ + +
+ - -
- -
+
Iones Desolvatados
+
Gas de secado
(nitrógeno calentado)
Entrada Capilar
Dieléctrico
Disolvente
Nebulizado
Gas de
Nebulización
(N2)
-4.500 V (End Plate)
en un angulo de 90º con La punta del nebulizador está
respecto a la entrada del
NEBULIZADOR ORTOGONAL
capilar
+
+
+ +
+
+ + + + + + + + + + + + + + + +
HPLC
p.e. Vcap: -5,000 V (típico -1500 -6000)
0 V (nebulizador conectado a tierra)
muy conveniente para CE/MS
Mesh Assembly: -3500 V (atraerá cargas + a la superficie
de la gota)
Ejemplo con
Polaridad +
Iones en solución
N2
SECADO
La presencia de sales no volátiles dificultara considerablemente la eficiencia del proceso de desolvatación
Para óptima sensibilidad los analitos deben estar totalmente ionizados al pH del eluyente
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
Proceso APCI (Ionización Química)
Proceso APPI (Fotoionización)
Capilar MS
Capilar
Entrada
HPLC Nebulizador
Vaporizador
(calentador)
hv
Gas de
Secado
+ + + + + + +
Lámpara
Kripton
Se fotoioniza a un Agente
Dopante y éste actúa como gas
reactivo
Vapor
Evaporación
Aerosol que contiene
al analito
Iones de
Analito +
+
+ +
+
+ + + +
+ +
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
Fotones
ionizan al
analito (con
P.I.<10eV) +
+ + +
+
+
+ +
+
+
hv
hv
APPI
Lámpara PhotoMate
Kripton emite e- de 10.0 eV y 10.6 eV
Potenciales de Ionización (PI)
• 2,4,6 – Trinitrotolueno 10.59 eV
• 4-Nitrotolueno 9.5 eV
• Cafeina 8.0 eV
• Fluoranteno 7.8 eV
• Antraceno 7.4 eV
Potenciales de Ionización de
Disolventes (PI)
• Agua 12.61 eV
• Acetonitrilo 12.19 eV
• Metanol 10.85 eV
• Acetona 9.70 eV
• Tolueno 8.82 eV
Valores de Energía de Fotoionización
S
i se
io
niz
an
N
o s
e io
niz
an
Energia lámpara Kripton 10.0 eV, 10.6 eV
Fuentes APCI y APPI para el LC/MSD
Capilar
Entrada
HPLC Nebulizador
Vaporizador
(calentador)
h
Gas de
Secado
+ + + + + +
+
Lámpara
UV
APPI APCI
Capilar
Entrada
HPLC Nebulizador
Vaporizador
(calentador)
Gas de
Secado
+ + + + + +
+
Aguja
Corona
Doble Fuente con detección SIMULTÁNEA (real)
ESI+APCI. Agilent Technologies
Violeta Cristal Vitamina D3
Fuente Multimodo
Fuente ESI Fuente APCI
Fuente Multimodo
Fuente ESI
Fuente APCI
Violeta Cristal
Vitamina D3
Capillary
HPLC inlet
Nebulizer
Drying gas
Corona needle
ESI Zone
APCI Zone
Thermal container
IR emitters
Charging electrode
Reversing electrode
Sensor for vapor temperature
APCI counterelectrode
En la zona ESI se crea un aerosol cargado cuya
dirección es ortogonal a la entrada del capilar MS
El aerosol es secado por lámparas de IR (no
contracorriente de N2) produciendo los iones ESI
El aerosol y los iones pasan con el gas de nebulización
de la zona ESI a la zona APCI
Las lámparas IR vaporizan de modo completo a analito y
disolvente en la zona APCI
APCI corona se produce entre la aguja y el
contraelectrodo y el disolvente se ioniza
El disolvente ionizado transfiere carga al analito
vaporizado produciendo iones de analito
Los iones ESI pasan al lado contrario del separador y
son apartados de la zona de APCI corona
Un sensor controla la temperatura del vapor de forma
que las lámparas IR mantienen la temperatura constante
Finalmente los iones ESI y APCI entran
simultáneamente al capilar y al MS (US patent 6,646,257)
Fuente Multimodo
2.- Técnicas de Filtrado de Masas y Detección en LC/MS:
Q?
QqQ?
TRAP? TOF?
Qq-TOF?
Sector Magnético?
TOF-TOF?
???
SI ¿Sabemos lo que
Buscamos?
Necesitamos
masa exacta MATRIZ SUCIA?
No
Menor de 5 pg En columna? QQQ
No
Necesitamos
Qualifiers
Ions/Spectrum?
Si-spectrum
or MS/MS qualifiers
Trampa
No
SI
No
o Multi ion SIM
CONCENTRACIÓN?
Bbaja concentración
QQQ
SI
No
>1 ng en columna
No
Aceptable %RSD: >8%
No
SI
Q
SI
Necesitamos MS/MS?
No
Q
SI Trampa
MUESTRA
.
