Snmek 1

Serologick metody v diagnostice nejen rostlinnch patogen

Metody vyuvajc kompatibiln reakce antigenu a protiltkyNkter texty a obrzky jsou pouity z veejn dostupnch webovch zdroj.

Vymezen zkladnch pojm a vztahAntigeny jsou stice, kter mohou stimulovat tvorbu protiltek. Mohou bt bu pirozen nebo chemicky syntetizovan, mohou bt bu vt (bakterie, proteiny, sacharidy) nebo mal molekuly, nkdy se stvaj antigeny i buky vlastnho organismu. Vmikrobiologii se vyuvaj jako antigeny cel mikroorganismy nebo jejich sti - tla, biky, rzn extrakty. AntigenProtiltkaAnti = proti (ecky)gen = od gegnomai tvoit

Makroorganismus rozpoznv povrchov znak, kter oznaujeme jako antigenn determinantu =epitop. Epitop je prv imunologick st, kterou protiltka rozpozn a je schopna se na ni navzat. Antigeny maj vtinou vce epitop, kter prokazujeme specifickmi metodami.

Struktura epitop podle pvodu a typu antigenuproteinov: determinanty tvo zpravidla aminokyselinov zbytky na konci peptidovch etzcpolysacharidov:determinanty tvo jednotky monosacharidnukleov kyseliny: determinanty tvo nkolik nukleotid nebo ppadn purinovch pyrimidinovch bz

Rozdlen EpitopSekvenn determinantyKonforman determinantyuruje posloupnost (sekvence) zkladnch subjednotek biopolymru (aminokyselin, monosacharid, nukleodid). Pitom subjednotky mohou bt v rzn nhodn konformaci. tvo jen jedna mon konformace urit sti molekuly antigenu (polypeptidovho nebo polysacharidovho etzce). Jsou typick pro nativn antigeny. Denaturac proteinovch antigen se mn prostorov struktura a tm i specifinost konformanch antigen. Specifinost sekvennch antigen se denaturac nemn.

Protiltky.Za tvorbu protiltek jsou zodpovdn Blymfocyty zkostn den. Protiltky jsou imunoglobuliny. Molekuly imunoglobulin jsou sloeny ze dvou lehkch a dvou tkch polypeptidovch etzc uspodanch do psmeneY.

Na molekule imunoglobulinu dle rozeznvme st konstantn a st variabiln. Prv na variabiln sti etzce nachzme aktivn neboli vazebn msto, kter se specificky ve santigenn determinantou (=epitopem).

Imunoglobuliny meme rozdlit podle kvality tkch etzc do pti skupin: IgG, IgA, IgM, IgE a IgD.Zkladn funkc protiltek je jejich vazba na specifick antigen, jeho neutralizace, opsonizace nebo aktivace komplementu.

REAKCE ANTIGEN PROTILTKAZkladem reakc je vznik biospecifick vazby mezi vazebnmi msty protiltky a determinantnmi skupinami antigenu za vzniku protiltkov-antigennch komplex (imunokomplex). Pi interakcch antigenu a protiltky se uplatuj stejn nekovalentn interakce jako nap. enzym-substrt.Sly podlejc se na vazb antigen protiltkaVODKOV VAZBYNEPOLRN HYDROBBN INTERAKCECOULOMBOVY SLYVAN DER WAASOVY SLYLONDONOVY DISPERZN PITALIV SLYSTRICK ODPUDIV SLY

