SFATUL GENETIC• Sfatul genetic reprezinta un ansamblu de masuri care se

iau in vederea inlaturarii sau limitarii raspandirii bolilor genetice in populatia umana.

• Sfatul genetic este solicitat in urmatoarele circumstante:- Cuplul doreste copii, iar unul dintre parteneri are o ruda

apropiata care sufera de o boala ereditara. - Unul dintre parinti are deja un copil cu un defect grav din

nastere.- Femeia a avut deja unul sau mai multe avorturi

spontane. Problemele severe ale cromozomilor fetusului pot duce uneori la pierderea sarcinii. Pierderile repetate ale sarcinii pot indica o problema genetica.

- Femeia a nascut deja un copil mort, care prezenta semnele fizice ale unei boli genetice. Multe boli genetice grave produc anomalii fizice care dau copilului afectat un aspect specific.

- daca partenerii cuplului prezinta un anumit grad de inrudire ( legatura consagvina);

- daca femeia are peste 35 de ani, i se recomanda in timpul sarcinii sa faca amniocenteza in vederea stabilirii unui diagnostic prenatal , luand in consideratie ca riscul bolilor cromosomiale cresc odata cu virsta femeii;

- daca in perioada timpurie a graviditatii mama a primit medicamente, a trecut chimioterapia sau a fost supusa radiatiei sau a altor factori chimici nocivi;

Obiectivele principale ale sfatului genetic sunt acelea de a stabili riscul pe care-l intampina un individ sau cuplu de a avea descendenti afectati de o boala ereditara.

Exista mai multe metode de diagnosticare a maladiilor:

• Clinico-genealogica - colectarea informatiei completa da la persoana in cauza (date despre parintii, frati, surori, buneii, rudele apropiate: ce maladii au suportat).

• Metoda citogenetica consta in cercetarea garniturii normale de cromosomi si al anomaliilor de numar si de structura a cromosomilor. De asemenea aceasta metoda include determinarea cromatinei sexuale. Pentru aceste analize, se colecteaza singe, sau celulele maduvei osoase, a pielii, a lichidului amniotic, tesuturilor embrionale.

• Metoda molecularo-genetica. Permite determinarea modificarilor structurale si functionale din acizii nucleici in patologia ereditara. Se extrage probele de ADN din singele periferic, din vilozitatile corionale, lichidul amniotic.

• Metoda imunogenetica - se utilizeaza in studiul pacientilor si rudelor lor in cazurile de imunodificienta ereditara. Permite determinarea predispozitiei ereditare cu ajutorul markerilor genetici (sistemul HLA).

• Metoda gemenilor se bazeaza pe compararea frecventei caracterelor la gemenii monozigoti (identici) si dizigoti (neidentici).

• In afara de examenele care se fac pentru toate gravidele:

- hemoglobina (depistarea anemiei), - grup sanguin, glicemie, teste pentru boli infectioase

(exemplu: RW - test pentru sifilis), secretii vaginale, - ecografie, sumar de urina, greutatea, tensiunea

arteriala, inaltimea fundului uterin precum si prezenta batailor cordului fetal pentru femeile ce intra in grupul de risc se mai fac teste suplimentare, numai dupa acordul femeii, dupa o consultatie medico-genetica.

Metode de diagnostic prenatal• Amniocenteza

Amniocenteza este un test efectuat asupra femeii insarcinate, de obicei intre saptamanile 16 si 18. Medicul introduce un ac subtire in abdomenul femeii pentru a preleva o cantitate mica de lichid amniotic, cca.20 de ml, ce inconjoara fetusul.

Analiza se face dupa o prealabila scanare ecografica ce

va releva imagini despre uter, placenta, lichid amniotic si fetus. Celulele din lichidul amniotic descuamate din tegumentele si mucoasele fetusului sunt cultivate in conditii speciale si apoi testate pentru prezenta anomaliilor cromozomiale.