SI
QQQ Q
TOF
$$$> $$> $
CUANTITATIVO CUALITATIVO
SI
TOF
TOF
¿PERO QUÉ DETECTOR?
Filtro de Masas
del Cuadrupolo
Fuente de Ionización Externa
Detector
Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas con Cuadrupolo
Emulación CUADRUPOLO
Resolución Espectral:
“baja”
Modelo Conceptual de Espectrómetros de Masas/Masas basados en Triple Cuadrupolos
Emulación CUADRUPOLO
Modalidad MRM
ideal para
Cuantificación de
Trazas de
“Compuestos Diana”
en matrices sucias
2 modalidades de trabajo:
- Product SCAN: “universal pero menos
sensible”. (Cinta en movimiento continuo). - SRM/MRM: muy sensible pero sólo
detecta unas pocas masas. (Cinta “fija”)
“MS/MS en el espacio”
Analizador de Masas
de Trampa de Iones
Paso 1 - Almacenamiento de Iones
Paso 2 - Eyección de los Iones
Ionización
Externa
• Iones de todas las m/z son almacenados
hasta el momento de la detección
Obtención Espectro
de MS1
Emulación TRAMPA
Resolución Espectral: “media”
Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas
con Trampa de Iones Externa
Modelo Conceptual de un Espectrómetro de Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)
Emulación TIEMPO DE VUELO
(TOF)
Tubo de vuelo del TOF:
Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones)
0 V
Analizador de Masas
de Tiempo de Vuelo (TOF)
Detección Iones
Ionización
Externa Campo Eléctrico
Pulsante
Resolución Espectral:
“alta”
Técnica “Pulsante”
1 amu
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Intens.
x106 807.00
807.50
807.92
808.60
[M+2H]2+
Δ=0.4
805 810 m/z
Comparación Resolución Espectral: TOF vs Trap & Quads
[M+4H]4+
100
323 324 325 326 327 328
20
40
60
80
324.85
325.10
325.36
m/z
Δ=0.25
Δ=0.26
1 amu
% A
bu
nd
ancia
Re
lativa
Tiempo de Vuelo (TOF)
[M+4H]4+
879.149
879.403 879.649
879.902
880.158
880.398
880.651
Δ=0.25
Iones con 4 cargas: Δm/z = 0.25
Δ=0.5
Iones con 2 cargas: Δm/z =0.5
Δ=0.5
[M+2H]2+
644 646 648 650 652
20
40
60
80
100 648.92
649.40
649.89
Δ=0.5
Resolución Espectral:
TOF > Trap > Q & QQQ
Trampa Iones (Trap) (modo máxima resolución)
Cuadrupolo (Q & QQQ)
1 amu
Analizador-Filtro de Masas: Cuadrupolo
ELECTRODOS NEGATIVOS
AMPLITUD AMPLITUD RF
-DC
-
0
+
( + ) FILTR0
MASAS
BAJAS
( -
) FI
LTR
O
MA
SA
S A
LTA
S
Los voltajes aplicados en ambos pares de
electrodos son iguales en magnitud pero de
signo opuesto. La magnitud del potencial
DC controla la masa seleccionada
ELECTRODOS POSITIVOS
- 0
+
AMPLITUD RF AMPLITUD +DC
FRECUENCIA RF
2 pares de electrodos Hiperbólicos
("rods") a los que se aplica una
componente de corriente alterna y
otra de continua de igual magnitud
pero de signo opuesto
20000
40000
60000
80000
100000
120000
MSD1 TIC, Scan
3.9
25
min 3 4 5 6 7
5000
10000
15000
20000
25000
30000
MSD2 TIC, SIM
2.9
55
3.1
56 6
.914
Adquisición SCAN “versus” SIM 25 pg de 3 sulfamidas (+250 pg de sulfaclorpiridazina) - CUADRUPOLO
Adquisición SCAN: • Proporciona información sobre
componentes inexperados de la
muestra, pero NO proporciona el
mismo nivel de sensibilidad que
el modo SIM
La pérdida de sensibilidad
en modo SIM, por dedicar el
50% del tiempo del ciclo a
adquirir en modo SCAN, es
solamente del 30% 25 pg 25 pg 25 pg
250 pg de compuesto INESPERADO
• La sensibilidad
mejorará en SCAN con la
reducción del rango de
masas seleccionado y en
SIM con la reducción del
nº de iones monitorizado Adquisición SIM:
Proporciona un nivel muy
elevado de sensibilidad, pero
NO da información sobre
componentes inesperados de
la muestra.
