Embed Size (px)
Citation preview
1
Université Paris XII Val-de-Marne École Doctorale Science de la Vie et de la Santé
Doctorat de Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire
SIGNALISATION CELLULAIRE ET FORMATION DE
COMPLEXES PROTEIQUES LORS DE L'ETIREMENT
DES CARDIOMYOCYTES DE RATS NOUVEAUX-NES
Nicolas DUQUESNES
Soutenue le 18 Avril 2008
Thèse dirigée par Bertrand CROZATIER
Membres du Jury : Monsieur DELCAYRE Claude : Directeur de recherche CNRS Rapporteur Monsieur CAZORLA Olivier : Charger de rechercher CNRS Rapporteur Monsieur LAPERCHE Yannick : Professeur, Université Paris XII Monsieur LECORVOISIER Philippe : MCUPH Monsieur CROZATIER Bertrand : Directeur de Recherche CNRS, Créteil
2
Résumé
L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires
à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L’objectif principal de mon
travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l’activation des
MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l’étirement.
Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D’une part, nous nous sommes intéressés
aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l’activation des MAPK. D’autre part, nous avons
cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de
signalisation activées par l’étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes
protéiques nécessaires à l’activation des différents partenaires.
Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l’Epidermal Growth Factor
Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à
l’activation de ERK et de JNK lors de l’étirement. Ces cascades de transduction peuvent être
dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient
considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l’activation de ERK
par l’étirement. Enfin, nous avons montré la formation d’un complexe Protein Kinase C
(PKC)/Calcineurine nécessaire à l’activation et à la translocation de la PKC lors de l’étirement.
Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure
connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la
signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire.
3
Remerciements
4
Sommaire Introduction .................................................................................................... p1 I - Le cœur ............................................................................................................... p3
A. Fonction et structure ………………………………………………………….... p3
1. Fonction, anatomie et ultrastructure ……………………………………………… p3 2. Structure du cardiomyocyte ………………………………………………………. p4 3. Les éléments contractiles …………………………………………………………. p5 4. Ponts actine-myosine et contraction ……………………………………………… p6 B. Le cœur : de l’embryon à l’adulte ……………………………………………... p7
1. Au stade fœtal …………………………………………………………………….. p7 2. Après la naissance ………………………………………………………………… p7 3. Au stade adulte ……………………………………………………………………. p8 C. Adaptation hypertrophique …………………………………………………….. p8
II - Stimulation de l’hypertrophie ……………………………………. p10 A. Stimulations neuro-hormonales…..…………………………………………….. p10
1. Le système rénine-angiotensine …………………………………………………... p10 2. Stimulation adrénergique …………………………………………………………. p11 3. L’endothéline ……………………………………………………………………... p11 4. Rôle des facteurs de croissance …………………………………………………… p12 B. L’étirement ………………………………………………………………………. p12
III - L'étirement cellulaire …………………………………………… p12 A. Rôle de l’étirement dans l’organisme ………………………………………….. p12
B. L’étirement dans le cœur ……………………………………………………….. p14
1. Réponse contractile du muscle cardiaque lors de l’étirement …………………….. p15 2. Perception de l’étirement et rôle des intégrines et du cytosquelette ………………. p18 3. Stimulations autocrines / paracrines liées à l'étirement …………..…………………. p23 C. Signalisation intracellulaire induite par l’étirement ………………………….. p25
1. Principales protéines intervenant dans la signalisation de l’hypertrophie desnnnnnnn cardiomyocytes……………………………………………………………………….. p25 2. Les Mitogen-activated protein kinases (MAPK) ………………………………….. p26 2.1 Structure générale ……………………………………………………………… p26 2.2 ERK 1/2 ………………………………………………………………………... p27 2.3 JNK 1/2 ………………………………………………………………………… p28 2.4 p38MAPK ……………………………………………………………………… p29 2.5 Les autres MAPK ……………………………………………………………… p30 2.6 Régulation des MAPK …………………………………………………………. p32 3. Activation des facteurs de transcription et de l’expression génique ……………… p35
5
IV - Méthodes d’étude de l’étirement ………………………………... p36 A. Etude de l’étirement du cœur entier …………………………………………… p36
B. Méthodes d’étude de l’étirement cellulaire ……………………………………. p37
Matériels et méthodes ………………………………...……………….. p40 I. Culture de cardiomyocytes de rats nouveaux nés ……………………………… p41
II. Méthode d’étirement cellulaire ………………………………………………… p54
III. Transfections, infections et traitements chimiques des cellules …………….. p47
IV. Quantification de la concentration protéique ………………………………... p48
V. Immunoprécipitation …………………………………………………………… p49
VI. Précipitation par affinité ………………………………………………………. p51
VII. Western blot …………………………………………………………………… p53
VIII. Immunomarquage …………………………………………………………… p59
Partie I : Rôles des récepteurs tyrosine kinases et des
petites protéines G lors de l’étirement des cardiomyocytes.
I - Les petites protéines G …………………………………………….. p65 A. Structure et fonction ……………………………………………………………. p65
B. Modifications post traductionnelles des petites protéines G …………………. p66
C. Activation et inactivation des petites protéines G ……………………………. p67
1. Les GEF ………………………………………………………………………….. p67 2. Les GAP ………………………………………………………………………….. p68 3. Les GDI …………………………………………………………………………... p68 D. Les différents groupes de petites protéines G ………………………………… p69
E. Voies de signalisation des petites protéines G ………………………………… p70
F. Rôle des petites protéines G dans l’hypertrophie cardiaque ………………… p71
I - Les facteurs de croissance et leurs récepteurs …………………… p72 A. Les facteurs de croissance ……………………………………………………… p72
6
B. Les récepteurs aux facteurs de croissances …………………………………… p72
C. L’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ……………………………... p74
1. Structure et dimérisation des récepteurs …………………………………………. p74 2. Rôle des récepteurs à l’EGF dans la signalisation cellulaire …………………….. p76 2.1 La liaison au ligand …………………………………………………………… p76 2.2 Transactivation de l’EGFR …………………………………………………… p76 2.3 Activation de l’EGFR et formation des complexes de signalisation …………. p78 2.4 Signalisation induite par l’EGFR …………………………………………….. p79 2.5 Rôle dans le cœur et dans l’hypertrophie cardiaque ………………………….. p80 Introduction de l'article 1 …………………………………………………………… p81 Article 1 : The EGF receptor activates ERK but not JNK through a Ras independentNNNNN pathway during cardiomyocyte stretch.
