SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA E IDENTIFICACIÓN DE TRABAJO DE …

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TIPO I

“SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA E IDENTIFICACIÓN DE

METABOLITOS SECUNDARIOS DE HOJAS DE Artemisia

absinthium L.”

AUTORES:

SILVA CORREA, CARMEN ROSA

SERRATO BOBADILLA, CINTHIA ANGELA

ASESOR:

Dr. WILLIAM SAGÁSTEGUI GUARNIZ

CO-ASESOR:

Mg. MAYAR GANOZA YUPANQUI

TRUJILLO – PERÚ

2010

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

En primer lugar:

A DIOS

Por su gran amor, por guiarme por el sendero de la verdad y el bien, por estar a mi lado para poder superar los obstáculos que se presentan, además de darme la oportunidad de lograr una de mis más anheladas metas: el ser profesional.

CARMEN.

Con todo amor y cariño para mis padres:

MARTÍN y ROSA

Por sus grandes esfuerzos, y sabios consejos, por el sacrificio abnegado, comprensión e invalorable apoyo que siempre me han brindado, lo que me inspira para ser cada día mejor.

CARMEN.



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A mi hermano:

MANUEL MARTÍN

Por su inmenso cariño, por su apoyo incondicional en cada momento de mi vida y darme ánimos para alcanzar esta meta tan importante en mi carrera profesional.

CARMEN.

A mis padrinos:

GRIMALDO y LUZMILA

Por su comprensión, confianza y apoyo incondicional, haciendo así posible el desarrollo de mi carrera profesional. Por ello mi eterno agradecimiento.

CARMEN.



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A mis amigos:

GLEND SANDOVAL

MARÍA VIOLETA LAU

CINTHIA SERRATO

Por su amistad y compañía brindada durante estos años, por sus palabras de aliento en los momentos difíciles y por compartir gratos momentos, que perdurarán por siempre.

CARMEN.



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Son muchas las personas especiales a las que me gustaría agradecer su amistad, apoyo, ánimo y compañía en las diferentes etapas de mi vida. Sin importar en donde estén y si alguna vez llegan a leer esta dedicatorias quiero darles las gracias por formar parte de mi vida, por todo lo que me han brindado desinteresadamente y por todas sus bendiciones.

CINTHIA.

Padre Celestial.

Como hija no soy la mejor pero procuro serlo y siendo así, nunca me has abandonado, a veces me he sentido tan sola….pero siempre me sabias hacer llegar el más caluroso abrazo que un padre puede dar a sus hijos, gracias por amarme así con mis miles de defectos y errores, nunca me dejes de cuidar y aunque grande te necesito más que antes, te amo mi papito, todo te lo debo a ti mi Dios.

CINTHIA.



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CESAR

Esposo mío, soy tan afortunada al tenerte a mi lado...pude dejar todo pero siempre me distes ánimo para seguir con mi carrera…te amo por ser la fuerza de mi vida, para mí siempre serás el mejor ejemplo de lucha pues tu sólo y sin apoyo alguno, más que tu voluntad lograste superarte en la vida, te amo tanto aunque a veces no lo diga, gracias por estar a mi lado siempre, te amo.

CINTHIA.

HÉCTOR.

Hijo mío, eres toda mi vida entera, si en algún momento lo olvide, créeme que ahora lo tengo como un sello en mi corazón…se que reniegas cuando te corrijo o cuando te digo que no a lo que pides; créeme, que por mi te diera todo y nunca te dijera que no, pero no siempre estaré a tu lado, mi chiquito bello, eres el motivo de mi existir.

CINTHIA.



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Miss ELENA MANTILLA RODRÍGUEZ,

Como no decirle gracias por esas palabras de aliento que siempre me dio, siempre me ha escuchado y más que una profesora ha sido un ángel que Dios ha puesto en mi camino, créame que sus palabras me han hecho levantarme y ver mis problemas no tan grandes como uno lo creía, gracias miss Elenita, que Dios derrame muchas bendiciones sobre Ud. Le quiero mucho.

CINTHIA.

CARMEN SILVA

Tu sí que eres una amiga, te doy el premio nobel por la paciencia que siempre me has tenido …gracias amigocha por comprenderme, por preocuparte por mí, por ayudarme, en fin se que siempre has querido que sea una buena amiga, esposa y buena alumna…gracias por estar a mi lado Camuchita…que todas tus metas profesionales se te cumplan y conociéndote a ti, de seguro que será así …Además Camuchita, tus padres se deben de sentir muy orgullosos de tener una hija como tú, muchos éxitos amiga.

