Upload
victor-george-siahaya
View
418
Download
31
Embed Size (px)
Citation preview
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
1/121
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
2/121
ii
SENYAWA ALAM
METABOLIT SEKUNDER
TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
3/121
iii
UU No 19 Tahun 2002 Tentang Hak Cipta
Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 21. Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi pencipta atau pemegang Hak
Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yangtimbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa
mengurangi pembatasan menurut peraturan perundang-undangan yangberlaku.
Hak Terkait Pasal 491. Pelaku memiliki hak eksklusif untuk memberikan izin atau melarang
pihak lain yang tanpa persetujuannya membuat, memperbanyak, ataumenyiarkan rekaman suara dan/atau gambar pertunjukannya.
Sanksi Pelanggaran Pasal 721. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan
sebagaimana dimaksud dalam pasal 2 ayat (1) atau pasal 49 ayat (2)dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu)bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000,00 (satu juta rupiah),atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda palingbanyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).
2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan,atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaranHak Cipta sebagaimana dimaksud dalam ayat (1), dipidana denganpidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyakRp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah)
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
4/121
iv
Azis Saifudin, Ph.D., Apt.
SENYAWA ALAM
METABOLIT SEKUNDER
TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
5/121
v
Katalog Dalam Terbitan (KDT)
SAIFUDIN, AzisSenyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik
Pemurnian/oleh Azis Saifudin.--Ed.1, Cet. 1--Yogyakarta:Deepublish, November 2014.
vii, 113 hlm.; 25 cm
ISBN 978-602-280-472-7
1. Senyawa I. Judul
546
Desain cover : Unggul Pebri HastantoPenata letak : Rizky Selvasari
Jl. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, SlemanJl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581
Telp/Faks: (0274) 4533427
Hotline: 0838-2316-8088
Website: www.deepublish.co.idE-mail: [email protected]
PENERBIT DEEPUBLISH
(Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA) Anggota IKAPI (076/DIY/2012)
Isi diluar tanggungjawab percetakan
Hak cipta dilindungi undang-undangDilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, ataumemperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini
tanpa izin tertulis dari Penerbit.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
6/121
vi
KATA PENGANTAR
Pembelajaran ilmu bahan obat alam atau farmakognosi diperguruan tinggi perlu dipikirkan ulang dan redidesain agar lebih
fundamental secara sains, integratif dengan ilmu terkait dan fleksibel
untuk membekali mahasiswa agar bisa berinteraksi dengan
penemuan terbaru dan berpikir lintas bidang/interdisipliner.
Sedangkan pelajaran fitokimia di farmasi yang selama ini terkesan
“berdiri sendiri” perlu dikembalikan ke induk aslinya yakni
farmakognosi. Dan farmakognosi dipertajam dengan kimia bahan
alam (natural product chemistry ). Buku ini menggunakan jembatanaspek kimia organik sebagai dasar dan bingkai pembahasan
farmakognosi. Di dalam buku ini dipaparkan teori dasar metabolit
sekunder, teknik isolasi dengan interface aspek farmakologi.
Beberapa konsiderasi akan inkonsistensi pola yang lazim dijumpai
pada pekerjaan metabolit ini juga dipaparkan, termasuk beberapa
problematika terkait kontroversi metabolit sekunder.
Semoga buku sederhana ini ikut memberikan bekal dan
menambah dasar keilmuan para mahasiswa yang kelak di masa
depan berpartisipasi mengelola kekayaan alam Indonesia. Penulisberharap buku sederhana ini bermanfaat kepada para peneliti,
mahasiswa tingkat sarjana atau pasca sarjana untuk mendukung riset
bidang senyawa alami, metabolit sekunder. Bagi penulis dan
keluarga semoga menjadi amal kebaikan.
Terima kasih saya ucapkan kepada para guru, senpai dan
kolega yang memberikan bimbingan dan sharing akademik maupun
kehidupan sosial.
Akhirnya terima kasih disampaikan kepada ibu dan bapakpenulis, istri tercinta Anggrek Sekar, wonderful kids Nabilah, Kiki,
dan Ubay yang memberikan inspirasi serta semangat.
Solo, 2014
Penulis
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
7/121
vii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ................................................................... vi
DAFTAR ISI .............................................................................. vii
BAB I PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN
MOLEKUL OBAT ........................................................... 1
BAB II BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN
METABOLIT SEKUNDER ............................................. 10
BAB III KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DANPEMILIHAN PELARUT .................................................35
BAB IV EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI .................39
BAB V BIOASSAY /UJI BIOAKTIFITAS/UJI
FARMAKOLOGI (BIOASSAY GUIDED
FRACTIONATION ) .....................................................69
BAB VI SKALING UP DAN DEREPLIKASI ..................................74
BAB VII EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEKPLAUSIBLE ...................................................................76
BAB VIII SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR (SANGAT
LARUT DALAM AIR ATAU METANOL) .......................78
BAB IX PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR .......84
BAB X ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA
METABOLIT SEKUNDER ............................................. 91
REFERENSI ............................................................................. 103
GLOSARIUM .......................................................................... 105
INDEKS ................................................................................... 110
BIODATA PENULIS .................................................................. 113
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
8/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 1
BAB I
PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN MOLEKUL OBAT
Target belajar: Pembaca memahami secara fundamental peran bahan
alam sebagai sumber molekul aktif farmakologis. Memahami posisi
farmakognosi dalam rumpun ilmu kefarmasian. Memahami peran
penting kimia organik sebagai jembatan memahami senyawa aktif
dari bahan alam.
Obat berdasarkan besar molekulnya dibagi menjadi dua yakni
mikromolekul dan makromolekul.
Gambar 1.1. Contoh kisah sukses molekul alam. Senyawa-senyawa
tersebut diresepkan di klinik. Molekul-molekul ini
dimurnikan dari tumbuhan dan mikroba tanpa
modifikasi apapun. Statin adalah golongan obat yang
memiliki share market terbesar di dunia.
N
N
O
OCH3
OH
H3CO
N
N
HO
OH
O
O
OCH3
O
NH
O
OO
O
O
O
O
O
HO
OH
OO
H
OH
Daunorubisin(anti kanker payudara)
Lovastatin /statin(anti kolesterol)
Artemisinin(anti malaria)
Vinblastin (anti leukemia) Taxol (anti berbagai kanker)
O OO
O
O
OH
OH
O
OH
H2N
OH
O
O
O
H H
O
H
HO
O
O
O
O
O
H
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
9/121
2 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Obat Mikromolekul
Berat molekul obat golongan ini antara 100-1000 Dalton.
Molekul kecil ini kebanyakan diformulasikan dalam bentuk tablet,
kapsul, salep, sirup, serbuk, dan sejenisnya yang sangat mudah
dijumpai di apotek atau toko obat. Mikromolekul diperoleh dengan
cara sintesis total atau parsial dan dengan cara pemurnian dari
tumbuhan, bakteri, jamur.
Obat yang dibuat dari mikromolekul selama proses ekstraksi
dari bahan alam atau sintesisnya memerlukan bantuan pelarut
organik yakni metanol, etanol (alkohol), kloroform, heksana, aseton,
dan etanol dan lain-lain. Lebih dari 90% lebih molekul jenis
ini tidak larut air.
Obat Makromolekul
Kebanyakan obat makromolekul berupa protein dan
polisakarida. Produk ini berbagai vaksin dan produk imunologi.
Berat molekul golongan ini mayoritas lebih dari 1000 Dalton dan
memiliki kelarutan dalam buffer air. Kebanyakan protein merupakan
produk bioteknologi yang dihasilkan dengan rekayasa genetika
dengan bantuan mikrobia. Demikian pula produk obat protein dan
vaksin ini disiapkan dan disimpan dalam buffer.
Makromolekul diperoleh dengan cara ekstraksi serum
binatang, fermentasi bakteri atau jamur. Sifat obat makromolekul
larut dalam air atau buffer.
Baik mikromolekul kebanyakan merupakan produk alam.
Sedangkan makromolekul dihasilkan dari proses fermentasi/
bioteknologi.
Sejak kehidupan manusia pertama Nabi Adam AS hingga detik
ini manusia memanfaatkan bahan alam untuk hidup. Untukmendukung kehidupan: kelahiran, pertumbuhan, makan, minum,
pakaian, papan, keindahan, seni, beragama, dan kematian manusia
tidak bisa terlepas dari bahan alam. Kesemua aspek kehidupan
tersebut manusia sangat tergantung dengan zat alami yang dihasilkan
oleh makhluk hidup lain. Dari sisi makhluk produsen, senyawa alami
ada yang digunakan sebagai zat esensial untuk hidup dan ada zat
yang sekedar untuk mendukung kehidupan. Zat esensial untuk hidup
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
10/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 3
digunakan untuk dasar-dasar kehidupan: tumbuh, berkembang, dan
bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupaan digunakan
sebagai zat pertahanan dari gangguan makhluk lain, menarik
(attractant ) makhluk lain, dan alelopat untuk mendominasi suatu
kawasan, menetralkan racun, dll.
Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia berupa
mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Secara famili
besar, metabolit primer dan metabolit sekunder adalah senyawa
organik.
Bahan alam dibedakan menjadi dua berdasarkan fungsi
terhadap makhluk hidup pembuatnya yakni:
1.
Metabolit primer2. Metabolit sekunder
Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh
makhluk tumbuhan, mikrobia atau hewan melewati proses
biosintesis yang digunakan untuk menunjang kehidupan namun tidak
vital (jika tidak ada tidak mati) sebagaimana gula, asam amino dan
asam lemak. Metabolit ini memiliki aktifitas farmakologi dan biologi.
Di bidang farmasi secara khusus, metabolit sekunder digunakan dan
dipelajari sebagai kandidat obat atau senyawa penuntun (leadcompound ) untuk melakukan optimasi agar diperoleh senyawa yang
lebih poten dengan toksisitas minimal (hit).
Metabolit Primer
Memiliki ciri:
Esensial untuk hidup: pertumbuhan normal, perkembangan dan
reproduksi. Berupa enzim fisiologis, menghasilkan energi misalnya
karbohidrat.
Terlibat langsung dalam fungsi fisiologis normal: protein dan
enzim
Terdapat di dalam organisme atau sel.
Dikenal dengan istilah metabolit sentral.
Berat molekul (BM) dari kecil dalam bentuk monomer hingga
sangat besar polimer ( > 1500 Dalton).
Contoh: glukosa, asam organik sederhana, asam lemak,
protein, hormon, enzim adalah metabolit primer.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
11/121
4 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Metabolit Sekunder
Memiliki ciri:
Tidak terlibat langsung dalam metabolism/kehidupan dasar:pertumbuhan, perkembangan dan reproduksi.