Conclusion et résultats complémentaires……………………………………………. p85 Introduction de l'article 2 ……………………………………………………………. p89 Article 2 : Role de Pyk2 Conclusion de l'article 2 ……………………………………………………………... p91
Partie II : Les complexes protéiques dans la signalisation
cellulaire : Mise en évidence d'un complexe PKCεεεε /
calcineurine I. La Protéine Kinase C ……………………………………………….. p93 A. Structure des PKC ……………………………………………………………… p93
B. Activation des PKC ……………………………………………………………... p95
C. Les protéines associées aux PKC ………………………………………………. p96
1. Les RACK : régulateurs de la protéine kinase………………………………. p96 2. Les protéines 14-3-3 ………………………………………………………… p97 3. les AKAP ……………………………………………………………………. p98
D. Rôle des PKC dans le coeur …………………………………………………….. p98
II. La calcineurine ……………………………………………………... p101 A. Structure et localisation ………………………………………………………… p101
B. Rôle de la calcineurine dans le cœur …………………………………………... p102
C. Inhibition de la calcineurine …………………………………………………… p103
7
III. Les complexes protéiques………………………………….……… p104 A. Les protéines échafaudage ……………………………………………………… p104
B. Les protéines d’ancrage ………………………………………………………… P106
Introduction de l'article 3 …………………………………………………………… p110 Article 3 : Dual level of interactions between calcineurin and PKC-epsilon inNNNNNNN cardiomyocyte stretch. Conclusion de l'article 3 ……………………………………………………………. P112
Travaux en cours, perspectives et conclusion générale
I. Interaction de la protéine 14-3-3 et de la PKC…………….……… p114
II. Analyse protéomique des modifications induites par l'étirementNNNNN et résultats préliminaires …………………………………………….. p116
Conclusion …………………………………………………………………... p120
Références ……………………………………………………………… p123 Annexe : Article 4 ……………………………………………………… p140
8
Abréviations
ADP : Adénosine diphosphate
AKAP : A kinase anchoring protein
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
ANF : atrial natriuretic factor
AngII : angiotensine II
AT1R : récepteur de l’angiotensine II de type I
ATP : adénosine triphosphate
BNP : B-type natriuretic peptide
CaMK : calcium calmoduline dependent kinase
Cn : calcineurine
DAG: diacylglycerol
EGF : epidermal growth factor
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
Epac : Exchange Protein Activated by cAMP
ERK : Extracellular signal regulated kinases
ET1: endothéline 1
FAC : complexes d’adhésion focales
FAK : Focal adhesion kinase ,
GAP : GTPase activating protein
GDI : GTPase dissociation inhibitors
GDP : guanine di phosphate
GEF : guanines nucléotides exchange factor
GFP : green fluorescent protein
GPCR : récepteurs couplés aux protéines G
GTP : guanine tri phosphate
IGF-1 : insulin-like growth factor-1
IP3 : inositol triphosphate
JNK : c-Jun N-terminal kinases
MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase
MMP : matrix metalloproteases
PI3K : Phosphatidylinositol 3-Kinase
PKA : protéine kinase A
PKC : protéine kinase C
PLC : phospholipase C
PP1, PP2A, PP2B : protein phosphatases 1, 2A, 2B
PS : phosphatidylsérines
Pyk2 : proline-rich tyrosine kinase 2
RACK : receptors for activated C-kinase
RBD : Ras binding domain
ROS : reactive oxygen species
RS : Réticulum sarcoplasmique
RyR : Récepteurs à ryanodine
SH2 : Src homology domain
TGF-b : transforming growth factor-b
TKR : récepteur tyrosine kinase
VEGF : vascular endothelial growth factor
1
Introduction
Le cœur a pour fonction de permettre la circulation du sang et donc la distribution de
l’oxygène et des nutriments et l'enlèvement des déchets dans tout l’organisme quelles que
soient les conditions imposées par sa propre structure ou par les conditions de circulation du
sang. Ce rôle primordial pour la survie de l’organisme lui impose des capacités d’adaptation
aussi bien à court terme pour palier un changement soudain des besoins de l’organisme qu’à
long terme pour s’adapter à une augmentation chronique des forces auxquelles il est soumis.
Lorsque ces mécanismes sont en défaut une insuffisance cardiaque peut survenir.
L'insuffisance cardiaque est un syndrome dont le pronostic, malgré les progrès thérapeutiques
des dernières décennies, reste particulièrement grave. Elle survient souvent au stade terminal
de l'évolution d'une hypertrophie ventriculaire qui est par ailleurs un facteur de risque
indépendant de mortalité cardiovasculaire car elle peut induire des troubles du rythme. Son
caractère péjoratif comme facteur de risque cardio-vasculaire explique que l’hypertrophie
ventriculaire soit le sujet d'intenses recherches tant cliniques que fondamentales d'autant que
les maladies cardiovasculaires sont actuellement la première cause de mortalité dans les pays
industrialisés.
L’hypertrophie ventriculaire peut avoir plusieurs origines. Elle peut être purement
physiologique comme dans le cas de l’exercice physique ou être pathologique. Dans ce cas,
l’hypertrophie ventriculaire est un mécanisme d’adaptation du muscle cardiaque en réponse à
des variations de la post-charge dues à l’hypertension artérielle ou à une sténose aortique ou à
des variations de la précharge consécutive à une insuffisance mitrale ou aortique.
L’application de différents stress, parmi lesquels l’étirement du muscle, entraîne une
stimulation de l’expression des gènes et la synthèse des protéines impliquées dans
l’hypertrophie de la cellule et donc du muscle.
Le but général de mes travaux a été d'analyser en détail les voies intra-cellulaires qui
conduisent à la stimulation de l'expression des gènes lors de l'étirement des cardiomyocytes.
Un grand nombre de protéines qui interviennent dans ces voies ont été identifiées.
Néanmoins, leur rôle exact et leurs interactions ne sont pas encore complètement connus. Mes
travaux se sont centrés sur les voies d'activation des Mitogen Activated Proteins Kinases
2
(MAPK), protéines majeures de la stimulation des gènes en amont du noyau. J'ai ainsi mis en
évidence des interactions entre les voies déjà identifiées avec, pour certaines d'entre elles, la
formation de complexes protéiques.
L’introduction générale sera consacrée à une recherche bibliographique concernant le
cœur considéré dans son aspect évolutif avec son adaptation en réponse aux stimuli
hypertrophiques. Nous aborderons ainsi l'étirement myocardique qui est un de ses principaux
stimuli et qui est le sujet de cette thèse. Cette introduction se terminera par une présentation
des méthodes utilisées dans nos travaux.
Les résultats seront divisés en 2 parties correspondant aux travaux principaux présentés dans
cette thèse. Chaque partie sera précédée d'une introduction de revue bibliographique
correspondant spécifiquement au travail présenté. La première partie comprend 2 travaux
soumis pour publication dont je suis respectivement 1e et 2ème auteur. J'y ai étudié les voies
conduisant à l’activation des MAP kinases lors de l’étirement, notamment les rôles des petites
protéines G, et plus particulièrement de Ras, ainsi que le rôle du récepteur de l’Epidermal
Growth Factor Receptor (EGFR) et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2). Les structures
et les rôles de ces différentes protéines seront décrits dans un chapitre de présentation. La
seconde partie qui est un travail publié dont je suis 2e auteur a mis en évidence un complexe
PKCε / calcineurine lors de l’étirement des cardiomyocytes. L'article sera précédé par une
présentation des complexes protéiques et de leur rôle dans la signalisation en insistant
particulièrement sur la PKC qui joue un rôle majeur dans la stimulation des MAP kinases lors
de l'étirement myocardique. Enfin, un chapitre de perspectives est consacré aux résultats en
cours. Ces résultats montrent la formation de complexes protéiques participant à la
signalisation de la PKC et l’association des protéines de la signalisation avec le cytosquelette
de la cellule.
3
I - Le cœur
A. Fonction et structure
1. Fonction, anatomie et ultrastructure
Le cœur a pour fonction de faire circuler le sang dans l’organisme afin de lui fournir
l’oxygène et les nutriments nécessaires. Il assure un rôle de pompe grâce à 4 cavités : 2
oreillettes communiquant chacune avec un ventricule qui éjecte le sang dans la petite
circulation (ventricule droit) et dans la circulation systémique (ventricule gauche). La paroi
des ventricules est composée de l’endocarde dirigé vers l’intérieur de la chambre
ventriculaire, du myocarde qui assure la majeure partie de la contraction et de l’épicarde vers
l’extérieur du muscle. Le cœur nécessite une grande quantité d’oxygène qui est apportée par
le réseau coronaire. Indépendamment du réseau vasculaire, le muscle cardiaque est composé
de plusieurs types cellulaires qui peuvent avoir des rôles électrique, endocrine et mécanique.