CINTHIA.



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AGRADECIMIENTOS

A nuestros Asesores:

Dr. WILLIAM SAGÁSTEGUI GUARNIZ

Mg. MAYAR GANOZA YUPANQUI

Por su valiosa orientación durante el desarrollo del presente trabajo de investigación.

A los Miembros de Jurado:

Mg. LIZARDO CRUZADO RAZCO

Mg. FRANCISCO SAAVEDRA SUÁREZ

Nuestro agradecimiento por sus valiosos aportes y desinteresada ayuda en la realización del presente trabajo.



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A los Sres. Técnicos de Laboratorio

Srta. ROSARIO CORVERA

Sr. LUIS LUJÁN

Sr. SANTIAGO LEÓN

Por su apoyo brindado durante la realización de este trabajo de investigación

CARMEN Y CINTHIA



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JURADO DICTAMINADOR

Mg. LIZARDO CRUZADO RAZCO ……………………………………….. (PRESIDENTE)

Dr. WILLIAM SAGÁSTEGUI GUARNIZ…………………………………… (MIEMBRO)

Mg. FRANCISCO SAAVEDRA SUÁREZ …………………………………… (MIEMBRO)



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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de la Facultad de

Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, presentamos a

vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente Trabajo de

Investigación Tipo I titulado: “SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA E

IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE HOJAS DE

Artemisia absinthium L.”

Es propicia esta oportunidad para manifestarles nuestro más sincero

reconocimiento a nuestra alma mater y a toda su plana docente, que con su

capacidad y buena voluntad contribuyeron a nuestra formación profesional.

Dejamos a vuestro criterio, señores miembros del jurado dictaminador, la

calificación del presente Trabajo de Investigación

Trujillo, Julio del 2010

CARMEN ROSA SILVA CORREA CINTHIA ÁNGELA SERRATO BOBADILLA



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SUMARIO

Pág.

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….. .2

II. DISEÑO DE CONTRASTACIÓN…………………………………….……9

III. RESULTADOS…………………………………………………………..…14

IV. DISCUSIÓN………………………………………………………………...21

V. RESUMEN Y CONCLUSIONES…………………………………….…..25

VI. RECOMENDACIONES …………………………………………………..26

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………..…..27

VIII. ANEXOS…………………………………………………………………...31



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I. INTRODUCCIÓN

Durante mucho tiempo los remedios naturales y, principalmente el uso de

plantas, fueron el principal y único recurso de que se disponía para intentar

prolongar la vida humana. En un principio las plantas se usaban ya sea por

experiencias adquiridas empíricamente o por intuición al observar las

propiedades de estas, lo anterior aún persiste, pero con la diferencia de que

hoy en día contamos con recursos para estudiarlas a fondo y de esta forma

conocer y valorar las maravillas que nos proporcionan 31.

Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de

los países en desarrollo. Aunque no existen datos precisos para evaluar la

extensión del uso global de plantas medicinales, la Organización Mundial de la

Salud (OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza,

rutinariamente la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de

atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales

implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos. De acuerdo a la

OMS una planta medicinal es definida como cualquier especie vegetal que

contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos o

cuyos principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de

nuevos fármacos 2,10.

El organismo vivo puede ser considerado un laboratorio biológico, no sólo

para compuestos químicos (hidratos de carbono, proteínas, grasas, etc.) que

son utilizados por el hombre, conocidos como metabolitos primarios, sino para



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una multitud de compuestos (compuestos fenólicos, alcaloides, terpenoides,

etc.) que ejercen un efecto fisiológico, llamados metabolitos secundarios 3, 32.

Estos son considerados compuestos no esenciales para el funcionamiento de

la célula vegetal, por cuanto no participan en las transformaciones bioquímicas

comunes o su función no está bien entendida. La variabilidad cualitativa entre

especies y familias botánicas se mantiene, en muchos casos, dependiendo de

factores climáticos, fenológicos, genéticos y edáficos, con sus diferentes

interacciones. Muchos de los compuestos producidos por las plantas silvestres

son aprovechados por éstas para protegerse de condiciones ambientales

adversas 1.

