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SEPSEA Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Centro de Analises Proteômicas e Bioquímicas
O uso da clavanina A nanoestruturada
no controle da sepse polimicrobiana
Brasília - DF
2012
Autor: Amanda Caroline Marques Saúde
Orientador: Dr. Octávio Luiz Franco
Coorientador: Drª Simoní Campos Dias
AMANDA CAROLINE MARQUES SAÚDE
O USO DA CLAVANINA A NANOESTRUTURADA
NO CONTROLE DA SEPSE POLIMICROBIANA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Titulo de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Dr. Octávio Luiz Franco
Coorientadora: Simoní Campos Dias
Brasília
2012
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB
26/09/2012
S255u Saúde, Amanda Caroline Marques.
O uso da clavanina a nanoestruturada no controle de sepse
polimicrobiana. / Amanda Caroline Marques Saúde – 2012.
89f. ; il.: 30 cm
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de
Brasília, 2012.
Orientação: Prof. Dr. Octávio Luiz Franco
Coorientação: Simoni Campos Dias
1. Doenças bacterianas. 2. Serviços de saúde. 3. Engenharia
genética. I. Franco, Octávio Luiz, orient. II. Dias, Simoni Campos,
coorient. III.Título.
CDU 575
Dissertação de autoria de Amanda Caroline Marques Saúde, intitulada “O uso da Clavanina A
nanoestruturada no controle de sepse polimicrobiana”, apresentada como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica
de Brasília, em 09 de fevereiro de 2012, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo
assinada:
________________________________________________
Prof. Dr. Octávio Luiz Franco
Universidade Católica de Brasília.
_______________________________________________
Profª. Dra. Simoni Campos Dias
Universidade Católica de Brasília.
_______________________________________________
Drª.Susana Elisa Moreno
Universidade Católica Dom Bosco
(Examinador externo)
_______________________________________________
Dr. João Alexandre R. G. Barbosa
Universidade Católica de Brasília.
Brasília
2012
Dedico este trabalho aos meus pais, que me
propiciaram uma vida digna, e me ensinaram que tudo
é possível desde que sejamos honestos e tenhamos a
convicção de que sempre existem escolhas e, que a
desistência não é uma delas. E que sonhar e
concretizar são verbos proporcionais a nossa vontade.
AGRADECIMENTO
Aos meus pais que possibilitaram a realização desse sonho;
Aos meus irmãos que me apoiaram a continuar acreditando em tudo que ainda posso realizar.
Ao meu companheiro Marcio, que me apoiou de forma indescritível;
Ao professor Octávio Luiz Franco, que me apresentou o mundo científico e me mostrou os
melhores caminhos;
A professora Simoní Campos Dias, que além de coorientadora se tornou uma grande amiga;
Aos amigos, Alicia Ombredane, Bernardo Petriz e Mariana Dornelles que sempre estiveram ao
meu lado me ajudando e apoiando;
A todos do grupo CAPB, por proporcionarem um ambiente de trabalho agradável e propício ao
conhecimento científico e
Aos colaboradores João Alexandre R. G. Barbosa, Luciano Paulino da Silva, Osmar Nascimento
Silva e Susana Elisa Moreno por todo o auxilio e dedicação.
SAÚDE, A. C. M. O uso da clavanina A nanoestruturada no controle da sepse polimicrobiana. Tese
(Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia). Universidade Católica de Brasília. Brasília –DF. 2012.
RESUMO
A resistência de bactérias infecciosas a antibióticos têm sido considerada um enorme
problema mundial. Alguns estudos têm demonstrado a eficiência de peptídeos extraídos de
animais marinhos contra bactérias patogênicas humanas. Dentre estes, as clavaninas,
peptídeos catiônicos isolados do tunicado marinho Styela clava, apresentam uma grande
atividade bactericida. Neste trabalho a nanobiotecnologia foi utilizada para encapsular
clavanina A, objetivando o desenvolvimento de nanoantibióticos injetáveis contra sepse
bacteriana. Para isso, a clavanina A foi dissolvida em solução de polímero Eudragit® L100-
55 e copolímero Eudragit® RS30D (3:1 m:m). Os dados obtidos por microscopia de força
atômica e espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico, demonstraram que as
nanopartículas secas apresentam cerca de 120 nm e em solução apresentam 372 nm,
respectivamente, com potencial zeta de -7,16 mV e índice de polidispersão de 0,123. A taxa
de encapsulação foi de 98 %, obtida utilizando-se cromatografia de fase reversa em coluna
Phenomenex C-18. Bioensaios in vitro demonstraram que a clavanina A nanoestruturada
apresentou 91 % de atividade bactericida, enquanto o peptídeo livre utilizando-se uma
concentração de 2 g.ml-1, não apresentou atividade inibitória. Nas mesmas concentrações
o peptídeo nanoestruturado causou 20 % de inibição do desenvolvimento de K. pneumoniae
e 40 % de P. aeruginosa. Não foi encontrada atividade inibitória contra as cepas de E. coli.
As nanopartículas contendo o peptídeo antimicrobiano clavanina A não apresentaram
atividade hemolítica. Os ensaios de sepse in vivo foram realizados utilizando-se
camundongos C57BL6 inoculados com 25 l de suspensão bacteriana contendo as quatro
espécies bacterianas previamente coletadas do ceco de camundongos. Estes ensaios
apresentaram 60 % de sobrevida dos camundongos induzidos a sepse letal na presença do
peptídeo nanoestruturado (2 g.ml-1). A clavanina A livre, em concentrações similares, não
apresentou nenhum efeito de sobrevida. Os dados aqui reportados mostram que a clavanina
A associada à nanoestrutura tem sua atividade aumentada e pode ser utilizada no
tratamento de infecções bacterianas. Desta maneira, estes estudos sugerem que as
nanopartículas podem ser utilizadas como uma metodologia eficaz no desenvolvimento de
produtos farmacêuticos e biotecnológicos através da potencialização da ação dos peptídeos
nanoencapsulados.
Palavras chave: Nanobiotecnologia. Clavanina A. Nanopartículas. Sepse.
ABSTRACT
The resistance of infectious bacteria against current medicines is a worldwide problem.
Previous studies have demonstrated the efficacy of peptides extracted from marine animals
against human pathogenic bacteria. Among them clavanins, which are antimicrobial peptides
isolated from marine tunicate Styela clava, show 23 amino acids residues, cationic properties
and also high bactericidal activity. In this work nanobiotechnology was used to encapsulate
the antimicrobial peptide clavanin A aiming to develop injectable nanoantibiotics against
bacterial sepsis. Firstly, clavanin A was dissolved in a polymer Eudragit® L100-55 and
copolymer Eudragit® RS30D solution (3:1 w:w). Atomic force microscopy and dynamic light
scattering showed dry nanoparticles ranging from height of 120 nm and nanoparticles in
aqueous solution with 372 nm, respectively, with zeta potential of -7,16 mV and
polidispersion index of 0.123 mV. An encapsulation rate of 98 % was assessed by using a
Phenomenex C-18 column reversed-phase chromatography. Bioassays showed that
nanostructured clavanin caused 91 % of S. aureus inhibition, while free peptide at a standard
concentration of 2 g.ml-1, was unable to inhibit bacterial development. Similar
concentrations of nanostructured peptide caused 20 % of development inhibition of K.
pneumoniae and 40 % of P. aeruginosa. Any inhibitory activity against E. coli was observed.
Furthermore, these structures do not showed hemolytic activity. In vivo sepsis bioassays
were performed by using C57BL6 mice inoculated with 25 l of bacterial suspension
containing the four bacterial species previously collected from mice cecum. These assays
presented a 60 % survival in mice induced to lethal sepsis in the presence of nanoformulated
peptides (2 g.ml-1). Free clavanin A at similar concentrations do not show any effect over
survival. Data here reported showed that clavanin A associated to nanostructures have their
antimicrobial activity improved and apparently could be utilized to threat bacterial infections.
Therefore, this study suggests that nanoparticles could be used as an effective method to
develop pharmaceuticals and biotechnology products using the potentialization of
nanoencapsulated peptides.
Key words: Nanobiotecnhology. Clavanin A. Nanoparticles. Sepsis.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AFM (Atomic force microscopy)- Microscopia de Força Atômica
ANBIO – Associação Nacional de Biossegurança
CDC (Centre for Disease Control and Prevention) – Centro de controle e prevenção de
doenças
CO2 – Gás carbônico
DLS (Dinamic light scattering) – Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico
EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) – ácido etilenodiamino tetra-acético
EHEC (Entero-hemorragic Escherichia coli) – Escherichia coli entero-hemorragica
ESBL - Enterobactérias produtoras de -lactamases
g – Gravidade
HPMC – Hidroxipopilmetil celulose
IAAS – Infecções Adquiridas em Serviços de Saúde
KPC - Klebsiela pneumoniae carpabenemase
M – Molar
mg – Miligrama
MIC – Concentração inibitória mínima
ml – Mililitro
MRPa – (Multi-drug Resistant Pseudomonas aeruginosa)
MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) – Staphylococcus aureus resistente a
meticilina.
MRSE (Methicilin resistant Staphylococcus epidermis) - Staphylococcus epidermis resistente
a meticilina
nm – Nanômetros
OMS – Organização Mundial de Saúde
PAMs – Peptídeos antimicrobianos
PBP (Penicilin Binding Protein) – Proteína ligada a penicilina
PBS (Phosphate buffered saline) – Tampão fosfato salino
PDI (polidispesity índex) – Índice de polidispersividade
PEG – Poli etileno glycol
PLGA ( poly(lactic-co-glycolic acid)) – Ácido polilático co-glicólico
SEM (Scanning eletron microscopy) – Microscopia eletrônica de varredura
SHU – Sindrome Hemolítica Urêmica
SIM – Sulfito, indol e motilidade
SIRS (Systemic inflammatory response syndrome) – Síndrome da resposta inflamatória
sistêmica
SRIS – Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
TFA – Ácido Triflouracético
TLRs – Receptores tool-like
TSI – Triplo, açúcar e ferro
UFC – Unidade Formadora de colônias
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
VISA (Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus) - Staphylococcus aureus resistente
a vancomicina
VRSA (Vancomycin resistant Staphylococcus aureus) - Staphylococcus aureus resistente a
meticilina.
g – Micrograma
l – Microlitro
LISTA DE TABELAS
Quadro 1: Principais agentes bacterianos causadores de Infecções Adquiridas em Sistemas
de Saúde e tipo de infecção a que estão relacionadas. 20
Quadro 2: Peptídeos antimicrobianos isolados de animais marinhos. 35
Quadro 3: Sequências primárias das clavaninas A-D. 37
Quadro 4: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes de sepse in vivo,
realizados em camundongos C57B6 (black) : 52
Quadro 5: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes inflamatórios in vivo,
realizados em camundongos C57B6 (black) : 53
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Porcentagem de uso de antibióticos sem prescrição médica nos diferentes países.
São descritas em vermelho as áreas que apresentam mais de 50 % de uso de antibióticos
sem prescrição médica, em roxo às que apresentam entre 20 e 50 %, em verde entre 5 e 19
% e em azul àquelas com menos de 5 %. 21
Figura 2: (A) Colônias típicas de S. aureus e (B) microscopia eletrônica de colônias de S.
aureus. 23
Figura 3: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de K. pneumoniae. 26
Figura 4: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de E. coli. 28
Figura 5: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de P. aeruginosa. 29
Figura 6: Mecanismos de formação de poros em membranas bacterianas por PAMs.
32
Figura 7: Múltiplas atividades relacionadas a funções antimicrobianas e imunomodulatórias,
apresentadas por diversos PAMs. 33
Figura 8: Tunicado Styela clava, do qual foi extraído o peptídeo antimicrobiano clavanina A
36
Figura 9: Exemplos de tipos de nanoestruturas utilizadas como carreadores de moléculas
bioativas (ilustração esquemática). (A) Dendrimeros, (B) Nanoemulsões, (C) Nanopartículas
Lipídicas sólidas, (D) Lipossomas (E) Nanopartícula metálicas (F) Ciclodextrina, (G)
Nanopartículas poliméricas (H) Nanotubo de carbono e (I) Fulerenos. 40
Figura 10: Nanopartículas poliméricas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas
(ilustração esquemática). (A) Nanoesferas e (B) nanocápsulas 41
Figura 11: Estrutura molecular dos polímeros Eudragit® L100-55 (A) e RS 30D (B). 42
Figura 12: Nanoestruturas formadas a partir de sistema de emulsificação o/a, utilizando
polímero e copolímero em proporção 1:3 (respectivamente) adicionados de 100 g de
clavanina “A” sintética. Amostra não centrifugada e não diluída. 55
Figura 13. Nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em
proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Imagens
obtidas por microscopia de força atômica, utilizando aparelho Agilent 9600 (Shimadzu,
Japão). Para obtenção da imagem utilizou-se superfície de mica muscovita. As imagens
foram corrigidas nos planos X e Y, as linhas que apresentavam má formação foram
retiradas. (A) Área de varredura de 50 x 50 m e (B) Área de varredura de 10 x 10 m.
56
Figura 14. Diâmetro das nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero
em proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética.
Análise obtida utilizando-se metodologia de Dynamic light scattering (DLS) em aparelho
Malvern Zetasizer Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso,
permitindo uma análise em solução de suas dimensões e propriedades. 58
Figura 15. Potencial zeta, das nanopartículas obtidas utilizando polímero e copolímero em
proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. As
análises foram realizadas utilizando-se Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern
Zetasizer Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma
análise em solução de suas dimensões e propriedades. 60
Figura 16. Teste de liberação com leituras a cada 12 horas, totalizando 48 h. Quantificação
de liberação por cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex C-18. Utilizou-se
como parâmetro de quantificação a área do pico referente à presença do peptídeo,
comparada a área de picos previamente conhecidos, utilizando-se curva padrão de
quantificação. 62
Figura 17. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a
uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus. Utilizou-se como controle
negativo (c-) água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial
cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão. 63
Figura 18. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a
uma concentração de 12g, contra Klebsiella pneumoniae. Utilizou-se como controle
negativo (c-) água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial
cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão. 64
Figura 19 Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a
uma concentração de 12g, contra Escherichia coli. Utilizou-se como controle negativo (c-)
água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1.
As barras verticais representam o desvio padrão. 64
Figura 20. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a
uma concentração de 12g, contra Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle
negativo (c-) água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial
cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão. 65
Figura 21. Avaliação de atividade antibacteriana das nanopartículas contendo clavanina A
(N+P), a uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoneae e Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-)
água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1.,
como comparativo foram utilizados o peptídeo livre (P.L.) e as nanopartículas sem o
peptídeo (N). As barras verticais representam o desvio padrão. 66
Figura 22. Ensaio hemolítico realizado com o uso de Triton X-100 0,1% como controle
positivo (C+), PBS 0,01M como controle negativo (C-). As barras verticais correspondem ao
desvio padrão. Foram utilizadas 12 g do peptídeo (clavanina A), as nanopartículas sem o
peptídeo e as nanopartículas contendo o peptídeo (12 g). 67
Figura 23. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse subletal intraperitoneal,
com administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de
sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P.
aeruginosa e K. pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o peptídeo
nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo,
utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do
peptídeo clavanina A). 69
Figura 24. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse letal intraperitoneal, com
administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse
foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.)
foi comparado com o peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o
qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo
nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A). 70
Figura 25. Análises de correlação de sepse e migração, realizadas após a indução de sepse
letal por via intraperitonial, com administração dos tratamentos de cada grupo. Os grupos
foram divididos em Letal, controle positivo (C+), 2 g de peptídeo nanoestruturado (Pep.
