Sequenciamento de DNA emMegaBACE DNA Analysis Systems

bull Prof Dr Luciano da Silva Pinto

TGTGAACACACGTGTGGATTGG

ls_pintohotmailcom

Sequenciamento do DNA

Definiccedilatildeo Identificaccedilatildeo da ordem exata dos pares de bases (A T G e C)

em um segmento de DNA

ImportacircnciaO conhecimento da sequumlecircncia de bases de um gene fornece importantes informaccedilotildees sobre sua estrutura funccedilatildeo e relaccedilatildeo evolutiva com outros

genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)

Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica

Watson amp Crick

Nobel 1962

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975

Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Sequenciamento do DNA

Definiccedilatildeo Identificaccedilatildeo da ordem exata dos pares de bases (A T G e C)

em um segmento de DNA

ImportacircnciaO conhecimento da sequumlecircncia de bases de um gene fornece importantes informaccedilotildees sobre sua estrutura funccedilatildeo e relaccedilatildeo evolutiva com outros

genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)

Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica

Watson amp Crick

Nobel 1962

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975

Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

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ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica

Watson amp Crick

Nobel 1962

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975

Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Watson amp Crick

Nobel 1962

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975

Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo

Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975

Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Sequumlenciamento de DNA

Projeto Genoma Humano

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Tecnologias de sequenciamento

- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)

- Pirosequenciamento

- Science 281 (1998) n 5375 363-365

- Nature 437 (2005) 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

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N+NO

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Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

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Em

issi

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(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

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50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Meacutetodo de Sanger

bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear

bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar

bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

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ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

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OH O

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Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

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scence

Em

issi

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(Exci

tati

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t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

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0

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40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)

bull 1 primer

bull DNA polimerase

bull dNTPs

bull ddNTPsOH

H

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Eletroforese

bull em placa

bull capilar

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA

Radioisoacutetopos

Leitura das sequecircncias -Manual

Leitura das sequecircncias -Automaacutetica

Fluoresceiacutenas

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Leitura da sequumlecircncia de DNA

bull ManualManualG A T C

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

bull AutomaacuteticaAutomaacutetica

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada

denaturaccedilatildeo

anelamento dos primers

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

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OH O

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Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

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t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT

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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

Organizando as Sequumlecircncias de DNA

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos

fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Generic Sequencing Instrument

GCTATAGTTGATTCCT

Electrical Field

-

+

Laser

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix

Energy Transfer Dyes

bullFluorescein Donor Dye

bullStandard Rhodamine Acceptor Dyes

Fluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Ar+ Laser

O

CO2-

N+N

ddNTP

O

CO2-

N+NO

CO2-

OH O

ddNTP

Radiationless

Energy Transfer

Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Norm

aliz

ed

Flu

ore

scence

Em

issi

on

(Exci

tati

on a

t 488 n

m)

Fluorescein-R110-ddGTP

Fluorescein-R6G-ddTTP

Fluorescein-TAMRA-ddATP

Fluorescein-ROX-ddCTP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

500 550 600 650 700

Wavelength (nm)

DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Leitura da sequumlecircncia de DNA

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Montagem

Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

clonar em vetor

sequenciamento

reads

Shotgun do genoma inteiro

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)

reads

Sequecircncia consenso(DNA original)

A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde

50Kpb ateacute 300Kpb

DNA genocircmico

~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaccedilos de 2000pb

Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaccedilos do genoma

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40

O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia

Genome Research 8 (3) (1998) 175-185

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal

- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background

background

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Regiatildeo de qualidade alta

bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante

Analisando o cromatograma

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml

bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml

Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades

bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel

Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

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Animaccedilotildees

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Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade

bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante

Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

Science 281 (1998) n 5375 363-365

Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

Computador

Bombeamento de fluiacutedos

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Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

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Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada

- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)

- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)

- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb

Pirosequenciamento

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(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

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Bombeamento de fluiacutedos

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Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

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Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

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Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

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Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

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Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

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Sanger vs Pirosequenciamento

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Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

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Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb

(shotgun)

DNA genocircmico

Ligaccedilatildeo do adaptador e

separaccedilatildeo em fita simples

Shotgun do genoma inteiro

- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

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Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

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Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

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Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

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- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo

- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA

- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento

- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD

Nature 437 (2005) 326-327

Pirosequenciamento

O sequenciador 454

Cacircmera de CCD

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Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)

Nature 437 (2005) 376-380

Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt

Pirograma

Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b

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Sanger vs Pirosequenciamento

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As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

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Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

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Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

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Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

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SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em

bacteacuteria (2 semanas de trabalho)

bull Natildeo haacute clonagem

bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp

bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)

bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees

Sanger vs Pirosequenciamento

bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)

bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas

bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo

bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240

Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

satildeo homoacutelogas

1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies

1831-1836 Viagem do Beagle

2004-2006 Viagem do Sorcerer II

Animaccedilotildees

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Os organismos possuem padrotildees

As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

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1831-1836 Viagem do Beagle

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As moleacuteculas tambeacutem

Daehhhh

EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicos

Macadores moleculares

Sequecircncias

Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas

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Macadores moleculares

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Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade

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