Mayormente los metabolitos secundarios más comunes son los

alcaloides, esteroides, diterpenos, sesquiterpenlactonas, flavonoides,

cumarinas, benzofuranos, xantatos, quinonas. Estos son compuestos químicos

de estructura relativamente compleja cuya función metabólica aún no es clara,

en los cuales sus propiedades terapéuticas están siendo científicamente

comprobadas, para sustentar su uso tradicional en problemas de salud 14.

Muchos de los metabolitos secundarios de las plantas, constituyen una

fuente de productos naturales con actividad biológica diversa, como por

ejemplo, actividad antibacteriana, antifúngica, anticancerígena, anticoagulante,

citotóxica, hipocolesterolémica, antihelmíntica, insecticida, neurotóxica,

molusquicida, inhibidores o promotores de crecimiento vegetal. Esta gama de

propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de

aplicación, ya sea aislándolo o usando directamente el extracto o infusión del



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compuesto al que se le ha detectado una actividad biológica específica,

empleándolo como precursor en la síntesis de compuestos orgánicos, con el fin

de modelar nuevas sustancias con propiedades preestablecidas 9,30.

La fitoquímica es la encargada del estudio de estas sustancias activas,

relacionando la química orgánica de los productos naturales y la bioquímica de

la planta; es decir que se interesa por la enorme variedad de sustancias

orgánicas que son elaboradas y almacenadas por las plantas, la estructura

química de esos compuestos, su biosíntesis y metabolismo 11. Para esto, usa

técnicas de separación, aislamiento y análisis espectroscópicos con el

propósito de determinar sus estructuras químicas; y técnicas de síntesis para

efectuar modificaciones estructurales en busca de mejorar la actividad y

selectividad 5,14.

El término separación es amplio, básicamente puede considerarse como

una operación que consiste en dividir una mezcla en partes de composición

distinta. La separación es un proceso físico, pero a menudo implica procesos

químicos, que utiliza técnicas de cromatografía en capa fina, en columna y de

cromatografía de líquidos de alta resolución, que son herramientas que

permiten aislar, purificar e identificar los componentes bioactivos en una gran

diversidad de plantas 8, 9,29.

La cromatografía plana o en capa fina es un tipo de cromatografía liquida

en la que la fase estacionaria está extendida sobre la superficie de un plano y



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la fase móvil fluye a través de ella. La fase móvil siempre es un líquido,

mientras que la fase estacionaria puede ser un líquido soportado en un sólido

(cromatografía de partición) o un solido sorbente (cromatografía de adsorción,

cambio iónico o exclusión. El flujo de la fase móvil se produce por capilaridad

(cromatografía horizontal y ascendente o por capilaridad y gravedad

(cromatografía descendente) 29.

Este tipo de cromatografía es considerada la más simple de todas las

técnicas cromatográficas. La diferencia principal con la cromatografía en

columna es de tipo técnico, es decir, sólo difieren en el medio de soportar el

adsorbente. En ambas técnicas se emplea alúmina (Al2O3) o gel de sílice como

fase estacionaria y una fase móvil orgánica. En la cromatografía en columna el

adsorbente se introduce en un tubo o columna (generalmente de vidrio),

mientras que en la cromatografía en capa fina, el adsorbente se deposita en

forma de capa delgada sobre una placa de vidrio o de plástico. Los dos

adsorbentes más corrientes, el gel de sílice y la alúmina, son diferentes, pero

actúan esencialmente del mismo modo. Ambos efectúan la separación

principalmente por retención de los componentes sobre la superficie mediante

de fuerzas de ácido de Lewis y base de Lewis; con diferente intensidad sobre

las muestras 6, 29.

Con el paso del tiempo las investigaciones químicas relacionadas con el

aislamiento, biosíntesis y elucidación estructural de nuevos compuestos

provenientes de la naturaleza han contribuido al avance farmacéutico en el



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tratamiento de enfermedades mediante la formulación de nuevos

medicamentos, es por ello importante continuar investigando los metabolitos

secundarios de las diversas especies de plantas, en busca de nuevos

principios activos 8, 9.

En el Perú se encuentra la especie Artemisia absinthium L. “ajenjo” que

es una especie herbácea que pertenece a la familia Asteraceae, de

aproximadamente 90 cm de altura, con sus órganos vegetativos pilosos. Es

originaria del Centro y Sur de Europa, Norte de África y Centro de Asia. Toda

la planta contiene un aceite esencial (oleum absinthii) que contiene tuyona,

tuyol, proazuleno, felandreno y otros compuestos como mirceno y acetato de

trans-sabinyl (26,4%) Además, las partes verdes contienen un glucósido

lactónico sesquiterpénico, (absintiina) que es un principio amargo 12, 13, 14, 15, 22,

25.