Les cellules P, les cellules transitionnelles, les cellules améboides et les cellules de Purkinje
assurent la production et la conduction de l’impulsion électrique jusqu’aux cellules
contractiles. Les fibroblastes ont un rôle endocrine et mécanique. Ils participent à la
signalisation paracrine dans le muscle et produisent une grande partie de la matrice extra-
cellulaire, notamment le collagène qui assure la cohésion du tissu musculaire, la transmission
des forces appliquées par les myofilaments et participent aux propriétés mécaniques du
muscle. Enfin, le muscle cardiaque contient 30% de cardiomyocytes qui représentent 75% du
volume total du myocarde et qui assurent la contraction du muscle.
Le muscle cardiaque est proche du muscle squelettique mais présente quelques différences
fondamentales. Les myofibres cardiaques composant le myocarde sont formées à partir des
cardiomyocytes qui, contrairement aux cellules du muscle squelettique, ne sont pas
fusionnées. Les cellules, de forme longitudinale, sont organisées en fibres parallèles et sont
reliées entre elles par les disques intercalaires riches en desmosomes. De plus, la présence de
jonctions communicantes permet la communication des cellules adjacentes. Par ailleurs, les
myofibrilles des cardiomyocytes sont plus courtes. Sur un plan fonctionnel, l’activité
électrique du myocyte cardiaque est différente de celle du myocyte squelettique. La régulation
4
de l’activité contractile du cœur est assurée par les systèmes nerveux autonomes sympathique
et parasympathique et par l’activité rythmique du cœur imposée par les cellules pace-makers
du nœud sino-auriculaire qui se propage de cellule en cellule assurant la contraction ordonnée
du cœur.
2. Structure du cardiomyocyte
Les cardiomyocytes différenciés sont souvent polynucléés, possèdent un cytoplasme riche en
protéines et en ions, possèdent également une grande quantité de mitochondries dont le rôle
est de fournir l’énergie nécessaire à la contraction de la cellule, sous forme d’adénosine
triphosphate (ATP). Les mitochondries représentent plus de 30% du volume des
cardiomyocytes qui ne possèdent pas de réserve énergétique. Le cardiomyocyte ventriculaire
possède une membrane externe, le sarcolemme, en contact avec les éléments contractiles de la
cellule et présentant des invaginations dans la cellule appelée tubules T. Ces structures
facilitent la transmission du stimulus excitateur au sein de la cellule. Elles permettent
également le passage d’éléments du milieu extracellulaire profondément dans le myocyte.
Enfin, elles entrent en contact avec le réticulum sarcoplasmique avec lequel elles forment des
dyades au niveau des récepteurs à ryanodine (RyR). Le réticulum sarcoplasmique (RS) ne
représente que 2% du volume de la cellule mais il a un rôle crucial dans la régulation de la
contraction et de la relaxation cardiaque. La dépolarisation de la membrane entraîne
l’ouverture des canaux calciques voltage-dépendants et donc l’entrée dans la cellule d’ions
calcium qui activent les RyR. Ces récepteurs permettent le relargage dans le cytoplasme du
calcium contenu dans le RS. Ce mécanisme appelé calcium induced calcium release entraîne
la libération d’une quantité suffisamment importante de calcium pour permettre la contraction
de la cellule. La relaxation est marquée par le repompage du calcium dans le RS par la pompe
SERCA dont l’activité est inhibée par le phospholanban. L’activation de la protéine kinase A
(PKA) ou de la calcium calmoduline dépendent kinase (CaMK) entraîne la phosphorylation
du phospholamban, le rendant inactif et levant l’inhibition de la SERCA. Le calcium à
nouveau contenu dans le RS peut ainsi être à nouveau libéré et permettre une nouvelle
activation des éléments contractiles et donc la contraction de la cellule.
5
Figure 1 : Stucture du myocyte (MI : mitochondrie, Mt : microtubule, SR : réticulum sarcoplasmique) (Goldstein and Entman 1979)
3. Les éléments contractiles
Les myocfibrilles sont les éléments contractiles de la cellule et constituent la moitié de son
volume. Elles sont subdivisées en compartiments appelés sarcomères possédant plusieurs
stries correspondant aux bandes A, I, Z, H et dans lesquelles les filaments d'actine et les
filaments de myosine sont assemblés longitudinalement. Pendant la contraction, les filaments
glissent les uns sur les autres, entraînant un raccourcissement de la cellule. Les sarcomères
sont délimités par les bandes Z auxquelles les filaments d’actine sont attachés. Les filaments
de myosine se situent au centre du sarcomère et sont liés aux bandes Z par la protéine géante
titine. La bande A est caractérisée par le chevauchement des filaments d’actine et de myosine
tandis que les bande I, de part et d’autre des bandes A, ne contiennent que les filament
d’actine. La bande H se trouve au centre de la bande A et n’est composée que des filaments
d’actine. Enfin, la bande H est parcourue par une ligne M composée de la M-line protein
(MLP) qui assure en partie le maintien de la structure du sarcomère (Figure 2). Cette
architecture de l’élément contractile est fondamentale pour la contraction de la cellule et pour
6
l’adaptation de la contraction lors de l'application de contraintes. Ce sujet est traité dans les
paragraphes suivants.
Figure 2 : Structure des éléments contractiles du cardiomyocyte (Gregorio and Antin 2000)
4. Ponts actine-myosine et contraction
Lors de la stimulation des cellules, le calcium libéré par le RS interagit avec les troponines
liées aux filaments d’actine, entraînant un changement de conformation du complexe et
permettant l’interaction de la tête de la chaîne légère de la myosine avec le filament d’actine.
La flexion de la myosine entraîne un glissement du filament par rapport à l’actine. Ce
mécanisme nécessite l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP par la myosine qui possède
une activité ATPase. La tête de la myosine se relaxe, retrouve sa position initiale et peut
entrer dans un cycle de contraction.
Figure 3 : Schéma des protéines intervenant dans le mécanisme de formation des ponts actine – myosine. (AF : filament d’actine, MF : filament de myosine, TnI : troponine I, S1 : tête de myosine, ELC et RLC : Chaînes légères essentielle et régulatrice de la myosine, MyBP-C : Myosin binding protein C. (Schaub, Hefti et al. 1998)
7
La mise en place des différentes structures et des propriétés mécaniques du coeur adulte est
progressive et dépend également de propriétés du cardiomyocyte qui évoluent dans le temps
au cours de l’organogenèse et de la croissance.
B. Le cœur : de l’embryon à l’adulte
La croissance du coeur est un processus intervenant durant l’embryogenèse, le développement
et l’évolution de l’organe en réponse aux conditions environnementales et aux stimuli
pathologiques. Lors de l’embryogenèse, le cœur grandit rapidement. Le stade postnatal est
marqué par la fin de l’hyperplasie. L’augmentation de la taille du cœur n’est alors due qu’à
l’hypertrophie des cellules cardiaques (Evans and Goodwin 2007). Au stade adulte, cette
capacité à croître n’est pas perdue.
1. Au stade fœtal
Lors de l’organogenèse, plusieurs facteurs peuvent avoir un rôle important dans le
développement du système circulatoire tels que la sécrétion d’hormones, de facteurs de
croissance, les contraintes mécaniques ou l’ischémie. In utero, le développement du cœur et
de ses cellules dépend du programme génétique uniquement jusqu’aux premières contractions
qui apportent une stimulation supplémentaire. Les contraintes mécaniques deviennent alors
nécessaires au développement normal du cœur par les phénomènes d’hyperplasie et
d’hypertrophie cumulés (Jonker, Zhang et al. 2007). L’étirement et la pression que supporte le
cœur ont un rôle important dans l’expression des protéines spécifiques aux cardiomyocytes
dès les premiers stades de développement du cœur.
2. Après la naissance
4 à 6 jours après la naissance, les cardiomyocytes cessent de se multiplier et subissent
une phase de mitose incomplète sans division cellulaire pour aboutir 3 semaines après la
naissance à une population binucléée à 90% chez le rats, environ 50% chez l’homme.