VODKOV VAZBY interakce elektronov deficitnho protonu se dvma atomy s velkou elektronovou hustotou (elektronegativn atomy). Proton vytv mstek mezi atomy V ppad protein se vodkov mstky tvo mezi hydrofilnmi skupinami (-OH, -NH2, -COOH) -OHO- -OHN- -NHN-HYDROFBN INTERAKCE vznikaj pi dostatenm piblen dvou hydrofbnch povrch. Zastuj se jich aminokyseliny leucin, izoleucin, valin a fenylalanin. Nevytvej s molekulami vody vodkov mstky, a proto ve vodnch roztocch dvaj pednost vzjemnm interakcm, pi kterch se odstran molekuly vody, kter hydrofbn skupiny obklopovaly. Molekuly protein ve vodnm prosted se sna zaujmout takovou polohu, aby jejich hydrofbn skupiny byly co nejble sob, m se vylou nebo omez kontakt s molekulami vody. Takto uspodan molekulyse tm dostvaj do energeticky vhodnjho stavu, protoe zskvaj entropii. Hydrofbn interakce pat vreakcch antigen a protiltek k nejvznamnjm.COULOMBOVY SLY vznikaj na zklad vzjemnho pitahovn opan elektricky nabitch funknch skupin nebo molekul. V molekulch protein jsou to obyejn koncov aminokyselinov jednotky jako je lysin, arginin, histidin, kyselina aspargov a glutmov. Pi interakci antigen-protiltka se s nimi asto setkvme, ale nemaj tak rozhodujc vliv jako hydrofbn interakce.Nap. proti kladn nabitm haptnm vzniknou zporn nabit protiltky.VAN DER WAALSOVY SLYNboj na jedn molekule nebo atomov skupin me indukovat vznik diplu na druh molekule. Zkladem je vzjemn ovlivovn elektronovch oblak dvou polrnch skupin atom.Vsledkem psoben jednoho elektronovho oblaku na druh je vznik oscilujcch dipl na obou skupinch.Takto vznikl diply se vzjemn pitahuj na mstech, kde maj opan nabit nboje.VAN DER WAALSOVY SLY se uplatuj hlavn pi stabilizaci imunokomplex.LONDONOVY DISPERZN SLY Pi interakci elektronovch oblak dvou nepolrnch skupin atom vznikaj podobn pitaliv sly.Disperzn sly jsou podmnn fluktuacemi elektron,a proto se uplatuj bez vzniku permanetnch dipl Sla vazby se vrazn zvyuje se zmenovnm vzdlenosti mezi reagujcmi skupinami. Pro vechny sly uplatujc se pi interakci antigen-protiltka plat zkladn poadavek, co nejtsnjho piblen obou reagujcch skupin, pak se mohou pitaliv sly uplatnit. Aby se mohly uplatnit, mus pekonat sterick odpudiv slySTERICK (PROSTOROV) ODPUDIV SLY vznikaj mezi dvma atomy, kter nejsou spojen chemickou vazbou, a to na zklad vzjemnho prolnn jejich elektronovch oblak. m vt komplementrnost maj oba typy oblak, tm men odpudiv sly jsou mezi nimi. Tyto sly jsou zkladnm faktorem, podle kterho se protiltka vybr vhodn antigen pro interakci.Nespecifick antigenov determinanty nemaj vazebn msta na molekule protiltky, proto jsou mezi nimi velk odpudiv sly, kter brn mezi omezuj tvorbu vazby na minimum (kov reakce).Kdy jsou elektronov obaly determinantu vazebnho msta komplementrn, odpudiv sly jsou mal a mohou pevldnout pitaliv sly, kter pak realizuj imunospecifickou vazbu. V tomto ppad m protiltka pro antigen vysokou afinitu

Srologick reakce reakce hodnotme kvalitativn a kvantitativn. Sledujeme dynamiku protiltek, tj. jejich zven nebo snen vzvislosti na ase. Pi stanoven kvantity srum nebo jinou tln tekutinu, ve kter chceme protiltky prokzat, edme fyziologickm roztokem geometrickou adou. Reciprok hodnota nejvyho edn, ve kterm jet dolo kpozitivn reakci, se oznauje jako titr. Clem kvantitativn srologick reakce je tedy zjitn titru.Polyklonln protiltkyMonoklonln protiltkyv se na vce antigennch determinant antigenuv se na jedinou determinantuPprav obou typ protiltek pedchz vbr a pprava antigenuMetody ppravy antigenuZskn antigenu pirozenou cestou z patogenaPro zskn antigenu touto cestou je nejprve nutn zvit koncentraci patogena na rove vyuitelnou pro imunizaci. K tomuto elu lze zvolit rzn strategie pro rzn patogeny.In vitro (BCT)