El “ajenjo” es tóxico en grandes dosis, pero es un excelente tónico

amargo, febrífugo, antiséptico, diurético, emenagogo y antihelmíntico. En su

uso tradicional se le conoce como uno de los mejores tónicos estomacales

contra la dispepsia, la gastralgia y la insuficiencia hepática. De sus hojas y

flores se obtiene una infusión de “coñac” que se utiliza contra la gota.

Igualmente es utilizada para estimular el apetito y facilitar la digestión; y como

tónico para el hígado y la vesícula biliar. En aplicaciones externas, se puede

utilizar contra dolores de cabeza y torceduras. También el “ajenjo” goza de gran

reputación como tónico contra la escrofulosis, la anemia, la artritis y como



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abortivo, así como el licor de “ajenjo” como tónico del sistema nervioso central.

Su uso prolongado engendra un proceso de degeneración nerviosa irreversible

(absintismo), que se manifiesta con grandes perturbaciones psíquicas, motrices

y sensoriales que conducen al decaimiento total del individuo. El agente

responsable es la esencia rica en α-tuyona 19, 23, 27, 33.

Además existe investigaciones que demuestran que Artemisia

absinthium presenta actividad antioxidante, atribuyendo este efecto a

compuestos fenólicos y flavonoides presentes en esta planta 4,16.

En base a estos antecedentes, en el presente trabajo se pretende

realizar la separación cromatográfíca e identificación de los metabolitos

secundarios presentes en hojas de Artemisia absinthium L., con el propósito de

que en posteriores investigaciones se evalué el efecto farmacológico de dichas

fracciones para así contribuir al descubrimiento de nuevos principios activos

que sirvan de precursores para la síntesis de nuevos fármacos en el

tratamiento de diversas enfermedades.

Para ello nos planteamos el siguiente problema:

¿Cuáles son los metabolitos secundarios presentes en las fracciones

cromatográficas de hojas Artemisia absinthium L?



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OBJETIVOS:

Separar mediante cromatografía en capa fina y en columna los

metabolitos secundarios de Artemisia absinthium L.

Realizar la identificación fitoquímica de las fracciones obtenidas.



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II. DISEÑO DE CONTRASTACIÓN

1) Identificación de Muestras de Artemisia absinthium L.

La planta de Artemisia absinthium L fue recolectada en el Departamento

de Cajamarca, provincia de Contumazá, e identificada y clasificada

según el syllabus de Engler comparando con el material disponible en el

Herbarium Truxillense de la Facultad de Ciencias Biológicas de la

Universidad de Trujillo.

DIVISIÓN……………………………………………………Angiospermae

CLASE…………………………………………………….Dicotyledoneae

SUBCLASE…………………………………………….Metachlamydeae

ORDEN……………………………………………….Campanulales

FAMILIA…………………………………………... Asteraceae

SUBFAMILIA…………………………………… Tubulifloras

GENERO…………………………………….. Artemisia

ESPECIE………………………………….absinthium L.

2) Secado y Pulverización de Artemisia absinthium L.

Las muestras de hojas se lavaron y secaron a temperatura ambiente y

luego se llevó a secado en estufa a 45 ºC por 48 horas. Finalmente se

pulverizaron las muestras secas con la ayuda de un molino eléctrico y se

almacenaron en bolsas de papel.



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3) Preparación de los extractos

Se pesó 200 gramos de hojas secas y molidas, luego se colocó en

frascos de boca ancha al 10% P/V, se agregó en cada uno cantidad

suficiente de hexano, éter de petróleo, diclorometano, acetato de etilo,

metanol, agua, exactamente hasta cubrir las hojas, se dejó macerar por

agitación magnética por 24 horas, a excepción del extracto acuoso, el

cual sólo fue llevado a reflujo por 1h. Luego cada extracto se filtró

obteniéndose dos productos: el marco y el extracto con solvente. El

marco se volvió a macerar 2 veces más con el respectivo solvente y

luego los extractos se juntaron para ser llevados a rotavapor Heidolph ®

a 37 ºC y 5 bar de presión constante. Para el caso del extracto acuoso

se filtró obteniéndose nuevamente el marco y el solvente. El extracto

seco se obtuvo a partir de una evaporación del solvente mediante una

estufa a 40 o 45 ºC, para luego llevarlo a refrigeración.