Tidak esensial, ketiadaan jangka pendek tidak berakibat
kematian. Ketiadaan jangka panjang mengakibatkan
kelemahan dalam pertahanan diri, survival, estetika, menarik
serangga.
Golongan metabolit sekunder distribusi hanya pada spesies
pada filogenetik /familia tertentu.
Seringkali berperan di dalam pertahanan terhadap musuh.
Senyawa organik dengan berat molekul 50-1500 Dalton.
Sehingga disebut mikro molekul.
Penggolongan utama: terpenoid, fenil propanoid, poliketida,
dan alkaloid adalah metabolit sekunder.
Pemanfaatan oleh manusia: untuk obat, parfum, aroma,
bumbu, bahan rekreasi dan relaksasi.
Mikroba dan tumbuhan baik darat maupun laut merupakan
salah satu sumber utama bahan obat. Berbagai obat penting yang
diresepkan di dalam terapi klinik seperti antibiotik, statin, vinkristin,
taksol didapatkan dengan pemurnian dari sumber alami yakni
mikroba dan tetumbuhan. Demikian halnya beberapa jenis-jenis
senyawa yang berpotensi sebagai agen promosi kesehatan seperti
katekin, genistein, flavonoid, stilebenoid, dan lain-lain juga diisolasi
dari bahan alam, baik dari mikroba, tumbuhan, jamur maupun
sarang serangga seperti propolis (sarang lebah) atau pun sarang
semut.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
12/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 5
Gambar 1.2. Dari 1355 obat yang digunakan di klinik pada rentangtahun 1981-2010, hanya 4.4% molekul alami langsung
sebagai obat dan 0.4% ekstrak, namun sekitar 48% obat-
obatan lain diperoleh dengan modifikasi molekul alami,
atau berupa vaksin. (Diadaptasi dari Newman et al , 2012
Journal of Natural Products).
Pada rentang tahun 1981-2010, 4.4% dari 1355 buah obat-
obatan yang beredar berasal dari pemurnian bahan alam dan 0.4%
ekstrak da 43% merupakan senyawa alami yang dimodifikasi
(Newman, Cragg, and Snader, 2012). Terkhusus pada area obat
kanker, 74% obat yang digunakan secara klinik berasal dari ekstraksi
senyawa alami atau modifikasi senyawa alami. Jika digabungkan
dengan senyawa tiruan (mimick ), vaksin, ekstrak maka kontribusi
bahan alam dalam penyediaan bahan obat lebih dari 50%. Dengan
demikian tampak sekali peran metabolit sekunder di dalam
penyediaan obat.
Perlu dicatat dengan baik-baik dan ditekankan di sini, bahwa
pemurnian molekul dari bahan alam bukanlah pekerjaan final danlangsung bisa digunakan obat akan tetapi masih dan perlu langkah
lain. Jadi hanya sekitar 5% senyawa yang dihasilkan ekstraksi
langsung bisa digunakan untuk obat, kebanyakan menemukan
senyawa model untuk disintesis atau dimodifikasi lebih lanjut.
Farmakognosi
Farmakognosi berasal dari kata Yunani Pharmakon (obat) dan
gnosis (pengetahuan), yakni pengetahuan tentang bahan obat. Secara
4.4%
22.1%
0.4%
14.9%
5.9%
52.4%
Molekul alam
Modifikasi molekul alam
Fitofarmaka
Peptida
Vaksin
Sintesis
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
13/121
6 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
khusus farmakognosi adalah salah satu rumpun ilmu farmasi yang
mempelajari sumber bahan obat yang berasal dari bahan alami
(tumbuhan, mikroba, sarang, mineral dan hewan). Jadi awal mula
farmakognosi mempelajari bahan mentah obat atau crude drug .
Di waktu lampu (….-1800 M) ketika ilmu kimia organik belum
berkembang farmakognosi berforkus melakukan identifikasi spesies
tanaman, klasifikasi taksonomi, mempelajari morfologi dan
penggunaan bahan-bahan alami untuk pengobatan penyakit.
Tonggak sejarah farmakognosi modern dimulai dengan pemurnian
molekul tunggal dari tanaman.
Gambar 1.2 Morfin senyawa organik pertama dimurnikan oleh Fredrick
Serturner (Merck GmBH) dari kuncup bunga Papversomniverum . Hingga hari ini masih digunakan di klinik
untuk analgetik umum.
Kelahiran farmakognosi modern (farmakognosi kimiawi)
dimulai dengan pemurnian molekul morfin (analgetik) oleh Friedrich
Sertuner pada tahun 1804 dari kuncup bunga (poppy ) Papaver
somniverum dan dikomersialkan oleh pabrik farmasi Jerman, Merck.
Selanjutnya isolasi morfin itu memberikan ide ilmuwan modern lainuntuk melakukan pekerjaan pemurnian molekul-molekul lain dari
bahan alam yang mungkin digunakan untuk obat seperti:
Striknin (pestisida hewan
kecil) Nikotin (stimulant)
Kuinin (anti malaria kuno) Atropin (relaksan otot polos)
Kafein (stimulant) dan Kokain (stimulan penekan
lapar, halusinogen)
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
14/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 7
Dengan ribuan spesies hayati tumbuhan tingkat tinggi,
mikroba, jamur, bakteri adalah sumber molekul-molekul penting
untuk kehidupan manusia dan lingkungan. Dengan ditemukan
metode kromatografi dan spektroskopi, farmakognosi memulai
babak baru yakni fokus dengan aspek pemurnian senyawa organik
tunggal. Jadi dalam farmakogos modern, kimiawi organik bukan
sekedar aspek lagi melainkan menjadi paradigma farmakognosi
modern. ScFinder, suatu portal kimia, ratusan ribu senyawa telah
ditemukan hingga kini dan ratusan senyawa baru ditemukan setiap
tahun. Senyawa tersebut diteliti dan dipelajari sebagai kandidat obat.
Jadi di dalam farmasi modern metabolit sekunder merupakan
sumber molekul obat. Pada kimia medisinal, metabolit sekundertersebut dipelajari dan diteliti untuk digunakan sebagai kandidat obat
modern. Di tingkat perguruan tinggi dan pasca sarjana metabolit
sekunder dijadikan sebagai obyek pembelajaran secara khusus karena
beberapa pertimbangan:
1. Aspek farmakologi: keanekaragaman struktur kimia metabolit
sekunder yang tinggi mengindikasikan potensi keragaman efek
farmakologinya dan merupakan sumber kandidat senyawa
obat yang tidak terbatas.
2. Stabilitas: molekul kecil memiliki stabilitas lebih tinggi
dibandingkan makromolekul. Makromolekul baik polisakarida
maupun protein rawan terhadap berbagai reaksi perusak.
Misalnya hidrolisis yang menyebabkan struktur pecah.
3. Aspek kimia medisinal dan teknologi pemisahan: senyawa
metabolit sekunder cenderung bersifat semipolar sehingga lebih
mudah berinteraksi atau melewati barrier/jaringan biologis.
Kimia medisinal secara praksis membangun paradigma berpikir
kompromis antara struktur senyawa obat dan aktifitasfarmakologis, pertimbangan polaritas obat terhadap
kemampuan menembus barrier jaringan dan sel. Dalam
prakteknya, aspek teknologi pemisahan juga menjadi unsur
penting kimia medisinal. Senyawa yang bersifat semi polar
lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan dengan teknologi
kromatografi yang dikembangkan saat ini (silika, ODS,
sephadex).
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
15/121
8 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
4. Aspek farmasetik dan teknologi farmasi: berat molekul yang
kecil memungkinkan takaran dosis yang kecil dan lebih bisa
diterima (acceptable) untuk manusia dan hewan. Berat
molekul kecil lebih fleksibel terkait bentuk sediaan yang akan
diformulasi obat (tablet, kapsul, powder, injeksi), lebih
kompromis dan harmonis dengan pilihan bahan
pengisi/pembantu. Aspek teknologi farmasi: konsekuensi dari
poin 3, bobot molekul yang kecil lebih mudah, efisien dan
ekonomis dalam proses produksi di industri farmasi. Begitu
juga terkait dengan wadah dan pengepak juga lebih
ekonomis.
5.
Aspek struktur: struktur senyawa aktif farmakologis seringkaliberstruktur kompleks dengan cukup banyak kiralitas (orientasi
letak gugus dalam 3 dimensi). Metode sintesis seringkali
menghasilkan campuran rasemis dan memiliki tahapan panjang
dilakukan untuk menghasilkan senyawa berstruktur kompleks.
Sehingga ekstraksi dan pemurnian masih merupakan jalan
paling ekonomis dan efisien terkhusus untuk senyawa
berstruktur rumit tersebut.
Pertanyaan
1. Apa keuntungan metabolit sekunder jika digunakan sebagai
bahan baku obat dibandingkan dengan molekul-molekul
besar?
2. Bandingkan sifat metabolit sekunder pula terhadap senyawa-
senyawa yang sangat mudah larut air? dapatkan Anda
memikirkan kelemahannya?
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
16/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 9
Gambar 1.4 diagram Kedudukan farmakognosi di dalam eksplorasimaterial aktif.
Standardisasi dan kontrolkualitas (kimia analisis)
Ekstrak aktif, gubal,
crude drug
Farmakognosi
Farmasetika
Tumbuhan, bakteri, jamur,dan hewan
Farmakologi
Tablet, serbuk, kaplet, sirup dll
Molekul
Molekul semi
alami
Molekul
Sintesis
Kimia Organik (termasuk
Fitokimia)
Kimia medisinal
Kimia sintesis
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
17/121
10 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
BAB II
BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN METABOLIT
SEKUNDER
Target Pembelajaran: Pembaca ditargetkan mampu membedakan
golongan terpenoid, poliketida, fenil propanoid, alkaloid atau
campuran berdasarkan kerangka kimia yang diberikan. Mampu
menyebutkan jalur biosintesis dan tahapan umum di dalam jalur
biosintesis terpenoid, poliketida dan fenil propanoid. Sedangkan
metode klasik dengan reagen tertentu bersifat dekstruktif sehingga
sudah mulai ditinggalkan. Untuk pembaca tingkat master
diharapkan mampu memperkirakan golongan metabolit sekunder
berdasarkan clue spektra NMR).
Jika manusia dibekali akal budi dan gerak pindah koordinasi
tubuh, makhluk hidup selain manusia dibekali oleh Allah SWT untuk
menghasilkan senyawa metabolit sebagai “alat” untuk survival
mendukung kehidupan mereka. Misal alkaloid sebagai senyawa
pertahanan dari musuh dan hama, flavonoid senyawa penghias,
senyawa pewarna, terpenoid sebagai atraktan atau penarik, atau
polifenol dalam rangka menetralkan senyawa beracun.
