Rippei Hayashi, Nono Takeuchi and Takuya Ueda

POR:Sara Manuela Ocampo RamírezPaola Andrea Parra Estrada

NLSNuclear Location Signal

Specific aminoacidic sequences

Nucleus Cytoplasm

Nuclear pore 1. Carrrier prontein2. Cytoplasmatic protein3. NLS4. Nuclear protein

1 23

44

IMPORTIN

Receptor and carrier proteins

Has two subunits

Importin- α Importin-β

Lewin´s cell

NRF- 2

GA-binding protein / E4 Transciption factor 1

Multimeric transcsiption factor

NRF-2α NRF-2β

NRF- 2

FUNCTION:Regulates lineage-specific genes,

cytosolic ribosomal proteins, genes that control cellular growth, regulates the

entire antioxidant system and mitochondria-related genes.

ACTIVATION:Regulated by nuclear transport upon

neural activation.

FUNCTION:Regulates lineage-specific genes,

cytosolic ribosomal proteins, genes that control cellular growth, regulates the

entire antioxidant system and mitochondria-related genes.

ACTIVATION:Regulated by nuclear transport upon

neural activation.

Cultivo de células y transfección

Resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas

de organismos multicelulares

Resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas

de organismos multicelulares

Introducción de DNA externo con un

vector de expresión.

Introducción de DNA externo con un

vector de expresión.

Construcciones de un plásmido

Formación de un DNA extracromosómico

independiente al DNA cromosómico

Formación de un DNA extracromosómico

independiente al DNA cromosómico

Fuente: google images

Inmunofluorescencia

Reacción antígeno-anticuerpo hecha visible por la incorporación de un

colorante fluorescente al anticuerpo. Exposición a luz ultravioleta.

Reacción antígeno-anticuerpo hecha visible por la incorporación de un

colorante fluorescente al anticuerpo. Exposición a luz ultravioleta.

Técnica de anticuerpos fluorescentes

Proteínas recombinantes

Proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería

genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza.

Proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería

genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza.

Ensayos in vitro de importación nuclear

Técnica para realizar un determinado experimento

en un tubo de ensayo, o generalmente en un

ambiente controlado fuera de un organismo vivo.

Técnica para realizar un determinado experimento

en un tubo de ensayo, o generalmente en un

ambiente controlado fuera de un organismo vivo.

Ensayos de unión de proteínas

Técnica usada para detectar interacción entre dos proteínas.

Activa un gen reportero o un factor de transcripción sobre la secuencia regulatoria

UAS (Upstream activating sequence), localizada al inicio del promotor.

Técnica usada para detectar interacción entre dos proteínas.

Activa un gen reportero o un factor de transcripción sobre la secuencia regulatoria

UAS (Upstream activating sequence), localizada al inicio del promotor.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS SEGÚN LA MOVILIDAD DE ÉSTAS

La separación puede realizarse

• En papel o en acetato de celulosa• Matriz porosa: gel• Disolución: libre

La separación obedece a la carga eléctrica y masa.

La separación obedece a la carga eléctrica y masa.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

Técnica de inmunoensayo de tipo heterogénea en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un

producto detectable como cambio de color o algún otro tipo

Tipo sándwichTipo sándwich

Tipo indirecto Tipo indirecto

Tipo competitivo Tipo competitivo

La importina-La importina-αα::ββ media media la importación nuclear la importación nuclear del complejo NRF-2del complejo NRF-2αβαβ

NúcleoNúcleo

NRF-2α

NRF-2α

NRF-2β

NRF-2β recluta a la NRF-2α. Dominios Ets pueden dirigir la NRF-2α al núcleo.

Hipótesis: Transporte de NRF-2 mediada por dominios Ets de NRF-2α y eficiencia aumentada por unión al NRF-2β

Importada al núcleo de manera eficiente.