4) Separación de los metabolitos secundarios: Fraccionamiento en

columna

La columna fue empacada usando silicagel G-60. El aislamiento de los

metabolitos a separar de cada extracto se llevó a cabo haciendo pasar

suficiente cantidad de fase móvil elegida, a través de la columna hasta

que las bandas individuales eluyan de de la columna y se puedan

recoger.



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Extracto Fase Móvil

Hexano Hexano-Metanol

Acetato De Etilo Acetato De Etilo – Metanol

Diclorometano Diclorometano- Metanol

Metanol Metanol - Hexano

Acuoso Metanol - Hexano

Las fracciones recogidas fueron evaluadas utilizando cromatografía en

capa fina, uniendo las fracciones que tuvieron el mismo Rf , para luego

llevarse a la identificación fitoquímica 25,26.

5) Análisis Fitoquímico

Se colocó las fracciones obtenidas en cantidades menores de 0.1 g y se

diluyó con el solvente y medio adecuado para cada reacción de

coloración y precipitación.

a) Identificación de Flavonoides

Reacción de Shinoda. Se colocó una cantidad de 0.1 g del extracto,

agregar etanol y luego una pequeña porción de limaduras de magnesio

y dos gotas de ácido clorhídrico concentrado. Con el desarrollo de

coloración es indicativo de la presencia de Flavonas (amarillo rojo),

Flavononoles (rojo a magenta), flavononas (rojo magenta o azul

violeta), isoflavonas (amarillo) 14.



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b) Identificación de Esteroles y Terpenoides

Reacción de Lieberman – Buchardat. Se colocó un 1 mL del extracto

y añadir 10 gotas de anhídrido acético, 20 gotas de ácido acético y una

gota de ácido sulfúrico 14.

Esta reacción sirve para revelar la presencia de esteroides que dan

coloraciones que varían del rosa al verde y finalmente pardas 17.

c) Identificación de Alcaloides

Reacción de Mayer. Se aforó 1.35 g de bicloruro de mercurio y 4 g de

yoduro de potasio en una fiola de 100 mL con agua destilada. Luego el

extracto se aciduló con una solución de ácido clorhídrico al 1%. El

reactivo de Mayer precipita al alcaloide en medio ácido, dando un color

blanquecino amarillento, sin embargo este precipitado es poco soluble

en exceso de reactivo y completamente soluble en alcohol 14.

d) Identificación de Cumarinas

Fluorescencia con luz UV. Se diluyó 0.1 g del extracto en 2 mL de

alcohol etílico 96º. Luego se colocó en un tubo de ensayo y se llevó a

lámpara UV, las fluorescencias se intensifican agregando amoniaco 14.

e) Identificación de Sesquiterpenlactonas

Reacción de Baljet. Se emplearon dos soluciones que se mezclaron

en volúmenes iguales antes de usarse. Solución A, 1 g de ácido pícrico

en 100 mL de etanol de 96º, solución B, 10 g de hidróxido de sodio en

100 mL de agua. Para la prueba se colocó 2-3 mg del extracto y unas



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III-IV gotas de reactivo, siendo positiva si se forma coloración

anaranjada o roja oscura 14.

f) Identificación de Antraquinonas

Reacción de Bortranger. Se colocó en un tubo de ensayo una

pequeña porción de extracto y se añadió unos 5 mL de benceno,

agítese. El benceno toma color amarillo. Luego se trasvasó el benceno

a otro tubo de ensayo y añadir unas gotas de solución de KOH. La

aparición de una coloración roja indica la presencia de antraquinonas

14, 17.

g) Identificación de Saponinas

Reacción de Rossel. Se colocó en una cápsula de porcelana cantidad

suficiente de extracto, y se añadió unas gotas de ácido sulfúrico

concentrado. 14.

h) Identificación de Taninos

Reacción de Tricloruro férrico. Se preparó una solución de Tricloruro

de hierro al 3% y se agregó 20 gotas al extracto. Esta reacción se

utiliza para identificar compuestos que posean en su estructura una

función fenólica, como los taninos. Según la naturaleza química del

tanino se observarán coloraciones que varían desde el azul-negro

(pirogálicos) hasta verde (catéquicos) 14,17.