Kenyataannya manusia manusia juga menghasilkan metabolit
kategori alkaloid. Berbagai neurotransmitter adalah alkaloid. Tanpa
alkaloid endogen hidup manusia cacat dan tidak sempurna.
Pembahasan khusus ada di golongan alkaloid.
Sifat-sifat kimiawi metabolit sekunder tersebut umumnya
memiliki berat molekul yang kecil (antara 50-1500 Dalton),
umumnya tidak larut air karena bersifat semi polar, dan strukturkimianya sangat beragam, jika saling bersenyawa jarang membentuk
molekul besar.
Gambar 2.1 Glukosinolat salah satu senyawa untuk senjata pertahanan
tumbuhan dari serangan virus, bakteri dan jamur.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
18/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 11
Selain melakukan biosintesis sekunder, makhluk hidup
melakukan biosintesis primer sebagai proses kimiawi vital untuk
dasar untuk melakukan aktifitas hidup. Biosintesis ini dilakukan untuk
menghasilkan senyawa-senyawa esensial dan dasar reaksi-reaksi
kehidupan misalnya gula (karbohidrat) untuk menghasilkan energi,
asam amino untuk membangun jaringan dan biokatalis, asam lemak
untuk membangun dinding sel dan cadangan energi. Tanpa
metabolit primer ini dasar-dasar hayati tidak ada dan metabolit
sekunder juga tidak bisa diproduksi.
Metabolit primer terdiri dari 3 golongan utama yakni
karbohidrat, protein dan lemak. Glukosa esensial untuk
menghasilkan energi, asam amino vital untuk menghasilkan berbagaihormon dan neuro transmitter, lemak untuk membangun jaringan.
Setiap metabolit primer ini akan bersenyawa membentuk polimer
atau ikatan yang lebih kompleks membentuk jaringan tubuh.
Jaringan otot tersusun dari pensenyawaan kompleks protein, dinding
sel tumbuhan atau cangkang binatang dibentuk dari persenyawaan
antar karbohidrat, jaringan lemak disusun oleh persenyawaan lemak.
Antar metabolit primer ini juga akan saling membentuk
persenyawaan dalam membangun sel-sel dan jaringan kemudian
organ.
Adapun sifat-sifat kimiawi metabolit primer, memiliki berat
molekul kecil mulai dari 80-300 Dalton/amu, larut dalam air (gula
dan asam amino) atau tidak larut air misalnya asam lemak, jika saling
berikatan membentuk senyawa dengan berat molekul sangat besar
(BM >1000-100.000 d). Secara farmakologis, senyawa metabolit
sekunder memiiliki berbagai aktifitas biologis: anti bakteri, anti
infeksi, anti kolesterol, anti kanker, anti diabetes dll.
Pertanyaan: apakah hubungan antara metabolit sekunder denganmetabolit primer ?
Gambar 2.2 Glukosa, adalah metabolit primer untuk bahan energi
kehidupan dan darinya berbagai metabolit sekunder juga
berasal.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
19/121
12 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Karena metabolit sekunder berjumlah jutaan di alam dan akan
terus ditemukan ratusan senyawa baru setiap tahun maka tidak
mungkin seseorang bisa menghafalnya, walaupun setiap golongan
struktur. Diperlukan frame work dan metode berpikir yang mampu
mencakup garis besar metabolit sekunder. Untuk itu pemahaman
dasar-dasar biosintesis diperlukan.
Tujuan memahami biosintesis metabolit sekuder:
1. Senyawa di alam berjumlah jutaan dan tidak mungkin dihafal.
Setiap tahun ditemukan ratusan senyawa baru. Bahkan antar
senyawa satu sama lain membentuk senyawa yang lebih
kompleks. Biosintesis digunakan untuk membangun paradigma
berpikir dan meringkas keterhubungan antar senyawa.2. Keteraturan pola struktur. Dengan memahami kerangka dan
jalur asal biosintesis suatu golongan senyawa bisa digunakan
untuk membantu menentukan struktur kimia. Inti kerangka
senyawa-senyawa metabolit sekunder memiliki keteraturan
pola dan memiliki bentuk yang seragam di dalam keragaman
sehingga penentuan struktur (elusidasi struktur) cukup terbantu
dengan pemahaman kerangka biosintesis.
3. Desain obat modern. Dengan memahami jalur biosintesis dan
mekanisme penyakit dimungkinkan desain obat (sintesis obat
dan QSAR (Quantitative-Structure Activity Relationship) atau
HKSA (Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas)) berdasarkan
pola interaksi penyakit dan target obat yang lebih selektif.
4. Aspek selektifitas. Terkait kondisi patologis (biokimiawi
penyakit), biosintesis terkait dengan berbagai mekanisme
penyakit dan pengobatan. Dengan memahami mekanisme dan
jalur biosintesis pembentukan senyawa penyebab penyakit
maka dimungkinkan memilih target, mengeblok ataumeminimalkan senyawa biologis penyebab penyakit. Misalnya
menurunkan jumlah kolesterol, merusakkan kapsul dari virus,
mengeblok protein penyebab diabetes, meminimalkan
pembentukan NO (nitrit) pada penyakit jantung atau
menyebabkan jejas kerusakan jaringan. Berbagai penyakit
masih menjadi misteri dan kini jalur biosintesis, pathway/ dan
jalur komunikasi sel menjadi topik penting di bidang
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
20/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 13
kedokteran dan pengobatan karena biosintesis seringkali terkait
dengan pembentukan agen degeneratif di dalam tubuh.
5. Aplikasi bioteknologi untuk produksi. Dengan diketahuinya
jalur biosintesis senyawa tertentu, melalui bioteknologi
kuantitas produk senyawa bermanfaat seperti obat yang
dihasilkan bisa dinaikkan. Jika senyawa kimia hanya bisa
dihasilkan dalam jumlah amat kecil misal taksol atau vinkristin
maka produksinya bisa ditingkatkan melalui potensi rekayasa
genetika atau manipulasi media fermentasi.
Berbagai mekanisme penyakit dan target obat baru ditemukan
dengan biosintesis, misalnya target biosintesis kolesterol, target enzim
pengganggu insulin, target penggangu asetil kolin pada Alzhaemer’s .
Ilmu biosintesis bukanlah ilmu yang mati dan statis namun berbagai
misteri besar kehidupan ada di dalamnya dan akan terus
berkembang dan ditemukan terutama di dunia biologi/kedokteran.
Untuk memahami dasar biosintesis metabolit sekunder maka
terlebih dahulu diperlukan beberapa istilah kunci:
1. Starting material: adalah senyawa sederhana yang biasanya
cukup stabil secara kimiawi dan menjadi bahan baku biosintesis
misalnya asam laktat glukosa, fruktosa, dan senyawa gula lain.2. Prekursor: adalah senyawa yang terbentuk dari starting
material namun bukan produk akhir, seringkali prekursor ini
ditambahkan dari luar untuk meningkatkan produk. Prekursor
kebanyakan merupakan asam amino.
3. Biokatalis: sebagaimana pengertian katalis pada umumnya
namun katalis di dalam biosintesis secara khusus adalah enzim-
enzim pembantu reaksi.
4. Jalur biosintesis atau pathway: adalah rangkaian tahapan reaksi
perubahan starting material menjadi metabolit.
5. Produk: senyawa terakhir yang dihasilkan, yakni senyawa
senyawa poliketida (C2), terpenoid (C5), senyawa fenil
propanoid (C9) sebagai kerangka utama, senyawa alkaloid,
dan senyawa campuran.
Metabolit sekunder berasal dari biosintesis primer. Umumnya
starting material paling awal adalah senyawa metabolit primer
sederhana dan stabil secara kimia dan fisika, yakni gula.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
21/121
14 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Penelitian biosintesis di dalam laboratorium:
Media hidup yang digunakan adalah kultur sel tumbuhan, kultur
jamur, kultur bakteri atau tumbuhan utuh.
Gambar 2.3 Alur biosintesis metabolit sekunder. Starting mula-mula
adalah air dan CO2 (fotosintesis) yang menunjukkan bahwafotosintesis adalah proses biokimiawi dasar yang mendasari
kehidupan. Dari fakta ini tampak sekali bahwa air adalah
starting material mula-mula semua makhluk hidup.
Dengan demikian berdasarkan jalur biosintesis, metabolit
sekunder digolongkan menjadi:
Glukosa
Asam mevalonat C5)
Asetil-CoA C2)
Turunan poliketida
Berbagai asam amino
alifatik
Dioksiselulosa C5)
Asam
Sikimat
Turunan asetat
Benzoik dan
fenolik C7)
FOTOSINTESIS
L-fenilalanin,tirosin, triptofan
C9)
Eritrose 4-P
H
2
O +
CO
2
O
2
+
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
22/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 15
1. Golongan asetat (C2): poliketida dan asam lemak.
2. Golongan mevalonat dan deoksisilulosa (C5): terpenoid
3. Golongan sikimat: fenil matanoid (C7) dan fenil propanoid
(C9)
4. Golongan alkaloid
5. Golongan campuran: kombinasi antar metabolit sekunder atau
metabolit sekunder dengan metabolit primer.
Golongan senyawa poliketida dan asam lemak C2)
Gambar 2.4 Tetrasiklin adalah antibiotik dihasilkan oleh biosintesis
asetat. Di tahap akhir mengalami aminasi
Senyawa C2 digolongkan menjadi 2 yakni golongan poliketida
dan turunan asam lemak. Asam asetat adalah building block dan
kerangka dasar golongan ini. Sehingga jumlah karbon golongan
metabolit sekunder ini berjumlah 2 dan kelipatannya (C2 x n).
Senyawa ini sangat luas distribusinya. Mulai dari makhluk jasad renik,
tumbuhan dan vertebrata menghasilkan senyawa golongan ini.
Berbagai golongan antibiotik, asam lemak, bahkan aflatoksin
penyebab hepatitis adalah senyawa-senyawa poliketida. C2 jika
membentuk struktur siklik maka ia menjadi poliketida dan jika
membentuk rantai alifatik panjang maka membentuk kerangka asam
lemak. Dengan demikian C2 berkontribusi membentuk metabolitprimer
Ciri-ciri senyawa poliketida adalah:
- Strukturnya tersusun dari rantai karbon dengan kelipatan 2
sehingga disebut C2, karena berasal dari starting material
asetat: nCH3CO2H -[CH2CO]n-. Adapun jumlah karbon
akhir bisa kehilangan 1 atau kelebihan bisa terjadi.
- Kadang membentuk cincin benzen aromatis
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
23/121
16 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
- Jika cincin benzen biasanya mengandung lebih dari satu gugus
hidroksil (-OH) atau alkoksi (-OR) maka gugu-gugus tersebut
akan berposisi meta satu sama lain.