Nano) e nanoestrutura (Nano). A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de
bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. O lavado
peritoneal foi obtido após 6 horas de indução de sepse. A análise estatística foi realizada por
ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras foram comparadas entre sí,
objetivando demonstrar sua similaridade (*). 72
Figura 26. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por
carragenina, administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de
cada grupo. A obtenção do lavado peritoneal foi realizada após 6 horas da administração do
indutor inflamatório. Foram utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e
negativo a carragenina 500 g (Car.), as amostras de peptídeo livre (pep. Livre), peptídeo
nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nanoest.) foram comparadas aos controles
negativo e positivo visando a observação do efeito anti-inflamatório. A análise estatística foi
realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p<0,05, onde as amostras foram
comparadas com as amostras controles sendo marcadas aquelas de acordo com a
similaridade entre a amostra e a solução salina (+) e a carragenina (*). 75
Figura 27. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por
carragenina, administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de
cada grupo. A obtenção do lavado peritoneal foi realizada após 12 horas da administração
do indutor inflamatório. Foram utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e
negativo a carragenina 500 g (Car.), as amostras de peptídeo livre (Pep. Livre), peptídeo
nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nanoest.) foram comparadas aos controles
negativo e positivo visando a observação do efeito anti-inflamatório. A análise estatística foi
realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras foram
comparadas com as amostras controles sendo marcada a similaridade entre a amostra e a
solução salina (*), a carragenina (+) e a dexametasona (#). 76
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 18
1.1 INFECÇÕES ADQUIRIDAS EM SERVIÇOS DE SAÚDE (IASS) ..................... 18
1.2 INFECÇÕES SEPTICÊMICAS: DEFINIÇÕES E AGENTES CAUSAIS ........... 22
1.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS ...................................................................... 23
1.4 KLEBSIELLA PNEUMONIAE .......................................................................... 25
1.5 ESCHERICHIA COLI ....................................................................................... 27
1.6 PSEUDOMONAS AERUGINOSA .................................................................... 29
1.7 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS .................................................................. 30
1.8 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM ANIMAIS MARINHOS ........................ 33
1.9 CLAVANINAS .................................................................................................. 36
1.10 NANOBIOTECNOLOGIA................................................................................. 38
1.10.1 Nanocarreadores e sistemas poliméricos ......................................... 40
2. HIPÓTESE .......................................................................................................... 44
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 45
4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 46
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 46
5. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 47
5.1 SÍNTESE E DETERMINAÇÃO DE PUREZA DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS:
47
5.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS: ............................ 47
5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA .............................................................................. 48
5.3.1 Microscopia de Força Atômica ........................................................... 48
5.3.2 Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico ........................... 48
5.4 BIOENSAIOS IN VITRO .................................................................................. 50
5.5 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO ................................................................ 49
5.5.1 Quantificação de encapsulação ......................................................... 49
5.5.2 Testes de liberação in vitro ................................................................. 50
5.6 ANÁLISES IN VIVO ......................................................................................... 50
5.6.1 AVALIAÇÃO DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS ................................ 52
6. RESULTADOS .................................................................................................... 54
6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS: .................................................... 54
6.1.1 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO E LIBERAÇÃO SUSTENTADA IN VITRO:
61
6.2 Ensaios in vitro .............................................................................................. 63
6.2.1 TESTE DE HEMÓLISE .......................................................................... 67
6.3 Análises in vivo ............................................................................................. 68
6.3.1 SOBREVIDA.......................................................................................... 68
6.3.2 ANÁLISES DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS: .................................. 73
6.3.3 ANÁLISES DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS APÓS INDUÇÃO DE SEPSE
71
7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 78
8. REFERÊNCIAS: .................................................................................................. 79
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 INFECÇÕES ADQUIRIDAS EM SERVIÇOS DE SAÚDE (IASS)
Diferente das infecções contraídas fora do ambiente hospitalar, também conhecidas
como infecções contraídas em comunidades, as infecções hospitalares são caracterizadas
como sendo adquiridas após a admissão em hospitais, se manifestando durante a
internação ou até mesmo após a alta e, podendo se relacionar com a internação ou com
procedimentos hospitalares (DOUGLAS, LUM, ROY ET AL., 2004). No entanto essas infecções
não estão restritas aos ambientes hospitalares; podendo estar relacionadas a todos os
locais onde há assistência ao paciente, envolvendo sistemas de não-internação, como
enfermarias, ambulatórios e consultórios, o que amplia a denominação de infecções
hospitalares para Infecções Adquiridas em Serviços de Saúde (IASS) (DOUGLAS ET AL.,
2004; PITTET, ALLEGRANZI, STORR ET AL., 2008). O aumento de infecções relacionadas aos
sistemas de saúde tem representado uma das principais causas de mortalidade e aumento
nos custos hospitalares, uma vez que prolongam o tempo de internação e valor dos
tratamentos (WEINSTEIN, 1998; PITTET ET AL., 2008).
Atualmente as IASS afetam milhões de pessoas por ano em todo o mundo,
representando um problema de saúde pública global. Estima-se que a incidência das IASS
seja em torno de 5-10 % nos países desenvolvidos e com frequência média de 27 % nos
países em desenvolvimento (PITTET ET AL., 2008). Segundo dados do Center for Disease
Control and Prevention (CDC), avalia-se que nos Estados Unidos ocorram dois milhões de
casos por ano com aproximadamente 5 % de óbito, estes casos levam a custo hospitalar de
US$ 4,5 bilhões. Em países em desenvolvimento como a Albânia, o Brasil, a Tanzânia, a
Tailândia e a Tunísia estima-se que 27 % dos pacientes internados em Unidades de Terapia
Intensiva (UTIs) adquiram IASS (PITTET ET AL., 2008). Segundo a Associação Nacional de
Biossegurança (Anbio), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e a Organização
mundial de Saúde (OMS) a incidência de infecções hospitalares representa entre 14 % e 19
% dos casos registrados em hospitais brasileiros. Esta porcentagem chega a representar
cerca de 100 mil óbitos por todo o Brasil (BENEVIDES, 2011).
Os índices de morbidade associados à IASS são diretamente relacionados à gravidade
da doença que levou o paciente ao sistema de saúde, as condições nutricionais, aos tipos
de procedimentos diagnósticos ou terapêuticos e ao tempo de permanência do paciente no
hospital (KLEVENS, MORRISON, NADLE ET AL., 2007). As UTIs tendem a apresentar índices
maiores de morbidade, uma vez que o estágio inicial e a intensidade de procedimentos, aos
19
quais os pacientes são submetidos, apresentam-se de forma mais grave do que nos demais
pacientes (PITTET ET AL., 2008).
Inúmeros micro-organismos são responsáveis pela formação da microbiota hospitalar,
sendo formada principalmente por bactérias, fungos e vírus (comumente destacados como
principais causadores de IASS). Entretanto, as bactérias estão relacionadas a 87 % dos
casos, representando assim, os principais agentes causadores destas infecções. Dentre as
infecções hospitalares estima-se que 32 % correspondem a infecções de trato urinário, 22 %
a infecções de sítio cirúrgico, 15 % a infecções pulmonares e 14 % a infecções da corrente
sanguínea, sendo que em UTIs, esta última pode chegar a taxas alarmantes de até 50 %
(KLEVENS ET AL., 2007).
Muitas bactérias constituem a microbiota humana normal, podendo causar
infecções em indivíduos imunodeprimidos ou debilitados. Outras bactérias são
naturalmente patogênicas, além de possuírem maior virulência, podendo causar
infecções esporádicas ou epidêmicas, independente do estado do hospedeiro (OMS,
2002; ANVISA, 2004). Dentre os micro-organismos patogênicos supracitados estão as
bactérias Gram-positivas como Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis e
as bactérias Gram-negativas como Escherichia coli, Pseudomonas sp., Klebsiella sp.,
Proteus sp., Enterobacter sp. e Serratia sp. No Quadro 1 observam-se os principais sítios
de isolamento destes patógenos (CARVALHARES, PESQUERO, QUINTANA ET AL., 2008).
20
Quadro 1: Principais agentes bacterianos causadores de Infecções Adquiridas em Sistemas
de Saúde e tipo de infecção a que estão relacionadas.
Patógeno Sítios de isolamento
Gram-negativas
Escherichia coli Trato urinário, feridas cirúrgicas e sangue
Pseudomonas aeruginosa Trato urinário, trato respiratório e queimaduras
Klebsiella pneumoniae Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.
Proteus mirabilis Trato urinário e em feridas cirúrgicas.
Enterobacter aerogenes Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.
Serratia marcescens Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.
Gram-positivas
Staphylococcus aureus Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas e sangue.
Staphylococcus epidemidis Trato respiratório, pele e sangue
*Adaptado de: Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA; (2004) e Carneiro; (2008)
O aumento dos custos associados a tratamentos de pacientes com infecções
causadas por micro-organismos resistentes está diretamente relacionado com a escassez
de medicamentos específicos aumentando a estadia do paciente nos hospitais (WEINSTEIN,
1998; PITTET ET AL., 2008). Além dos organismos abaixo citados serem comumente
encontrados em sítios de infecções adquiridas nos sistemas de saúde, cepas resistentes
destes micro-organismos apresentam-se como um dos maiores problemas relacionados à
IASS (CARVALHARES ET AL., 2008). A evidência de resistência microbiana foi primeiramente
descrita em 1929, pelo bacteriologista Alexander Fleming que descreveu o primeiro
antibiótico isolado, a penicilina. Com esse estudo Fleming demonstrou também a resistência
de alguns micro-organismos, como Enterobactérias e Pseudomonas aeruginosa, a esse
medicamento (FLEMING, 1929).
Atualmente discute-se a relação entre a resistência bacteriana e a adaptação fisiológica em
resposta à mudança no ambiente, especialmente na membrana externa de natureza
lipoprotéica, que por sua vez, atua limitando a entrada de muitos tipos de moléculas,
21
inclusive agentes antibacterianos. Algumas bactérias Gram-negativas possuem, por
exemplo, a capacidade de responder a pressão de seleção por hidrolise do anel -lactâmico
por meio de lactamases, além de apresentar um fator de resistência conhecido como fator
R, plasmídeo que configura a resistência aos antibióticos, o qual pode ser disseminado por
conjugação (TAVARES, 2005; CARVALHARES ET AL., 2008; PADRÃO, MONTEIRO, MACIEL ET AL.,
2010).
Alguns autores ressaltam ainda, a ocorrência de mutações possivelmente induzidas
pelo uso indiscriminado de antibióticos em ambientes propícios a seleções mutagênicas
(como em hospitais, por exemplo). Morgan e colaboradores (2011) revisaram o uso de
antibióticos sem prescrição médica em trinta e cinco países, neste trabalho os autores
enfatizaram o alto índice de uso indiscriminado de antibióticos nos cinco continentes, como
demonstra a Figura 1. Com intuito de diminuir a ocorrência destes eventos, a Organização
Mundial da Saúde enfatiza a importância do uso de medicamentos apropriados para as
diversas condições clínicas, bem como a prescrição em doses adequadas e por período
suficiente para cura (PALMEIRA AND DA SILVA, 1994; SADER, MENDES, MONTELLI ET AL., 1998;
UENO AND JORGE, 2001; MARSARO JR, L;, LAZZARI ET AL., 2005).
Figura 1: Porcentagem de uso de antibióticos sem prescrição médica nos diferentes países.
São descritas em vermelho as áreas que apresentam mais de 50 % de uso de antibióticos
sem prescrição médica, em roxo às que apresentam entre 20 e 50 %, em verde entre 5 e 19
% e em azul àquelas com menos de 5 %.
*Fonte: (MORGAN, OKEKE, LAXMINARAYAN ET AL., 2011).
22
Para isso, faz-se necessária a existência de protocolos estratégicos que garantam a
prescrição e o uso racionais dos antibióticos atuais, após a restrição da venda destes
antibióticos não foi encontrado na literatura trabalhos que especifiquem as porcentagens de
uso indevido de antibióticos. Neste sentido o conhecimento sobre o perfil bacteriológico
encontrado nas UTIs permite o uso de antimicrobianos específicos, diminuindo
proporcionalmente o aparecimento de cepas multi-resistentes (OMS, 2002; CARVALHARES ET
AL., 2008; PADRÃO ET AL., 2010).
1.2 SEPSE: DEFINIÇÕES E AGENTES CAUSAIS
A definição e classificação de infecções que evoluem a quadros de sepse, sepse
grave e choque séptico relacionam-se diretamente à Síndrome da Resposta Inflamatória
Sistêmica (SRIS), esta resposta inflamatória pode ser desencadeada por diversos fatores,
dentre eles pode-se citar quadros de infecções, pancreatite, politrauma, isquemia, choque
hemorrágico, cirurgias e queimaduras (Bone, 1997). Desta forma a sepse caracteriza-se
pelo desencadeamento de SIRS relacionado a uma infecção, podendo, no entanto, evoluir
apresentando quadros de disfunções orgânicas secundárias, passando a ser definida como
sepse grave e, por fim, instabilidade cardiovascular, requerendo vasopressores, sendo
definida como choque séptico (MEDICINE, 1992 ).
A problemática causada pela grande incidência de infecções adquiridas em serviços
de saúde apresenta índices de morbidade diretamente relacionados ao estado inicial do
paciente e a intensidade de procedimentos, aos quais os pacientes são submetidos. Neste
sentido, a sepse apresenta-se como uma infecção de grande incidência e de difícil
tratamento, mesmo àquelas que não representam IASS (MEDICINE, 1992 ). Nos Estados
Unidos estima-se que de 20 a 80 % dos casos de sepse em UTI levem a óbito. Na América
Latina, incluindo o Brasil, os dados sobre a incidência de sepse são raros. No entanto,
estima-se que a incidência de sepse seja de 27 %, sendo que 23 % levam a óbito (SILVA
AND OTHER, 2002; CARVALHO, VIEIRA, FILHO ET AL., 2010).
Dentre os micro-organismos relacionados a septicemias são destacados fungos, vírus,
e bactérias. Dentre as bactérias são isoladas, principalmente, P. aeruginosa em 26,4 % dos
casos, S. aureus em 31,2 % dos casos, E. coli em 15,5 % e Klebisiella sp. em 8,59 %
(SALES JÚNIOR, DAVID, HATUM ET AL., 2006; CARVALHO ET AL., 2010). Poucas estratégias
utilizadas no tratamento da sepse bacteriana apresentam resultados positivos. Há grande
dificuldade de se encontrar fármacos eficazes no controle da infecção, SIRS e alterações
cardiovasculares. A Campanha de Sobrevivência a Sepse (Surviving Sepsis Campaign),
23
publicada em 2005 e revisada em 2008, teve como objetivo reduzir a mortalidade por
septicemias em 25 % em cinco anos, para isso o programa reforça o conceito de que no
tratamento da sepse tanto a precocidade quanto as ações guiadas por metas são de suma
importância, uma vez que essa infecção se apresenta como uma síndrome complexa, mas
reversível se abordada precocemente (HENKIN, COELHO, PAGANELLA ET AL., 2009; ARAÚJO,
2011).
1.3 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus são cocos Gram-positivos da família Staphylococcaceae/
Micrococcaceae. Estes micro-organismos são catalase e coagulase positivos e oxidase-
negativos, apresentam diâmetro aproximado de 1,0 µm, são anaeróbios facultativos e
não esporulados, podem ser encontradas ao menos 200 variedades de espécies
(DURAI,NG AND HOQUE, 2010). S. aureus constituem uma colônia de cor amarelada
devido à produção de uma série de carotenóides, e distribuição na forma de cachos
irregulares (Figura 2), uma vez que as células se dividem sucessivamente em três planos
perpendiculares havendo ligação entre as células irmãs, após cada divisão sucessiva,
fato este, que determina a nomenclatura estafilococcus (MARSHALL AND WILMOTH, 1981).
S. aureus pode crescer em uma faixa de temperatura de 7,0 a 48,5 ºC (com temperatura
ótima entre 30-37 ºC), em pH entre 4,2-9,3 (sendo o pH ótimo entre 7,0-7,5) e em
concentrações de cloreto de sódio bastante elevados, cerca de 15 % (DURAI ET AL.,
2010).
Figura 2: (A) Colônias típicas de S. aureus e (B) microscopia eletrônica de colônias de S.
aureus.
*Fonte: Figura A (http://profjabiorritmo.blogspot.com) / 2011 e figura B
(http://farmaciainfoco.blogspot.com) / 2011. A B
A B
24
Na maioria dos casos S. aureus pode habitar o corpo humano sem causar danos.
Estima-se que 60 % dos seres humanos saudáveis sejam portadores intermitentes de S.
aureus (LE LOIR,BARON AND GAUTIER, 2003). Quando em situações onde o sistema
imunológico encontra-se reprimido, como em casos de infecções secundárias (injúrias da
pele e doenças crônicas), o paciente pode se tornar vulnerável a infecções por esta
bactéria. A colonização por S. aureus pode causar inúmeras patologias, como por
exemplo, infecções localizadas ou disseminadas dentre elas foliculites, furúnculos,
carbúnculos, intoxicação alimentar, síndrome do choque tóxico, pneumonia, bacteremia,
gastroenterite estafilocócica, endocardite e osteomielite (MARSHALL AND WILMOTH, 1981;
LE LOIR ET AL., 2003). S. aureus coloniza principalmente o trato respiratório superior,
habitando primariamente a mucosa da nasofaringe. No entanto esta bactéria pode ser
encontrada regularmente em outros epitélios incluindo a pele, cavidade oral e o trato
gastrointestinal (KLUYTMANS,VANBELKUM AND VERBRUGH, 1997; LE LOIR ET AL., 2003).
A grande variedade de doenças humanas a que está relacionada S. aureus deve-
se a sua capacidade de produzir toxinas, exoenzimas, adesinas e proteínas
imunomoduladoras (LE LOIR ET AL., 2003). Desta forma a patogênese da infecção por S.
aureus pode ser caracterizada por um processo complexo, que envolve uma gama
diversificada de fatores de virulência associados à parede celular e secreção de
proteínas. Estas proteínas podem ser expressas coordenadamente em diferentes fases
de infecção tornando o tratamento ineficaz para cada fase infecciosa (NOVICK, PROJAN,
ROSENBLUM ET AL., 1984).