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III. RESULTADOS

Los resultados del Análisis Fitoquímico de las fracciones cromatográficas

obtenidas de hojas de Artemisia absinthium L. se muestran en las siguientes

tablas:

En la Tabla Nº 1 se presenta los metabolitos secundarios encontrados

en extractos Hexánico, Acetato Etílico, Diclorometano, Metanol y acuoso de

hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, identificados con reacciones de

coloración y precipitación.

En la Tabla Nº 2 se presenta los metabolitos secundarios encontrados

en fracciones cromatográficas en el extracto hexánico de hojas de Artemisia

absinthium “ajenjo” (fase móvil hexano-metanol), identificados con reacciones

de coloración y precipitación.

En la Tabla Nº 3, Nº 4, Nº 5 y Nº 6 se presenta los metabolitos

secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto acetato

etílico, diclorometano, metanólico y acuoso, respectivamente.



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TABLA Nº 1: Metabolitos secundarios encontrados en extractos Hexánico, Acetato Etílico, Diclorometano, Metanol y acuoso de

hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, identificados con reacciones de coloración y precipitación.

METABOLITOS PRUEBA

EXTRACTO

HEXANO

EXTRACTO

ACETATO ETILO

EXTRACTO

DICLOROMETANO

EXTRACTO

METANÓLICO

EXTRACTO

ACUOSO

Alcaloides Mayer - - +

+ +

Antraquinonas Bortranger - - + - -

Esteroles y

Terpenos

Lieberman –

Burchardat + + + + -

Flavonoides Shinoda - + + + +

Lactonas Baljet + + + - -

Taninos FeCl3 + + - + -

Cumarinas Fluorescencia - - - - -

Saponinas Rossel - - - - -

+ : Presencia del metabolito secundario

- : Ausencia del metabolito secundario



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TABLA Nº 2: Metabolitos secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto hexánico de hojas de Artemisia

absinthium “ajenjo” (fase móvil hexano-metanol), identificados con reacciones de coloración y precipitación.

Metabolitos Prueba Fracciones Cromatográficas del Extracto Hexánico

1 2 3 4 5 6 7 8

Alcaloides Mayer - - - - - - - -

Antraquinonas Bortranger - - - - - - - -

Esteroles y

Terpenoides Lieberman – Burchard - + - - + + - -

Flavonoides Shinoda - - - - - - - -

Lactonas Baljet - - + + - - - -

Taninos FeCl3 + - - - - - + +





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TABLA Nº 3: Metabolitos secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto acetato etílico de hojas de

Artemisia absinthium “ajenjo” (fase móvil: acetato móvil – metanol), identificados con reacciones de coloración y

precipitación.

Metabolitos Prueba Fracciones Cromatográficas del Extracto Acetato Etílico

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Alcaloides Mayer - - - - - - - - - -

Antraquinonas Bortranger - - - - - - - - - -

Esteroles y

Terpenoides

Lieberman –

Burchard + - - - + - - - + -

Flavonoides Shinoda - + + - - - - - - +

Lactonas Baljet - - - - - + - + - -

Taninos FeCl3 - - - + - - + - - -





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TABLA Nº 4: Metabolitos secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto diclorometano de hojas de

Artemisia absinthium “ajenjo” (fase móvil: diclorometano – metanol), identificados con reacciones de coloración y

precipitación.

Metabolitos Prueba Fracciones Cromatográficas del Extracto Diclorometano

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Alcaloides Mayer + - + + - - - - - -

Antraquinonas Bortranger - + - - - - - - - -

Esteroles y

terpenoides

Lieberman –

Burchard - - - - - - - + + -

Flavonoides Shinoda - - - - - - + - - +

Lactonas Baljet - - - - + + - - - -

Taninos FeCl3 - - - - - - - - - -





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TABLA Nº 5: Metabolitos secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto metanólico de hojas de

Artemisia absinthium “ajenjo” (fase móvil: metanol - hexano), identificados con reacciones de coloración y

precipitación.

Metabolitos Prueba Fracciones Cromatográficas del Extracto Metanólico

1 2 3 4 5 6 7 8

Alcaloides Mayer + - + - - - + -

Antraquinonas Bortranger - - - - - - - -

Esteroles y

Terpenoides Lieberman – Burchard - - - - + - - -

Flavonoides Shinoda - - - + - - - +

Lactonas Baljet - - - - - - - -

Taninos FeCl3 - + - - - + - -





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TABLA Nº 6: Metabolitos secundarios encontrados en fracciones cromatográficas en el extracto acuoso de hojas de Artemisia

absinthium “ajenjo” (fase móvil: metanol- hexano), identificados con reacciones de coloración y precipitación.