Gambar 2.5 Posisi meta antara dua gugus alkoksi adalah salah
satu ciri khas dari senyawa golongan poliketida.
- Jika membentuk rantai panjang dan berakhiran dengan gugus
karboksilat maka disebut golongan asam lemak.
- Rantai panjang tersebut kadang mengalami siklisasi
Ciri sekunder:
- Semakin panjang rantai karbon maka semakin larut dalam
pelarut non polar, namun semakin banyak gugus hidroksil
maka kelarutan makin tinggi pada pelarut polar seperti
metanol.
Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang satu atau
kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict rumus C2, C5, C9.
Karena proses di alam oleh reaksi enzimatis.
- Diproduksi oleh hampir semua makhluk hidup, dari makhluk
tingkat rendah bakteri, alga, jamur, tumbuhan dan mamalia
hingga manusia.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
24/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 17
Jalur biosintesis poliketida:
Gambar 2.6 Biosintesis golongan asam lemak dari starting material asam
asetat (C2)
Gambar 2.7 Mekanisme biosintesis golongan poliketida (diadaptasi dariDewick, 2006)
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
25/121
18 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Identifikasi senyawa poliketida:
Secara kimiawi: dikarenakan beragam strukturnya, maka tidak ada
reagen khusus penciri golongan poliketida. Biasanya identifikasi
didasarkan pada reaksi gugus fungsional kemudian diidentifikasi
perubahan warna yang terjadi atau pergeseran pada panjang
gelombang tertentu. Contohnya jika bergugus fenolik maka potensial
dikopling dengan senyawa pengkelat sehingga larutan lebih gelap.
Sedangkan pencirian fisis dengan menggunakan lampu UV biasanya
akan memberikan pemadaman pada 254 nm dan warna tertentu
pada 366 nm. Jadi tidak terlalu spesifik. Walaupun reagen anilin bisa
mengidentifikasi cincin benzene namun akan bias dengan golongan
fenil propanoid. Untuk identifikasi modern penggunaan reagenkimiawi destruktif era sekarang sudah dihindari
Untuk golongan asam lemak mudah dicirikan berdasarkan sifat fisis
yang meninggalkan noda semi transparan pada kertas. Di bawah
sinar UV asam lemak tidak memberikan pemadaman flouresensi.
Dengan spektra NMR: jika memiliki proton pada gugus aromatis
maka akan memberikan sinyal geseran kimia sekitar δ 6-8 ppm. Jika
mengadung proton rantai panjang karbon ikatan tunggal (-CH2-)
maka akan memberikan sinyal antara δ 1-2,8 ppm, beberapa
diantaranya overlap. Jika mengandung proton dengan ikatan ganda
maka akan menunjukkan peak sekitar δ 5-6,5 ppm.
Latihan:
Jelaskan mengapa senyawa-senyawa berikut disebut poliketida:
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
26/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 19
Golongan Senyawa Terpenoid C5)
Gambar 2.8 Artemisinin adalah obat anti malaria yang diekstraksi dari
jamur Artemisinia annua , merupakan senyawa terpenoid.
Artemisinin menghambat pertumbuhan Plamodium
falciparum .
Terpenoid adalah senyawa yang tersusun dari kerangka
isopren (C5), yakni rantai beranggota lima karbon bercabang
(branching) metil pada karbon nomor 2 atau kelipatannya. Senyawa-
senyawa seskuiterpen (Zingiberaceae ), asam ursolat yang terdapat
dalam berbagai tanaman dan bersifat penghambat kanker dan
menurunkan gula darah, asam betulinat yang tekandung dalam
berbagai tatanaman termasuk buah kayu putih yang bersifat
antidiabetes, azadiraktin dari biji mimba (Azadirachta indica ) sebagaipestisida, berbagai macam parfum dan aroma kebanyakan adalah
senyawa-senyawa terpenoid. Karotenoid dalam berbagai tanaman
sebagai pro vitamin A. Skualen suplemen kesehatan, bahkan
kolesterol yang jika kadarnya dalam tubuh berlebihan menyebabkan
penyakit jantung dan stroke adalah merupakan senyawa golongan
terpenoid.
Jalur Biosintesis
Isopentenil piropospat (IPP) atau dimetil alil piropospat
(DMAPP) adalah starting material paling awal dari terpenoid.
Jalur biosintesis terpenoid di mulai dari pembentukan
isopentenil piropospat (IPP) yakni isopren yang mengikat dua
buah pospat kemudian bergabung satu dengan yang lain dari
kepala-ekor membentuk monoterpen, seskuiterpen, diterpen,
triterpen dan seterusnya. Mengapa isoprene dalam reaksi ini
harus mengikat pospat ?.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
27/121
20 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid: 1 jalur
mevalonat dan 2. deoksiselulosa. Jalur biosintesis
deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru ditemukan.Jalur deoksiselulosa ditandai lazim ada di dalam tumbuhan
atau bakteri, namun jarang terdapat di dalam makhluk
vertebrata termasuk manusia.
Minyak atsiri monoterpen dan seskuiterpen, steroid, kolesterol
merupakan senyawa terpenoid.
Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran ?.
Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis
makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup
selektif pada makhluk vertebrata.Mekanisme pembentukan senyawa terpenoid:
Gambar 2.9 Dimetilalil piropospat (DMAPP) dan Isopentenil piropospat
(IPP) adalah starting material terpenoid. Terpenoid tersusun
dari rantai karbon tersebut atau kelipatannya.
Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid makhluk
hidup ada dua, yakni jalur mevalonat dan deoksiselulosa. Jalur
biosintesis deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru
ditemukan. Jalur deoksiselulosa lazim ada di dalam tumbuhan atau
mikroba namun jarang terdapat di dalam makhluk vertebrata
termasuk manusia.
Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesismakhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup selektif
pada makhluk vertebrata. Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran?
Jalur biosintesis terpenoid dimulai dari pembentukan
isopentenil piropospat (IPP) atau dimetilalil piropospat (DMAPP)
yakni isopren yang mengikat dua buah pospat kemudian bergabung
satu dengan yang lain dari kepala-ekor membentuk monoterpen,
seskuiterpen, diterpen, triterpen dan seterusnya. Isoprene adalah unit
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
28/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 21
pembangun terpenoid bukan merupkan starting material paling awal
dari terpenoid. Mengapa isoprene dalam reaksi ini harus mengikat
pospat? Meskipun DMAPP dan IPP memiliki ikatan ganda namun
electron namun tidak terlalu reaktif untuk bereaksi dengan molekul
sejenis.
Gambar 2.10 Diagram skematik terbentuknya golongan terpenoid
Ciri-ciri senyawa terpenoid adalah:
1. Jumlah rantai atom karbon di dalam kerangka sebanyak 5 atau
kelipatannya. Sehingga disebut senyawa golongan C5.
2. Seringkali bercabang metil (branching – CH3). Karena starting
material nya memiliki gugus metil maka jelaslah terpenoid yang
dihasilkan mewarisi gugus metil ini.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
29/121
22 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
3. Kadang mengandung gugus metilen (=CH2) terminal atau -
CH2OH. Disebabkan suatu reaksi pada cabang metil pada poin
2 gugus metil tersebut kadang mengalami modifikasi menjadi
gugus metilen terminal atau metil yang mengikat hidroksi.
4. Seringkali membentuk cincin atau rantai siklik yang unik
Ciri sekunder:
5. Semakin panjang rantai karbon (jumlah karbon) kelarutan
makin larut pada pelarut non polar.
6. Jarang memiliki gugus aromatis.
7. Jika memiliki rantai ikatan ganda umumnya berjumlah
terbatas.
Keberadaan senyawa terpenoid berbobot molekul rendah
berlimpah distribusinya pada tumbuhan dan makhluk tingkat rendah
seperti jamur/fungi, bakteri dengan struktur sangat beragam. Pada
makhluk vertebrata dan manusia jenis senyawa terpenoid didominasi
turunan steroid.
Identifikasi Terpenoid
Secara kimia: Karena terpenoid sangat beraneka ragam strukturnyadan tidak memiliki gugus yang uniform terkait reaktifitas kecuali
ikatan gandanya maka secara kimia terpenoid diidentifikasi dengan
penyemprotan pereaksi vanillin-asam sulfat atau anisaldehida-asam
sulfat yang akan menghasilkan warna-warna ungu, kuning coklat,
hitam pada sinar tampak. Vanillin dan anisaldehida memperpanjang
rantai terkonjugasi dari senyawa target. Atau kadang dilakukan
reaksi oksidasi, yang diperkirakan terlepasnya beberapa hidrogen
meningkatnya jumlah ikatan ganda sehingga terbentuk warna violet
pada cahaya tampak. dengan pereaksi umum serium(IV)sulfat yang
akan menghasilkan warna ungu, biru atau kuning.
Secara fisika: Karena ikatan gandanya terbatas maka identifikasi non
spesifik terpenoid adalah dengan melihat bercak kromatografi lapis
tipis silica gel254 nm di bawah sinar lampu UV 254 akan menghasilkan
bercak warna ungu pemadaman, dengan warna latar lempeng
fluoresensi hijau (lempeng berwarna hijau). Dan di bawah lampu UV
366 mm tidak menghasilkan fuoresensi. Semakin terbatas ikatan
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
30/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 23
gandanya tentu intensitas akan lemah. Sehingga senyawa-senyawa
triterpen seperti asam ursolat, asam betulinat, kolesterol sulit tampak
dengan identifikasi fisis. Untuk memvisualkan bercak kromatografi
golongan terpenoid rantai panjang memerlukan derivatisasi dengan
penyemprotan vanillin, anisal dehida, serium sulfat kemudian
dipanaskan beberapa detik sehingga akan timbul warna dari kuning
hingga merah tua. Harap dicatat bahwa reaksi kimia seperti ini
terlalu umum.
Gambar 2.11 Vanilin dan anisaldehida, jika dengan bantuan asam sulfat
dan pemanasan 103 0C merupakan penampak bercak
umum untuk senyawa yang tidak nampak pada UV 254
atau 366 terutama turunan terpenoid: minyak atsiri,
senyawa terprenilasi, saponin bahkan steroidal/triterpen.
Secara spektroskopi proton NMR: karena terpenoid memiliki gugus
metil, maka jika dibaca pada spektra NMR akan tampak sinyal
tunggal tinggi pada geseran kimia (chemical shift ) antara δ 0.8
sampai sekitar 2 ppm. Atau jika terdapat gugus ekso metilen terminal
(=CH2) maka akan terdapat puncak sinyal tinggi tajam antara 5
sampai 5,6 ppm berupa doublet).
Soal latihan:
a. Sebutkanlah mengapa senyawa-senyawa berikut ini adalah
termasuk terpenoid dan masuk pada golongan tepenoid yang
mana?