A produção de fatores de virulência em S. aureus tem sido controlada em
resposta a densidade de células, pelo fenômeno denominado quorum sensing, o qual
corresponde ao processo de comunicação intra e interespécies microbianas que permite
a regulação da expressão gênica em resposta a flutuações na densidade da população
celular. Além disto, fatores como a disponibilidade de energia e sinais ambientais são
produzidos quando necessário (NOVICK, 2003). Estes fatores podem ser organizados em
a) fatores de aderência como fibrinogênio, fibronectina, elastina e coagulase; b) fatores
relacionados à evasão da defesa do hospedeiro como enterotoxinas estafilocócicas (SEs
A-E, G-J, K, L, M, O e P), toxina esfoliativa A e TSST, proteína A, lipases e
polissacarídeos capsulares e c) fatores relacionados com a invasão e penetração/adesão
como toxinas α, β, δ, γ e δ – hemolisinas (NOVICK, 2003).
A resistência de S. aureus a penicilina surgiu após alguns anos de uso do
antibiótico, quando foram encontradas cepas de S. aureus capazes de produzir a enzima
25
penicilinase, a qual destrói a penicilina por hidrólise enzimática. Após a rápida disperção
do gene plasmidial que codifica a penicilinase tornou-se necessário o desenvolvimento de
antibióticos mais eficazes como a meticilina, uma penicilina modificada desenhada para
resistir à ação destrutiva da penicilinase estafilocócica. Porém, em 1961 (apenas dois
anos após liberação da meticilina para uso) o primeiro caso de S. aureus meticilina
resistente (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus - MRSA) foi relatado na
Inglaterra. A resistência à meticilina ocorre devido a síntese de uma nova proteína de
construção e manutenção da parede celular bacteriana, substituindo a proteína de
ligação à penicilina (Penicillin Binding Protein - PBP) pela PBP2a, a qual não pode ser
bloqueada pela ação do antibiótico (PAN, BATTISTI, ZONCADA ET AL., 2009; CARVALHO ET
AL., 2010).
Atualmente estas cepas representam mais de 60 % das infecções nos EUA, e
cerca de 40 % das infecções em hospitais brasileiros, sendo o risco de morte aumentado
em 2,5 vezes quando comparado a cepas sensiveis a meticilina. Em consequência
observou-se um aumento nos custos hospitalares de até 3,0 vezes quando comparados
aos custos relacionados a infecções por cepas não resistentes (PAN ET AL., 2009;
PANTOSTI AND VENDITTI, 2009; CARVALHO ET AL., 2010). A resistência a meticilina levou a
incorporação do uso da vancomicina no tratamento de pacientes infectados por MRSA.
Em 1996 vários trabalhos reportaram isolados resistentes à vancomicina, dentre as cepas
MRSA resistentes a vancomicina são descritas MRSA com Resistência Intermediária à
Vancomicina (Vancomycin-Intermediate S. aureus – VISA) e, MRSA Resistente à
Vancomicina (Vancomycin-Resistant S. aureus – VRSA) podendo-se também encontrar
S. aureus resistentes a vancomicina, mas não a meticilina (JENKINS, 2006).
1.4 Klebsiella pneumoniae
Bactérias do gênero Klebsiella têm como características morfológicas células
variando entre 0,3-1,0 μm de diâmetro e 0,6-6,0 μm de comprimento (Figura 3), são
diferenciadas das demais enterobactérias por apresentarem uma espessa cápsula
polissacarídica, estas bactérias apresentam temperatura ótima de crescimento a 37 ºC.
Dentre as espécies do gênero Klebsiela as espécies K. pneumoniae, K. oxytoca e K.
planticola tem sido comumente isoladas em ambientes hospitalares (PODSCHUN AND
ULLMANN, 1998).
26
Figura 3: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de K. pneumoniae.
*Fonte: (http://www.gefor.4t.com) / 2011.
Entre 1970 e 1980 um alto índice de infecções causadas por bactérias do gênero
Klebsiella foram associados à IASS, o que levou a um aumento no uso das
cefalosporinas. O uso cada vez mais disseminado deste antibiótico levou a grande
pressão de seleção destes micro-organismos, tornando necessária a produção de novas
gerações de cefalosporinas, sendo elas de 1ª a 5ª geração (COLOMBO, JANINI, SALOMAO
ET AL., 2009). Entre 1990 e 1996, um dos patógenos Gram-negativos mais comuns
consistia na K. pneumoniae, sendo esta responsável por 32 % das IASS. Como um
patógeno oportunista, Klebsiella sp. desenvolve-se primariamente em indivíduos
imunodeprimidos hospitalizados ou que apresentem alguma doença debilitante grave. Em
1998 estimava-se que 8 % de todos os casos de IASS dos Estados Unidos e Europa
tinham como principal agente K. pneumoniae, a qual correspondia por uma porção
significante de pneumonias, septicemias e infecções brandas em tecidos relatadas em
UTIs. Entre 2007 e 2011 foi observado um índice de mortalidade de 58 %, relacionado a
infecções causadas por bactérias carbapenemases em pacientes em UTIs (PODSCHUN
AND ULLMANN, 1998; ANVISA, 2011).
A carbapenemase, enzima capaz de conferir resistência a penicilinas,
cefalosporinas e monobactâmicos, foi inicialmente relatada em K. pneumoniae nos EUA,
em 1996, e encontrada posteriormente em outros países, incluindo Israel, China, Europa,
América Central, América do Sul e, recentemente, Brasil. Os primeiros relatos de K.
pneumoniae carbapenemase (KPC) no Brasil datam do ano de 2005, emergindo em São
Paulo, e sendo cada vez mais descritas na literatura, com casos em várias cidades
brasileiras, dentre elas Rio de Janeiro, Recife, Londrina, Belém do Pará e Brasília. Entre
2009 e 2010 este micro-organismo causou 70 mortes na capital paulista e atualmente já
A B
A B
27
registrados 135 casos de pessoas contaminadas com a bactéria, sendo 18 óbitos no
Distrito Federal, dispersa tanto pela rede pública de saúde quanto na particular
(MONTEIRO, SANTOS, ASENSI ET AL., 2009; PAVEZ,MAMIZUKA AND LINCOPAN, 2009;
PEIRANO, SEKI, VAL PASSOS ET AL., 2009; DIENSTMANN, PICOLI, MEYER ET AL., 2010).
1.5 Escherichia coli
Dentre as bactérias Gram-negativas, as Enterobactérias representam 80 % dos
isolados microbiológicos. Sendo responsáveis por cerca de 70 % das infecções urinárias
e 50 % das septicemias relacionadas a casos de IASS. A maior parte das Enterobactérias
pode ser encontrada no trato gastrointestinal humano, no reino animal, na água, no solo e
nas plantas. Dentre as Enterobactérias isoladas em infecções destacam-se Klebsiella sp.,
Escherichia coli, e Proteus sp.. A predominância destas espécies pode ser explicada pela
alta de virulência das cepas, causada pela existência de fimbrias, que auxiliam na
aderência a superfícies ou membranas mucosas (ANVISA, 2004; TORTORA,FUNKE AND
CASE, 2005). As E. coli (Figura 4) são bacilos anaeróbios facultativos, catalase positivos e
oxidase negativos. Podem apresentar dimensões entre 0,5 µm de diâmetro e 1,5 µm de
comprimento. E. coli são anaeróbias facultativas e podem se desenvolver em
temperaturas variando entre 8 e 48 ºC, com temperatura ótima de crescimento em 39 ºC
e pH tendendo a neutralidade, sendo bem resistentes a pHs levemente ácidos ou
básicos, 9 e 5, respectivamente (NEIDHARDT,INGRAHAM AND SCHAECHTER, 1990 ; VELOSO,
2006).
Dentre os enterococos, a bactéria E. coli tem sido descrita como o principal
agente identificado em infecções sanguíneas, sejam comunitárias ou relacionadas a
serviços de saúde, podendo ser, também relacionados como causadores primários de
infecções no trato urinário, meningite neonatal, septicemia hospitalar e enterites. As
infecções por E. coli apresentam índice de mortalidade entre 32 e 50 % em ambiente
hospitalar, comumente associado a resistência a antibióticos atuais (VON BAUM AND
MARRE, 2005; SANTOS, PIGNATARI, SILVA ET AL., 2009).
28
Figura 4: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de E. coli.
*Fonte: Figura A (http://archive.microbelibrary.org/) / 2011 e figura B
(http://criandocriancas.blogspot.com) / 2011.
Algumas cepas de E. coli possuem capacidade de resistência à drogas atuais como
ampicilina, sulfonamidas e doxiciclina. A resistência à amoxicilina/ácido clavulánico,
trimetoprim/sulfametoxazol e ciprofloxacina tem evoluído nos últimos seis anos
apresentando taxas que variam entre 20 % e 30 % de aumento de resistência a estes
antibióticos (SILVA, 2009). Em cepas de E. coli a mudança conformacional do rRNA, por sua
metilação, resulta na co-resistência aos macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina
(GEORGOPAPADAKOU, RUSSO, LIEBMAN ET AL., 1987).
Em 2011, foram registrados 3.092 casos de Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU),
causada por Escherichia sp.. O surto atingiu 16 países sendo 14 situados na Europa. Na
Alemanha, foram registrados 2.229 casos de infecções por E. coli, com 9 óbitos, alem
disto 759 casos de SHU foram relatados , sendo 21 fatais (OMS, 2011). Nos Estados
Unidos, foram notificados 3 casos de SHU e 1 caso suspeito de infecções causadas por
E. coli enterohemorragica (Entero-hemorragic Escherichia coli - EHEC). No Canadá,
houve relato de 1 caso suspeito de EHEC (OMS, 2011). Segundo Bezuidt e colaboradores
(2011) o surto causado pela bactéria EHEC teve como base a combinação de
características do genoma de cepas de E. coli, as quais permitiram novos determinantes
de virulência. Os autores demonstraram que as cepas encontradas em fezes de humanos
apresentavam determinantes de virulência que permitiam seu acesso a tecidos extra-
intestinais, causando infecções sistêmicas (BEZUIDT, PIERNEEF, MNCUBE ET AL., 2011).
A B
29
1.6 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas spp. são bacilos Gram-negativos com dimensões que variam entre 0,5
– 1,0μm de largura e 1,5 – 5,0μm de comprimento, aeróbios, não-esporulados, não-
fermentadores de glicose e móveis devido à presença de um flagelo polar. Pseudomonas
sp. são amplamente distribuídos, já que apresentam poucas exigências para seu
desenvolvimento. Estes micro-organismos podem se desenvolver em temperaturas de até
42°C. Pseudomonas aeruginosa (Figura 5), pode utilizar diferentes substratos como fonte de
carbono, desta forma pode ser isolada de água, plantas, solo e tecidos animais (MURRAY,
DREW, KOBAYASHI ET AL., 1992).
P. aeruginosa representa uma das espécies do gênero Pseudomonas com maior
importância clinica, uma vez que apresenta alto potencial de virulência. Este potencial pode
ser associado a fatores estruturais e às toxinas produzidas por P. aeruginosa, dentre os
quais se podem destacar a cápsula polissacarídea, a exotoxina A e a exoenzima S. P.
aeruginosa pode ser caracterizada de acordo com sua coloração, uma vez que os
pigmentos piocianina (azul) e pioverdina (fluorescente), além dos pigmentos piorrubina
(coloração avermelhada) e a piomelanina (coloração marrom / preto), são característicos
desta espécie (MURRAY ET AL., 1992).
Figura 5: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de P. aeruginosa.
*Fonte: Figura A (http://wdict.net/es/word/pseudomonas) / 2011 e figura B
(http://pseudomonas.com/p_aerug.jsp) / 2011.
P. aeruginosa apresenta-se, principalmente, de forma oportunista sendo,
comumente, associada a pacientes imunocomprometidos com neutropenia, diabetes mel-
litus, queimaduras extensas e neoplasias, além disto, o comprometimento do processo
respiratório normal por procedimentos invasivos ou ventilação mecânica, os quais tornam o
A B
30
individuo mais suscetível a infecções por este patógeno (LEVIN, BARONE, PENÇO ET AL.,
1999).
A resistência da espécie P. aeruginosa a antibióticos usuais, como os
carbapenemos, pode ser associada a diferentes mecanismos de resistência, dentre eles:
resistência intrínseca por indução cromossômica, alteração de sitio de ação, degradação do
antimicrobiano por produção de enzimas, sistemas de bomba efluxo do antimicrobiano,
alteração da permeabilidade da membrana externa de Gram-negativos e tolerância ao
antimicrobiano por produção de biofilme. Desta forma P. aeruginosa multiresistente
(multidrug resistent P. aeruginosa – MRPa) pode apresentar resistência a combinação
drogas, dificultando o tratamento de infecções causadas por estas cepas (LOMOVSKAYA, LEE,
HOSHINO ET AL., 1999; OIE, UEMATSU, SAWA ET AL., 2003; FERREIRA AND LALA, 2010).
1.7 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
A proteção contra patógenos tem sido primordial para o sucesso evolutivo das mais
diversas espécies. Neste sentido são encontradas inúmeras linhas de defesas com
mecanismos de ação distintos. Dentre eles os peptídeos antimicrobianos desempenham
papel fundamental na proteção contra outros organismos e são encontrados em animais,
plantas, bactérias e fungos, entre outros (ZHANG, GU, CHAN ET AL., 2008).
No intuito de se produzir fármacos e produtos biotecnológicos efetivos contra micro-
organismos patogênicos, a purificação de peptídeos antimicrobianos se tornou uma
ferramenta útil, possibilitando o uso de centenas destes (PAMs) isolados. Os diferentes
PAMs isolados possuem origem distinta, assim como o seu espectro de atividade e
estrutura, apresentando algumas propriedades comuns como revisadas por Kindrachuck e
colaboradores (2010). Estes peptídeos possuem, comumente: a) sequências menores que
60 resíduos de aminoácidos (geralmente entre 12 e 50 aminoácidos, principalmente L-
aminoácidos); b) carga líquida positiva (geralmente entre +2 e +9) devido à presença de
resíduos básicos de lisina, arginina ou histidina, juntamente com domínios hidrofóbicos (em
torno de 50 % de resíduos hidrofóbicos); c) características anfipáticas e, d) grande
variedade em dobramentos estruturais, incluindo α-hélices, folhas-β, hélices estendidas e
loops (KINDRACHUK,NIJNIK AND HANCOCK, 2010).
Estas características conferem aos PAMs a capacidade de interagir com as mais
diversas membranas lipídicas, as quais se tornam alvos eficientes no mecanismo de ação
destes peptídeos. Assim, esses peptídeos podem apresentar amplo espectro de atividade
31
contra vários alvos, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas,
vírus, entre outros (KINDRACHUK ET AL., 2010). Os PAMs podem, também, apresentar
atividade sobre componentes intracelulares, o qual pode ocorrer de diversas formas, dentre
elas, se deslocando através da membrana citoplasmática e atuando sobre o metabolismo,
se ligando ao DNA, inibindo a replicação, a transcrição e a tradução, inibindo atividade
enzimática e síntese de parede celular ou até mesmo estimulando os mecanismos de
defesa do hospedeiro, aumentando ainda mais seu potencial antimicrobiano (KINDRACHUK ET
AL., 2010).
A atividade destas moléculas está diretamente relacionada à seqüência de
aminoácidos, a qual define suas propriedades bioquímicas (carga, anfipaticidade e
hidrofobicidade) e configuração tridimensional (conformação molecular, ângulo polar e
geometria) definindo então os elementos cruciais para sua atuação (GANZ, 2003; BROGDEN,
2005). As interações entre PAMs e a membrana tem como principio básico a alteração e a
alteração da permeabilidade da bicamada lipídica, causando sua despolarização e
desequilíbrio osmótico celular. Para que haja esta interação o peptídeo pode ser atraído
para a superfície microbiana, o que pode ocorrer por força eletrostática ou por cargas
líquidas existentes na superfície do micro-organismo. Em seguida o peptídeo se insere na
membrana citoplasmática (BROGDEN, 2005).
Nguyen e colaboradores (2011) ilustraram a diversidade de propriedades estruturais
dos peptídeos antimicrobianos e mecanismos de ação associados à interação entre o PAM
e a membrana microbiana (Figura 6). Os mecanismos de peptídeos com atividade
antimicrobiana podem ser baseados em sua estrutura. Desta forma a grande diversidade de
PAMs liberados durante um processo infeccioso pode agir sinergicamente, ou ainda um
mesmo PAM pode apresentar vários mecanismos de ação, ampliando seu efeito
antimicrobiano (NGUYEN,HANEY AND VOGEL, 2011).
32
Figura 6: Mecanismos de formação de poros em membranas bacterianas por PAMs.
*Adaptado de Nguyen (2011).