Analiza serveste si la determinarea sexului copilului. Cand exista posibilitatea unei cezariene sau riscul de nastere prematura, amniocenteza poate ajuta si la stabilirea gradului de maturitate al plamanilor copilului. Ca si prelevarea de villus corionic, procedura are un risc scazut de a provoca un avort spontan.

Amniocenteza este recomandata in urmatoarele situatii:• Varsta materna inaintata. Cu cat inainteaza in varsta

femeile au un risc din ce in ce mai mare de a naste un copil cu sindrom Down. In unele tari amniocenteza se practica la toate gravidele peste 35 de ani. Optiunea pentru a efectua testul prenatal poate sa apartina si femeilor tinere

• Familii in al caror istoric figureaza bolnavi cu sindroame cromozomiale. In aceasta situatie nu conteaza varsta mamei si este recomandata amniocenteza pentru testarea cromozomilor

• Familii in al caror istoric figureaza boli genetice, sau daca parintii sunt purtatori ai unei boli genetice.

• Depistarea ecografica a unor anomalii

• Analiza vilozitatilor coriale: Aceasta analiza permite diagnosticarea bolilor ereditare in primul

trimestru de sarcina (in saptamina 8-10 de sarcina).

Prioritatea acestei metode consta in faptul, ca daca se determina schimbari in dezvoltarea copilului, graviditatea poate fi intrerupta prin recomandarea avortului terapeutic.

Prelevarea de villus corionic (Chorionic villus sampling – CVS) consta in recoltarea cu ajutorul unui cateter, care se introduce in cervixul uterin, de tesut extraembrionar, care din punct de vedere genetic este identic cu celulele fetale.

Removing a cell for diagnosis from a human embryo.

Searching for Chromosome and Gene Defects – Pre-Implantation Genetic Diagnosis (PGD)

The diagnosis: trisomy 21 (Down syndrome).

Testul alfa-fetoproteinei : Cu ajutorul acestei analize se determina cantitatea de alfa-

fetoproteina, subsatnta elaborata de catre copil si ce trece in singele mamei. Testul e cert in saptamana 20 de sarcina.

Cantitatea crescuta de aceasta substanta poate semnala o malformatie deschisa de tub neural (anencefalia, spina bifida - o maladie caracterizata prin dereglarea formarii coloanei vertebrale si a maduvei spinarii).

In cazul in care se determina cresterea alfa-fetoproteinei, deseori este necesar de efectuat si alte investigatii, cum ar fi: ultrasonografia, amniocenteza.

PRICIPII SI TEHNICI

Dezvoltarea unor tehnici moleculare din ce în ce mai sofisticate a condus la o explozie de informaţii asupra structurii şi funcţiei genelor precum şi asupra mecanismelor de reglare a activităţii lor.

Aplicarea acestor tehnici a culminat cu finalizarea în anul 2001 a celui mai îndrazneţ şi ambiţios program de investigare a biologiei umane, Proiectul Genom Uman.

Impactul geneticii în practica medicală, sănătate publică şi cercetarea medicală, a devenit important şi unanim recunoscut. Volumul informaţiilor referitoare la aspectele moleculare ale patologiei umane se află într-un proces de creştere exponenţială.

FISH

• Principiul acestei metode de citogenetica moleculara este hibridizarea prin complementariatea a unei sonde de AND monocatenat de cca kb cu o anumita regiune a unui cromozom.

• Sonda este marcata fie direct prin incorporarea unui nucleotid fluorescent fie indirect prin incorporarea unui nucleotid modificat ce contine o molecula “reporter” ( precum biotina sau digoxigenina) care e recunoscuta de un ligand specific (streptavidina pt biotina si Ac specifici pt digoxigenina) conjugat cu un fluorocrom.

Izolarea ADN

• Metoda de izolare ADN se alege în funcţie de materialul din care este izolat ADN: sânge, ser, ţesut, oase, măduvă, lichid amniotic, etc.