In vivo (viry)Izolace antigenu je pak zvisl na ce ad faktor, kter maj vliv na kvalitu, kvantitu a v neposledn ad i clenost danho antigenu. Zejmna pi strategii in vivo izolujeme zpravidla sms ppadnch antigen, kter je nutn pozdji separovat. Jako separan metody jsou vyuvny metody centrifugan resp. ultracentrifugan v gradientu obv. sacharozy. Pro purifikaci kapsidovho proteinu vir lze rovn s spchem pout chromatografickk metody, precipitan metody rznmi solemi nebo PEG. Nelze opominout ani metody elektroforetick SDS PAGE v tomto ppad nen ani nutn oddlen partikule izolovat z gelu a po homogenizaci lze okamit pout pro imunizaci.Rekombinantn antigenPi znalosti genomu patogena lze vyut pro ppravu antigenu a strategii rekombinantnch molekul. V takovch ppadech pouijeme znmou sekvenci pro pmou syntzu danho polypetidu slubou. V nkterch ppadech lze dan sek vloit do vhodnho plasmidu a tento transformovat do vhodnho klonu bakterie, nejastji pak E.coli, a ta exprimuje dan protein. Ze smsi je pak mon jej rychle purifikovat SDS PAGE a pout pro imunizaci.

cDNA cloning

Transformace expreseselekce

In silico syntetick antigen

cDNA proteinSyntza Konjugace s nosiem Pprava polyklonlnch protiltekVbr zvete

Imunizace -postup vytven imunity v organizmu, tedy tvorba protiltek. Pro vnesen antigenu do tla zvete lze pout nkolik strategi mezi zkladn pat injekn a operativn.

Injekn IntravenoznIntramuskulrnoperativnpankreasslezinaDutina binIntrapeitoneln

asov rozvrh pro imunizaciPro spnou imunizaci je nutn dvky antigenu opakovat a to v tdennch intervalech. Za 6-7 tdn je zpravidla titr protiltek dostaten vysok a je tedy mon pistoupit k purifikaci protiltek. Po celo dobu imunizace je nutn sledovat nrst titru protiltek v sru. Na zvr je tedy vhodn aplikovat vt dvku antigenu (booster) pro zskn nejvyho titru. Zskn krve Separace sraPprava IgGKrev v laboratorn teplot se pirozenm zpsobem sr, tekut st je srum, kter lze po filtraci dlouhodob skladovat lyofilizovan nebo rozputn v glycerolu v -30 C. IgG lze purifikovat precipitac, chromatograficky, nebo pomoc afinitn chromatografie. Mon je i ultracentrifugace v gradientu. Jako posledn krok pi pprav polyklonlnch protiltek je pochopiteln jejich testovn specifity.Testovn specifityPprava monoklonlnch protiltek Jeliko jsou produktem jednoho klonu B lymfocyt, jsou specifick proti jedin antigenn determinant. Fz normlnch B lymfocyt pochzejcch zimunizovanho ivoicha a neoplastickch myelomovch bunk lze pipravit tzv. hybridomy, co jsou klony bunk schopn produkce monoklonlnch protiltek. Zatmco matesk normln B lymfocyt (od imunizovanho drce) je nositelem specifity produkovan protiltky, myelomov buka je nositelem vysokho a neomezenho proliferanho potencilu, nesmrtelnosti. Hybridom tedy zdd po myelomov buce monost nepetritho rstu a po aktivovanm B lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonln protiltku namenou proti jedn antigenn determinant.