Esto no facilitó significativamente la importación nuclear

Se formó un heterodímeroSe requieren para importación

nuclear

Dependían de esto para la importación nuclear, al igual que la importación del

complejo NRF-2α-GFP:NRF-2β

NRF-2β media importación nuclear de complejos NRF-2αβ

Ran Q69LForma mutante de Ran GTPasa

Disocia moléculas de carga de la importina-β-relacionada, por lo que estas median la importación nuclear.

Rch1-IBBRch1-IBB y una importina-α, se unen y enmascaran la importina-β. El dominio Rch1-IBB inhibió la importación del complejo nuclear.

Identificación Identificación del NLSs del del NLSs del NRF-2NRF-2αα y el y el

NRF-2NRF-2 β β

NRF-2α que normalmente es dependiente del NRF-2 β, in vivo fue localizada en el núcleo estando sola.

Lo anterior gracias a la mutante NRF-2 α Y409E, que no se une al NRF-2 β, todavía se puede mover

en el núcleo.

Inhibe la localización nucleas de NRF-2 α, lo que apoya la idea de que esta va al núcleo a través del dominio Ets.

La deleción del aminoácido 310, causó un aumento sorprendente en la localización citosólica

Se hizo localizar en el núcleo. Esenciales para la

función de la NLS

Representantes de cada subtipo de importina-αLa importina-β y Ran no pueden activar la importación nuclear en ausencia de la importina-α. Rch1, NPI-1, Qip1 activan la de NRF-2α-GFP:NRF-2β.

El complejo importina-α:β media importación nuclear

de la NRF-2αβ

Los carriles 1 y 4 A y el carril 1y2 B indican que la NRF-2α y la NRF-2β se unen a Rch-1: importinaβ facilitando

su importación nuclear respectivamente.

Los carriles 6 A y el carril 4 B indican que hay mutaciones en la importación nuclear de

NRF-2α y la NRF-2β si se utiliza una variedad de tipo salvaje.

Observación de la importación nuclear de NRF-2α y NRF-2β utilizando proteínas mutantes incapaces de unir Rch1-importina β.

Las mutaciones no inhibieron las interacciones del complejo NRF-2αβ.

RELACION DE LA IMPORTACION ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA

1 2 3 4

1. Interacción entre Rch1 y NRF-2B no se unen por si solas.

2. Utilización de Rch1 con IBB murado tiene mas afinidad por NRF-2B.

3. Utilización de Rch1 con una residuo mutado inhibe la unión del NRF-2B.

4. Unión eficiente entre Rch1 completo y NRF-2

•Do HJ, Song H, Yang HM, Kim DK, Kim NH, Kim JH, et al. Hu W, Philips AS, Kwok JC, Eisbacher M, Chong BH

Its appeared that the nuclear import of NRF-2α alone is not an efficient event in vivo as compared to that of the NRF-2αβ complex. It is unlikely that the residual of NRF-2α inhibits nuclear import, the deletion had no effect on its subcellularlocalization. Therefore, it is probable that the nuclear-localization capability of the NRF-2α Ets is not as strong as the NLS of NRF-2β.

•Desagree

Learned to develop ourselves with article both in English and in Spanish language.

Learned to relate what we saw in class what we learned in Article.

We put into practice the knowledge learned about reading the electrophoresis.

Learned the importance of being specific and clear in the study of items.

NFR-2

NRF-2α NRF-2β

ADN Dominio de ACT.

Dominio ETs NLSIMPORTINA α β

núcleoTransporta complejo proteína

Subunidad β Subunidad α

Prot. citosólicasGenes

ribosómicos

celular

•GONZÁLEZ RABANAL, José Manuel; CALVO PRIETO, Jesús; BARROS PUGA, Marta. Gestión de la función administrativa del servicio Gallego de salud. Vol 3. Editorial Mad, S.L. 2006. Pag 364.•GÓMEZ, Susana; GUTIERREZ, Maria Fernanda. La inmunología en el diagnóstico clínico. Primera edición. Centro editorial Javeriano. 1994. Pag 76.•MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 2. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2006. Pag 121-127; 148-155.