8
3. Au stade adulte
L’augmentation de la contrainte et donc de la force à développer afin de vaincre cette
contrainte entraînent une augmentation de la taille du muscle. La prolifération étant très
limitée pour les myocytes adultes, l’augmentation de la masse musculaire en réponse aux
signaux extérieurs est due en grande partie à l’augmentation de la taille des myocytes. Cette
perte de la capacité à se multiplier limite la capacité du cœur à récupérer sa fonction après un
infarctus. Malgré la sortie du cycle cellulaire, ils possèdent encore la capacité de dupliquer
leur ADN, c’est pourquoi chez la plupart des espèces, les cardiomyocytes sont binucléés. De
plus, les cardiomyocytes de certains vertébrés inférieurs sont capables de se diviser et de
régénérer le myocarde. Or de récents travaux ont montré que les cardiomyocytes adultes
peuvent se diviser mais dans des proportions extrêmement faibles (Leri, Kajstura et al. 2002).
Les différences entre les voies de signalisation de l’activation du cycle cellulaire entre ces
vertébrés et les mammifères supérieurs sont encore mal comprises mais l’étude de la
régulation du cycle cellulaire par des promoteurs telles que les cyclines et les cdk ouvre des
pistes potentielles de recherche de manipulations thérapeutiques (Ahuja, Sdek et al. 2007).
L’hypertrophie cellulaire contribue à la croissance et à la physiologie du cœur jusqu’au stade
adulte mais participe également à l’adaptation hypertrophique du cœur. Lors de l’hypertrophie
cardiaque, certains types cellulaires tels que les fibroblastes peuvent proliférer tandis que les
cardiomyocytes dont la division est rare présentent un phénotype hypertrophique.
C. Adaptation hypertrophique
L’hypertrophie est un mécanisme d’adaptation permettant au cœur de maintenir ou
d’augmenter le débit cardiaque lors d’une défaillance du muscle ou en réponse à une
augmentation de la précharge ou de la postcharge (Heineke and Molkentin 2006) dans des
conditions physiologiques ou pathologiques. On oppose actuellement, selon leurs
caractéristiques des hypertrophies dites physiologique ou pathologique. Plusieurs laboratoires
ont tenté et tentent encore de les caractériser sur un plan moléculaire afin de les différencier.
Cependant, l’hypertrophie est une réponse à l’augmentation de la contrainte. Elle devient
délétère lorsque la réponse n’est plus adaptée aux besoins de l’organisme. 2 morphologies
différentes caractérisent l’hypertrophie ventriculaire gauche (Opie, Commerford et al. 2006) :
9
- L’hypertrophie concentrique due à l’augmentation de la postcharge qui correspond aux
forces que le ventricule a à vaincre lors de l'éjection par hypertension artérielle ou
sténose aortique qui provoquent une résistance à l’éjection. La paroi du ventricule
s’épaissit sans dilatation de la cavité du ventricule. La surcharge de pression entraîne
une augmentation du diamètre des myocytes sans modification significative de leur
longueur (figure 4).
- L’hypertrophie excentrique est due à une augmentation de la précharge lors des
insuffisances mitrale ou aortique ou lors de lésions du myocarde. La précharge est la
force que le muscle subit lors de la diastole et qui induit un étirement du muscle
ventriculaire. Précharge et étirement sont donc presque synomymes. Nous y reviendrons
plus longuement lors de la description du mécanisme de Starling. Une augmentation
chronique de la précharge induit une surcharge dite de volume qui entraîne une
augmentation du diamètre de la cavité ventriculaire sans augmentation de l’épaisseur du
ventricule. Sur un plan cellulaire, l’hypertrophie excentrique entraîne une faible
augmentation du diamètre des cellules et une augmentation significative de leur
longueur (figure 4).
Enfin, l’hypertrophie peut être consécutive à une perte de myocarde contractile comme dans
le cas d’un infarctus. De nombreuse modification interviennent alors : une fibrose de la
cicatrice musculaire et une hypertrophie du muscle sain restant afin de combler la perte de
capacité contractile de l’organe (figure 4).
Figure 4 : remodelage cardiaque : différentes morphologies de la cellule et de l’organe (Opie, Commerford et al. 2006)
10
II - Stimulation de l’hypertrophie
L’hypertrophie cardiaque résulte de l’hypertrophie des cardiomyocytes et de la prolifération
d’autres types cellulaires. L’hypertrophie des myocytes cardiaques est induite par 2 stimuli
majeurs : l’activation des système neuro-hormonaux (essentiellement catécholamines et
système rénine-angiotensine-aldostérone) qui induisent une sécrétion autocrine / paracrine et
l’étirement du muscle cardiaque par l’augmentation de la pression ou du volume de sang dans
le ventricule.
A. Stimulation neuro-hormonale
De nombreux facteurs neuro-hormonaux sont en partie responsables du développement de
l’hypertrophie cardiaque tels que l’angiotensine, les catécholamines, l’endothéline ou les
facteurs de croissance.
1. le système rénine-angiotensine
L’activation du système rénine angiotensine et la libération d’angiotensine II entraînent une
sécrétion autocrine / paracrine conduisant à un phénotype hypertrophique (Ruwhof and van
der Laarse 2000). Les ARN et les protéines du système rénine-angiotensine sont présents dans
le cœur. La renine, l’angiotensinogène, l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) et le
récepteur de l’angiotensine II de type I (ATIR) sont détectables et leurs expressions sont
augmentées lorsqu’une surcharge est appliquée au cœur. La surexpression des récepteurs AT1
entraîne une hypertrophie du myocarde indépendamment du rôle du système rénine /
angiotensine sur la physiologie des vaisseaux et sur la pression artérielle (Paradis, Dali-
Youcef et al. 2000). De plus, les inhibitions des ACE ou des ATIR diminuent l’hypertrophie
cardiaque, la synthèse protéique et la fibrose induites par l’hypertension artérielle (Ikeda,
Nakamura et al. 2000).
Lors de l’hypertrophie cardiaque, d’autres types cellulaires peuvent être stimulés par
l’angiotensine qui induit la prolifération des fibroblastes cardiaques et la production de
11
collagène impliqué dans la fibrose. (Pathak, Sarkar et al. 2001; Sarkar, Vellaichamy et al.
2004; Hattori, Akimoto et al. 2006).
2. Stimulation adrénergique
Les catécholamines, la norepinephrine et l'épinephrine peuvent conduire à l’hypertrophie des
cardiomyocytes. Au niveau du cœur, l’exposition prolongée aux catécholamines entraîne une
augmentation de la masse musculaire. De nombreux travaux ont été réalisés afin de connaître
le rôle de leurs différents récepteurs. Le cœur possède 2 types de récepteurs adrénergiques, α
et β, et plusieurs sous-types (α1, α2, β1, β2, β3). Les 2 types de récepteurs sont impliqués
dans l’hypertrophie des cardiomyocytes (Barki-Harrington, Perrino et al. 2004). L’activation
des récepteurs α et β adrénergiques des cardiomyocytes en culture induit une augmentation de
la synthèse protéique.
Les voies d’activation de l’hypertrophie induite par la signalisation adrénergique sont encore
controversées. Le rôle de la PKA qui est activée par l’adénosine monophosphate cyclique
(AMPc) produite par les adénylate cyclases activées elles-mêmes par les protéines G
hétérotrimériques après l’activation des récepteurs β (Xiao 2001; Zheng, Han et al. 2004) a
été clairement identifié. Cependant d’autres voies sont activées par les récepteurs
adrénergiques comme la voie de la PI3K (Xiao, Pimental et al. 2001; Xiao 2001).