Jako zdroj aktivovanch B lymfocyt se pouvaj slezinn buky my, kter byly imunizovny. Je ovem nutn pout myelomov buky snjakou vlastnost, kter umon selekci pozitivn fusovanch bunk.-Postrdaj schopnost syntzy hypoxanthine-guanine-phospho ribosyltransferase (HGPRT). Jak myelomov buky zvolit?Tento enzym umouje bunkm syntzu purin pomoc extracelulrnho zdroje hypoxantinu jako prekurzoru. Obyejn nen absence HGPRT problm, protoe buky maj alternativn zpsob syntzy purin. Pokud jsou buky vystaveny psoben aminopterinu (analog folic acid) , jsou neschopn vyut jin zdroje pro syntzu purin a jejich peit je striktn vzno na HGPRT.-Ztracen schopnost tvorby jakkoli protiltky 1. Jako prvn krok je nutn pesunout fuzovan buky do kultivanho media, ktermu se k HAT mdium protoe obsahuje: hypoxanthine aminopterin the pyrimidine thymidineLogick zvry:-nespojen myelomov buky nemohou rst, nebo postrdaj HGPRT. -normln slezinn nefzovan buky nerostou protoe pekroily dobu svoj ivotnosti -hybridomov buky vyprodukovan spnou fz jsou schopny rst, nebo slezinn buky dodvaj HGPRT myelomovm bukm.2.Supernatant vkad bunn kultue pak obsahuje dan protiltky3. Vzhledem ktomu e pvodn bunn kultura nemus pochzet pouze zjedn hybridomov buky, je tedy nutn izolovat jednu buku a podrobit nov kultury screeningu. 4. Optovn otestovat supernatant na ptomnost hledan protiltky. Kad pozitivn kolonie reprezentuje klon a tud protiltky, kter produkuje jsou monoklonln. To znamen, e kolonie produkuje jeden druh protiltek specifickch pouze kjedn determinant pouitho antigenu.

Produkce McAbIn vitro In vivo

Jednoduch Difuse v agaruPrincip: antigen v tekut fzi difunduje do agaru, ve kterm je obsaena protiltka. Pi pozitivn reakci vznik precipitan linie. Precipitt je vsledkem tvorby trojrozmrn mkov struktury po interakci: polyvalentnho antigenu s polyvalentn protiltkou.

Agar s protiltkouAntigen v tekut fziPrecipitan linieJednoduch horizontln difuseAgarozov plotna s protiltkouOtvor s antigenemPrecipitan linieDvojit difuse ve zkumavceProtiltka v agaruagarTekut fze antigenPrecipitan linieDvojit difuse horizontlnRozmstn jamek pro aplikaci antigenu a protiltky me bt odlin pro rzn viry i aplikace. Uspodn jamek hraje dleitou roli pi studiu vztah mezi antigenem a protiltkou.

Tvar precipitan linie me napovdt v jakm jsou k sob antigeny vztahu, zkrcen tedy meme dospt k tmto zvrm.AAABAAxABCAABAAxABCIdentick antigenRozdln antigenNkter determinanty jsou rozdlnJeden antigen inhibuje druhmikroaglutinace a mikroprecipitacePrincip: Tato metoda nen nron na mnostv antigenu a protiltky, a je citlivj ne testy difusn. Pro vyhodnocen je nutn pout mikroskop. Za vyuit malho mnostv regenci je mon doshnout reprezentativnho vsledku.

Neprecipitujc protiltky:- monovalentn nebo univalentn- konvenn protiltky(maj jen jedno vazebn msto)Pina neprecipitace:nzk afinita protiltekmus se pidat velk nadbytek antigenu, aby mohl reagovat aspo s nktermi vazebnmimsty, nadbytek brn, aby probhla druh fze precipitace:agregace malch komplexImunoelektroforzaTato metoda je kombinac mezi rozlienm agarozov elektroforzy a specifitou a citlivost imunoenzymatick difuse v agaru. Je tedy mon rozliit nap. viry, kter jsou si velmi blzk a rovn pak aplikovaat nkolik rznch IgG v jedn reakci.