Alguns peptídeos demonstram, além da atividade antimicrobiana, uma atividade
imunomodulatória, a qual se caracteriza pelo estímulo da resposta imune humoral do
hospedeiro contra o patógeno, mediada pelo peptídeo. Neste sentido os peptídeos com
atividade imunomudolatória possuem efeito direto na imunidade humoral (Figura 7),
relacionando-se aos processos de atividade quimiotática e indução de quimiocinas; indução
de mediadores imunes e estimulação de atividades microbicidas; efeitos na sobrevivência e
apoptose de leucócitos e células epiteliais; estimulação da proliferação celular e promoção
da angiogenese (mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já
existentes, o qual ocorre por meio de ação direta do peptídeo nas células endoteliais) e
atividades antiendotóxicas e anti-inflamatórias: objetivando evitar sepse os peptídeos agem
de modo a suprimir seletivamente respostas pró inflamatórias além de aumentar a atividade
imune de efeito protetor (KINDRACHUK ET AL., 2010).
Agrupamento de lipídios “carregados”
Bicamada não intermediária
Oxidação de
alvo lipídico
Carreador
aniônico
Despolarização não lítica
da membrana
Eletroporação
Carpete
Poro toroidal
Poro toroidal desordenado
Espessamento da membrana Barril stave
Adsorção da
Membrana
Mudança
conformacional
+ + +
Membrana bacteriana
33
Figura 7: Múltiplas atividades relacionadas a funções antimicrobianas e imunomodulatórias,
apresentadas por diversos PAMs.
*Adaptado de Kindrachuck et al.(2010).
Desta forma, pode-se destacar que peptídeos que apresentam atividade
antimicrobiana associada à atividade imunomodulatória são biotecnologicamente inovadores
para o desenvolvimento de medicamentos eficazes contra patógenos resistentes, uma vez
que promovem não só a função inibitória do processo infeccioso, mas também estimulam o
sistema imune do hospedeiro regulando o processo inflamatório e endotóxico (KINDRACHUK
ET AL., 2010).
1.8 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM ANIMAIS MARINHOS
Os invertebrados marinhos representam cerca de 30 % das espécies animais
distribuídas em vinte filos encontrados nos mais diversos ambientes. Apesar de não
apresentarem um sistema imune adaptativo, como os vertebrados, o sistema imune dos
invertebrados marinhos garantiu o sucesso evolutivo destes animais, permitindo sua
proteção contra microrganismos patogênicos e levando assim a possibilidade de
colonização dos mais diversos ambientes (BARRACCO, 2004; TINCU AND TAYLOR, 2004).
Atividade imunomodulatória
Supressão inflamatória:
Atividade antiendotóxica
Atividade anti-inflamatória
Indução da apoptose
Lise da Membrana
Indução de citocinas e quimicinas
Quimiotaxia
Degranulação de macrocélulas
Diferenciação celular
Polarização Th1/Th2
Adjuvanticidade
Angiogenese
Alvos citoplasmáticos ou de membrana
Atividade antimicrobiana
Ativação e aumento:
34
O sistema imune, de forma geral, tem sido representado pela imunidade inata, a
qual pode ser definida como a primeira linha de defesa contra a maioria dos micro-
organismos (TINCU AND TAYLOR, 2004). Segundo Mydlarz et al. (2006) a efetividade da
resposta imune dos invertebrados marinhos tem como princípio diferenciar agentes
infecciosos e não infecciosos, invalidar ou destruir invasores e por fim eliminar células
danificadas ou doentes. Para isso o sistema imune se divide em sistema imune humoral, o
qual se baseia em agentes antimicrobianos, e reações de coagulação da hemolinfa e
melanização celular e, sistema imune celular, o qual se baseia em barreiras físico-químicas
melanina, fagocitose, vesículas granulado, enzimas antioxidantes e proteínas adesivas
(MYDLARZ,JONES AND HARVELL, 2006).
Este sistema faz de uma forma geral, uso de processos de comunicação e
integração de moléculas imunológicas, que possibilitam o reconhecimento de padrões
moleculares específicos expressos na superfície de microrganismos parasitas. Dentre as
moléculas imunológicas podem ser incluídas as proteínas plasmáticas e receptores
celulares como receptores toll-like (TLRs), o sistema de ativação de pro-fenoloxidases e o
sistema complemento (MYDLARZ ET AL., 2006).
Uma grande variedade de peptídeos com atividade antimicrobiana foi isolada de
invertebrados marinhos, os quais se apresentam, comumente, como moléculas menores
que 10 kDa, com características catiônicas e anfipáticas. Os peptídeos de invertebrados
marinhos classificados de acordo com as estruturas que apresentam sendo elas: lineares,
peptídeos anfipáticos em -hélice (peptídeos lineares com estrutura estendida,
caracterizados por repetições de determinado ou determinados aminoácidos, geralmente
prolina, triptofano, histidina ou glicina), folhas- ou estruturas mistas de -hélices e folhas-
estabilizadas por pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína (OTERO-GONZALEZ,
MAGALHAES, GARCIA-VILLARINO ET AL., 2010). Estes peptídeos têm sido isolados de diversos
filos, dentre estes artrópodes, moluscos, cnidários, anelídeos, equinodermos e cordatos,
como demonstra o Quadro 2 (TINCU AND TAYLOR, 2004; OTERO-GONZALEZ ET AL.,
2010).Desta forma a potente atividade antimicrobiana dos peptídeos isolados de animais
marinhos torna-os uma ferramenta útil para o desenvolvimento de fármacos e produtos
biotecnológicos.
Quadro 2: Peptídeos antimicrobianos isolados de animais marinhos.
Filo Espécie Peptídeo Filo Espécie Peptídeo
Cordados Styella clava Styelinas Moluscos Mytilus edulis Mitilina A e B
Clavaninas Mitimicina
Clavaspirinas Mytilus galloprovincialis Miticina A e B
Styella plicata Plicatamida Mitilinas B, C, D e G1
Halocynthia aurantium Dicintaurinas Dolabela auricularia Dolabelina B1, B2 e B3
Halocidinas Argopecten irradians AiBD
Halocynthia roretzi Halociaminas Porífera
Jaspis sp. Jaspamida
Artrópodes Pnaeus vannemi Penaeidinas 1 a 3
Discodermia kiiensis Discodermina A-H
Litopenaues vannamei Lv 1 a 6 Halichondria cylindrata Halicylindramides (A–C)
Litopnaeus setiferus Ls 1 a 3 Aciculites orientalis Aciculitinas A–C
Penaeidina 4 Cnidários
Carcinus maenas Crustina Cm-1 Aurelia aurita Aurelina
Callinectes sapidus Callinectina Chlorohydra viridissima Hydralisina
Pacifastacus leniusculus Astacidina 1 Stychodactyla helianthus Citolisina
Pacifastacus leniusculus Astacidina 2 Anelídeos
Hyas araneus Arasina 1 Perinereis aibuhitensis Perinerina
Scylla serrata Scygonadina Arenicola marina Arenicina
Tachyplesis tridentatus Taqueplesina I Nereis diversicolor Hedistina
Limulus polypfermus Taqueplesina II Ecnodermos
Polifemusina I e II
Strongylocentrotus
droebachiensis Strongyolocina 1 and 2
Tachyplesus gigas Taqueplesina III
*Adaptado de: (TINCU AND TAYLOR, 2004; OTERO-GONZALEZ ET AL., 2010)
35
36
1.9 CLAVANINAS
As clavaninas compõem uma família de quatro isoformas de peptídeos
antimicrobianos (“A”, “B”, “C” e “D”) isoladas dos hemócitos do tunicado Styela clava (Figura
8). Estes invertebrados marinhos apresentam cerca de 10 cm de comprimento (com
espécimes de até 20 cm), são sésseis, geralmente fixados a superfícies duras. Ocorrem
principalmente em regiões entre marés a profundidades acima de 25 m, com temperaturas
que variam de -2ºC a 23ºC e salinidade entre 22 e 36 ppt (sendo os indivíduos adultos
sensíveis a salinidades inferiores a 10 ppt e, as larvas a 18ppt) (LEE, ZHAO, CHO ET AL.,
1997; MOORE, 2003).
Figura 8: Tunicado Styela clava, do qual foi extraído o peptídeo antimicrobiano clavanina A
*Fonte: (http://wdfw.wa.gov)
O sistema imune de S. clava, quando na presença de patógenos induz a produção
de moléculas bioativas ativando células fagocitárias conhecidas por hemócitos, nos quais a
clavanina encontra-se amplamente distribuída (MENZEL, LEE, SJOSTRAND ET AL., 2002). A
clavanina A, presente em múltiplos granulócitos e macrófagos, pode apresentar diferentes
funções de defesa do hospedeiro como, por exemplo, fagócitaria, ação antimicrobiana e
imunoestimulatória . Desta forma a distribuição do peptídeo em diferentes subtipos de
granulócitos eosinofílicos sugere que estes subtipos possuam diferentes funções em vias
específicas, uma vez que alguns subtipos de grânulos citoplasmáticos podem ser
secretados dentro da hemolinfa e outros podem funcionar, primariamente, como fagócitos
(LEE ET AL., 1997; MOORE, 2003).
Lee e colaboradores (1997) demonstraram que as clavaninas são amplamente
eficazes contra bactérias Gram-positivas, incluindo S. aureus resistente a meticilina, bem
como bactérias Gram-negativas e fungos. As diferentes isoformas das clavaninas isoladas
apresentam grandes similaridades relacionadas à sequência primária (Quadro 3). Segundo
37
Lee e colaboradores (1997b) as clavaninas são compostas por uma sequência de vinte e
três resíduos de aminoácido (sendo dezoito posições conservadas nos quatro peptídeos)
ricos em histidina, glicina e fenilalanina e possuem o C-terminal amidado. Além disso, sua
estrutura proposta apresenta uma α-hélice resolvida por dicroísmo circular. Finalmente,
estes peptídeos apresentam características catiônicas e anfipáticas muito comuns a
peptídeos antimicrobianos (LEE ET AL., 1997).
Quadro 3: Sequências primárias das clavaninas A-D.
Clavanina Sequência Primária
A VFQFL GKIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2
B VFQFL GRIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2
C VFHLL GKIIH HVGNF VYGFS HVF-NH2
D AFKLL GRIIH HVGNF VYGFS HVF-NH2
A presença do C-terminal na forma carboxamida no lugar do ácido carboxílico
impede a clivagem do peptídeo por carboxipeptidases e permite a formação de uma ligação
de hidrogênio adicional na formação de estruturas em α-hélice (LEHRER, LEE, MENZEL ET AL.,
2001). A amidação, uma das modificações pós-traducionais mais comuns que ocorrem nos
PAMs, envolve a descarboxilação oxidativa do carbono de um resíduo terminal de glicina
num processo enzimático de duas etapas. (BRADBURY AND SMYTH, 1987). De fato, peptídeos
com estruturas em -hélice apresentam a anfipaticidade segregada em volta da hélice
formada, a qual permite que ele interaja, após a interação eletrostática, com a membrana
bacteriana (NGUYEN ET AL., 2011).
Alguns experimentos utilizando peptídeos sintéticos com o grupo carboxamida presente
demonstraram um aumento significativo na atividade antimicrobiana comparativamente aos
análogos não modificados (MOR AND NICOLAS, 1994; CHENG, HALE, KINDRACHUK ET AL.,
2010). Dentre as isoformas observadas, a clavanina A se destaca por apresentar uma maior
atividade antimicrobiana e imunomodulatória. Este peptídeo apresenta atividade contra
bactérias Gram-negativas (P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli), Gram-positivas
(Micrococcus flavus, Lactobacillus sake e S. aureus, inclusive cepas resistentes a meticilina)
bem como contra o fungo Candida albicans (SAWADA,ZHANG AND COOPER, 1993; LEE ET AL.,
1997; VAN KAN, DEMEL, BREUKINK ET AL., 2002; OTERO-GONZALEZ ET AL., 2010).
38
As glicinas nas posições 6 e 13 facilitam a formação da -hélice e permitem o caráter
anfipático da molécula aumentando a afinidade com membranas fosfolipídicas. A clavanina
A possui atividade otimizada para variações de pH entre 5,5 e 7,4, sendo que o aumento de
pH reduz a taxa de interação do peptídeo na membrana. (VAN KAN, VAN DER BENT, DEMEL ET
AL., 2001; VAN KAN ET AL., 2002). Apesar da eficiência antimicrobiana apresentada pela
clavanina A, análises estruturais e experimentos in vivo ainda são escassos para este
peptídeo.
1.10 NANOBIOTECNOLOGIA
A nanobiotecnologia consiste na interface entre nanotecnologia e biologia definida
como a ciência que estuda o desenvolvimento e a utilização de materiais, dispositivos e
sistemas em escala nanométrica (0.1 a 1000nm). Estima-se que os Estados Unidos gastem
mais de US$ 3,7 bilhões em nanociência e nanotecnologia apenas nos próximos três anos.
Para o mesmo período o Japão pretende investir US$ 3 bilhões e a Comissão Européia US$
7,5 bilhões apenas em seu Programa de Desenvolvimento Tecnológico, de 2007 a 2013. No
Brasil foram aplicados cerca de R$ 140 milhões a áreas nanobiotecnológicas entre os anos
de 2001 e 2006, distribuídos em diversas vertentes como agronegócio, energia, pigmentos e
tintas, saneamento básico e recursos hídricos, siderurgia, vidros e cerâmicos, setores
químicos e petroquímicos, têxteis, cosméticos e relacionados à saúde (humana e animal)
(HASSAN, 2005; ZANETTI-RAMOS AND CRECZYNSKI-PASA, 2008).
A nanotecnologia apresenta um amplo aspecto tecnológico, que abrange setores de
materiais e manufatura, dispositivos eletrônicos e ópticos, energia e meio ambiente,
biotecnologia e medicina, instrumentos e educação. Dentre estes a nanobiotecnologia
merece destaque por apresentar impactos positivos, principalmente na área da saúde
através da sua aplicação na melhoria de testes diagnósticos e tratamento de doenças. Sua
proposta consiste em desenvolver sistemas carreadores de medicamentos e moléculas em
escala nanométrica visando alcançar melhor estabilidade, absorção e controle de liberação
das drogas (SPEISER, 1991; ZANETTI-RAMOS AND CRECZYNSKI-PASA, 2008; AMARAL, BOCCA,
RIBEIRO ET AL., 2009).
Atualmente, 95% das moléculas com potencial terapêutico possuem propriedades
cinéticas e biofarmacêuticas pobres apresentando dificuldades relacionadas à baixa
solubilidade, difusividade, meia-vida, controle de liberação e imunogenicidade (Zanetti-
Ramos et al., 2008). Os fármacos, em geral, produzem efeitos por reagirem com outras
39
moléculas e desta forma podem causar efeitos nos mais diversos níveis da organização
biológica. Neste sentido ensaios biológicos tem sido necessários para avaliar e comparar a
atividade de futuros fármacos, estes ensaios se definem pela estimativa da concentração,
da potencia e da resposta biológica produzida pelo fármaco de interesse (RANG, DALE,
RITTER ET AL., 2008).
A produção de nanoestruturas carreadoras de fármacos tem se mostrado uma
ferramenta útil, uma vez que possuem capacidade de transportar moléculas bioativas, de
forma específica, a órgãos e tecidos alvo (ZHANG ET AL., 2008). Estes produtos divergem
entre si em tamanho, forma e composição. Além disso, estes compostos possuem, ainda,
propriedades físico-químicas específicas como, por exemplo, o aumento da área de
superfície e da reatividade da molécula associada a produtos terapêuticos. Alguns autores
demonstram que estas características promovem uma maior solubilidade, aumento da meia
vida da molécula no sangue, diminuição da toxicidade da droga, uma extensa variedade de
vias de administração e a capacidade de seletividade para tecidos e órgão afetados pela
patologia (REIS, NEUFELD, RIBEIRO ET AL., 2006; ZHANG ET AL., 2008; BAWA, 2009).
A diversidade de materiais empregados, bem como a diversidade de técnicas
aplicadas no desenvolvimento de estruturas em escala nanométrica permite uma
diversidade de sistemas nanométricos e modelos estruturais (REIS ET AL., 2006). Dentre as
nanoestruturas mais utilizadas (Figura 9) podem ser observadas estruturas como:
dendrimeros, moléculas sintetizadas por crescimento radial a partir de um núcleo
polifuncionalizado; nanoemulsões, sintetizadas a partir de uma dispersão nanométrica de
gotículas oleosas em uma fase aquosa externa, estabilizada por um sistema tensoativo
adequado; nanopartículas lipídicas sólidas; sistemas de liberação formados por lipídios em
estado sólido; lipossomas, vesículas esféricas formadas por bicamadas de fosfolipídios em
meio aquoso; nanopartícula metálicas, estruturas formadas por material metálico;
ciclodextrina, unidades de D-glucopiranose, formadoras de estruturas cíclicas tronco-
cônicas; nanopartículas poliméricas, estruturas formadas a partir de polímeros
biodegradáveis, nanotubo de carbono, estrutura em forma de tubos formada a partir de
carbonos e fulerenos, moléculas estruturadas em forma circulara partir de carbono (ROCHA-
FILHO, 1996; OLBRICH, BAKOWSKY, LEHR ET AL., 2001; FRONZA,CAMPOS AND TEIXEIRA, 2004;
CUNHA-FILHO AND SÁ-BARRETO, 2007).