O
H
OR
OR
Vanilin/Anisaldehid
Senyawa terpenoid
OH
H
OR
OR
H
Senyawa vanilin terpenoidal
103 0
C, 3 menit
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
31/121
24 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
b. Sebutkanlah mengapa Mengapa senyawa artemisinin obat
malaria dengan struktur ini termasuk terpenoid dan masuk
golongan terpenoid apa?
Arteminisin obat malaria dari Artemisin:
c. Termasuk golongan terpenoid apakah senyawa dengan
struktur berikut ?
O
O
HO OH
OH
O
6. Steviol
OH
CO2H
4. -kariofilen
3. Iridoid1. Citral
5. Heyneanol
7. Amrin
2. p-Cimen
HH
HO
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
32/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 25
Andrografolid dalam herba sambiloto:
Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang
satu atau kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict
rumus C2, C5, C9. Karena proses di alam oleh reaksi
enzimatis. Asal ciri utama memenuhi dan sesuai golonganmetabolit.
Golongan fenil propanoid C9) dan fenil metanoid C7)
Gambar 2.12 Podofilotoksin adalah senyawa anti kanker kulit diisolasi
dari spesies tumbuhan Podophyllum spp. Podofilotoksin
bahan baku obat kanker etopsida (Inzet) yang digunakan
untuk kanker paru, testes, limfoma dll.
Senyawa fenilpropanoid adalah senyawa memiliki kerangka
aromatik fenil (C6) dengan rantai samping propanoid (C3) sehingga jumlah total karbonnya adalah 9 dan disebut C9 atau fenil
propanoid dan kelipatannya.
Senyawa fenil propanoid terbentuk dari asam sikimat (Gambar
2.3 dan 2.11). Selain fenil propanoid, jalur asam sikimat
dihipotesiskan membentuk building block C7. Berbagai senyawa
golongan lignin, stilben, kumarin memiliki kerangka C9. Asam galat,
O
OH
OCH3
H3CO
O
O H
H
O
O
O
OO
HO
HO
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
33/121
26 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
struktur benzoik, berbagai polifenol (bukan jalur tunggal) terbentuk
dari struktur C7.
Golongan Fenil propanoid adalah adalah senyawa yang
memiliki aktifitas farmakologi luas seperti antikanker
(podofilotoksin), filantin berefek sebagai hepatoprotektor dan
stimulan kekebalan dalam tanaman meniran (Phyllanthus niruri ),
antiaterosklerosis (stilebenoid, resveratrol), antidiabetes
(sinamaldehide, terkandung dalam kulit kayu manis (Cinnamomum
burmani ), eugenol bahan antiseptik gigi diperoleh dari kuncup bunga
cengkeh (Syzygium aromaticum ). Berbagai bahan parfum atau aroma
aromaterapi merupakan senyawa fenil propanoid. Jadi minyak atsiri
disusun oleh golongan monoterpen, seskuiterpen, danfenilpropanoid.”
Gambar 2.13 Flowchart pembentukan senyawa dengan kerangka C9 dan
C7 atau disebut golongan fenil propanoid dan fenilmetanoid
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
34/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 27
Ciri-ciri senyawa fenil propanoid dan fenil metanoid:
1. Selalu memiliki kerangka inti fenil dan propanoid sehingga
disebut C9 dan kelipatannya misalnya 2 x C9, 3 x C9 dst. Jika
C7 maka memiliki kerangka benzil dan 1 rantai karbon
samping
2. Pada kerangka aromatik jika memiliki gugus hidroksil (-OH)
atau alkoksi (-OR) biasanya akan berada pada posisi para
terhadap rantai samping propanoidnya.
3. Jika terdapat lebih dari satu alkoksi (-OR) atau hidroksil (-OH)
maka akan berposisi orto.
Keberadaanya berlimpah pada tumbuhan namun terbatas pada
jamur dan belum ditemukan pada manusia atau vertebrata.
Golongan ini melewati starting material asam amino L-tirosin dan L-
fenilalalin yang merupakan asam amino esensial (manusia tidak
memiliki jalur biosintesis ini). Sehingga potensi toksisitas kecil pada
manusia.
Identifikasi senyawa fenil propanoid:
Secara kimia : reaksi umum untuk identifikasi fenil propanoid
tidak ada reagen khusus untuk identifikasi. Sedangkan keberadaanrantai samping propanoid atau gugus lain tentu tidaklah spesifik.
Tergantung dari berbagai gugus fungsional yang terikat. Jika
mengandung gugus hidroksil maka reagensia pengkopling semacam
FeCl2 yang berakibat warna larutan menjadi gelap.
Secara fisika : Senyawa ini biasanya jika dilihat di bawah sinar
UV 254 nm lempeng KLT silica gel254 akan mengalami pemadaman
fluoresensi (quenching). Khusus untuk golongan kumarin akan
memberikan flouresensi biru terang, sedangkan pada larutan
berflouresensi hijau. Adapun berbagai reagensia penciri gugus kimia
tentu tidak spesifik untuk mencirikan golongan fenilpropanoid.
Secara spektroskopi NMR. Tanda kurung di awal dan diakhir
alinea dibuang.: karena dipastikan memiliki kerangka aromatik,
biasanya proton pada aromatik akan memiliki geseran kimia antara δ
6 sampai 7 ppm. Pola pemecahannya mengikuti sistem ABX misalnya
dd (doublet of doublet ) atau double dengan coupling constant kecil
antara 1-3 Hz yang menunjukkan coupling meta. Diukur pada
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
35/121
28 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
karbon NMR maka akan terdapat sinyal karbon sebanyak enam
buah pada geseran kimia di atas δ 100 ppm. Sedangkan rantai
samping tergantung gugus yang diikat, jika membuat proton fenil
maka akan memberikan sinyal pada geseran kimia antara δ 4,5- 6
ppm, jika berupa proton alifatik maka akan berada di antara δ 1-2
ppm, jika terikat pada karbon yang mengikat oksigen maka akan
berada di antara δ 3-4 ppm.
Tugas: Identifikasilah termasuk golongan senyawa apa golongan
berikut ini!
Golongan alkaloid
Gambar 2.14 “Piculah Adrenalin mu! Adrenalin adalah salah satu
alkaloid yang diproduksi oleh makhluk vertebrata dari
asam amino tirosin. Adrenalin berfungsi mediator pada sel
saraf terkait rasa simpati dan kewaspadaan. Jadi tidaklah
betul alkaloid hanya terdapat pada tumbuhan melainkanhampir semua kingdom termasuk manusia.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
36/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 29
Definisi alkaloid klasik menyatakan
bahwa semua senyawa metabolit sekunder
yang mengandung unsur nitrogen di dalam
kerangkanya. Alkaloid diklasifikasi-kan
berdasarkan asam amino prekursornya
dan di dalam kerangkanya masih memiliki
atom nitrogen.
Adapun senyawa dengan kerangka asetat, terpenoid, shikimat
yang mengalami aminasi (pemasukan atom N) bukanlah alkaloid
secara definisi khusus.
Senyawa alkaloid memiliki peran yang sangat besar di dalam
bidang kedokteran. Senyawa yang pertama kali diisolasi secara murniadalah morfin. Berbagai obat penting terutama obat syaraf adalah
alkaloid. Berbagai doping, bahan obat narkotik, kopi dikonsumsi
sehari-hari oleh manusia mengandung alkaloid yakni kafein, coklat
adalah alkaloid teobromin.
Namun secara dominan alkaloid adalah senyawa metabolit
sekunder yang berasal dari prekursor asam amino. Sehingga untuk
mempelajari alkaloid bisa ditelusuri berdasarkan building block atau
kerangka asam amino asalnya.
Golongan utama alkaloid:
alkaloid turunan ornitin
alkaloid turunan lisin
alkaloid turunan asam nikotinat
alkaloid turunan tirosin
alkaloid triptopan dan asam antranilat
alkaloid turunan histidin
alkaloid karena reaksi aminasi
Keberadaan dan fungsi alkaloid:
Keragaman struktur alkaloid sangat tinggi. Alkaloid berpotensi
sebagai sumber obat yang berlimpah dan berefek farmakologis
beragam. Sifat fisiko-kimia yang bersifat semipolar dan mampu
berinteraksi dengan membran sel. Kontribusi atom N di dalam
struktur memberikan efektifitas interaksi kimiawi dengan reseptor.
N C
O
OH
H
H
H
R
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
37/121
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
38/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 31
- Semua golongan dengan metabolit primer (terutama
monosakarida glukosa, rhamnosa, fruktosa)
- Semua metabolit sekunder juga bisa melakukan reaksi
halogenasi, sulfurasi, dan aminasi.
Soal latihan: (Harap dipahami bahwa jumlah karbon kurang satu
atau kelebihan satu dari rumus umum bisa terjadi)
1. Senyawa kavibetol merupakan senyawa marker pada daun
sirih (Piper bettle ). Merupakan senyawa golongan apakah
kavibetol?
2. Senyawa flavonoid adalah senyawa yang distribusinya sangat
luas pada berbagai familia dan spesies tanaman. Tersusun dari
kerangka apakah senyawa flavonoid?
3. Tetrahidrokanabinoid (THC) adalah senyawa aktif dalam
tanaman ganja (Cannabis sativa ). Senyawa ini berpotensi untuk
mengobati multiple sclerosis. Tersusun dari kerangka apa saja
golongan tersebut?
4. Dounorubisin disari dari jamur Streptomyces peucetius
digunakan untuk mengobati kanker leukemia limfosit dan
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
39/121
32 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
myeloid akut. Termasuk golongan apakah senyawa taxol dan
dounorubisin?
5. Kurkumin adalah bumbu dapur yang berkhasiat untuk
mencegah keganasan (malignansi) kanker. Termasuk golongan
apakah kurkumin?
6. Lunamarin adalah senyawa yang terdapat pada daun maitan
atau sanrego (Lunasia amara Blanco). Termasuk senyawa
apakah senyawa lunamarin dan tersusun dari building block
apa saja?
7. Jeruk purut atau Citrus hystrix kaya dengan kumarin salah
satunya ada eupecindatin. Termasuk building block apakah
senyawa tersebut?
8. Saponin terdistribusi pada bererapa spesies. Digoksin
merupakan saponin. Lerak untuk mencuci kain batik tulis juga
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
40/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 33
merupakan saponin. Tersusun dari kerangka apa sajakah
senyawa saponin dengan struktur di bawah ini?
9. Kapsisin adalah senyawa yang terkandung di dalam buah cabai
(Capsicum sp), selain bermanfaat untuk memberikan rasapedas pada sambal, kapsisin berefek sebagai pengurang nyeri
(analgetik). Merupakan senyawa apakah dan tersusun dari
kerangka apa senyawa kapsisin tersebut?