Pevn nosiELISA-Enzyme linked immunosorbent assayMetoda m adu variant; vechny jsou zaloeny na vysoce specifick interakci antigenu a protiltky, piem na jednoho z tchto partner je kovalentn navzn enzym (nejastji peroxidasa nebo alkalick fosfatasa). Tento enzym katalysuje chemickou pemnu substrtu, kter je pidn do reakn smsi, na produkt, kter je barevn (stanovuje se spektrofotometricky, viz chromogenn substrt) nebo fluoreskujc (fluorimetrick stanoven); koncentrace produktu je mrn koncentraci antigenu nebo protiltky ve vzorku. Dalm spolenm znakem metod ELISA je zakotven (adsorpce nebo kovalentn navzn) antigenu nebo protiltky na nerozpustn nosi (asto povrch reakn ndobky nebo mikrotitran destiky), co usnaduje separaci imunochemicky navzanch molekul.

Nepm kompetitivn ELISA Princip tto metody je zaloen na tom, e antigen zakotven na pevn nosi sout se stanovovanm antigenem ve vzorku o omezen poet vazebnch mst na molekukch protiltky. m vce antigenu obsahuje analyzovan vzorek tm mn protiltky se nave na zakotven antigen. Nenavzan sloky se odstran a nsledn se pid enzymem znaen sekundrn protiltka proti navzan protiltce. Konen detekce je uskutenna enzymovou reakc, kdy vznik barevn produkt. Intenzita zbarven je mena spektrofotometricky. Vhodou tohoto stanoven je monost pouit komern pipravench znaench protiltek (nap. prase IgG proti krlim IgG).

Pm nekompetitivn ELISA - "sandwich DASNejastji vyuvan uspodn enzymov imunoanalzy na pevn fzi (ELISA) pro stanoven patogen je pm nekompetitivn (tzv. sendviov) formt. V prvnm kroku jsou na pevnou fzi imobilizovny protiltky. Pot je pidn antigen, kter interaguje s navzanmi protiltkami. Po odstrann nenavzanch sloek nsleduje aplikace protiltky znaen enzymem (nejastji peroxidasa, alkalick fosfatasa, b-galaktosidasa a glukosa oxidasa). K detekci je vyuita enzymov reakce, kdy je bezbarv substrt pemnn na barevn.

DIBA dot immunobinding assayMembrny jsou vhodnm terem pro aplikaci rznch imunoenzymatickch metod. V zvislosti na aplikaci lze vybrat mezi nylonovmi a nitrocelulozovmi membrnami. Preferovny jsou zejmna nylonov membrny. Co se te antigenu, vhodn je pochopiteln aplikace nativnho. Pi aplikaci protiltek lze rovn volit mezi monoklonln i polyklonln variantou. V neposledn ad je nutn zvolit detekn systm. Me se jednat o enzymatick, fluorescentn i radioaktivn systm. Lze aplikovat jak pm tak nepm i sendviov uspodn protiltek, tak jak dan metoda vyaduje. Nanesen antigenuAplikace BR vyvzn NespecifickchderterminantAplikace McAbAplikace conjugtuvizualizaceWestern Bloting

Po rozdlen protein na SDS PAGE pichz jejich penos na membrnu pomoc elektroblotingu. Po penosu je nutn proteiny zafixovat a dle pak s pouitm specifickch protiltek identifikovat hledan protein (virus atp.)Imunofluorescence

Tato metoda byla vyvinuta k detekci antigenu pmo ve tknch i organelch, je mon pout bu pm i nepm znaen v zvislosti na druhu a povaze antigenu.

Aglutinan metody (LA-latex agglutination)

Uniformn latexov stice jsou pokryty protiltkami, v ppad pouit takto pipravench protiltek a kompatibilnho antigenu lze doshnout bhem nkolika minut tvorby sraeniny, kterou lze snadno sledovat.SSEM serologically specific electron microscopyPotaen stk protiltkouAplikace suspenze s viryBarven virUranyl acettem

IEM immunoelectron microscopyez pletiva pipraven na sceAplikace prvn protiltkyAplikace druh protiltky konjugovan s koloidnm zlatem