Metabolitos Prueba Fracciones Cromatográficas del Extracto acuoso

1 2 3 4 5 6

Alcaloides Mayer - - + - + -

Antraquinonas Bortranger - - - - - -

Esteroles y

Terpenoides Lieberman – Burchard - - - - - -

Flavonoides Shinoda + + - - - +

Lactonas Baljet - - - - - -

Taninos FeCl3 - - - - - -





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IV. DISCUSIÓN

En el presente trabajo se realizaron extracciones y separaciones

cromatográficas en las hojas Artemisia absinthium L., con la finalidad de

identificar los metabolitos secundarios presentes en cada fracción

cromatográfica. Para ello se realizó la identificación preliminar mediante

reacciones de coloración y de precipitación de los metabolitos secundarios

presentes en los diversos extractos obtenidos con solventes orgánicos de

diferente polaridad (Hexánico, Acetato Etílico, Diclorometano, Metanólico y

acuoso) en hojas de Artemisia absinthium L. “ajenjo”, notándose la

presencia de esteroles y terpenos en los extractos Hexánico, Acetato

Etílico, Diclorometano y Metanólico; alcaloides en los extractos

Diclorometano, Metanólico y acuoso; flavonoides en los extractos acetato

etílico, Diclorometano, Metanólico y acuoso; lactonas sesquiterpénicas en

los extractos Hexánico, Acetato Etílico, Diclorometano; mientras que

taninos, en los extractos Hexánico, Acetato Etílico y Metanólico. Es

importante resaltar que la presencia de esteroles solo se notó en el extracto

Diclorometano, no encontrándose saponinas y cumarinas en ninguno de los

extractos (Tabla Nº 1).

Luego de esta identificación se procedió a la separación de los

metabolitos secundario encontrado en los distintos extractos, mediante

cromatografía en columna, utilizando como fase móvil solventes orgánicos



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con sistemas de polaridad creciente. Las fracciones obtenidas fueron

evaluadas mediante cromatografía en capa fina, procediendo a unir

aquellas fracciones que presenten igual Rf 24,26.

Los metabolitos separados correspondientes a Alcaloides se

encontraron en las fracciones F1, F3, F4 – Diclorometano; F1, F3, F7 –

Metanólico y F3, F5- Acuoso (Tabla Nº 4, Nº 5 Y Nº 6). Los alcaloides en la

naturaleza se encuentran en forma de sales aunque también libres. Los

alcaloides son muy usados en farmacología y en medicina (analgésicos,

anestésicos, hipnóticos, cardiotónicos, hipotensores, tranquilizantes,

alucinógenos, eméticos, etc.) 5, 28.

Las fracciones que presentan antraquinonas correspondieron a F03

F04 – Diclorometano (Tabla Nº 4). Las Antraquinonas derivadas del

antraceno y el fenantreno, son principios activos laxantes y purgantes, en

sus formas de heterósido 3, 5, 6.

La presencia de Esteroles y terpenoides se identifico en las

fracciones F2, F5, F6 – Hexánico; F1, F5, F9- acetato etílico; F8, F9 –

Diclorometano; F5- Metanólico (Tabla Nº 2, Nº 3, Nº 4 y Nº 5). Los terpenos

presentan una gran diversidad de estructuras, formadas por unidades

repetidas de cinco carbonos (isopentil o isopreno), por lo que se pueden

encontrar formando parte de estructuras más complejas como por ejemplo

aceites esenciales. Los terpenos se dividen en cinco grupos de acuerdo con



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el número de unidades de isopreno que contenga su molécula, por lo tanto

existen monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, sesterterpenos,

triterpenos y politerpenos. Entre los principales usos terapéuticos se

encuentra que actúan como sedantes, tranquilizantes, hipnóticos,

antiespasmódicos, carminativos, analgésicos, antiinflamatorios, diuréticos,

coleréticos, antipiréticos, hipotensores, y antiarrítmicos 24, 28.

Se identificó flavonoides en las fracciones F2, F3 –Acetato etílico; F7.

F10- Diclorometano; F4, F8 –Metanólico, F1 F2 y F6- acuoso (Tabla Nº 3,

Nº 4, Nº 5 Y Nº 6). Los flavonoides son una familia muy diversa de

compuestos, aunque todos los productos finales se caracterizan por ser

polifenólicos y solubles en agua. Existen 6 clases principales, las

chalconas, las flavonas, los flavonoles, los flavanoles, las antocianidinas, y

los taninos condensados, y otras dos más, las xantonas y las auronas.