40
Figura 9: Exemplos de tipos de nanoestruturas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas
(ilustração esquemática). (A) Dendrimeros, (B) Nanoemulsões, (C) Nanopartículas Lipídicas sólidas,
(D) Lipossomas (E) Nanopartícula metálicas (F) Ciclodextrina, (G) Nanopartículas poliméricas (H)
Nanotubo de carbono e (I) Fulerenos.
*Fonte: http://www.canon.com/technology/s_labo/nano/003/01.html
1.10.1 Nanocarreadores e sistemas poliméricos
Dentre os vários sistemas utilizados para a estruturação de fármacos as
nanopartículas poliméricas consistem em um sistema coloidal carreador menor que 1 m,
sintetizados a partir de polímeros, sendo apropriadas para o transporte de fármacos,
peptídeos, antígenos e vacinas de DNA (SANTOS-MAGALHAES, PONTES, PEREIRA ET AL.,
2000). O termo nanopartículas tem sido utilizado para denominar nanocápsulas e
nanoesferas. Nas nanocápsulas, o fármaco está confinado em uma cavidade com núcleo
líquido circundado por uma membrana polimérica, enquanto nas nanoesferas o princípio
ativo pode estar adsorvido na superfície da esfera ou incrustado na matriz polimérica (Figura
10) (REIS ET AL., 2006).
Estas estruturas são consideradas eficientes carreadores de drogas devido às suas
características de biodegradabilidade e biocompatibilidade. Além disto, garantem o aumento
da meia-vida da droga no organismo, diminuindo a necessidade de frequente administração,
trazendo maior conforto ao paciente e maior garantia de não interrupção do tratamento. Na
literatura pode-se observar o uso destes sistemas para as mais diversas patologias, dentre
A B C
D E F
41
elas podemos citar agentes quimioterápicos, broncodilatadores, e antibióticos (REIS ET AL.,
2006; SURI,FENNIRI AND SINGH, 2007; TUROS, REDDY, GREENHALGH ET AL., 2007a; TUROS,
SHIM, WANG ET AL., 2007b; KREYLING,HIRN AND SCHLEH, 2010).
Figura 10: Nanopartículas poliméricas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas (ilustração
esquemática). (A) Nanoesferas e (B) nanocápsulas
. *Fonte: (http://www.canon.com/)/ 2011.
As nanopartículas poliméricas têm sido utilizadas como carreadores de antibióticos,
neste sentido, Turos e colaboradores (2007) descreveram nanopartículas poliméricas
covalentemente ligadas à penicilina com atividade contra cepas de S. aureus resistentes a
meticilina. As partículas foram preparadas por polimerização em emulsão e apresentam
ação prolongada contra a bactéria S. aureus. Em artigo publicado no mesmo ano, o autor
demonstra a facilidade de preparação e controle de partículas poliméricas, bem como a alta
eficiência quando comparada a penicilina livre (TUROS ET AL., 2007b). Rai e colaboradores
(2010) relataram a síntese de nanopartículas de ouro contendo o antibiótico cefaclor. Neste
trabalho as nanopartículas obtidas apresentaram entre 22 e 52 nm, demonstrando MIC de
10 mg.ml-1 e 100 mg.ml-1 contra S. aureus e E. coli, respectivamente. Os autores sugeriram,
ainda, que a ação das nanopartículas associadas ao cefaclor inibiu a síntese da camada de
peptídeoglicano, gerou poros na parede celular bacteriana, aumentando a permeabilidade
da parede e resultando na morte celular (RAI,PRABHUNE AND PERRY, 2010). Apesar dos
relatos sobre o uso de nanopartículas contendo antibióticos convencionais, não foram
encontrados relatos de nanopartículas contendo peptídeos com atividade antimicrobiana, o
que torna este trabalho inovador em relação ao desenvolvimento de nanoantibióticos
eficazes contra infecções bacterianas.
No sentido de se obter maior eficiência terapêutica, o uso de sistemas poliméricos
para nanoestruturação de antibióticos pode ser, também, arquitetado no sentido de se
A
B
42
proteger a droga do organismo do hospedeiro, aumentar a especificidade com a membrana
bacteriana (ou possíveis marcadores presentes na membrana), manter uma liberação
controlada (diminuindo as concentrações e as administrações necessárias) e evitar os
mecanismos de resistência apresentados por microrganismos (SURI ET AL., 2007; TUROS ET
AL., 2007b). Para isso as propriedades químicas e físicas específicas, como por exemplo,
alta viscosidade, elasticidade ou dureza, resistência ao calor, à umidade e à abrasão,
podem ser exploradas permitindo a utilização de metodologias distintas para a formação de
nanopartículas. Dentre estas metodologias a polimerização in situ de monômeros, ou
dispersão de polímeros pré-formados, pode ser utilizada no desenvolvimento de
nanopartículas poliméricas a depender do polímero e da molécula de interesse (REIS ET AL.,
2006).
Neste trabalho os polímeros utilizados para a formação de nanopartículas
poliméricas contendo o peptídeo antimicrobiano clavanina A foram polímeros de metacrilato
(Eudragit®). Estes polímeros têm sido comumente utilizados no encapsulamento de
fármacos. Apesar do tamanho do polímero o grau de pureza e a eficiência de encapsulação
fazem destes polímeros materiais eficientes na formação de cápsulas ou partículas
poliméricas. O Eudragit® L100-55 caracteriza-se como um copolímero aniônico á base de
ácido metacrílico e metil metacrilato (Figura 11A) e o Eudragit® RS 30D, um copolímero
formado de ésteres de ácido acrílico e metacrílico contendo grupos quaternários de amônio,
os quais tornam o polímero permeável, como demonstrado na Figura 11B (EVONIK®, 2004a,
2004b).
Figura 11: Estrutura molecular dos polímeros Eudragit® L100-55 (A) e RS 30D (B).
*Fonte: Evonik Industries® (www.evonik.com.br)/2011.
Morishita e colaboradores (1992) descreveram o uso do polímero Eudragit® para
estruturação de microesferas contendo inibidores enzimáticos importantes para o aumento
A B
43
da biodisponibilidade de insulina. Em estudo mais recente Zhang e colaboradores (2008)
desenvolveram micelas formadas a partir de dois ou mais blocos de cadeias de polímeros
com características hidrofóbicas distintas. Desta forma os blocos hidrofóbicos formam um
núcleo apto a expulsar a água e a parte hidrofílica forma uma estrutura ao redor do núcleo
para estabilizá-lo e obter contato com a água. A porção hidrofílica garante uma proteção
estéril da micela, alem da estabilidade na corrente sanguínea (ZHANG ET AL., 2008).
Nassar e colaboradores (2009) descreveram a nanoencapsulação do composto
imunomodulatório tacrolimus, utilizando um sistema de nanocápsulas de dupla camada,
para isso o autor utilizou nanopartículas poliméricas envoltas em micropartículas de
hidroxipropilmetil celulose (HPMC). Este sistema garantiu a proteção do peptídeo por um
núcleo formado por dois polímeros de polimetacrilato, e aumentou a sua biodisponibilidade
no sistema dos camundongos testados. Os polímeros utilizados para este estudo possuem
como característica a solubilidade de um dos polímeros em pH 5,5 (Eudragit L 100-55) e a
não solubilidade do outro no mesmo pH Eudragit RS 30D. Este fato que confere ao autor a
possibilidade de testar a formação de nanopartículas a partir de diferentes proporções (3:1,
1:1 e 1:3 de Eudragit L100-55 e RS30D respectivamente) e compará-las em relação as suas
características quando administradas de forma oral. A segunda camada foi feita utilizando
metodologia de microencapsulação em HPMC, este polímero tem como função primordial a
proteção das nanopartículas em relação às barreiras metabólicas de primeira passagem
(NASSAR, ROM, NYSKA ET AL., 2009).
Em suma, observa-se que a grande necessidade de obtenção de novas drogas
eficazes contra a resistência bacteriana tem aumentado a busca por metodologias
inovadoras. O uso de sistemas poliméricos para a nanoestruturação de antibióticos, e
fármacos em geral, tem se mostrado uma ferramenta útil no melhoramento das drogas
atuais. Diminuindo partes duradouras de pesquisas na busca de novos agentes e
aumentando o uso de agentes já descritos, permitindo a inovação biotecnológica no
desenvolvimento de novos fármacos (MORISHITA, MORISHITA, TAKAYAMA ET AL., 1992; ZHANG
ET AL., 2008; NASSAR ET AL., 2009). Nesse sentido, tem sido de particular interesse a
avaliação do possível melhoramento na atividade antibacteriana da clavanina A, através do
encapsulamento do peptídeo em nanocarreadores poliméricos.
44
2 HIPÓTESE
A clavanina A nanoestruturada apresentará atividade antimicrobiana in vitro e in vivo
contra as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Klebsiella pneumonia.
45
3 JUSTIFICATIVA
O aumento significativo de mortes causadas por infecções hospitalares no Brasil leva
a crescente necessidade de descoberta e formulação de novos compostos com atividade
antimicrobiana. Neste sentido os peptídeos tem se mostrado como uma excelente estratégia
para o desenvolvimento de fármacos biocidas devido a sua alta e múltipla atividade
antimicrobiana. Entretanto, a instabilidade destes peptídeos ao entrar em contato com o
metabolismo humano, torna-os inviáveis para aplicações diretas ao organismo. Por outro
lado, o desenvolvimento de nanoformulações capazes de manter a estabilidade destes
compostos e realizar a liberação sustentada torna-se uma ferramenta útil para o
desenvolvimento de produtos biotecnológicos eficazes. Desta forma, espera-se também
diminuir a dose utilizada, reduzindo o risco de superdosagem e necessidade de múltiplas
administrações, mantendo o método terapêutico por tempo prolongado, diminuindo a chance
de resistência microbiana por interrupção do tratamento.
46
4 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo a nanoestruturação do peptídeo antimicrobiano
clavanina A e a avaliação comparativa entre a atividade do peptídeo livre e nanoformulado
quanto a sua atividade antibacteriana in vitro e em modelos septicêmicos in vivo.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver nanopartículas poliméricas a partir do polímero Eudragit L100-55 e do
copolímero Eudragit RS 30D em diferentes proporções.
Analisar a taxa de liberação sustentada do peptídeo nanoestruturado.
Analisar as características morfológicas, relacionadas ao diâmetro e altura das
nanoestruturas formadas, por meio de microscopia de força atômica (AFM) e
espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS).
Avaliar a taxa de encapsulação dos complexos nanoformulados contendo a
clavanina.
Comparar o potencial in vitro do peptídeo livre e do peptídeo nanoestruturado contra
as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Klebsiella pneumoniae.
Comparar o potencial in vivo (contra o pool de bactérias contendo S. aureus, E. coli,
P. aeruginosa e K. pneumoniae) do peptídeo nanoformulado, com o peptídeo livre
em modelo animal induzido a sepse.
Avaliar o efeito da clavanina A nanoestruturada na evolução da sepse polimicrobiana
Avaliar o efeito anti-inflamatório da clavanina A nanoestruturada.
47
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 SÍNTESE E DETERMINAÇÃO DE PUREZA DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS:
A clavanina A (VFQFL GKIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2) foi sintetizada pela China
Peptides Co., Ltd., República Popular da China, segundo o método de síntese em fase
sólida através da estratégia F-moc (HIRATA, CEZARI, NAKATE ET AL., 1994). O peptídeo foi
purificado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RT-HPLC). A massa
molecular e a pureza do peptídeo sintetizado foram confirmadas por espectrometria de
massa utilizando o equipamento MALDI-TOF/TOF Ultraflex III (Bruker Daltonics). As
amostras foram solubilizadas em solução saturada de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico
(1:3) e 1µL dessa mistura foi depositada sobre placa de MALDI tipo MTP 384 e secas a
temperatura ambiente. Para determinação da massa exata do peptídeo realizou-se a
calibração utilizando-se Peptide calibration standard II (Bruker Daltonics) como padrão de
massas moleculares. O valor teórico obtido pelo serviço online Protein Prospector
(http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm) foi comparado com o valor experimental
obtido pela análise feita no espectrômetro de massa.
5.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS:
Para estruturação das nanocápsulas foram utilizados inicialmente 100 g do peptídeo
sintético e diferentes proporções dos polímeros, sendo elas 1:3, 1:1 e 3:1 (Eudragit® L100-
55 e Eudragit® RS 30D, respectivamente). Posteriormente a proporção (3:1
respectivamente L100-55:RS30D) foi mantida, sendo então utilizados 22,5 mg do polímero
Eudragit® L100-55 e 7,5 mg do copolímero Eudragit® RS 30D, obedecendo-se a proporção
de peptídeo, L100-55 e RS30D, respectivamente, 0,1:3:1. A Figura 11 demonstra as
estruturas do polímero e do copolímero utilizados para a nanoestruturação do peptídeo
antimicrobiano clavanina A (NASSAR ET AL., 2009). A quantificação do peptídeo sintético foi
realizada observando-se as absorbâncias medidas nos comprimentos de onda com 205,
215 e 225 nm e os valores obtidos foram aplicados às seguintes fórmulas (MURPHY AND
KIES, 1960).
X = (A215-225)x144 (1)
Y= (A105)x31 (2)
(X+Y) /2 x Fator de diluição = [Peptídeo] g.ml-1 (3)
48
As nanopartículas foram preparadas a partir de emulsificação óleo/água, utilizando-se
solução de acetona 95 % e etanol 5 % (utilizando-se uma proporção de 1:10 de solução em
relação a massa total de polímero e copolímero, neste caso 30 mg) objetivando-se a
solubilização dos componentes (copolímero, tensoativo, peptídeo e polímero). Após a
formação da fase oleosa, foram adicionados 2,5 ml de água milli-Q autoclavada. Em seguida
a amostra foi incubada a 4 ºC por 12 h e posteriormente centrifugada a 13,400 rpm por 30
min, objetivando a limpeza das estruturas formadas. Desta forma o sobrenadante foi
coletado e o precipitado descartado. Para retirada do solvente utilizou-se o sistema de
rotavaporação em equipamento Buchi® RIII, a pressão constante de 20 in.Hg, por 10 min
com temperatura ajustada a 37ºC.
5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA
5.3.1 Microscopia de Força Atômica
Para a análise morfológica foi avaliada a altura (nm) das partículas por microscopia de
força atômica (Atomic force microscopy - AFM) em aparelho Agilent 9600 (Shimadzu,
Japão). A fim de se obter uma concentração adequada para melhor visualização das
estruturas formadas, as amostras foram diluídas utilizando de 1:1000 (l) amostra/ água
ultrapura filtrada e , 1 l de amostra diluida foi aplicado à superfície de mica-moscovita,
recém clivada e fixada à superfície metálica plana. As análises foram realizadas em modo
dinâmico, utilizando-se sonda PPP-NCHR NanoSensors® (SHENG,QING AND MAO, 2007).
Após a secagem das amostras foram obtidas imagens com resolução de 512 x 512 pixels,
utilizando-se scanner de dimensão máxima de 125 μm x 125 μm de varredura, e áreas de
varredura de 50 μm x 50 μm e 10 μm x 10 μm. As imagens obtidas foram corrigidas em
relação ao plano pelo software SPM-9600 off-line, as análises relacionadas a altura das
partículas foram segmentadas e correlacionadas utilizando-se o mesmo software.
5.3.2 Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico
De forma complementar aos dados obtidos por microscopia de força atômica, o efeito
das nanoestruturas em valores de diâmetro hidrodinâmico de LUVs, foram avaliados por
espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico, com um analisador de partículas
49
Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments Ltd.), usando células descartáveis de polietileno.
Para cada experimento foram realizadas sucessivas leituras em cubeta de 1 mL contendo
LUVs, o experimento foi realizado a 25ºC, foram realizadas três corridas com quinze
medidas para cada corrida. As soluções foram submetidas ao espalhamento de luz
monocromática (10 mW Ele-Ne laser, λ = 632,4 nm) e a intensidade de luz espalhada foi
medida em um ângulo de espalhamento de 90°. As soluções de nanopartículas foram
previamente centrifugadas a 13.400 g, e o precipitado descartado, visando eliminar
partículas contaminantes, que pudessem interferir na leitura (restos de polímeros ou
tensoativo).