3. L’endothéline
D’autres facteurs neuro-hormonaux comme l’endothéline (ET) sont impliqués dans
l’hypertrophie cardiaque. L’endothéline a été mise en évidence en 1988 par Yanagisawa et. al.
qui ont montré les propriétés vasoconstrictrices de la protéine (Yanagisawa, Inoue et al. 1988;
Yanagisawa, Kurihara et al. 1988). Cependant l’ET possède d’autres effets biolgiques sur
d’autres tissus. 3 isoformes de l’ET ont été identifiées et ont pour effet de stimuler la
croissance des cardiomyocytes et la myofibrillogénèse. De plus, elles modifient les propriétés
contractiles des cellules en régulant les concentrations ioniques et l’ouverture de certains
canaux. L’endothéline 1 se lie aux récepteurs de surface ETA entraînant l’activation des
12
protéines G hétérotrimériques, de la PLC, de la PKC, des petites protéines G et des MAPK
(Sugden 2003).
4. Rôle des facteurs de croissance
De nombreux facteurs de croissance sont impliqués dans l’hypertrophie parmi lesquels le
TGF-β (transforming growth factor-β) (Calderone, Takahashi et al. 1995; Huang, Kuo et al.
2004), l’IGF-1 (insulin-like growth factor-1)(Fuller, Mynett et al. 1992; Calderone, Takahashi
et al. 1995), la myotrophine (Sen, Kundu et al. 1990), le VEGF (vascular endothelial growth
factor)(Li, Hampton et al. 1997; Seko, Takahashi et al. 1999) et l’EGF (epidermal growth
factor. Ces différents facteurs peuvent être synthétisés par les cardiomyocytes ou par les
cellules non-musculaires et entraîner une augmentation de la taille des cardiomyocytes (Long,
Henrich et al. 1991).
Le rôle du récepteur à l’EGF que j'ai particulièrement étudié sera détaillé dans la partie I.
B. L’étirement
L’étirement est, avec les facteurs neuro-hormonaux, un stimulus majeur de l’hypertrophie
cardiaque. L'étirement étant le sujet principal de ma thèse, nous allons lui consacrer un
chapitre spécial qui reprendra son rôle dans l'organisme avant d'étudier son rôle
spécifiquement dans le cœur.
III - L'étirement cellulaire
A. Rôle de l’étirement dans l’organisme
Une grande majorité des organismes, des organes ou des cellules sont sensibles à l’application
d’une force extérieure. L’application des forces entraîne une signalisation complexe, d’une
part via des mécanismes non spécifiques du type cellulaire (Trepat, Deng et al. 2007) mais
également par des mécanismes spécifiques du type cellulaire. Le stress mécanique peut
13
induire l’activation de la transcription des gènes chez des végétaux (Wick, Gansel et al. 2003)
et également chez les insectes. Chez ces derniers, les contraintes de pression et de torsion
cellulaire peuvent être dues à la formation des organes et être nécessaires au développement
physiologique de l’insecte (Somogyi and Rorth 2004). L’étirement cellulaire est également
impliqué dans le développement des mammifères. Il a un rôle depuis la mise en place des
cellules de l’embryon jusqu'à la réponse de différents organes aux contraintes.
Mis à part les récepteurs de pression de la peau dont le rôle dans l’application des forces est
évident, les cellules telles que les cellules endothéliales et la plupart des organes de
l’organisme sont sensibles aux forces qui leur sont appliquées.
1. Au niveau du système nerveux central
Les astrocytes, support des neurones, peuvent se comporter comme des capteurs de
pression et ainsi être sensibles au stress mécanique qu’ils traduisent en signaux chimiques.
Les mécanismes de mécanotransduction de ces cellules permettent la mise en place de
réponses spécifiques à l’importance de l’agression ou de la pathologie (Ostrow and Sachs
2005).
2. Au niveau du poumon
L’étirement cellulaire dû aux mouvements physiologiques est primordial dans la mise
en place de la structure alvéolaire du poumon. L’étirement peut également être provoqué par
des facteurs extérieurs et avoir un rôle potentiellement délétère dans le cas de la ventilation
artificielle qui peut provoquer une inflammation ainsi qu’un œdème pulmonaire avec
activation de la voie des MAPK (Correa-Meyer, Pesce et al. 2002).
3. Au niveau du foie
L’étirement mécanique entraîne au niveau des cellules stellaires hépatiques
l’expression de TGFβ tant au niveau du transcrit qu’au niveau de la protéine. La transcription
de ce facteur de croissance nécessite l’activation de voies de transduction de la petite protéine
G Rho(Sakata, Ueno et al. 2004).
4. Au niveau des reins
14
Le stress mécanique entraîne une hypertrophie des cellules épithéliales du rein ou
podocytes dans toutes les phases du cycle cellulaire. Cet effet qui comprend une augmentation
de la synthèse protéique nécessite l’activation des petites protéines G, des MAPK et de la voie
Akt. L’étirement cellulaire joue donc un rôle en cas d’atteinte des podocytes lorsque la
pression intraglomérulaire augmente (Petermann, Pippin et al. 2005)
5. Au niveau de la peau
L’activation des récepteurs à l’angiotensine II entraîne la transactivation des
récepteurs à l'EGF en réponse à l’étirement des keratinocytes de la peau qui active la voie
PI3K / Akt, protégeant les cellules de l’apoptose (Kippenberger, Loitsch et al. 2005).
6. Au niveau des muscles
Les muscles sont particulièrement sensibles aux stimuli mécaniques. La surcharge ou
l’augmentation chronique de la force développée entraîne une hypertrophie du muscle tandis
que l’immobilisation ou l’absence de stimulation entraîne son atrophie. Les cellules des
muscles squelettique, cardiaque et lisse répondent à l’étirement cellulaire par une
augmentation de la synthèse protéique, notamment des protéines de l’appareil contractile
(Goldspink 1999). Au niveau des muscles squelettiques, l’augmentation de la demande de la
force développée entraîne une modification de l’expression des gènes, du phénotype
cellulaire, et de la réponse cellulaire (Goldspink 2002).
B. L’étirement dans le cœur
Lors du cycle cardiaque, le cœur est en permanence soumis à des variations de pression
auxquelles il doit s’adapter. De plus, des événement extérieurs telle qu’une sténose qui
entraîne une augmentation de la résistance de la circulation systémique ou des événements
intense au cœur telle une insuffisance mitrale peuvent faire varier les conditions de pression et
de volume, entraînant un étirement anormal du muscle et par conséquent des fibres qui le
composent. Le cœur régule donc son activité à chaque battement, y compris pour un cœur
transplanté, ce qui implique au moins en partie des mécanismes intrinsèques au muscle (Kohl,
Hunter et al. 1999). L’étirement des fibres et des sarcomères entraîne, en réponse, une
amélioration de la force de contraction par différents mécanismes (Stelzer and Moss 2006).
15
L’augmentation des capacités du coeur en réponse à un étirement anormal des fibres entraîne
une réponse en plusieurs phases :
- Une phase immédiate appelée loi de Frank-Starling qui intervient dans les secondes qui
suivent l’étirement.
- Une phase rapide qui survient quelques minutes après la stimulation, est due à un
changement du degré d’activation du muscle.
- Une phase tardive qui nécessite une stimulation à long terme, entraîne l’activation des
voies de signalisation conduisant à la synthèse de protéines, au remodelage cardiaque et
finalement à l’hypertrophie cardiaque.
1. Réponse contractile du muscle cardiaque lors de l’étirement.
Les premières expériences sur cœur isolé perfusé furent réalisées en 1866 par Elias Cyon qui
connecta le cœur d’une grenouille à un système circulatoire artificiel. J. Coats puis H. P.
Bowditch utilisèrent des protocoles semblables pour étudier la fonction cardiaque et les
facteurs pouvant la moduler. Ils montrèrent le rôle de la pression sur l’amplitude de la
contraction.