Penggolongan metode lain:
Sebagian ilmuwan lain mengklasifikasikan metabolit sekunder
berdasarkan keluasan distribusinya dan kelimpahannya di alam.
Penggolongan ini biasanya memiliki tujuan pragmatis namun tidak
terlalu spesifik untuk melakukan kuantifikasi dan digunakan untuk
melakukan estimasi kasar golongan senyawa yang kemungkinan
bertanggung jawab secara farmakologis. Golongan senyawa itu
adalah:
1.
Gol. Fenolik2. Gol. Flavonoid
3. Gol. Saponin
4. Gol. Minyak atsiri
5. Gol. Tannin
6. Gol. Alkaloid (terbatas pada beberapa genus)
7. Gol. Steroid
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
41/121
34 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Namun dengan kemajuan kimia organik selama 30 tahun ini,
pembagian golongan umum ini sudah tidak terlalu relevan. Seorang
peneliti akan cukup mudah menelusuri pustaka terakit golongan
metabolit sekunder yang dikandung oleh suatu tanaman dan
menegasikan golongan yang tidak perlu dianalisis. Jika ditelusuri
ketujuh metabolit sekunder tersebut sudah tercakup dari kerangka
molekul C2, C5, C7, C9, alkaloid, atau kombinasi.
Pertanyaan:
1. Termasuk golongan metabolit sekunder apakah senyawa
fenolik, flavonoid, dan golongan tannin?. Bagaimana
hubungan kekerabatan mereka?2. Bagaimana hubungan kekerabatan antara saponin dengan
senyawa steroid?
3. Sebutkan komponen metabolit sekunder yang menyusun
golongan minyak atsiri?
4. Jelaskan kedudukan ketujuh golongan tersebut di dalam
khazanah metabolit sekunder?
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
42/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 35
BAB III
KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN
PEMILIHAN PELARUT
Target Pembelajaran: Pembaca diharapkan mampu memahami sifat
dasar metabolit sekunder dan memberikan overview pelarut yang
sesuai di dalam upaya ekstraksi.
Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan kepolaran
secara tegas tidaklah tepat. Penggolongan metabolit sekunderberdasarkan polaritas sangatlah kaku sehingga tidak mutlak bisa
diterapkan. Sifat polaritas antar golongan metabolit sekunder
kebanyakan tidaklah berbeda secara dramatis. Untuk mengisolasi
dan memurnikan metabolit sekunder harus dipahami sifat dasar
molekul metabolit sekunder. Mayoritas metabolit sekunder bersifat
semi polar sehingga larut dalam pelarut organik. Metanol dan
asetonitril adalah pelarut organik paling polar. Heksana, benzana,
dan petroleum eter bersifat non polar. Hanya sebagian saja dari
metabolit sekunder bersifat polar dan larut dalam metanol atau air.
Kebanyakan metabolit yang larut metanol adalah senyawa glikosida
yang mengikat satu atau lebih molekul gula heksosa/pentosa.
Adapun kebanyakan golongan terpenoid bersifat non polar sehingga
larut ke dalam pelarut non polar dan semi polar. Namun untuk
monoterpen dan seskuiterpen masih mampu larut dalam metanol.
Metode kromatografi baik fase normal atau terbalik yang saat
ini diterapkan dan berkembang kebanyakan kompatibel dengan
senyawa semi polar. Sehingga senyawa yang sangat polar atau nonpolar tidak kompatibel dengan metode pemisahan kromatografi.
Begitu juga metabolit primer polisakarida, lemak, dan protein
tunggal dari bahan alam tidaklah tepat menggunakan metode
kromatografi konvensional. Demikian juga senyawa yang larut air
dan sangat larut metanol atau yang sangat non polar sangat sulit
memurnikan dan mengkarakterisasinya.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
43/121
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
44/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 37
Solven Konstanta
dielektrik
ε)
Penggunaan
Kloroform 4,81 Untuk partisi terhadap air. Dicampur
metanol kadar rendah (5-20 %) untukfase gerak KLT fase normal. Selalu larut
dengan metanol berapa pun kadarnya.
Cukup toksik. Direkomendasikandiganti dengan diklorometan untuk
kromatografi kolom adapun KLT tidakmasalah. Dalam bentuk terdeutronasi
pelarut yang bersih untuk kebanyakan
senyawa semi polar-non polar.
Eter (dimetil
eter)
5,0 Toksik dan anestetik. Jika terpaksa
digunakan dengan rasio 1-4 terhadap
heksana digunakan sebagai fase gerakuntuk pemurnian dan pemisahan
dengan KLT. Dilakukan di lemari asam.
Etil asetat 6,02 Untuk partisi cair-cair dengan air.
Dilakukan setelah heksana. Dicampur
dengan heksana (0-100%) untuk fase
gerak kromatografi kolom. Dicampur
dengan kloroform atau diklorometana
untuk kromatografi kolom senyawa-senyawa non polar. Dilakukan sebelum
campuran heksana-etil asetat.
Asam asetat 6,15 Sedikit mengasamkan fase gerak pada
KLT pemisahan halus
Diklorometana 8,93 Untuk partisi cair-cair menggantikankloroform. Dicampur metanol kadar
rendah (5-20 %) untuk fase gerak KLT
fase normal.
n -butanol 17,8 Untuk partisi terhadap air setelah etil
asetat. Kadang dicampur sedikit asam
asetat atau asam lemah lain dan
dijenuhkan dengan air untuk analisis
KLT glikosida. Ditutup rapat. Baumengganggu pernapasan.
n -propanol 20,1 partisi cair-cair dengan air jika perlu
lebih halus ketika fraksi air setelah
dipartisi dengan n-butanol
Aseton 20,7 Ekstraksi senyawa semi polar. Kadang
dicoba dengan sedikit metanol untuk
KLT. Dalam bentuk terdeutronasi
sebagai pelarut semi polar NMR.
Etanol 25,3 Untuk ekstraksi awal simplisia baik
sendiri atau dicampur dengan air kadar
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
45/121
38 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Solven Konstanta
dielektrik
ε)
Penggunaan
< 30%.
Metanol 33 Pelarut utama untuk ekstraksi simplisia.Campuran dengan aseton atau
asetonitril untuk fase gerak fase terbalik.
Rasio sangat kecil terhadap klorofomatau diklorometana untuk fase gerak
KLT fase normal.
Asetonitril 36,6 Dalam bentuk campuran dengan air
untuk fase gerak KLT fase terbalik dan
HPLC
DMSO 47,2 Pelarut untuk bioassay. Dalam bentuk
terdeutronasi sebagai pelarut NMR
Air 80 Pengekstraksi polar, membuat infusa,
membuat dekokta. Dalam bentuk
terdeutron sebagai pelarut NMR
Gambar 3.1 Diagram alur proses ekstraksi hingga diperoleh senyawa
aktif. Pengujian efek farmakologi harus dilakukan setiap
tahap. Sampel yang aktif yang diteruskan. Itulah inti dari
bioassay guided gractionation .
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
46/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 39
BAB IV
EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI
Target Pembelajaran: Pembaca mampu memahami alur pemurnian
mulai dari proses ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi. Mampu memilih
fase diam dan fase gerak dalam setiap tahap serta menentukan bobot
minimal yang harus dimiliki pada setiap proses.
Ekstraksi
Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah
maserasi (perendaman). Yakni merendam material di dalam pelarut.
Maserasi (merendam dalam pelarut) adalah metode ekstraksi pilihan
pada tahap pendahuluan ataupun ekstraksi perbanyakan. Selain
karena simple juga tidak banyak gangguan fisis.
Adapun metode dasar yang lain seperti perkolasi, Shoxleat, gas
superkritikal, counter current chromatography, microwave dll
digunakan menyari bahan yang targetnya sudah jelas.
Tahapan ekstraksi melewati dua mekanisme dasar yakni:
Disolusi : proses terendamnya senyawa target oleh solven.Difusi : proses terbawanya senyawa-senyawa oleh solven keluar
sel atau matriks alami.
Agar solven bisa menjangkau tempat senyawa di dalam sel
atau ruang antar sel maka penyerbukan harus dilakukan. Serbuk yang
terlalu halus menyebabkan larutan keruh atau terbentuk dispersi
yang mengganggu kedua proses itu. Pembatas proses difusi adalah
gradien difusi yang mendekati ~1. Artinya kadar senyawa di dalam
pelarut dan di dalam material alami sama. Biasanya setelah 1 malamdiganti pelarut baru.
Pada pekerjaan skrining seringkali hanya dibutuhkan 1-10 gram
serbuk bahan untuk diekstraksi. Barulah jika setelah bioassay
diketahui sampel yang paling poten maka yang diperbanyak.
Bioassay secara in vitro modern hanya membutuhkan bobot ekstrak
sekitar 1 mg. Untuk mempercepat ekstraksi seringkali dikombinasi
dengan sonikasi 1 jam, menaikkan suhu 30-400C. Tidak perlu dalam
jumlah besar.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
47/121
40 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Polarisasi dan Depolarisasi
Konsep interaksi kimiawi pada ekstraksi, fraksinasi kasar, dan
sub fraksinasi berdasarkan derajat polaritas pelarut-pelarut. Di sisi
lain harus dimengerti bahwa tidaklah tepat mengandalkan konsep
kelarutan “like dissolves like ” belaka. Seseorang harus memiliki
pemahaman yang cukup dengan prinsip ikatan kimia dan batas
kelarutan. Tidaklah benar bahwa senyawa polar hanya larut di
dalam pelarut polar atau sebaliknya. Pada batas tertentu sekelompok
metabolit sekunder dapat mengalami polarisasi atau depolarisasi
pada suatu kuantitas pelarut berlebih sehingga terjadi peristiwa “like
dissolves unlike ”. Contohnya etanol dalam jumlah besar mampu
melarutkan glikosida (polarisasi ). Heksana yang bersifat non polardalam jumlah besar juga mampu menarik polifenol karena fenomena
depolarisasi. Untuk itulah pekerjaan pengawalemakan (defatting )
bukanlah pekerjaan yang dianjurkan karena menyebabkan cukup
banyak metabolit terlarut hilang. Contohnya senyawa xanton
(ksanton) kadar akan berkurang dari ekstrak jika heksana digunakan
untuk pengawalemakan ekstrak kulit manggis.
Interaksi Kimiawi
Konsep yang harus dikuasai adalah pada fase pemisahan halus
adalah interaksi antara fase diam, pelarut, dan analit. Pada fase diam
normal interaksi kimiawi yang paling penting adalah ikatan hidrogen
antara tiga komponen.
