Sicheresund kontaminationsfreies Arbeiten mit Zellkulturen

Leibniz‐Institut DSMZ‐Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Cord Uphoff

Leibniz‐Institut DSMZ‐Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenBraunschweig

Sicheres und kontaminationsfreies Arbeiten mitZellkulturen


Zuverlässigkeit wissenschaftlicher und präklinischer Daten

Translationale Forschung

Modellsysteme

Diagnoseverfahrenzielgerichtete Therapeutika

Verbesserung derallgem. Gesundheit


Identität

• Authentizität

• Kreuzkontaminationen

• falsch bezeichnete Zelllinien

• falsch klassifizierte Zelllinien

Qualitätskriterien von Zelllinien

Database of Cross-Contaminated or Misidentified Cell LinesAmanda Capes-Davis and R. Ian Freshneyhttp://www.hpacultures.org.uk/media/E50/3B/Cell_Line_Cross_Contaminations_v6_0.pdf

http://www.hpacultures.org.uk/media/E50/3B/Cell_Line_Cross_Contaminations_


Kontaminationen und Infektionen

• langsam wachsende Bakterien (z.B. Mykoplasmen)

• Viren

Qualitätskriterien von Zelllinien

Stabilität von Zelllinien

• genetische Stabilität

• epigenetische Stabilität


Prävalenz von Zellkulturkontaminationen (DSMZ)

• Hefen und Pilze: ~ 2%

• „Konventionelle“ Bakterien: ~ 2%

• Mykoplasmen: >20%

• Viren in latenter Phase: ca. 8%(z.B. EBV, HBV)

• Aktive Viren: ca. 5%(z.B. EBV, HHV‐8, HPV, C‐Typ‐Retroviren)

• Kreuzkontaminationen: ca. 15%


Ausmaß von Kreuz‐ und Mykoplasmakontaminationen

69%

18%

6%

7%

authentisch und mykoplasmafrei

falsch undMykoplasmen

falsch, abermykoplasmafrei

607 Leukämie‐Lymphom Zelllinien

authentisch,aber Mykoplasmen


Verifikation der Authentizität von Zelllinien

• Spezies: PCR, Isoenzymanalyse

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

100 150 200 250 300 350

HELA.A01_04100509P0

Size (nt)

Dye

Sig

nal

134, 65

138, 89

143, 72

151,90

1 85,3 3

192,90

199,78

208, 96

2 24, 03

231, 90

2 39, 88

247, 97

2 82, 57

286,65

302,94

307, 00

• Individuum: DNA‐Profil Zytogenetik

• Gewebe/Tumor: Immunphänotypisierung Genexpression Zytogenetik


Nonaplex Single‐Locus DNA Typisierung von STRs

AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT

Allel 6

Allel 3

AGAT AGATAGAT

D5S818

CSF1

D5S818

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539

vWA

A212

A218


ACC Cell Line Lot Datum D5 D5' D13 D13 D7 D7' D16 D16 vWA vWA' TH01 TH01' TPOX TPOX' CSF1 CSF1' Amel Amel'

57 HELA Referenz 11.1.2000 11 12 12 14 8 12 9 10 16 18 7 7 8 12 9 10 X X

57 HELA 12 17.4.2005 11 12 12 14 8 12 9 10 16 18 7 7 8 12 9 10 X X

Vom Signal zur Datenbank

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

100 150 200 250 300 350

HELA.A01_04100509P0

Size (nt)

Dye

Sig

nal

11D5

12D5

16vWA

18vWA

7TH01

12D13

13.3D13

XAmel

8D7

8TPOX

12D7

12TPOX

9D16

10D16

9CSF1

10CSF1

1M 2 3 4 5 6 7 8 910 1211

13

APO B1

D17S5

D1S80

D2S44


Mykoplasmen auf HELA Zellen

Mycoplasma hyorhinis

Mycoplasma fermentans


Protokoll für die Detektion von Mykoplasma‐Kontaminationen

Zelllinie: Ankunft

Quarantäne Kulturlabor

Mykoplasmatestung

Mykoplasma positiv

Eliminierungwenigstens zwei sensitive Detektions-methoden

Mykoplasma negativ

Sterilkultur-Labor

Zelllinie: kontinuierliche Kultur

Monatliche Mykoplasmatestungeine schnelle und sensitive Detektions-methode


Behandlung von Mykoplasmainfektionen

85 8377 75 73

66

12 717 16 19 24

311 6 9 8

100

20

40

60

80

100

Sparflo

xacin

BM-C

yclin

Ciproflo

xacin

Plasmoc

inEnro

floxa

cin

MRA

Cell DeathResistance

Cured

Uphoff & Drexler, In Vitro Cell Dev Biol 38: 86‐89 (2002)Updated 2010

%


Virusdiagnostik

Zellkultur

aktive Viren

Zellen

DNA-Präparation

Überstand

integrierte und zelluläre Virusformen

RNA-Präparation

PCR

cDNA Synthese

HBV

PCR

HCV

Zellen

Präparation von zellulärer DNA

PCR

EBV (latent/lytisch)

HIV-1/-2

HTLV-I/-II

(HHV-8, HPV, SMRV, TTV, XMRV)

Ultrazentrifugation

Ausstattung für aseptische Arbeiten in der entsprechenden biologischen Sicherheitsstufe‐ zertifizierte mikrobiologische Sicherheitswerkbänke Klasse II‐ Inkubatoren‐Wasserbäder, Zentrifugen, Glas‐ und Plastikwaren etc.‐monatliche Reinigung der Oberflächen

Zugangsbeschränkung: keine Versuchstierhaltung

nicht authorisierte Personen

Sterilität: chemische Desinfektion vor und nach Benutzung

zentrale Sterilisationseinrichtung


Zellkultureinrichtung


Anwender

Befolgung strenger aseptischer Techniken und guter Laborpraxis(Grundregeln guter mikrobiologischer Technik)

Laborprotokolle für jede Zellkultur

Keine Gespräche während der Arbeit mit Zellkulturen


Zellkulturen

Bezug von Zellkulturen von anerkannten Zellkultursammlungen

Expansion neuer Zellkulturen und Kryokonservierung (“master” und “working cell bank”)

Regelmäßige Überprüfung der Zellkultur auf Infektionen und Identität

Ausschließliche Nutzung von Medien und Reagenzien für jeweils eine Zelllinie

Vermeidung der Überpassagierung von Zellkulturen

Kein prophylaktischer Einsatz von Antibiotika


Qualitätskontrolle

Zuverlässige Mykoplasma‐Detektionsverfahren etablieren und regelmäßig durchführten

Identität von Zellkulturen sollte vor Projektbeginn bestätigt werden

Medienbestandteile sollten auf Sterilität getestet werden


Zusammenfassung

• Kreuzkontaminationen und Kontaminationen mit Mykoplasmen gehören zu den häufigsten und hartnäckigsten Probleme in der Zellkulturtechnik

• Regelmäßige Testung der Zellkulturen ist von eminenter Bedeutung

• Bei Einhaltung der Regeln der guten Zellkulturtechnik lassen sich Kontaminationen zuverlässig vermeiden

• Viruskontaminationen und die Freisetzung der Viren sind im Allgemeinen risikobestimmend für die Zellkulturen


Zusammenfassung


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

Kontakt: Dr. Cord UphoffBereich Menschliche und Tierische ZellkulturenTel: 0531-2616156E-Mail: [email protected]

mailto:[email protected]

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