5.4 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO
5.4.1 Quantificação de encapsulação
A eficiência de encapsulação do peptídeo na vesícula foi avaliada pela diferença
entre a quantidade total do peptídeo usado para preparar os sistemas de liberação
sustentada e o peptídeo livre encontrado após a metodologia de encapsulação. Após a
encapsulação do peptídeo a amostra foi aplicada em filtro Amicon® 10 kDa e centrifugado a
4.400g por 15 min, sendo o precipitado coletado, filtrado e injetado em coluna de
cromatografia de fase-reversa (HPLC) Phenomenex® C-18. Para quantificação específica,
foi construída uma curva padrão utilizando-se concentrações crescentes do peptídeo, sendo
elas de 1 a 10 g (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10g), e de 10 a 100 g (10, 20, 30, 40, 50, 60,
70, 80, 90 e 100g), aplicadas na coluna acima descrita, a utilização de duas curvas (1-
10g e 10-100g) possibilitou ampla relação entre a amostra e a curva padrão obtida. A
porcentagem de peptídeo encapsulado e liberação sustentada do mesmo foram observadas
utilizando-se gradiente linear de solução de acetonitrila contendo ácido trifluoracético (TFA)
0,1 % (variando de 5 a 95 %) e solução aquosa + TFA 0,1 %. De acordo com os
cromatogramas obtidos, calculou-se a área do pico referente ao peptídeo. Para isso utilizou-
se o software Star Chromatography Workstation (Versão 6.41), o qual permite visualizar a
área do pico de interesse em mAu x seg. As concentrações de peptídeos encontradas após
o teste de liberação sustentada foram então correlacionadas à curva previamente
estabelecida.
50
5.4.2 Testes de liberação in vitro
Para as análises de liberação sustentada in vitro a amostra foi dividida em alíquotas de 1
ml de solução aquosa contendo a clavanina A nanoestruturada, e posteriormente incubadas
a 37ºC. Objetivando a separação do peptídeo livre das estruturas e restos de estruturas, as
amostras foram coletadas e aplicadas em tubos Amicon® 10 kDa e centrifugadas a 4.400 g
por 15 min. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o precipitado coletado e aplicado a
cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex® C-18. Visando, maior eficiência de
obtenção de dados sobre a liberação sustentada do fármaco, este experimento foi dividido
em duas partes, possibilitando leituras a cada hora (totalizando 12 h) e leituras a cada 6 h
totalizando 48 h de incubação das amostras.
5.5 BIOENSAIOS IN VITRO
As análises in vitro foram realizadas contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus
aureus ATCC25923 e as bactérias Gram-negativas Escherichia coli ATCC8739, Klebsiella
pneumoneae ATCC13885 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Para realização dos
bioensaios as bactérias foram previamente plaqueadas e incubadas por 48 h. Em seguida
uma das colônias foi repicada em 5 ml de meio Luria Bertani (LB) para incubação por 12 h.
As diferentes amostras foram previamente preparadas, sendo elas: o peptídeo (clavanina
A), as nanopartículas sem o peptídeo e as nanopartículas contendo o peptídeo. Como
controle positivo utilizou-se o antibiótico comercial cloranfenicol em uma concentração final
de 40 g.ml-1 e como controle negativo utilizou-se água destilada. A avaliação in vitro da
atividade antibacteriana dos peptídeos foi realizada pela determinação da absorbância a 595
ηm, sendo avaliada a cada 30 min totalizando 12 h de experimento (0, 30, 60, 90, 120, 150,
180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570, 600, 630, 660, 690 e
720 min). Os ensaios foram realizados em microplaca de ELISA contendo 96 poços, as
amostras foram aplicadas em triplicata, com volume final de 100 l em cada poço (NCCLS,
2003).
5.6 ANÁLISES IN VIVO
Para as análises in vivo utilizou-se a metodologia proposta por Moreno et al (2006), a
qual propõe a indução de sepse intraperitoneal por injeção de um pool de bactérias. O
conjunto de bactérias foi obtido por coleta do ceco de três camundongos seguida de
51
filtração, as culturas foram realizadas em placas de petri contendo meio BHI (brain heart
infusion) e incubadas a 37 ºC. Para estocagem a suspensão de bactérias foi centrifugada e
o precipitado foi ressuspendido em solução salina estéril, em seguida adicionou-se glicerol
60 % ás suspensões e se estocou a -80ºC. Para uso uma das alíquotas foi incubada a 37ºC
por 21 h. Posteriormente diluída, de forma seriada, e quantificada em espectrofotômetro
com absorbância a 595 nm. As bactérias foram identificadas por três diferentes testes
bioquímicos denominados TSI (Triplo açúcar ferro) contendo ágar, pelo método SIM (Sulfito,
Indol, Motilidade) e pelo teste do citrato, sendo identificadas as bactérias: P. aeruginosa, S.
aereus, E. coli e K. pneumonia, com 4,1 x 1010 UFC.ml-1. Desta forma foi definido o grupo de
acordo com a quantidade de suspensão aplicada a cada camundongo, sendo aplicado ao
grupo letal (L) 25µl de suspensão bacteriana por camundongo. Para realização do
experimento de sobrevida à sepse letal e subletal utilizou-se camundongos C57B6 (black)
divididos em 05 grupos (Quadro 4), sendo eles Infectados com 25 l de inoculo bacteriano
diluídos em 175 l de soro fisiológico. Os animais, foram pré tratados, com 15 min de
diferença da aplicação da suspensão bacteriana, e foram administradas as doses, de acordo
com o grupo, a cada 24 h.
52
Quadro 4: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes de sepse in vivo,
realizados em camundongos C57B6 (black) :
Grupo Infectados
01 Infectados e não tratados
02 Infectados, tratados com antibiótico comercial (cloranfenicol 40
g.ml-1).
03 Infectados, tratados com peptídeo nanoestruturado (2, 4 e 12
g.ml-1)
04 Infectados, tratados com a nanoestrutura sem o peptídeo.
05 Infectados, tratados com o peptídeo livre (2, 4 e 12 g.ml-1).
5.6.1 Avaliação de migração de neutrófilos
Para indução inflamatória utilizou-se a carragenina injetada por via intraperitoneal,
sendo que para cada animal utilizou-se 500 l de solução salina adicionada de carragenina
0,001 g.ml-1, para os devidos tratamentos os animais foram divididos em 12 grupos, como
demonstra a Quadro 5. Após 6 h do estímulo flogístico (carragenina) os grupos de animais
pré-tratados com o peptídeo livre, peptídeo nanoestruturado e a nanoestrutura, foram
avaliados a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal dos camundongos. Os
animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e a cavidade peritoneal lavada com 3 mL de
solução salina contendo EDTA 0,1M e solução fisiológica. A partir do exudato coletado foi
realizada a contagem total e diferencial das células presentes. A contagem total de células
foi realizada pelo equipamento Sysmex® modelo KX-21N e expressa como número de
53
células x 106.mL-1. A contagem diferencial foi realizada em lâminas do esfregaço de células
do exudato, devidamente coradas utilizando-se metodologia de panótico rápido (Laborclin®).
As laminas obtidas foram examinadas em microscópio óptico (objetiva x1000), foram
contadas 100 células por lâmina, diferenciando-se quatro tipos celulares: neutrófilos,
eosinófilos, basófilos e mononucleares. A quantidade de cada tipo celular presente na
cavidade peritoneal foi calculada pela percentagem dessas células contadas nos esfregaços
e pela quantidade de células totais obtidas na contagem total. Os resultados foram
expressos como nº de neutrófilos x 106.mL-1 (MORENO, ALVES-FILHO, RIOS-SANTOS ET AL.,
2006).
Quadro 5: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes inflamatórios in vivo,
realizados em camundongos C57B6 (black) :
Grupo Tratamento Concentração do
peptídeo
Controle positivo
Solução salina
-
Controle negativo Carragenina -
Controle fármaco
comercial
Carragenina + Dexametasona -
Controle peptídeo Peptídeo livre 2 g
4 g
12 g
*Controle nanoestrutura Nanoestrutura sem peptídeo Equivalente a 2 g
Equivalente a 4 g
Equivalente a 12 g
Amostra Peptídeo Nanoestruturado 2 g
4 g
12 g
*O grupo controle da nanoestrutura apesar de não conter o peptídeo possui uma quantidade de nanoestruturas
aproximada da quantidade de nanoestruturas presentes na amostra.
54
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS:
Objetivando o desenvolvimento de nanoformulações capazes de manter a
estabilidade do peptídeo antimicrobiano clavanina A e realizar a liberação sustentada do
fármaco, este trabalho teve como principio a nanoestruturação do peptídeo antimicrobiano
clavanina A. Para isso, utilizou-se sistema de emulsificação óleo/água, sendo encapsulados
100g do peptídeo, em 22,5 mg de polímero Eudragit® L 100-55 e 7,5 mg de copolímero
Eudragit® RS 30D. A formação de emulsões de óleo em água ocorreu devido a dissolução
dos componentes oleosos em um solvente hidrofóbico (solução de acetona e etanol) sendo
posteriormente adicionada a água, ocorrendo desta maneira a formação de gotículas de
óleo, que por sua vez envolvem o polímero, o copolímero e o peptídeo, permitindo a sua
solubilização em água após a retirada do solvente (REIS ET AL., 2006).
As nanopartículas obtidas foram caracterizadas utilizando-se, de forma complementar,
microscopia de força atômica e espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico.
Primeiramente a nanoformulação do peptídeo antimicrobiano clavanina A foi realizada, nas
diferentes proporções de polímero Eudragit® L 100-55 e copolímero Eudragit® RS 30D,
respectivamente, sendo elas 3:1, 1:1 e 1:3. Para as formulações 1:3 não foi possível
observar a formação de nanopartículas como demonstra a Figura 12. Na proporção 1:1 não
foi possível obter imagens, possivelmente por contaminação da ponteira de sílica utilizada
na varredura da amostra. As análises por microscopia de força atômica ocorrem por contato
direto da ponteira de sílica com a amostra, desta forma a contaminação da ponteira com a
amostra a ser analisada pode interferir diretamente na obtenção das imagens. Para análise
das imagens das nanopartículas obtidas utilizando-se as amostras preparadas em
proporção 3:1 de polímero e copolímero, respectivamente, utilizou-se microscopia de força
atômica em aparelho Agilent 9600 (Shimadzu, Japão), em superfície de mica moscovita
(amostra seca).
55
Figura 12: Nanoestruturas formadas a partir de sistema de emulsificação o/a, utilizando polímero e
copolímero em proporção 1:3 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética.
Amostra não centrifugada e não diluída.
Foi possível observar nanoestruturas com distribuição gaussiana unimodal de altura,
variando entre 69 e 260 nm, sendo em maioria as nanopartículas com cerca de 120 nm
(Figura 13). As análises por microscopia de força atômica permitem observar estruturas
contendo de 1 nm a 5 m. No entanto, as nanopartículas analisadas podem apresentar uma
redução de 20 % e um desvio padrão de 15 %, sendo possível diminuir esse erro de acordo
com a escolha da ponteira de sílica, a ser utilizada no aparelho de AFM (SCALF AND WEST,
2006).
508.04
[nm]
0.002.00 um 5.00 x 5.00 um
Peptideo 1 3-1
56
Figura 13. Nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em proporção 3:1
(respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Imagens obtidas por microscopia
de força atômica, utilizando aparelho Agilent 9600 (Shimadzu, Japão). Para obtenção da imagem
utilizou-se superfície de mica muscovita. As imagens foram corrigidas nos planos X e Y, as linhas que
apresentavam má formação foram retiradas. (A) Área de varredura de 50 x 50 m e (B) Área de
varredura de 10 x 10 m.
A
B
57
O desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos vem sendo utilizado no
tratamento de diversas doenças, objetivando o desenvolvimento de drogas que apresentam
curto tempo de meia-vida, o que torna a administração do fármaco frequente, e
consequentemente aumenta o efeito citotóxico desses medicamentos (DUNCAN, 2006). Em
revisão Zhang e colaboradores (2008) demonstraram que micelas contendo o fármaco de
interesse, formadas a partir de dois ou mais blocos de cadeias de polímeros com
características hidrofóbicas distintas, tendem a formar um núcleo para expulsar a água,
assim a parte hidrofílica forma uma estrutura ao redor do núcleo para estabilizá-lo e obter
contato com a água. Os autores defenderam, ainda, que a porção hidrofílica garante uma
proteção estéril da micela, além da estabilidade na corrente sanguínea (ZHANG ET AL., 2008).
Nassar e colaboradores (2009) descreveram a nanoencapsulação do fármaco
imunosupressor tacrolimus utilizando um sistema de nanocápsulas de dupla camada. Este
sistema garantiu a proteção do peptídeo por um núcleo formado por dois polímeros de
polimetacrilato, e aumentou a sua biodisponibilidade no sistema dos animais testados. Os
polímeros utilizados para este estudo possuem como característica a solubilidade de um dos
polímeros em pH 5,5 (Eudragit L 100-55) e a não solubilidade do outro no mesmo pH
(Eudragit RS 30D, fato que confere ao autor a possibilidade de testar a formação de
nanopartículas a partir de diferentes proporções (3:1, 1:1 e 1:3 de Eudragit L100-55 e
RS30D respectivamente) e compará-las em relação as suas características quando
administradas de forma oral. A segunda camada foi feita utilizando metodologia de
microencapsulação em hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Este polímero tem como função
primordial a proteção das nanopartículas em relação as barreiras metabólicas de primeiras
passagem (NASSAR ET AL., 2009). Até a presente data não foram encontrados peptídeos
nanoencapsulados no mercado de fármacos.
Independente do polímero a ser utilizado o tamanho das nanopartículas obtidas está
diretamente relacionado à via de administração a qual se pretende utilizar. Segundo Gref e
colaboradores (1996) nanopartículas ideais para fins injetáveis são biodegradáveis,
biocompativeis e possuem tamanho menor que 200 nm. Os autores propõem o uso de
nanopartículas de PLGA associadas à PEG contendo fragmentos dos anticorpos Fab ou
Fab2. As nanopartículas obtidas foram capazes de proteger o fármaco do sistema imune do
hospedeiro, bem como manter uma liberação sustentada do mesmo (GREF,MINAMITAKE AND
LANGER, 1996). Fraceto e colaboradores (2006) desenvolveram nanocápsulas de
lipossomas injetáveis contendo benzocaína, fármaco utilizado como anestésico local, as
estruturas apresentaram entre 100 e 200 nanômetros. Este trabalho teve como objetivo
desenvolver estruturas injetáveis que aumentassem a especificidade do fármaco com o
58
tecido em questão, além de sustentar de forma controlada sua liberação (FRACETO AND DE
PAULA, 2006; MELO, 2011). Neste sentido, as nanopartículas obtidas apresentam-se viáveis,
em teoria, para o uso endovenoso. Uma vez que a administração por via endovenosa
permite a aplicação de grandes volumes diretamente na corrente sanguínea, desta forma,
garantindo que o medicamento seja rapidamente absorvido, metabolizado e distribuído.
(CASSIANI, 2000; RANG ET AL., 2008; DINIZ, 2010).
As análises morfológicas de nanopartículas poliméricas podem ser realizadas por
diferentes metodologias (microscopia eletrônica, de varredura ou de transmissão,
microscopia de força atômica e espalhamento de luz dinâmico), estas metodologias podem
ser utilizadas de forma complementar, possibilitando a caracterização da amostra com uma
maior especificidade. O uso de espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico (DLS)
permite a observação de partículas em escala nanométrica a partir do espalhamento de luz
causado pelas partículas da amostra (CHICEA, 2010), desta forma, em complemento às
análises por AFM, a metodologia de espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico
(Zetasizer nano ZS -Malvern®) realizadas em meio aquoso permitiram a demonstração do
comportamento das nanopartículas em solução, de acordo com as análises foi possível
observar nanoestruturas contendo cerca de 372 nm de diâmetro, como demonstra a Figura
14.
Figura 14. Diâmetro das nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em
proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Análise obtida
utilizando-se metodologia de Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern Zetasizer Nano-Zs.
As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma análise em solução de suas
dimensões e propriedades.
Tamanho (nm)
Nú
me
ro (
%)
59
As análises complementares utilizando AFM e DLS permitem corroborar o tamanho e
o nível de agregados formados ou não pelas nanopartículas obtidas, além do formato de
suas estruturas (esférica, achatada, estrelar, entre outras). A diferença encontrada nas
análises morfológicas, realizadas por AFM e DLS, permitiu observar que em meio aquoso
(DLS) as nanopartículas apresentam em média 372 nm de diâmetro, e em superfície (AFM)
as mesmas estruturas apresentaram em média 120 nm de altura, provavelmente por seu
achatamento após secagem. Domingues (2006) discute em tese as características de
diferentes sistemas de nanoparticularização. O trabalho teve como objetivo caracterizar
sistemas aquosos e secos e compreender o impacto da secagem em nanopartículas. Para
isso a autora utilizou os polímeros poli(-caprolactona) e o polímero Eudragit® RS100
contendo indometacina. Foi observada variação do tamanho das estruturas após a
secagem, sendo diminuídas em cerca de 100 nm para as duas estruturações, poli(-
caprolactona) e Eudragit® RS100 (DOMINGUES, 2006). Perevyazko e colaboradores (2010)
demonstraram a caracterização de nanopartículas de poli (metil metacrilato) utilizando DLS
e SEM (microscopia eletrônica de varredura), os autores demonstraram que além da
diferença de tamanho de nanopartículas obtidas utilizando-se diferentes metodologias de
produção das nanopartículas, também se observa diferenças quando utiliza-se DLS ou SEM
na caracterização destas moléculas (PEREVYAZKO, VOLLRATH, HORNIG ET AL., 2010).