Entre 1892 et 1895, Otto Franck perfectionna le modèle de cœur isolé perfusé de grenouille,
lui permettant d’effectuer des mesures isovolumétriques ou isotoniques. Il constata que,
lorsque le remplissage du ventricule augmente, la pression diastolique augmente. Il organisa
ses résultats en courbes pression-volume comprenant la courbe de pression diastolique ainsi
que les courbes de pressions maximales isovolumétrique et isotonique.
Ernest H. Starling travailla sur la relation entre le volume d’éjection et la pression de
remplissage sur des systèmes cœur-poumon de chien. Il détermina les effets de la résistance
périphérique et du retour veineux sur l’éjection cardiaque. Il montra, sur le cœur de chien, que
lorsque le retour veineux augmente, le volume diastolique et le volume d’éjection
augmentent. Il détermina également que lorsque la résistance à l’éjection augmente, le volume
diastolique augmente, limitant le volume d’éjection. Que ce soit en cas d’augmentation du
retour veineux ou de la résistance périphérique, Starling a montré que la longueur des fibres
est augmentée. Il a montré ensuite que la consommation d’oxygène du cœur isolé est
déterminée par le volume diastolique et par la longueur des fibres musculaires. Il en a déduit
ce qu’il appela la « loi du cœur » qui correspond à la relation entre le remplissage
16
ventriculaire et le volume d’éjection et est plus utilisée aujourd’hui sous le terme : « lois de
Frank-Starling » (Zimmer 2002).
Figure 5 : Mécanisme moléculaire de la loi de Frank-Starling (A : augmentation de la force développée en fonction de l’étirement passif du muscle. B : mecanicme de chevauchement des filaments des sarcumères impliqué dans l’augmentation de la force développée). (Crozatier 1999)
Dans un premier temps, la loi de Starling à été expliquée sur un plan cellulaire par
l’augmentation des chevauchements des filaments fin d’actine et des filaments épais de
myosine et donc de l’augmentation du nombre de ponts actine / myosine entre les filaments.
Ce mécanisme est à la base de la réponse immédiate du cœur lors de étirement du muscle
(figure 5).
Ce modèle appliqué dans un premier temps au muscle squelettique n’est pas suffisant pour
expliquer l’augmentation de la contraction du muscle cardiaque car celui ci montre bien une
augmentation immédiate de sa force de contraction mais si la contrainte est maintenue, il
montre une seconde augmentation qui nécessite quelques minutes.
Pollack et Julian sur le muscle papillaire puis Fabiato et al. sur des fibres cardiaques pelées
ont montré que l’augmentation de la force contractile est également due à une variation de
l’activation du muscle (Julian and Sollins 1975; Krueger and Pollack 1975; Fabiato and
Fabiato 1976). Comme le mécanisme mis en jeu par la loi de Frank-Starling , cette activation
est réversible (figure 6).
17
Figure 6 : Mise évidence du mécanisme de d’activation du muscle papillaire par l’étirement (A : diminution rapide de la force active consécutive à une diminution rapide de la précharge, B : diminution progressive de la force active, C : augmentation de la force active après augmentation de la précharge, D : augmentation progressive de la force active. (Parmley and Chuck 1973)
Plusieurs observations ont permis d’expliquer ce phénomène. Dans un premier temps, il a été
montré que, lors de l’étirement, l’affinité de la troponine C pour le calcium est augmentée et
d’autres travaux ont montré que le calcium a un rôle prépondérant dans la modulation de la
longueur des sarcomères (Smith and Fuchs 2000). Une autre hypothèse met en jeu une
modification de l’espace inter-filamentaire (Fuchs and Wang 1996). En diminuant l’espace
entre l’actine et la myosine, la probabilité d’interaction est augmentée ainsi que la force
contractile. D’autres systèmes peuvent être impliqués dans la réponse à l’étirement comme la
production de NO qui peut faciliter l’augmentation de la force de contraction et augmenter la
transitoire calcique, participant ainsi à l’augmentation secondaire de la contraction (Khan,
Skaf et al. 2003; Seddon, Shah et al. 2007).
Enfin, la dernière phase de la réponse musculaire à l’étirement met en jeu l’activation de la
synthèse protéique. Cette phase est lente, irréversible et s’accompagne d’une stimulation
d’autres types cellulaire tels que les fibroblastes qui peuvent proliférer et avoir un rôle
inapproprié, entraîner une fibrose du cœur voire l’apoptose et la nécrose de cardiomyocytes
Tous ces facteurs participent à la réponse du myocarde lors de l’étirement qui, comme on l'a
vu précédemment, avec les facteurs neuro-hormonaux induisent l'augmentation de la synthèse
protéique donc l'hypertrophie ventriculaire.
18
2. Perception de l’étirement et rôle des intégrines et du cytosquelette
▫ La perception de l'étirement
La perception de l’étirement au niveau des cardiomyocytes est encore mal connue (Epstein
and Davis 2003). Plusieurs hypothèses sont étudiées faisant intervenir des protéines géantes
telle que la titine (LeWinter, Wu et al. 2007; Linke 2007), des protéines du cytosquelette ou
des canaux ioniques.
La titine est une protéine géante qui peut atteindre 3000 kDa et qui relie les lignes Z aux
lignes M au niveau des sarcomères. Elle a aussi pour rôle de maintenir l’intégrité des
sarcomères lors de la contraction. Cette protéine peut générer une force passive (figure 7) et
pourrait moduler les interactions actine / myosine en réponse à l’étirement en modulant la
sensibilité au calcium des protéines contractiles ainsi que l’espace interfilamentaire (Cazorla,
Vassort et al. 1999; Rassier, Lee et al. 2005; LeWinter, Wu et al. 2007; Linke 2007). Elle
participe à la formation des ponts actine-myosine et par conséquent à la longueur des
sarcomères et donc à la modulation de la force de contraction impliquée dans le mécanisme de
Frank-Starling. De plus, depuis la fin des années 1990, plusieurs études montrent que la titine
est impliquée dans la perception de l’étirement et dans la réponse cellulaire aux contraintes
mécaniques (LeWinter, Wu et al. 2007; Linke 2007).
Figure 7 : Rôle de la titine dans le développement de la force passive lors de l’étirement des sarcomères. A, B, C, D : étirement séquentiel de la titine (Granzier and Labeit 2004)
19
La titine peut avoir un rôle majeur dans la signalisation de l’étirement. En effet, de par sa
taille, la titine peut former de nombreux complexes avec une grande quantité de protéines
appartenant à plusieurs compartiments de la cellule (Linke 2007). La titine est également
considérée comme l’une des bases de multiples complexes permettant la perception de
l’étirement : elle forme des complexes depuis les lignes Z jusqu'à la MLP et la T-cap, liant
ainsi le sarcomère au sarcolemme. Ses propriétés élastiques au niveau des bandes I peuvent
également être impliquées dans la perception de l’étirement (Miller, Granzier et al. 2004).
Figure 8 : Protéines interagissant avec la titine pour la formation de complexes multiprotéiques impliqués dans la perception de l’étirement
Les canaux ioniques : La nature de ces canaux est encore controversée. Néanmoins, plusieurs
études ont démontré que ces canaux seraient sensibles au gadolinium mais non spécifiques
(McNicholas-Bevensee, DeAndrade et al. 2006). Ils peuvent permettre le passage des ions
Na+, K+ et sont couplés à des protéines Gi sensibles à la toxine pertussique (Dassouli,
Sulpice et al. 1993). De plus, l’étirement des cardiomyocytes entraîne un influx calcique
entraînant la formation de vagues calciques impliquées dans le mécanisme de CICR (calcium-
induced calcium release).