• În studiile de genetică moleculară sursa majoră o reprezintă leucocitele sangvine. Pornind de la câţiva mililitri de sânge, prelevat pe anticoagulant, se pot obţine câteva sute de micrograme de ADN.

Protocol de lucruProtocolul este ajustat pentru izolarea ADN din 2 ml sânge.• Se prelevează sângele (2ml) în tuburi Falcon sterile de 50-15 ml si se adaugă 7 ml BLB 1x.• Tuburile se ţin pe gheaţă 30’.• Centrifugare la 2500 rpm, 10’.• Se elimină supernatantul si se resuspendă în 6 ml BLB.• Centrifugare la 2500 rpm, 10’.• Se elimină supernatantul şi se amestecă cu 200 μl BLB.• Centrifugare la 2500 rpm, 10’.• Se elimină supernatantul şi se resuspendă în 100 μl BLB.• Se adaugă: 800 μl WLB, 20 μl Proteinază K, 40 μl SDS 20%. Se incubează peste noapte la

370C.• Se adaugă 240 μl de NCl 6M si se agită puternic 15 secunde.• Centrifugare 15’ la 3500 rpm, fără frână.• Se recuperează supernatantul în 40 μl NaCl si se agită 15 secunde.• Centrifugare 15’ la 3500 rpm.• Se adaugă 4 ml etanol 100% pentru precipitare (răcit la 40C).• ADN se recuperează cu o pipetă pasteur în 200 μl etanol 70% (răcit la 40C), într-un tub

eppendorf de 1,5 ml. • Se centrifughează 10’ la 2500 rpm.• Se lasă etanolul să evapore .• Se resuspendă ADN în 200 μl TE.• Se pune pe baie de apă la 650C, 30’ pentru inactivarea nucleazelor.• Se lasă ADN să resuspende la temperatura camerei.• Se păstrează la -20C.

Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)

• Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) este definită ca o metodă de sinteză şi amplificare enzimatică in vitro a unor secvenţe de ADN

• Reacţia PCR este contituită din serii de trei paşi esenţiali, care definesc un ciclu PCR:

- denaturarea ADN matriţă dublu catenar- alinierea perechilor de primeri la matricele de ADN monocatenar- extensia primerilor sub acţiunea ADN polimerazei• ADN ce urmează a fi amplificat se află în cantitate foarte mică şi

este utilizat ca matriţă pe un sector limitat (ADN ţintă), delimitat de doi primeri, cu orientare opusă, unul pe catena matriţă 5'-3’ iar celălalt pe catena matriţă 3'-5'. Primerii sunt reprezentaţi de oligonucleotide sintetizate ,,in vitro", reprezentând piese scurte de ADN monocatenar, de numai 20-50 nucleotide lungime.

Denaturarea (la Denaturarea (la temperatura de temperatura de 94oC) 94oC)

Etapa de asociere a Etapa de asociere a primerilor primerilor (la temperatura de (la temperatura de 54-60oC)54-60oC)

Etapa de elongareEtapa de elongare(la temperatura de (la temperatura de 72oC)72oC)

2 copii (după un 2 copii (după un singur ciclu)singur ciclu)

Aplicaţii ale tehnicii PCR

• Identificarea si analiza mutatiilor in ADN. • Detectarea mutatiilor punctiforme cunoscute si

necunoscute, prin digestie cu endonucleaze de restrictie a produsului amplificat.

• Detectarea polimorfismelor ADN pentru depistarea indirecta a mutatiilor producatoare de boli.

• Pe baza metodei PCR au fost elaborate programe de screening al familiilor in care exista predispozitie la diabet zaharat, boli coronariene, hipertensiune arteriala, precum si unele forme de cancer.

• Rol important in diagnosticul prenatal si presimptomatic al bolilor monogenice (boli cauzare de o sigura mutatie genica)

Electroforeza

• Este o metodă care permite moleculelor încărcate electric să migreze în câmp electrostatic, spre polul de semn contrar

• Metodă standard de analiză a acizilor nucleici

• Mobilitatea electroforetică este determinată de urmatorii factori: concentraţia de agaroză, conformaţia moleculei de ADN, prezenţa bromurii de etidiu în gel, tamponul de electroforeză si voltajul aplicat.