As análises realizadas por DLS permitiram, ainda, a observação do índice de
polidispersividade (polydispersity index - PDI) de 0,123. O índice de polidipersividade é um
parâmetro calculado em função da autocorrelação obtida pela análise de DLS. Em suma,
este dado consiste em uma extrapolação da função de autocorrelação, que pode ser
alterado de acordo a variabilidade de tamanhos encontrados na amostra (NIDHIN,
INDUMATHY, SREERAM ET AL., 2008). O PDI apresenta limites entre 0,01 e 0,5, no entanto
amostras com grande variabilidade de tamanho entre as estruturas apresentam PDI de 0,7.
Em relação à nanopartículas infere-se que quanto maior o PDI, maior a probabilidade de
formação de agregados por parte da amostra. Neste caso o índice se encontra ideal para a
não formação de agregados por parte da amostra (MALVERN, 2010). Trierweiler (2009)
demonstrou que o PDI de 0,30 para nanopartículas poliméricas está relacionado com a alta
homogeneidade na distribuição de tamanho das nanopartículas (TRIERWEILER, 2009). O
potencial zeta é uma medida que relaciona a carga total das estruturas de interesse e a
relaciona com a estabilidade dessas estruturas. Em se tratando de nanopartículas pode-se
encontrar cargas variando entre + 30 mV, sendo que quanto mais próximo de 0 mV maior a
probabilidade de elas se aglomerarem, uma vez que não há cargas para se repelirem
60
(Carneiro-da-Cunha, 2011). As medidas de potencial zeta permitiram a observação da carga
das nanopartículas, as quais apresentaram um potencial zeta de -7,16 mV (Figura 15).
Figura 15. Potencial zeta, das nanopartículas obtidas utilizando polímero e copolímero em
proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. As análises
foram realizadas utilizando-se Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern Zetasizer
Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma análise em
solução de suas dimensões e propriedades.
Potencial zeta (mV)
Estr
utu
ras (
x1
03)
6
0 -100 0 100
61
Eficiência de encapsulação e liberação sustentada in vitro:
A eficiência de encapsulação do peptídeo na vesícula foi avaliada pela diferença entre
a quantidade total do peptídeo usado para preparar os sistemas de liberação sustentada e o
peptídeo livre encontrado após a metodologia de encapsulação. Para isso 1 ml de amostra
foi aplicada a filtro Amicon® 10 kDa e centrifugado a 4.400g por 15 min, o precipitado foi
coletado e aplicado à cromatografia de fase-reversa em coluna de HPLC Phenomenex® C-
18, e posteriormente comparada à curva padrão do peptídeo, obtida a partir de
concentrações conhecidas do peptídeo aplicadas à mesma metodologia aplicada às
amostras. De acordo com os dados obtidos foi possível observar uma eficiência de
encapsulação de 98% do peptídeo aplicado. A eficiência de encapsulação do fármaco pode
ser afetada por inúmeras vertentes, dentre elas, as características físico-químicas do
fármaco e do polímero, pH as solução, características relacionadas à superfície das
partículas, quantidade de fármaco nanoestruturado, metodologia de nanoformulação e tipo
de tensoativo (SCHAFFAZICK AND GUTERRES, 2003). Nassar e colaboradores 2009) utilizaram
o mesmo polímero em metodologia similar à utilizada no presente estudo. O autor observou
uma taxa de encapsulação de 85 % de tacrolimus em nanopartículas contendo entre 350 e
400 nm (NASSAR ET AL., 2009). Medeiros (2011) demonstrou nanopartículas de quitosana
contendo os peptídeos antitumorais PSLEM 0817 (isolado de Phyllomedusa tomopterna),
PSLEM 0906 (isolado de Trachycephalus venulosus), PSLEM 0904 (fragmento de proteína
supressora de metástase) e PSLEM 0850 (isolado de veneno de abelhas), com uma
eficiência de encapsulação de 97% (MEDEIROS, 2011). Li (2005) observou uma taxa de
encapsulação de até 80 % de albumina em polímeros de metacrilato Eudragit S100 (LI,
2005).
De acordo com o ensaio de liberação sustentada foi possível observar que durante as
doze primeiras horas não houve liberação do peptídeo encapsulado. A partir da 12ª hora foi
possível observar a liberação de até 3,5 g do peptídeo encapsulado (Figura 16).
62
Figura 16. Teste de liberação com leituras a cada 12 horas, totalizando 48 h. Quantificação de
liberação por cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex C-18. Utilizou-se como
parâmetro de quantificação a área do pico referente à presença do peptídeo, comparada a área de
picos previamente conhecidos, utilizando-se curva padrão de quantificação.
A liberação sustentada do fármaco pode ser influenciada, primeiramente, pela
associação fármaco – polímero e, posteriormente pela relação nanoestrutura – solução.
Desta forma a distribuição do fármaco na superfície das partículas; difusão do fármaco
através da matriz das nanoestruturas; difusão através da parede polimérica; a relação de
erosão da matriz polimérica ou combinação dos processos de difusão e erosão são
processos diretamente relacionados à cinética de liberação do fármaco (SOPPIMATH,
AMINABHAVI, KULKARNI ET AL., 2001). Assim, as taxas de liberação do fármaco in vitro podem
se apresentar de forma rápida ou lenta, ou ainda não serem observadas, no entanto esta
relação de liberação in vitro, pode ou não influenciar na atuação do fármaco in vitro e/ou in
vivo. Medeiros (2011) não observou liberação dos peptídeos antitumorais encapsulados em
nanopartículas de quitosana in vitro, no entanto análises in vivo relacionadas ao uso das
nanopartículas de quitosana permitiu a atividade antitumoral dos peptídeos encapsulados.
Nassar e colaboradores (2009) observaram uma rápida taxa de liberação do fármaco
tacrolimus encapsulado em nanopartículas de metacrilato, apresentando 100% de liberação
do fármaco em 4 horas de experimento.
0
1
2
3
4
5
0 12 24 36 48
Pe
pti
de
o li
vre
(
g)
Tempo (horas)
63
6.2 ENSAIOS IN VITRO
Os ensaios in vitro tiveram por finalidade observar e avaliar as possíveis atividades
antibióticas apresentadas pela amostra de interesse, neste caso, a suscetibilidade dos
patógenos E. coli, K. pneumoniae, S. aureus e P. aeruginosa às nanopartículas contendo o
peptídeo antimicrobiano clavanina A. Para realização dos bioensaios utilizou-se meio de
cultura Luria Bertani (LB) líquido. Cada bioensaio teve duração de 12 h, com leituras de
absorbância a cada 30 min. As porcentagens de inibição foram calculadas de acordo com o
controle negativo (H2O destilada), considerando que o controle negativo representa 100 %
de desenvolvimento bacteriano. De acordo com as análises foi possível observar que as
nanopartículas contendo 12 g do peptídeo encapsulado apresentaram 91 % de atividade
antimicrobiana in vitro contra as cepas de S. aureus, como demonstrado na Figura 17. Não
foi encontrada ação antibiótica utilizando-se a mesma concentração do peptídeo livre e nem
das nanopartículas sem o peptídeo.
Ainda de acordo com os bioensaios realizados a inibição do crescimento de K.
pneumoniae foi de 20% para o tratamento utilizando o peptídeo nanoestruturado, sendo de
13% para a nanopartícula sem o peptídeo e não apresentando inibição para o tratamento
contendo apenas o peptídeo (Figura 18).
Figura 17. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma
concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus. Utilizou-se como controle negativo (c-) água
destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1
. As barras
verticais representam o desvio padrão.
Tempo (horas)
Ab
s. (5
95
nm
)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C+
C-
Nano. + Pep.
Nanop.
Pep.
Tempo (horas)
Ab
s. (5
95
nm
)
64
Figura 18. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a
uma concentração de 12g, contra Klebsiella pneumoniae. Utilizou-se como controle
negativo (c-) água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial
cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão.
Em bioensaios desenvolvidos contra as cepas de E. coli não foi observada inibição
para os tratamentos contendo o peptídeo livre, nem para as nanopartículas contendo o
peptídeo antimicrobiano e nem para as estruturas sem o peptídeo (Figura 19). O bioensaio
contra as cepas de P. aeruginosa apresentaram inibição do crescimento bacteriano de
39,8% para o tratamento utilizando o peptídeo associado à nanopartícula, contra 7,33% para
a nanopartícula não contendo o peptídeo. Não foi observada inibição para o tratamento
contendo o peptídeo livre (Figura 20). A Figura 21 resume a atividade in vitro do peptídeo e
das nanoparticulas contra as quatro bactérias acima citadas.
Figura 19 Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma
concentração de 12g, contra Escherichia coli. Utilizou-se como controle negativo (c-) água destilada
e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1
. As barras verticais
representam o desvio padrão.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C+
C-
Nan. + Pep
Nanop.
Pep.
Tempo (horas)
Ab
s. (5
95
nm
)
Tempo (horas)
Ab
s. (5
95
nm
)
65
Figura 20. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma
concentração de 12g, contra Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-) água
destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1
. As barras
verticais representam o desvio padrão.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C+
C-
Nan. + Pep
Nanop.
Pep.
0,0
0,1
0,2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C+
C-
Nan. + Pep
Nanop.
Pep.
Ab
s. (5
95
nm
)
Tempo (horas)
Ab
s. (5
95
nm
)
66
Figura 21. Avaliação de atividade antibacteriana das nanopartículas contendo clavanina A (N+P), a
uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae
e Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-) água destilada e como controle
positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1
., como comparativo foram utilizados o
peptídeo livre (P.L.) e as nanopartículas sem o peptídeo (N). As barras verticais representam o desvio
padrão.
De acordo com a literatura, poucas nanopartículas contendo peptídeos
antimicrobianos com atividade contra micro-organismos patogênicos têm sido
desenvolvidas. No entanto, Turos e colaboradores (2007) descreveram nanopartículas
covalentemente ligadas à penicilina com atividade contra cepas de MRSA. As partículas
foram preparadas por polimerização em emulsão e apresentaram ação prolongada contra a
bactéria. Em artigo publicado no mesmo ano, o autor demonstra a facilidade de preparação
e controle de partículas poliméricas, bem como a alta eficiência quando comparada ao
antibiótico livre (TUROS ET AL., 2007b). Alguns autores têm sintetizado nanopartículas de
íons de prata contra S. aureus, MRSA, Staphylococcus epidermidis (MRSE), Streptococcus
pyogenes, Salmonella typhi, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae. Essas partículas
apresentaram atividade contra todas as bactérias citadas. Para isso as bactérias foram
tratadas com as nanopartículas de íons de prata (AgNO3). Estes íons causaram
modificações morfológicas nas células bacterianas levando à inibição de seu
desenvolvimento. As células afetadas apresentaram estado ativo, no entanto demonstraram-
se inviáveis quando cultivadas (FENG, WU, CHEN ET AL., 2000; MORONES, ELECHIGUERRA,
CAMACHO ET AL., 2005; KIM, KUK, YU ET AL., 2007; JUNG, KOO, KIM ET AL., 2008; NANDA AND
SARAVANAN, 2009).
67
Além de poucos estudos utilizando nanopartículas no controle de infecções
bacterianas, não foram encontrados relatos de nanopartículas poliméricas contendo
peptídeos antimicrobianos. Neste sentido o presente estudo demonstra-se inovador no
desenvolvimento de produtos biotecnológicos farmacológicos.
6.2.1 Teste de hemólise
O ensaio hemolítico foi realizado com o uso de triton X-100 0,1% como controle
positivo (C+), PBS 0,01M como controle negativo (C-). O peptídeo livre foi comparado com o
peptídeo nanoestruturado, e a nanoestrutura livre, a qual não contém o peptídeo. Para o
cálculo de taxa de hemólise a liberação de hemoglobina foi medida a λ 405 nm e expressa
como porcentagem de hemólise, sendo o controle positivo considerado como 100%
hemolítico. Para representatividade dos dados o ensaio foi realizado em triplicata. De acordo
com os dados obtidos (Figura 21) não houve atividade hemolítica para nenhuma das
amostras testadas (nanopartículas contendo o peptídeo, peptídeo livre e nanopartículas sem
o peptídeo). Estes dados demonstram que o uso do peptídeo nanoestruturado não
apresenta indícios de citotoxicidade relacionada a hemólise de células sanguineas
humanas, podendo ser viável para uso farmacológico (DRESCH, HAESER, LERNER ET AL.,
2005).
Figura 22. Ensaio hemolítico realizado com o uso de Triton X-100 0,1% como controle positivo (C+),
PBS 0,01M como controle negativo (C-). As barras verticais correspondem ao desvio padrão. Foram
utilizadas 12 g do peptídeo (clavanina A), as nanopartículas sem o peptídeo e as
nanopartículas contendo o peptídeo (12 g).
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
C+ C- Pep. Nano +Pep. Nanop
Ab
s: 4
05
nm
Amostra
68
Gou e colaboradores (2009) desenvolveram de nanopartículas de Poly(ε-
caprolactone)/ Poly(ethyleneglycol)/ Poly(ε-caprolactone) contra tumores. Os autores
demonstraram que as nanopartículas obtidas não apresentaram atividade hemolítica,
viabilizando seu uso no desenvolvimento de novos fármacos (GOU, ZHENG, MEN ET AL.,
2009). Por outro lado, Creangã e colaboradores (2009) demonstraram os efeitos de
nanopartículas de magnetita em eritrócitos. Os autores concluíram que o fluido magnético se
apresentava incompatível com as células sanguíneas, inviabilizando seu uso farmacêutico
(CREANGĂ, CULEA, NĂDEJDE ET AL., 2009). Desta forma pode-se observar que os ensaios de
hemólise in vitro podem ser essenciais para o conhecimento prévio de indícios de toxicidade
do composto em desenvolvimento, no entanto os resultados destes testes não dispensam
testes in vivo e análises específicas relacionadas à toxicidade do composto.
6.3 ANÁLISES IN VIVO
6.3.1 Sobrevida
Como descrito anteriormente, a sepse caracteriza-se pelo desencadeamento de
SIRS relacionado a uma infecção, no entanto, a sepse pode evoluir apresentando quadros
de disfunção orgânica secundária, passando a ser definida como sepse grave e, por fim,
instabilidade cardiovascular, requerendo vasopressores, definindo o quadro de choque
séptico (MEDICINE, 1992 ). Os quadros de sepse evoluem de acordo com o tempo e a
resposta inflamatória do individuo, quando a resposta é, ainda, controlada existe um
equilíbrio entre os mediadores anti e pró inflamatórias restaurando-se a homeostase. No
entanto, quando há avanço da infecção consequentemente a perturbação deste equilíbrio
levando ao desencadeamento de SIRS, desencadeando processos de disfunção e,
posteriormente, falência múltipla de órgãos (BONE,GRODZIN AND BALK, 1997).
Para realização dos teste de sobrevida os camundongos foram pré tratados (15
minutos antecedentes a aplicação da suspensão bacteriana) com as diferentes amostras,
sendo elas peptídeo nanoestruturado, peptídeo livre, a nanoestrutura sem o peptídeo e os
controles positivo (cloranfenicol 40 g.ml-1 ) e negativo (animais não tratados). Em seguida
foram administradas doses dos tratamentos referentes a cada grupo (2, 4 e 12 g.ml-1). As
doses foram administradas a cada 24 h, objetivando a observação da sequência terapêutica
durante sete dias (tempo total de observação). De acordo com os resultados obtidos (Figura
69
22) foi possivel observar uma sobrevida, ao fim do sétimo dia, de 100 % dos animais
induzidos a sepse subletal tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A,
utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo. Para os animais tratados com as
nanopartículas associadas a clavanina A (12 e 4 g do peptídeo) observou-se uma taxa de
sobrevida de 20%. Os animais tratados com a estrutura sem o peptídeo apresentaram 80%
de sobrevida. Para o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada
sobrevida.
Figura 23. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse subletal intraperitoneal, com
administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi
realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e K.
pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e
a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do
peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A).
Os resultados obtidos pela curva de sobrevida dos animais induzidos a sepse letal
(Figura 23) demosntraram diferenças significativas dos resultados obtidos para sepse letal.
Neste caso, os animais tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A,
utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo, apresentaram 40% de sobrevida ao
fim do sétimo dia. O grupo tratado com as estruturas sem o peptídeo observou-se uma taxa
de sobrevida de 20%, o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada
sobrevida.
Nanop.
Nano + Pep. 2 g
Nano + Pep. 12 g
Nano + Pep. 4 g
Pep. 12 g
70
Figura 24. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse letal intraperitoneal, com
administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi
realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o
peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo,
utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo
clavanina A).