Lors de l’étirement cellulaire, l'échangeur Na+ / H+ est activé et participe à la perception de
l’étirement et la signalisation cellulaire conduisant à l’hypertrophie de la cellule (Yamazaki,
Komuro et al. 1998; Yamazaki and Yazaki 2000). Le mécanisme faisant intervenir
l’échangeur Na+/H+ n’est pas encore complètement compris. Néanmoins, plusieurs paramètres
20
peuvent intervenir. La concentration sodique et le pH sont des paramètres variables pouvant
influencer l’activation des voies de signalisation cellulaire directement ou indirectement par
l’activation des ROS ou des mitochondries. Un mécanisme indépendant des paramètres
précédents est également possible de par son rôle de protéine d’échafaudage. De plus,
l’échangeur peut réguler l’organisation du cytosquelette en réponse à divers stimuli.
▫ Rôle des intégrines
Lors de l’étirement du muscle, les protéines permettant l’adhésion des cellules à la matrice
extracellulaire ont une importance majeure dans la perception et la transduction du signal.
Les intégrines sont une famille de protéines dont le rôle principal est la liaison du
cytosquelette à la matrice extracellulaire. Elles sont formées de 2 sous-unités α et β associées
en hétérodimère avec un grand domaine extracellulaire et un court domaine cytoplasmique.
Le domaine extracellulaire des intégrines permet la liaison des cellules avec la matrice et donc
assure l’adhésion des cellules mais elles peuvent également lier les protéines exprimées par
les autres cellules assurant ainsi la liaison des cellules entres elles (Takada, Ye et al. 2007). Le
domaine cytoplasmique des intégrines est lié au cytosquelette, permettant la transmission des
contraintes aux sarcomères (figure 9)
Figure 9 : Rôle des intégrines : liaison des sarcomères avec la matrice extracellulaire (Brancaccio, Hirsch et al. 2006)
Les intégrines participent à la formation des complexes d’adhésion focales (FAC) (Liu,
Calderwood et al. 2000). Les FAC assurent la liaison au cytosquelette mais comprennent
également de nombreuses protéines de signalisation incluant entre autre la Focal adhesion
21
kinase (FAK), Src et la paxiline (Liu, Calderwood et al. 2000; Wozniak, Modzelewska et al.
2004). Les FAC peuvent donc avoir un rôle dans la transduction du signal mécanique perçu
au niveau des intégrines en facilitant sa transduction grâce à un regroupement des protéines.
En aval de ces complexes, de nombreuses voies peuvent être activées (Torsoni, Constancio et
al. 2003; Nadruz, Corat et al. 2005) en faisant intervenir la PLC, des protéines Grb2, la
protéine activatrice de Ras SOS, les petites protéines G ou les MAPK (Kawamura, Miyamoto
et al. 2003; Torsoni, Marin et al. 2005; Lal, Verma et al. 2007).
D’autres mécanismes peuvent être impliqués dans la réponse aux stimulations perçues par les
intégrines. Elles peuvent transmettre le signal d'étirement par l'intermédiaire des protéines du
cytosquelette telles que l’α-actinine, la taline, la vinculine, la paxiline ou la tensine (Liu,
Calderwood et al. 2000). Les intégrines participent aux libérations autocrines/paracrines
d'hormones ainsi qu'à la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance qui sont
détaillées ultérieurement (Samarel 2005; Yutao, Geru et al. 2006).
▫ Le cytosquelette de la cellule
Structure et fonctions :
Le cytosquelette est un réseau de filaments et de tubules qui contribue à la stabilité de la
structure cellulaire et à l’ancrage des éléments contenus dans le cytoplasme tels que l’appareil
de Golgi et les mitochondries. Le cytosquelette est en relation avec les protéines extra et
intracellulaire afin de transmettre les différentes contraintes appliquées aux cellules (Wang
and Ingber 1994; Choquet, Felsenfeld et al. 1997).
Le cytosquelette cellulaire est composé de 3 réseaux de filaments :
- les filaments fins
- les filaments intermédiaires
- les microtubules.
Les filaments fins d’actine participe au mécanisme de la contraction cellulaire décrit dans
l’introduction. Dans les cardiomyocytes, les filaments fins, composés de 2 isoformes d’actine,
sont impliqués dans le maintien du cytoplasme et dans l’élasticité du cytoplasme. L’actine est
les protéines associées représentent environ 60% des protéines totales de la cellule. Les
22
mutations de l’actine entraînent une désorganisation des filaments fins qui peut être constatée
dans certaines cardiopathies dilatées (Bookwalter and Trybus 2006).
Le réseau de filaments intermédiaires est formé de filaments de 10nm de diamètre. Il entoure
le noyau et est lié aux membranes nucléaires et cytoplasmiques. Il est également lié aux autres
réseaux du cytosquelette. Leur rôle est de préserver l’intégrité tissulaire et peut être important
dans les conditions de stress mécanique imposé par la contraction musculaire et par
l’étirement du muscle. Comme les filaments fins, la désorganisation de ce réseau entraîne le
développement de cardiomyopathies (Di Somma, Marotta et al. 2000).
Le 3ème réseau de filaments est formé par les microtubules. Ils sont formés d’un assemblage
d’hétérodimères de tubuline α et β qui forment un cylindre de 25nm de diamètre et sont
disposés selon l’axe longitudinal dans les cardiomyocytes adultes (Goldstein and Entman
1979; Kostin, Hein et al. 2000).
Dans les cardiomyocytes, les microtubules s’organisent autours du noyau et des myofibrilles
ainsi que sous la membrane cytoplasmique. La localisation et la structure des microtubules
leur permettent d’être impliqués dans de nombreux processus cellulaires notamment le
maintien de l’architecture du cytoplasme et l’organisation des organelles et des mitochondries
(Appaix, Kuznetsov et al. 2003). Les microtubules participent également à la synthèse
protéique, à la signalisation intracellulaire et au transport intracellulaire (Rogers and Gelfand
2000). Ces filaments sont associés à de nombreuses protéines (Sato, Nagai et al. 1997; Liao
and Gundersen 1998; Calaghan, Le Guennec et al. 2004).
Rôle du cytosquelette dans le cœur :
Les microtubules participent à de nombreuses réponses cellulaires telles que la réponse à
l’ischémie (Vandroux, Schaeffer et al. 2004), l’apoptose (Saji, Fukumoto et al. 2007) et
l’hypertrophie.
L’hypertrophie cellulaire, associée à une augmentation de la surface cellulaire est
accompagnée d’une augmentation du réseau de microtubules (Tagawa, Rozich et al. 1996;
Heling, Zimmermann et al. 2000). Lors de l’hypertrophie cardiaque, l’augmentation de la
polymérisation de la tubuline et l’augmentation de la synthèse protéique contribuent à la
myofibrillogenèse. L’hypertrophie des cardiomyocytes est diminuée par l’inhibition chimique
de la synthèse des microtubules (Hein, Kostin et al. 2000). Au cours de l’étude du rôle des
23
microtubules lors de l’hypertrophie cardiaque et de la dysfonction myocardique, plusieurs
hypothèses ont été proposées pour savoir si l’augmentation de la proportion de microtubules
est une conséquence ou une cause de la perte de fonction contractile. Néanmoins la
localisation des microtubules le long des myofibrilles et leur rôle de support de l’organisation
interne de la cellule laisse supposer un rôle important dans la biologie de la cellule (Bailey,
Dipla et al. 1997; Tagawa, Koide et al. 1998).