• Pentru electroforeză se folosesc geluri de:- agaroză- poliacrilamidă

Protocol de lucru

• Pentru prepararea a 200 ml de gel de agaroză 2% în soluţie tampon TBE 0,5x, se cântăresc 4 grame de agaroză într-un vas gradat şi se completează până la volumul de 200 ml cu soluţie tampon TBE. Se amestecă bine.

• Se încălzeşte soluţia de agaroză pe o plită electrică sau baie de apă • După formarea gelului, se lasă să răcească până la aproximativ 500C sau până se

poate atinge vasul cu mâna.• Se adaugă bromura de etidiu, 10 μl de soluţie 10 mg/ml. Se amestecă bine.

• Se montează pieptenele

7. După întărirea gelului acesta se fixează în aparat, cu godeurile poziţionate la polul negativ.

6. Se toarnă gelul uşor, evitându-se formarea de bule.

8. La 10 μl produs de PCR se adaugă 1 μl de tampon de încărcare şi se amestecă.

9. Dacă se observă plutirea probelor înseamnă că tamponul de încărcare nu are densitatea necesară. Se poate folosi acelaşi tampon dar într-o cantitate mai mare.

10.Electroforeza se realizează la 100 V, 2-3 h, până când albastrul de bromfenol a parcurs 2/3 din lungimea gelului.

11.După migrarea probelor, se îndepărtează gelul din aparat, şi se pune acesta pe geamul transiluminatorului pentru vizualizare.

Cel mai utilizat sistem de electroforeză în gel de agaroză este cel pe orizontală.

Cel mai utilizat sistem de electroforeză în gel de agaroză este cel pe orizontală.

• Metoda cea mai utilizată pentru vizualizarea ADN în gelurile de agaroză şi acrilamidă este colorarea cu colorantul fluorescent bromură de etidiu, care are proprietatea de a se intercala între bazele stivuite din ADN

Secvenţierea ADN

• Secvenţierea ADN constă în stabilirea cu exactitate a succesiunii nucleotidelor dintr-o anumită regiune genomică. În 1977 au fost publicate două metode diferite prin care se putea realiza secvenţierea ADN: metoda degradării chimice Maxam-Gilbert şi metoda enzimatică Sanger.

• Principiu:- se sintetizează o catenă de ADN complementară fragmentului, cu

secvenţă necunoscută, utilizând ADN polimeraza şi o amorsă rediomarcată.

- reacţia poate fi inhibată în dreptul unui anumit nucleotid, prin folosirea unor analogi nucleotidici de tipul didezoxinucleotidelor care au pierdut gruparea 3’OH.

- ADN polimeraza poate adăuga un astfel de nucleotid, dar după ce acesta a fost încorporat, reacţia se opreşte datorită absenţei grupării 3’OH din didezoxinucleotid, necesară polimerizării.

- se realizează fragmente cu o lungime egala distanţei dintre amorsă şi locul unde s-a încorporat un anumit didezoxinucleotid.

• Molecula de ADN ce trebuie secvenţiată este separată în cele două catene

• Fiecare catenă este clonată într-un vector monocatenar, fiind inserată într-un anumit situs, după o secvenţă primer cunoscută şi marcată radioactiv sau fluorescent

• Monocatenele de ADN servesc ca matriţă pentru sinteza unei catene noi, complementare, folosind ADN polimeraza şi nucleotidele necesare sintezei.

• Reacţia se desfăşoara concomitent în 4 eprubete; în fiecare se va stabili localizarea unui anumit nucleotid, folosind ca analog inhibitor un anumit didezoxinucleotid.

• Ansamblul celor patru reactii poate fi citit pe o scara (pozitionala directionata), de la fragmentele mici la cele mari.