A análise dos dados permite observar que a taxa de sobrevida dos animais durante
o experimento varia de acordo com o tempo de indução à sepse. Neste sentido foi possível
observar que a evolução do quadro de sepse para os animais não tratados (letal), tratados
somente com a estrutura (Nanop.) e tratados com o peptídeo livre (Pep.) não se modifica
após o segundo dia, sendo apenas 20% sobreviventes após 48 h de experimento. Para os
animais tratados com as nanopartículas associadas à clavanina A (2 g) a taxa de sobrevida
observada foi de 80 % até o segundo dia e de 60 % do segundo ao sexto dia. Estudos
posteriores poderão demonstrar se esta relação poderá prolongar o tempo de tratamento,
quando associado a outros antibióticos já utilizados. Alem disso, os resultados sugerem
fortemente que o efeito observado pode estar relacionado a atividade imunomodulatória
associada a atividade antibiótica do peptideo, novos experimentos poderão elucidar essa
caracteristica imunomodulatória.
O modelo de sepse caracterizado pela administração intraperitoneal da bactéria viva
ou de componentes microbianos tem sido muito utilizado para observação de sobrevida de
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
100
Nano Pep 2 ug
Estrutura 50 ul
Letal
Pep. Livre 12 ug
Dias após a Sepse
So
bre
vid
a (
%)
Nanop.
Nano + Pep. 2 g
Pep. 12 g
71
modelos animais. Essa metodologia reproduz os sintomas da sepse, demonstrando uma
real proximidade do quadro de sepse observado em casos clínicos, uma vez que o processo
se inicia a partir do foco infeccioso induzido na cavidade peritoneal, sendo disseminado de
forma rápida. Giacometti e colaboradores (2002) demonstraram a atividade de três proteínas
sendo elas a buforina II (BUF), a indolicidina (IND) e a sequência KFFKFFKFF (KFF), em
três diferentes formas de indução da sepse por E. coli (infusão intraperitoneal de LPS,
infusão intraperitoneal de colônias bacterianas, perfuração do ceco). Inicialmente não foi
observada diferença significativa entre os resultados obtidos para cada metodologia. Para
as metodologias de administração de LPS e infusão de colônias bacterianas não foi
observada sobrevida para os grupos controle, para os grupos tratados com as amostras de
BUF, IND e KFF, respectivamente, 26, 40 e 53 % de sobrevida nos grupos em que foi
utilizada a infusão intraperitoneal da bactéria e 33, 53 e 66% de sobrevida, respectivamente
(GIACOMETTI, CIRIONI, GHISELLI ET AL., 2002).
Cirioni e colaboradores (2002) demonstraram o uso das magaininas I (M1), II (M2) e
magainina II amidada (M2-NH2) no tratamento contra sepse bacteriana. Para isso os autores
induziram a sepse em camundongos por infusão intraperitoneal de colônias de E. coli. Os
autores demonstraram que 86,7% dos animais não tratados não sobreviveram, os grupos
tratados com M1, M2 e M2-NH2 apresentaram, respectivamente, 73,3; 80 e 66,7 % de
sobrevivência (CIRIONI, GIACOMETTI, GHISELLI ET AL., 2002). Coopersmith e colaboradores
(2002) demonstraram a relação entre o nível de apoptose celular no intestino de pacientes
com sepse bacteriana e os níveis de mortalidade encontrados. Para isso os autores
utilizaram camundongos previamente induzidos a super-expressão da proteína
antiapoptótica BCl2. Os animais foram, posteriormente, induzidos a sepse por infusão
intraperitoneal de colônias de P. aeruginosa, a sobrevida observada foi de 40% dos animais
com a super expressão protéica contra 4 % dos animais controle (COOPERSMITH,
STROMBERG, DUNNE ET AL., 2002). Os estudos acima descritos apresentam o uso de
peptídeos antimicrobianos utilizados no controle de infecções septicêmicas. Entretanto o uso
de nanopartículas poliméricas contendo peptídeos antimicrobianos não foi, ainda, relatado o
que dificulta uma comparação exata.
6.3.1 Análises de migração de neutrófilos após indução de sepse
Como anteriormente descrito, a sepse resulta da complexa interação entre o micro-
organismo infectante e a resposta imune, pró-inflamatória e pró-coagulante do hospedeiro,
desta forma a resposta imune inata pode ser responsável pelo processo inflamatório inicial
da sepse, a qual corresponde a alterações relacionadas a oferta de oxigênio e substratos,
72
levando as células a reagir à agressão séptica modificando seu comportamento, função e
atividade. Apesar dos mecanismos de disfunção orgânica não estarem completamente
elucidados estes mecanismos podem ser classificados em sistêmicos ou orgão específico.
Desta forma a resposta imune em relação a sepse pode desencadear tanto uma resposta
imune exagerada quanto a falta de resposta imune levando a falência multipla dos orgãos, a
depender do tempo de evolução da doença (HENKIN ET AL., 2009).
De acordo com os dados obtidos pela contagem total e diferencial das células
retiradas do lavado peritonial dos camundongos foi possivel observar que os camundongos
tratados com o antibiotico comercial, cloranfenicol 40 g.ml-1 (c+), os animais não tratados,
e os animais tratados somente com a nanoparticula, sem o peptídeo, apresentaram niveis
simililares de migração de neutrófilos (Figura 26). No entanto, segundo a análise estatística
por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,0001 , realizada com auxilio do software GraphPad
Prism 5, não houve diferença significativa entre os grupos testados.
Figura 25. Análises de correlação de sepse e migração, realizadas após a indução de sepse letal por
via intraperitonial, com administração dos tratamentos de cada grupo. Os grupos foram divididos em
Letal, controle positivo (C+), 2 g de peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nano).
A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli,
P. aeruginosa e K. pneumoniae. O lavado peritoneal foi obtido após 6 horas de indução de sepse. A
análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras
foram comparadas entre sí, objetivando demonstrar sua similaridade (*).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Letal C+ Pep. Nano.(2 ug)
Nano
Ne
utr
ófi
los
x 1
03
l
* *
*
*
Segundo Fialkow e colaboradores (2006) a apoptose de neutrófilos pode ser
inversamente proporcional a gravidade da sepse, neste sentido quanto maior a presença de
neutrófilos, mais facilmente pode-se controlar a infecção. Desta forma, o aumento na
73
contagem de neutrófilos encontrada para os animais tratados com a nanoestrutura contendo
a clavanina A, pode ser associada a regulação do tempo de evolução da sepse,
aumentando o tempo entre a infeção dos animais e a falência multipla dos orgãos (FIALKOW,
FOCHESATTO FILHO, BOZZETTI ET AL., 2006). Alves-Filho e colaboradores (2005)
demonstraram a importância da migração de neutrófilos para o foco infecioso, uma vez que
estes são capazes de controlar o desenvolvimento bacteriano e estimular a ativação de
outras celulas do sistema imune (ALVES-FILHO, BENJAMIM, TAVARES-MURTA ET AL., 2005).
Benjamim e colaboradores 2000 demonstraram a deficiência de migração de neutrófilos em
camundongos submetidos a sepse letal e subletal, os autores relacionam o aumento da
deficiência ao estado de sepse, uma vez que os animais submetidos a sepse subletal
apresentaram maior migração de neutrófilos e menor número de bactérias no exsudato
peritoneal (BENJAMIM,FERREIRA AND CUNHA, 2000). Desta forma conclui-se que a
concentração diminuta do número de neutrófilos encontrada nos animais não tratados e dos
tratados com o cloranfenicol 40 g.ml-1 e com as nanoestruturas sem o peptídeo, podem se
relacionar ao maior desenvolvimento bacteriano. Para os animais tratados com as
nanopartículas associadas ao peptídeo antimicrobiano, os quais apresentaram niveis
maiores de migração de neutrófilos, pode-se relacionar a um leve aumento de atividade
imunológica contra a infecção.
6.3.2 Análises de migração de neutrófilos:
Os neutrófilos representam os principais mediadores da imunidade inata,
contribuindo para a eliminação de micro-organismos patogênicos. Em relação a septicêmias
a migração de neutrófilos relaciona-se diretamente com a diminuição de mortalidade, uma
vez que permite a continuidade da resposta imune ao processo infeccioso. Neste sentido a
análise de migração de neutrófilos objetiva a observação de indução ou inibição da
capacidade de resposta do organismo em relação ao processo infeccioso (BENJAMIM, 2001).
Para a análise de migração de neutrófilos, os animais foram previamente tratados utilizando-
se 500 g de carragenina, fármaco inflamatório/endematogênico, aplicada via
intraperitoneal. Objetivando a observação comparativa de inibição do processo inflamatório
utilizou-se um grupo controle de animais não tratados após a indução inflamatória e um
grupo de animais aos quais não foi aplicado o indutor inflamatório, os demais grupos de
camundongos foram induzidos ao processo inflamatório e receberam os diferentes
tratamentos, sendo eles, peptídeo livre, nanopartículas contendo o peptídeo e
nanopartículas sem o peptídeo.
74
De acordo com os dados obtidos pela contagem total e diferencial das células
retiradas do lavado peritonial dos camundongos (Figura 24) foi possivel observar a
diminuição de migração de neutrófilos tanto para o peptídeo livre como para as
nanopartículas contendo o peptídeo e para as nanoparticulas sem o peptídeo, como
demonstrado na Figura 9. Considerando-se a carragenina como 100 % indutor inflamatório,
o peptídeo livre com concentrações de 2, 4 e 12 g, apresentou respectivamente, 77, 80 e
58% de inibição da indução inflamatória causada pela carragenina. O peptídeo encapsulado
apresentou com concentrações de 2, 4 e 12 g, respectivamente, 51, 83 e 41% de inibição
da inflamação e as nanopartículas sem o peptídeo apresentaram, para as mesmas
concentrações, 82, 80 e 84% de inibição do processo de inflamação. Segundo a análise
estatística por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,05 , realizada com auxilio do software
GraphPad Prism 5, houve diferença significativa entre a carragenina e as amostras de
peptídeo livre (2 e 4 g), peptídeo nanoestruturado (4 g) e nanoestrutura 50, 100 e 300 l.
Em relação a solução salina apenas apresentaram diferença significativa as amostras de
peptídeo livre 12 g, peptídeo nanoestruturado 2, 4 e 12 g e nanoestrutura (50 e 300 l).
Neste sentido pode-se inferir que para as amostras que demonstraram diferença
significativa com a carragenina houve dimuinuição do efeito inflamatório induzido, para as
amostras que demonstraram diferença significativa com a solução salina houve efeito
inflamatório mesmo que diminuto.
75
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
2 4 12
Pep. Livre (g)
2 4 12
Pep. Nano(g)
50 100 300
Nanoest. (l)
Carragenina (500g)
Salina
*
Car.
+
+
+
* **
*
+
Nº
de
Ne
utr
ófilo
s (
x1
03)
Figura 26. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por carragenina,
administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de cada grupo. A obtenção
do lavado peritoneal foi realizada após 6 horas da administração do indutor inflamatório. Foram
utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e negativo a carragenina 500 g (Car.), as
amostras de peptídeo livre (pep. Livre), peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura
(Nanoest.) foram comparadas aos controles negativo e positivo visando a observação do efeito anti-
inflamatório. A análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p<0,05, onde
as amostras foram comparadas com as amostras controles sendo marcadas aquelas de acordo com
a similaridade entre a amostra e a solução salina (+) e a carragenina (*).
A análise comparativa das amostras obtidas (peptídeo livre, o peptídeo encapsulado,
12 g de peptídeo, e as nanopartículas sem o peptídeo) permitiu a observação de
modulação do efeito inflamatório causado por indução, para isso a carragenina foi
considerado como 100% indutor inflamatório. O peptídeo livre, o peptídeo encapsulado (12
g) e as nanopartículas sem o peptídeo apresentaram respectivamente 42, 37 e 24% de
inibição da indução inflamatória causada pela carragenina (Figura 25). , para as mesmas
concentrações, 82, 80 e 84% de inibição processo inflamatório. Segundo a análise
estatística por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,05 , realizada com auxilio do software
GraphPad Prism 5, houve diferença significativa entre a carragenina e a amostra de
peptídeo livre (12 g) e nanoestrutura. Em relação a solução salina foi observada diferença
significativa para as amostras de peptídeo livre 12 g, peptídeo nanoestruturado 12 g e
76
0.0
0.5
1.0
1.5
Pep. Liv re
(12 g)
Pep. Nano
( 12 g)Nanoest.Sal. Dexa.
Carragenina (500g)
*
+
Car.
Nº
de
Ne
utr
ófilo
s (
x10
3)
##
#
+
*
nanoestrutura. Neste experimento observou-se ainda o efeito do fármaco anti-inflamatório
dexametasona, sendo que apenas a amostra de peptideo nanoestruturado 12 g
apresentou diferença significativa.
Figura 27. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por carragenina,
administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de cada grupo. A obtenção
do lavado peritoneal foi realizada após 12 horas da administração do indutor inflamatório. Foram
utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e negativo a carragenina 500 g (Car.), as
amostras de peptídeo livre (Pep. Livre), peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura
(Nanoest.) foram comparadas aos controles negativo e positivo visando a observação do efeito anti-
inflamatório. A análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde
as amostras foram comparadas com as amostras controles sendo marcada a similaridade entre a
amostra e a solução salina (*), a carragenina (+) e a dexametasona (#).
Com a indução do processo inflamatório estimula-se a migração de células
imunológicas para o local afetado, desta forma a contagem de neutrófilos pode ser utilizada
como um dosador da evolução do processo (ROBBINS,COTRAN AND KUMAR, 2001). Para isso
a análise de moléculas com potencial anti-inflamatório, por exemplo, pode ser realizada de
acordo com a avaliação de migração de células imunológicas para locais específicos, por
meio de indução destes processos.Guarna e colaboradores (2006) revisaram a potencial
atividade anti-inflamatória encontrada em peptídeos catiônicos com atividade
antimicrobiana, apesar dos mecanismos de ação destes peptideos não serem
completamente elucidados sugere-se que haja interação dos peptídeos com propriedades
catiônicas com as células de defesa do hospedeiro, regulando sua migração para o local da
infecção (GUARNA,COULSON AND RUBINCHIK, 2006). Neste trabalho foi utilizada metodologia
de indução inflamatória por applicação intraperitoneal de carragenina, metodologia
77
semelhante foi utilizada por Bank e colaboradores (1990) objetivando demonstrar a atividade
anti-inflamatória do peptídeo 401 isolado do veneno de abelhas européias. Neste trabalho
os autores utilizaram indução inflamatória sub-cutanea aplicando carragenina para idução
de edema de pata. Após aplicação do peptideo 401 foi observada redução de 50 % do
edema induzido, sendo relacionada a atividade anti-inflamatória do peptídeo com a
capacidade de degranulação de mastócitos (BANKS, DEMPSEY, VERNON ET AL., 1990). Luger
e colaboradores (2007) demonstraram o -MHS como uma nova classe de peptideos anti-
inflamatórios. Esses peptideos endógenos foram derivados do tri-decapeptídeo
proopiomelanocortina por modificações pós-traducionais, os autores demonstraram que este
peptídeo foi capaz de suprimir o processo inflamatório induzido e regular o processo de
migração de celulas do sistema imune (LUGER AND BRZOSKA, 2007).
78
7 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar a viabilidade do projeto para o
desenvolvimento de possíveis produtos biotecnológicos. Os resultados preliminares
possibilitam observar:
A partir do polímero Eudragit L100-55 e do copolímero Eudragit RS 30D utilizando a
proporção 3:1 de polímero e copolímero, respectivamente, as estruturas
apresentaram segundo análises de microscopia de força atômica, distribuição
unimodal de tamanho (entre 62 e 250 nm de altura).
As análises das características morfológicas, obtidas por DLS apresentaram
nanopartículas contendo 372 nm de diâmetro, além de índice de polidispersividade
de 0,123, o que possibilita inferir-se que as estruturas possuem baixa variação do
tamanho entre as nanopartículas e baixa tendência a se aglomerar.
De acordo com os bioensaios in vitro contra as bactérias S. aureus, E. coli, P.
aeruginosa e K. pneumoniae a clavanina “A” nanoestruturada apresentou índices de
inibição do crescimento bacteriano positivos.
O peptídeo nanoestruturado não apresentou atividade hemolítica.
A taxa de encapsulação apresentou 98% de eficácia na nanoestruturação do
peptídeo antimicrobiano clavanina A. A liberação sustentada in vitro demonstrou que
o peptídeo em questão libera até 3% do peptídeo encapsulado na 12ª hora de
experimento.
Foi possível observar o potencial in vivo (contra o pool de bactérias contendo S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae) do peptídeo nanoformulado,
comparado ao peptídeo livre. Sendo possível observar uma taxa de sobrevivência de
60% dos animais tratados com o peptídeo nanoestruturado ao fim do sétimo dia de
experimento.
Não foi observado efeito anti-inflamatório nos animais tratados com o peptídeo
nanoestruturado.
Neste sentido conclui-se que a estruturação dos peptídeos antimicrobianos, como a
clavanina “A”, em sistema polimérico apresenta grande potencial biotecnológico, uma
vez que se observou a possibilidade de nanoestruturação e o aumento da eficiência
79
destas nanopartículas em animais induzidos a sepse. Novos experimentos poderão
elucidar melhor o potencial biotecnológico das estruturas propostas.
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