Menos Sensible en
modo Barrido que
las Trampas y QqTOF
parent ions enter
collision cell -
collide with
argon gas and
dissociate
Q1 is parked allowing
only parent ions
of a single m/z to pass
to the collision cell
Q3 is scanned
passing full
scan product
ion spectra to
the detector
ion guide
transports
+/- ions to Q1
+/- ions and
neutrals formed
in API source
API
Source
Detector
Triple Cuadrupolo: Barrido Completo MS/MS (MS2)
DIsociación (CID) en Celda Colisión
“MS/MS en el espacio”
Ideal para la Cuantificación
de Trazas de “Compuestos
Diana” en matrices sucias
(coeluciones)
Parent Ions Enter
Collision Cell -
Collide with
Ar Gas and
Dissociates
Q1 is Parked Allowing
Only Parent Ions
of a Single m/z to Pass
to the Collision Cell
Q3 is Parked Passing
Only Product Ions
of a Single m/z
to the Detector
Ion Guide
Transports
+/- Ions to Q1
+/- Ions and
Neutrals Formed
in API Source
API
Source
Detector
Triple Cuadrupolo (QqQ): ejemplo modalidad SRM (MRM sucesivos cambios en los iones producto seleccionados en Q3)
Energía de Fragmentación No Selectivaº
“MS/MS en el espacio”
MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con
Máxima Sensibilidad y Selectividad
170 210 250 290
210
222
268 280 165
190 210
210
150 170 190 210
210 158
191
160
158
190
191
sin “fondo químico”
Cuadrupolo “3” (Q3) Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión
Espectro con
iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)
Q1 sólo deja
pasar el ión
“precursor”
210 pass
Celda Colisión
rompe el ión
210 (y sus
productos)
Q3 monitoriza
sólo los
fragmentos 158 y
191 característicos
del ión 210 para
cuantificar y
cualificar con máx.
sensibilidad
Modo MRM
Modo SCAN
Iones de varios compuestos coeluyentes
Trampas de Iones: Obtención Espectro MSn
Espectro de Masasn
(n=1-11)
(C.I.D.: Disociación Inducida por
Colisión (con helio) del ión precursor)
1-Acumulación
+
3-Excitación 3
6-Detección 6
5-Acumulación
de Fragmentos
5
4-Fragmentación
He
4 2
He
1
2-Aislamiento
Ión
Precursor
Espectro
MSn MS/MSMS/…
La energía de
Fragmentación se aplica
selectivamente. Sólo la
recibe el Ión Precursor o
rango de iones que interese
fragmentar
En una Trampa el proceso de transmisión de Iones
de “Fuente a Detector” es un proceso discontinuo
Acumulación
Detección: MS1
385 352 241 187
MS MS2 MS3 MS4
Agilent 1100 LC/MSD-Trap
Diagrama3D de MS4 de un Péptido, M 384 g/mol
MS1
MS2 (385)
MS4 (385/352/241)
MS3 (385/352)
MS4 (385/352/241)
Fundamentos del TOF ó Tiempo de Vuelo (“Time-of-Flight”)
Acelerar con la misma energía a los iones procedentes de la fuente Los iones de distinta masa adquieran distintas velocidades y
lleguen al detector con distintos “tiempos de vuelo” (menor masa mayor velocidad)
E = - m v 2
2
1 v =
m 2E
t = Long.
m 2E
2(30000) =
1.0
50200
= 91 µsec
Fuente
Iones Zona libre de campo eléctrico.
Opcional: Reflectron (espejo de iones)
Detector
Tiempo 30 kV 0 V
Técnica pulsante con un intervalo típico de generación de pulsos de 100 µseg. (10.000 pulsos/s)
Tiempos Vuelo típicos (vuelo 2m): m/z - µseg.: 118 = 20µs. 622 = 46µs. 3000 =100µs.
Resoluciones en el rango de ppm’s requerirán la medición del tiempo de vuelo con una precisión mejor de 1 nanosegundo
Masa Exacta Requiere una Elevada Resolución Espectral
921.5 922.0 922.5 923.0 923.5 924.0 924.5 m/z, amu
0.00
1000.00
2000.00
3000.00
4000.00
5000.00
6000.00
7000.00
8000.00
9000.00
1.00e4
1.10e4
1.20e4
1.30e4
Inte
nsity
, counts
922.0092
923.0121
0.087
Resolución = M/ΔM
922/0.087 = 10.600
Resolución Espectral:
> 4.000 a masas bajas >10.000 a partir de masas medias
R=13.500
m/z 2722 2724
m/z 118 119 120
R=4.700
m/z = 922
m/z = 2.722
m/z = 118
La elevada resolución espectral proporcionada por los TOF’s
(superior a Trampas y Cuadrupolos) permitirá obtener “masa exacta”
mediante la adición en continuo de algunos compuestos como
referencia interna para m/z.
TOFs
La Importancia de disponer de “Masa Exacta” para “centrar” la búsqueda: Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el nº
de posibles composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestión.
• En moléculas pequeñas el poder determinar el peso molecular con la
tercera cifra decimal permite típicamente definir una fórmula empírica
inequívoca.
Exactitud Masa (u.m.a)
5.687
10
100
1000
1
0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001
176
386
882
1347
1672
5687
P.M.
882
176
386
1347
1672
Nº
Po
sib
les
Fó
rmu
las
Em
pír
ica
s
QUADs
RESUMEN: Ventajas del acoplamiento LCMS
• Operación robusta
• Identificación y confirmación
• Sensibilidad y Especificidad
• Facilidad de Uso
• Tecnología asequible
Si hubiera tenido un
LCMS hubiera sabido lo
que era esto antes de
tomármelo