Untuk menghasilkan senyawa aktif secara farmakologis
diperlukan kerja yang sistematik dengan melakukan pendekatan
bioaktifitas. Untuk itu diperlukan target biologis yang sesuai sebagai
representai penyakit tertentu. Demikian pula pemilihan bahan hayati
dilakukan secara random (acak) dengan jumlah jenis sampel (spesies)banyak. Semakin banyak spesies yang diuji semakin besar peluang
untuk memperoleh bahan aktif yakni jumlah spesiesnya Untuk
pemilihan sampel secara random, sampel tidak harus pernah
dilaporkan untuk penyakit yang ingin diteliti. Di industri, sampel
random ini dilakukan secara HTS (high throughput screening) , yakni
penapisan dengan uji farmakologis secara cepat dengan jumlah stok
sampel sangat kecil (
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
48/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 41
penggunaan tradisional untuk penyakit yang sesuai
(etnofarmakologi) dari pengamatan empiris, data empiris dari
record , daftar obat tradisional atau dari publikasi, dan laporan
ilmiah. Bahkan bisa dari buku resep tradisional atau pustaka lokal
yang bisa dipertanggung jawabkan artinya tidak hanya 1-2 buku
resep saja.
Untuk isolasi skala proyek penelitian uji aktifitas in vitro lebih
sesuai karena akan menyesuaian jumlah fraksi yang dihasilkan.
Namun demikian harus selalu dipikirkan penyesuaian bobot sampel
yang tersedia jika ingin dilakukan uji secara in vivo / in vitro.
Dengan setiap langkah ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi
semua material selalu dipantau dengan pengujian aktifitasfarmakologis. Paradigma kerja ini disebut bioassay-guided
fractionation . Pendekatan ini menjadi standard dalam penemuan
obat baik dari bahan alam maupun sintesis.
Secara kuantitas ada tiga macam metabolit sekunder yakni
yang ditemukan sebagai senyawa utama (major compound ),
senyawa minor (minor compound ), dan senyawa kelumit (trace
compound )*.
Adapun perinciannya adalah sebagai berikut:
- Senyawa utama jika ditemukan dalam prosentasi lebih besar
dari 0,01 % dari berat simplisia(>100 mg/kg simplisia.
- Senyawa minor jika ditemukan dalam prosentase kurang dari
0,01-0,0001 % (75-20** mg/kg simplisia)
- Senyawa kelumit jika ditemukan dalam prosentasi kurang dari
0,0001 % (5-0,5 mg/kg simplisia)
* Berdasarkan limit of identification dengan NMR 400 MHz.
** Angka-angka ANTARA tidak eksak karena mempertimbangkan
kehilangan selama proses ekstraksi.
Pentingnya Dokumentasi
Pemastian spesies atau disebut otentikasi dengan
mengkonsultasikan kepada taksonomis jika merupakan spesies yang
bukan merupakan domain umum. Namun jika sudah jelas dan
merupakan public domain misalnya pohon jati (Tectona grandis ),
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
49/121
42 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
bawang merah (Alium cepa ), melinjo (Gnetum gnemon) tentu
mudah menentukan spesiesnya. Voucher atau contoh bagian
tanaman atau tanaman utuh (herba) wajib disimpan untuk
dokumentasi jika sewaktu-waktu untuk konfirmasi atau penelusuran
kembali demikian deskripsi tempat pengambilan sampel. Teknologi
dokumentasi elektronik pribadi juga bisa digunakan, misalnya
menyimpan dalam bentuk fotonya. Tanpa dokumentasi dan
otentikasi yang baik bisa menimbulkan keraguan hasil atau kesulitan
untuk memperoleh hasil yang sama.
Bahan Simplisia Crude Drug)
Untuk mendapatkan ekstrak yang poten dilakukan berdasarkan:1. Pendekatan data empiris: mengamati bahan yang secara
empiris memberikan efek positif pada penderita penyakit
tertentu.
2. Sampling random: sampel diseleksi dari berpuluh-puluh
(hingga ratusan) bahan hayati. Skrining haruslah dilakukan
sehemat dan seefisien mungkin. Era sekarang bioassay
didasarkan pada target molekul in vitro atau kultur sel yang
membutuhkan jumlah bahan uji sangat sedikit. Cukup
disediakan 1-10 gram bahan mentah. Semuanya dimaserasi
hingga didapatkan 1-10 mg ekstrak. Kemudian diuji pada dosis
tunggal misalnya mengacu 25 µ g/mL (replikasi atau triplikasi).
Sampel yang menunjukkan efek poten lalu ditentukan ED50
atau IC50-nya. Setelah diperoleh ekstrak paling poten maka
simplisia ekstrak yang paling poten tersebut diperbanyak
setidaknya 1 kg.
Saran: Untuk mahasiswa tingkat skripsi sebaiknya bekerja dalam
rangka untuk membuktikan data empiris atau dari 10 sampel
random. Untuk tesis sekitar 25 sampel agar lebih mungkin untuk
mendapatkan bahan poten. Adapun untuk tingkat desertasi
seharusnya menghasilkan karya yang sangat berbobot temuan baru
baik senyawa baru atau senyawa sangat poten untuk itu tingkat
disertasi diperlukan jumlah sampel yang jauh lebih banyak.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
50/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 43
Ekstraksi dan Uji Farmakologi Pendahuluan
Untuk melakukan isolasi dan pemurnian metabolit sekunder
terlebih dahulu perlu diketahui apakah suatu ekstrak memiliki
aktifitas biologis yang menjanjikan. Untuk itu perlu dilakukan
farmakologis pendahuluan. Hal itu tidak terlepas dari model
penyakit yang diteliti atau dijadikan sasaran pengobatan. Sebagai
ketentuan umum ekstrak dikatakan memiliki aktifitas farmakologi
yang menjanjikan jika memiliki kemampuan hambat atau dosis
efektif lebih dari 75% populasi pada kadar 25 μ g/mL terhadap
aktifitas molekul (enzim/protein) penyebab penyebab penyakit, sel
kanker, bakteri atau jamur dengan Semakin kecil dosis efektif maka
semakin poten dan promising. Biasanya jika dosis efektif terlalu besarmaka tidak dilanjutkan. Beberapa peneliti melakukan eksepsi tetap
melakukan pemurnian pada spesies-spesies yang belum diketahui
kandungan metabolit sekundernya.
Gambar 4.1 Maserasi dilakukan 10 bagian pelarut: 1 bagian simplisia.
Misal 1 kg bahan dalam 10 L metanol.
Pada era sekarang, pada dasarnya isolasi senyawa dari bahan
alam tidaklah sulit terlebih jika targetnya adalah major compound
(senyawa utama). Akan tetapi untuk melakukan isolasi terlebih
dahulu perlu dipahami sifat-sifat bahan secara umum. Biasanya
bahan yang berasal dari ekstrak daun adalah paling sulit untuk
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
51/121
44 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
mendapatkan senyawa dikarenakan matriks nabati dan kompleksnya
jaringan. Material yang berupa ekstrak dari biji atau rimpang-
rimpangan tentu lebih sederhana dan jauh lebih mudah untuk
mendapatkan senyawa. Demikian bahan dari kayu memiliki jaringan
dan kerumitan kandungan metabolit yang lebih sederhana
dibandingkan organ daun. Sehingga beberapa peneliti ada yang
secara pragmatis menghindari penggunaan daun.
Berikut ini adalah sifat-sifat bahan secara umum:
(Adapun pertimbangan utama pemilihan harus didasarkan
pada sejauh mana potensi sampel terhadap target).
Organ Keuntungan Kerugian
Daun Biasanya organ daun memiliki
ketersediaan material yangtinggi.
Keragaman golongan meta-bolit sekunder di dalam daun
bermacam-macam mulai dari
yang non polar seperti
steroid,triterpene. Semipolar
seperti flavonoid hingga se-nyawa polar seperti polifenol
dan glikosida atau terpenoid
terhidroksilasi.
Kompleksitas jaringan dan
matriks nabati paling kom-pleks dan kandungan kimia
sangat beragam sehinggamempersulit pemisahan.
Kandungan asam lemak
tinggi sehingga paling sulit
dalam preparasi.
Defatting dengan pelarutheksan atau petroleum eter
bisa dilakukan namun perlu
diwaspadai kehilangan se-
nyawa yg larut pada solventersebut (depolarisasi).
Cukup sulit mendapatkan
isolat metabolit sekunder
dalam jumlah banyak dan
beragam.
Jika isolasi metabolit se-
kunder maka harus berhati-hati adanya positif palsu
yang disebabkan oleh asam
lemak.
Buah Matriks nabati dan jaringan
sel tidak terlalu kompleks.Target metabolit semi polarmudah lebih mudah di-
pisahkan.
Pembuatan simplisia ribet
karena harus diiris dirajangdan butuh waktu penge-ringan lebih lama.
Kandungan metabolit se-
kunder lebih rendah. Butuhbobot simplisia banyak.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
52/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 45
Organ Keuntungan Kerugian
Kebanyakan berisi metabolit
primer (karbohidrat) bersi-
fat polar larut metanol atauair. Kromatografi fase
normal atau terbalik tidak
terlalu kompatibel dan bisadiaplikasikan.
Keberadaan asam lemakkadang mengakibatkan po-
sitif palsu pada beberapa uji
farmakologi yang bertarget
protein/enzim
Kayu Jaringan lebih sederhana dari
daunMudah mendapatkan senya-
wa semipolar seperti senyawa
golongan fenil propanoid dan
modifikasinya yaknia lignan
dan juga terpenoid kompleks.
Tergantung spesies dan
familinya jaringan kayumengandung alkaloid.
Biasanya adsorben untuk
pemisahan dengan kolom
silika dengan sistem solven
kombinasi antara heksana
dengan etil asetat.
Kulit buah Jaringan lebih sederhana dari
daun.
Mudah mendapatkan senya-
wa semi polar seperti xanton,
polifenol dan terpenoid
Biji Jaringan termasuk paling
sederhana
Meskipun jaringan biji seringmengandung karbohidrat danasam lemak. Dengan peng-
ekstraksi etanol atau etilasetat atau diklorometana
(CH2Cl2) karbohidrat akan
minimal.