Poseen acciones terapéuticas muy variadas, tales como acción vitamínica,

antihemorrágica, antiarrítmicos, protectores de la pared vascular o capilar,

antiinflamatoria, antibacteriana, antifúngica, diurética, antiurémica y

antiespasmódica 28.

Las fracciones que presentan taninos fueron F1, F7, F8 – Hexánico;

F4, F7 – Acetato Etílico; F2, F6 – Metanólico (Tabla Nº 2, Nº 3 y Nº 5). Se

identificó la presencia de lactonas sesquiterpénicas en las fracciones F3,

F4-Hexánico; F6, F8 - Acetato Etílico, F5, F6 – Diclorometano (Tabla Nº 2,

Nº 3 y Nº 4). Los taninos son sustancias químicas complejas, no



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nitrogenadas, de diferente estructura química, dan con las sales de hierro

precipitados azules, negros o verdes. Su interés medicinal radica

principalmente en su carácter astringente, ya que por su propiedad de

coagular las albumina de las mucosas y de los tejidos, crea una capa de

coagulación aislante y protectora, que reduce la irritación y el dolor, además

de que detiene las pequeñas hemorragias 3, 28.

Según los resultados, las lactonas de naturaleza sesquiterpénica se

obtuvieron en mayor proporción en el solvente de más baja polaridad;

siendo ausentes en metanol y agua. Esto indica la presencia de lactonas

de naturaleza lipofílica, que tiene afinidad por los solventes apolares. Cabe

resaltar, también que las lactonas pueden estar en forma de glucósidos;

pero éstos son muy inestables (Glucósidos lactónicos) y que se pudieron

destruir en el tratamiento previo de la droga, a la marcha fitoquímica. Tal es

así que no aparecieron en el extracto acuoso. Mucciarelli (1995) afirma que

en muchos casos, la presencia de monoterpenos y sesquiterpenos en las

distintas especies de Artemisia son la razón de su aplicación etnobotánica,

identificándose en A. absinthium diferentes compuestos en dependencia de

su procedencia geográfica 7,11, 18, 20.



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V. RESUMEN Y CONCLUSIONES

En el presente trabajo se investigó los metabolitos secundarios en las

fracciones cromatográficas obtenidas de las hojas de Artemisia absinthium L. Para

tal fin se recolectaron hojas de Artemisia absinthium L., nombre común “ajenjo”, de

la Provincia de Contumazá, Departamento de Cajamarca, que fueron desecadas a

temperatura ambiente y en estufa a 45 ºC, pulverizadas y tratadas con solventes

Hexánico, Acetato Etílico, Diclorometánico, Metanólico y Acuoso, y obtener los

extractos correspondientes con una segunda separación mediante el

fraccionamiento en columna y confirmar la presencia de los metabolitos

secundarios con reacciones de coloración y precipitación.

De los resultados encontrados se concluye que los metabolitos secundarios

encontrados en las diferentes fracciones cromatográficas evaluadas con

reacciones de coloración son: Alcaloides, Flavonoides, Taninos, Antraquinonas,

Lactonas, Esteroles y Terpenoides.



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VI. RECOMENDACIONES

Por el uso de Artemisia absinthium L. “ajenjo” en medicina tradicional es

importante continuar estos estudios de investigación a fin de determinar los

metabolitos responsables de los efectos farmacológicos atribuidos a esta

planta.



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ANEXO Nº 1: Artemisia absinthium L. “Ajenjo”.



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ANEXO Nº 2: Separación cromatográfica de los metabolitos secundarios.

ANEXO Nº 3: Fracciones cromatográficas obtenidas.



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ANEXO Nº 4: Cromatografía en capa fina y determinación de Rf de

las fracciones obtenidas.

ANEXO Nº 5: Identificación de Flavonoides mediante Reacción de

Shinoda.



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ANEXO Nº 6: Identificación de Esteroles mediante Reacción de

Lieberman – Buchardat.

ANEXO Nº 7: Identificación de Alcaloides mediante Reacción de Mayer



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ANEXO Nº 8: Identificación de Sesquiterpenlactonas mediante Reacción

de Baljet.

ANEXO Nº 9: Identificación de Taninos mediante Reacción de Tricloruro

férrico.



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SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA E IDENTIFICACIÓN DE TRABAJO DE …