Mudah mendapatkan senya-
wa golongan terpenoid,lignan
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
53/121
46 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Organ Keuntungan Kerugian
Bunga Mudah mendapatkan senya-
wa golongan pilifenol,
flavonoid dan modifikasinya
Negatif palsu, hati-hati
dengan senyawa berwarna
yang menggangu ujibioassay dengan metode
kolorimetri
Rimpang Matriks tidak kompleks
dengan karbohidrat rendah
Mudah mendapatkan senya-
wa golongan fenil propanoid,terpenoid seperti seskuiterpen
atau diterpen dan polifenol
glikosida
Propolis,
sarang
serangga,
bekatul,
dan
metabolit
binatang
Matriks dan residu nabati
tidak kompleks
Kandungan kimia bervariasi
tergantung geografi. Konse-kuensinya bisa berbeda
potensi aktifitas farma-
kologisnya.
dll
Ekstraksi
Ekstrak/sari adalah material hasil penarikan oleh pelarut air
atau pelarut organik dari bahan kering (dikeringkan). Hasil penyarian
tersebut kemudian pelarutnya dihilangkan dengan cara penguapan
dengan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental jika
pelarutnya pelarut organik. Jika pelarutnya air, pada tahap akhir
dilakukan penghilangan total dengan cara liofilisasi menggunakan
alat freeze dryer . Hasil liofilisasi akan berupa serbuk. Akan tetapi
teknologi liofilisasi di Indonesia tergolong komersial dan sangat
mahal serta terbatas dimiliki institusi ilmiah di Indonesia. Untuk itu,
cara lain bisa ditempuh dengan pengentalan dengan waterbathdengan temperature kurang dari 60 0C.
Metanol, etanol 70 %, dan etanol 96% adalah pelarut pilihan
utama untuk mengekstraksi metabolit sekunder yang belum diketahui
strukturnya dan untuk tujuan skrining. Ketiga pelarut ini memiliki
extracting power (daya ekstraksi) yang luas sehingga semua
metabolit sekunder tersari dalam tiga kali maserasi. Jika tujuannya
mengisolasi dan memurnikan senyawa target sudah jelas bisa
menggunakan pelarut organik lain (butanol, etil asetat, kloroform,
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
54/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 47
aseton, atau heksana) yang memiliki sifat ekstraksi terbaik (melalui
trial and error dan dipantau dengan plat KLT atau HPLC atau
densitometer dengan detektor UV/Vis). Tujuan pemurnian tertarget
tersebut dinamakan dereplikasi.
Biasanya ekstraksi dilakukan dengan maserasi atau perendaman
bahan dengan pelarut terpilih karena maserasi merupakan cara
ekstraksi yang paling mudah dengan rendemen ekstraksi tinggi.
Seringkali maserasi dikombinasi dengan digesti dan refluk selama 1-2
jam dengan suhu 40-60 0C untuk untuk meningkatkan efisiensi
penyarian. Biasanya ekstraksi dilakukan 2-3 kali atau sampai material
tidak mengandung senyawa terlarut lagi (dicek dengan KLT dan
lampu UV 254/366 nm). Jika penggunaan tradisional, masyarakatsecara turun temurun menggunakan bahan dengan cara direbus atau
dekok maka pelarut yang digunakan adalah air dengan cara merebus
atau mendekoktasi. Namun jika uji pendahuluan dilakukan secara
skrining pada berbagai material maka ekstraksi menggunakan pelarut
metanol atau etanol 70 % atau etanol 96 % (dalam air). Bobot
simplisia yang digunakan untuk skrining farmakologis sebanyak 10-
100 gram. Berdasarkan penelitian, ketiga jenis solven itu memiliki
ekstraktabiliti terbaik. Hampir semua metabolit sekunder akan
terlarut sempurna oleh ketiga solven tersebut dengan maserasi tiga
kali. Metode ekstraksi lain seperti perkolasi, perkolasi
berkesinambungan, gas superkritis dll bukanlah metode terpilih
untuk ekstraksi pendahuluan. Metode-metode ekstraksi tersebut
lebih tepat menjadi topik pembahasan untuk aplikasi industri atau
perbanyakan rendeman atau scaling up .
Adapun pelarut organik etil asetat, butanol,
diklorometan/kloroform, dan heksana lazim digunakan untuk tahap
fraksinasi dengan metode partisi cair-cair atau enap tuang (padat-cair). Penggunaan langsung salah satu jenis pelarut organik itu juga
tidak bisa disalahkan asal cukupnya pertimbangan pustaka.
Jika skrining telah dilakukan dan menunjukkan salah satu
sampel aktifitas poten maka dilakukan pekerjaan isolasi. Untuk
tujuan isolasi direkomendasikan bobot bahan simplisia awal
sebaiknya minimal 1 kg agar peluang mendapatkan senyawa aktif
farmakologis secara secara kualitatif maupun kuantitatif lebih tinggi.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
55/121
48 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Seringkali (hampir selalu) tahap fraksinasi belum mendapatkan
senyawa tunggal. Fraksinasi tahap II biasanya dilakukan dengan cara
kromatografi kolom. Kromatografi kolom pilihan utama adalah fase
normal. Kemudian jika masih belum mencapai target dilakukan
fraksinasi tahap ke III dengan fase terbalik. Kromatografi permeasi
dengan fase diam polisakarida sering dilakukan setelah fraksinasi
tahap II.
Fraksinasi Kasar
Fraksinasi dengan Partisi
Ekstrak (metanol, etanol 70%, atau etanol 96%) yang
diperoleh masih kasar dan sangat kompeks isinya. Untuk itu perludilakukan fraksinasi cair-cair atau partisi.
Lazimnya untuk ekstrak metanol atau etanol 70% dilarutkan
ke dalam air hingga tepat larut. Kemudian dipartisi bertingkat mulai
dari:
1. Butanol
2. Etilasetat
3. Kloroform/diklorometana
4. Heksan
Sebaiknya heksana digunakan terakhir untuk mencegah
pengambilan metabolit sekunder yang kurang selektif.
Untuk semua pelarut organik akan berada fase atas kecuali
kloroform akan berada di bawah air.
Masing-masing fraksi kental harus diperoleh setidaknya 10 gram agar
bisa dilakukan tahap fraksinasi lanjut. Selain itu semua fraksi partisi
tersebut juga harus segera diuji kembali aktifitasnya.
Catatan: Gunakan corong pisah yang berbentuk buah pear/lebih
bulat untuk mempartisi dua pelarut yang tetapan dieliktrikumnya
sangat berbeda (polaritasnya sangat beda misal air dengan heksana).
Corong pisah yang berbentuk lebih memanjang digunakan untuk dua
pelarut yang polaritasnya berdekatan misalnya air dengan butanol
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
56/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 49
Gambar 4.2 Diagram partisi cair-cair. Ekstrak kering dari metanol atauetanol berair dilarutkan terlebih dahulu dalam air. Heksana,
kloroform, etil asetat, dan butanol adalah yang digunakan
untuk mempartisi. Selain kloroform pelarut organik selalu
di lapisan atas air.
Setelah mendapatkan ekstrak kental atau ekstrak kering maka
dilakukan pemisahan kasar dari ekstrak berdasarkan tingkat
polaritasnya yakni mulai dari non polar, semi polar dan polar.Fraksinasi biasanya dilakukan untuk ekstrak pola: air, metanol atau
etanol 70%.
Fraksinasi ekstrak air bisa dilakukan dengan cara partisi atau
pelarutan pada solven organik. Jika fraksinasi dilakukan secara
partisi, ekstrak air dilarutkan kembali dengan air pada volume tepat
larut kemudian dilakukan partisi secara berturutan dengan butanol,
etil asetat, diklorometana atau heksana jika perlu. Partisi
menggunakan alat corong pisah (separatory funnel ). Jika fraksinasi
dilakukan dengan cara pelarutan maka ekstrak air dilarutkan secara
berturutan dengan metanol, etilasetat dan diklorometan atau
heksana. Pelarutan cukup dilakukan dengan menggunakan alat
berbahan gelas, bahan yang larut dipisahkan dan prosedur diulangi
2-3 kali. Semua fraksi yang dihasilan dipantau potensinya dengan uji
farmakologi.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
57/121
50 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Kasus yang sama bisa dilakukan untuk ekstrak metanol dan
ekstrak etanol 70%. Partisi untuk ekstrak metanol sebaiknya
ditambahkan air 1-2% untuk meningkatkan efektifitas pemisahan.
Jika ekstraksi dilakukan secara langsung dengan menggunakan
kloroform atau diklorometana atau heksana biasanya tidak
dilakukan fraksinasi karena pelarut-pelarut ini biasa digunakan untuk
mengekstraksi kayu dan kulit buah. Pada sampel tersebut lemak
pengganggu atau sakarida tidak terlalu banyak. Sehingga setelah
kering bisa langsung dilakukan kromatografi kolom. Meskipun
metanol seringkali juga digunakan untuk mengekstraksi bahan-bahan
tersebut.
Mengapa fraksinasi pada ekstrak air penggunaan pelarutdiklorometan atau heksana jika perlu saja?.
Tidak semua fraksi yang diperoleh harus dilanjutkan untuk
purifikasi. Hanya fraksi yang prospektif saja yakni memiliki aktifitas
farmakologi cukup tinggi saja yang dilanjutkan. Misal jika kita telah
memperoleh berbagai fraksi metanol, fraksi etil asetat, fraksi
diklorometan, fraksi heksana dan residu, untuk itu wajib dipantau
aktifitas biologisnya. Untuk itu, uji farmakologi wajib dilakukan
untuk memandu/memilih bahan mana yang layak untuk dilanjutkan.
Selain itu juga harus memperhatikan bobot fraksi kering yang ada.
Pengentalan/Pengeringan:
Pada dasarnya pengeringan dilakukan setelah tiap tahap
ekstraksi, fraksinasi, dan pemurnian. Ada beberapa metode
pengeringan:
1. Diuapkan di atas water bath (penguapan): Baik sistem terbuka
maupun tertutup. Sistem tertutup mencegah solven meracuni
ke mana-mana2. Diuapkan dengan rotaroy evaporator : Digunakan untuk semua
pelarut organik. Tidak cocok untuk bahan berair. Air
membutuhkan waktu penguapan yang sangat lama. Saat ini
beredar multirotaroty evaporator . Lebih efisien karena enam
sampel dikeringkan bersamaan.
3. Liofilisasi (freeze dryer ): Digunakan untuk bahan yang berair
tidak untuk pelarut organik.
8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder
58/121
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 51
4. Dialiri dengan gas N2: Untuk bahan yang termolabil, harga
mahal, jumlah rendemen kecil.
Pada tahap ekstraksi, fraksinasi, atau sub fraksinasi dengankromatografi kolom akan dihasilkan sekitar 50 botol dengan volume
sekitar 100 ml fraksi, kemudian dipekatkan dengan cara evaporasi.
Pekerjaan pada tahap ini sangat ribet karena jumlah sampel yang
sangat banyak. Untuk mempermudah pekerjaan beberapa peneliti
membiarkan sampel-sampel di dalam fume hood (lemari asam)
sampai beberapa hari, ada yang mengeringkan dengan suatu
rotatory evaporator berhari-hari. Alat terbaru untuk meringkas
pekerjaan adalah dengan multi evapora