Le stress mécanique perçu par les intégrines, peut être transmis à l’actine des microfilaments
qui peuvent interagir avec les microtubules et les filaments intermédiaires. Lors de la
perception de l’étirement, d’autres protéines telles que les protéines associées au cytosquelette
peuvent intervenir comme la mélusine, la muscle LIM protein (MLP) qui se lie à T-cap, la
titine qui participe à l’architecture des sarcomères ou la T-cap qui lie la titine aux disques Z
(Gregorio, Trombitas et al. 1998; Hoshijima 2006; Donker, Maessen et al. 2007). De plus, des
mutations de plusieurs des protéines du sarcomère et du cytosquelette sont impliquées dans
les cardiopathies (Itoh-Satoh, Hayashi et al. 2002; Chang and Potter 2005).
3. Stimulations autocrines / paracrines liées à l'étirement
Certaines voies de signalisation impliquées lors de l’hypertrophie telles que les voies de
l’angiotensine II ou les voies activées par les TKR sont activées en réponse à un étirement des
cellules. Ces voies peuvent être activées par la libération de facteurs autocrines / paracrines ou
par les protéines impliquées dans l’adhésion de la cellule à son support.
▫ Stimulations neuro-hormonales
Les travaux réalisés par Sadoshima et Izumo au début des années 1990 ont mis en évidence
une libération autocrine/paracrine d’angiotensine II lors de l'étirement des cardiomyocytes
(Sadoshima and Izumo 1993; Sadoshima and Izumo 1993; Sadoshima and Izumo
1996). Cependant, l’origine de l’angiotensine II a largement été discutée et attribuée aux
cellules non musculaires pouvant contaminer les cultures de cardiomyocytes (Gray, Long et
al. 1998; Lijnen and Petrov 1999). Néanmoins, la sécrétion du peptide par les cellules
musculaires est maintenant reconnue ainsi que le rôle des récepteurs de l’angiotensine II, liés
ou non à l’angiotensine II (Miyata and Haneda 1994; Sadoshima, Qiu et al. 1995; Gray, Long
et al. 1998; Zou, Akazawa et al. 2004; Yasuda, Miura et al. 2008).
24
Par ailleurs, le rôle de l'angiotensine libérée lors de l'étirement a été considéré par certains
comme uniquement limité aux cardiomyocytes de rats nouveaux-nés (qui étaient le modèle de
Sadoshima et Izumo). Thienelt et al avaient en effet exclu le rôle de l'angiotensine libérée lors
de l'étirement dans les cardiomyocytes adultes (Thienelt, Weinberg et al. 1997). Cependant
une autre étude sur cœur isolé de cobaye adulte a montré qu'il existe bien une activation des
récepteurs à l'angiotensine lors de l'étirement (Paul, Ball et al. 1997). Actuellement, il est
accepté que l’angiotensine induit la croissance des cellules par un processus autocrine /
paracrine lors de l'étirement, ce processus étant inhibé par les inhibiteurs d’AT1R ou d’ACE
(Yamazaki, Komuro et al. 1998; Yamazaki, Komuro et al. 1998; Wollert and Drexler 1999).
Cependant, l’angiotensine II sécrétée n’est pas indispensable à l’activation des voies de
signalisation de l’hypertrophie (van Kesteren, Saris et al. 1999).
Les voies de signalisation activées par les récepteurs de l’angiotensine sont controversées. Il a
été montré que la protéine kinase C (PKC) est nécessaire à l’activation de la cascade de
phosphorylation de la MAPK ERK en aval de la protéine Raf1 car l'inhibition de la PKC
bloque l’activation des protéines en aval (Zou, Komuro et al. 1996; Chiloeches, Paterson et al.
1999).
D’autres facteurs neuro-hormonaux sont également impliqués dans la signalisation induite par
l’étirement. C'est le cas en particulier de l'endothéline. Plusieurs études montrent que
l’étirement des cardiomyocytes en culture entraîne une augmentation de l’expression des
ARNm de l’ET1 et sa libération par les cellules stimulées (Sugden 2002; Rosenkranz 2004;
Watkins, Jonker et al. 2006). L’inhibition des récepteurs de l’ET1 inhibe les voies de
signalisation de l’hypertrophie induite par l’étirement notamment la voie des MAPK Raf1-
MEK-ERK.
▫ Stimulation des facteurs de croissance.
Les facteurs de croissance sont exprimés et sécrétés par les cellules en culture soumises à un
stress mécanique (van Wamel, Ruwhof et al. 2001; van Wamel, Ruwhof et al. 2002). C'est le
cas des cardiomyocytes ainsi que les fibroblastes, les cellules endothéliales, ou les cellules
musculaires lisses (Ruwhof and van der Laarse 2000). La partie I décrira en détail le
mécanisme d'activation et le rôle du facteur de croissance le plus étudié : l'EGF.
25
La figure 10 schématise les voies d'activation mises en jeu lors de l'étirement par des
mécanismes directs et des mécanismes autocrines / paracrines au niveau de la membrane
plasmique.
.
Figure 10 : Mécanismes d’activation de la signalisation intracellulaire (à gauche de la figure : facteurs autocrine paracrine, à droite de la figure : mécanismes directs d’activation (Force, Michael et al. 2002)
C. Signalisation intracellulaire induite par l'étirement
Le paragraphe précédent a montré la multiplicité des facteurs mis en jeu lors de la perception
de l'étirement. La signalisation d'aval fait elle aussi intervenir de multiples voies qui sont plus
ou moins interconnectées. La formation de complexes multiprotéiques est un des mécanismes
par lequel il existe une communication entre les voies de signalisation. Elle est responsable
d'une microcompartimentation dans la cellule.
1. Principales protéines intervenant dans la signalisation de l’hypertrophie des
cardiomyocytes.
Les plus connues des voies de transduction du signal d'étirement sont les cascades de
phosphorylation aboutissant à la phosphorylation de facteurs de transcription, modulant ainsi
la transcription des gènes et la phosphorylation / déphosphorylation de protéines régulatrices
de la transcription dans le cytoplasme qui, activées, migreront vers le noyau afin de réguler la
transcription des gènes. Parmi ces protéines, nous décrirons les petites protéines G et la voie
PI3K / Akt dans la partie I, la PKC, la PKA et la calcineurine dans la partie II et nous
décrivons ci-dessous en détail les MAPK qui sont les cibles intracellulaires que j'ai étudiée
dans les 2 articles principaux de cette thèse.
26
2. Les Mitogen-activated protein kinases (MAPK)
Les MAPK sont des sérines thréonine kinases activées par leur phosphorylation au niveau de
résidus thréonine et tyrosine. Ces protéines font parties de cascades de phosphorylations qui
ont été décrites chez de nombreuses espèces dont les mammifères, les insectes et chez les
bactéries (L'Allemain 1994). De nombreux stimuli activent les cascades des MAPK parmi
lesquels les hormones, les facteurs de croissances et les facteurs de stress. Les cascades des
MAPK sont impliquées dans les voies de signalisation conduisant à la mitose, la prolifération,
la différenciation, la croissance cellulaire, l’expression génique ou la mort cellulaire en
réponse aux signaux extracellulaires (Johnson and Lapadat 2002; Zhang and Liu 2002).
Structure générale
Les MAPK comptent 5 groupes. 3 ont largement été étudiés : les Extracellular signal
regulated kinases 1 et 2 (ERK); les c-Jun N-terminal kinases 1, 2 et 3 (JNK) ou stress
activated protein kinase (SAPK); les p38MAPK α, β, γ, et δ. 2 autres groupes sont moins bien
connus et leurs rôles dans la signalisation cellulaire restent incertains : les Extracellular signal
regulated kinases 3 et 4 et les Extracellular signal regulated kinases 5 (Coulombe and
Meloche 2007). En aval, les MAPK phosphorylées activent les facteurs de transcriptions tels
que c-myc, c-jun ou ATF2 mais peuvent également activer d’autres kinases en amont et en
aval de la cascade des MAPK, affinant ainsi la régulation des voies de signalisation
(Whitmarsh 2007).
Figure 11 : Structure des MAPK (domaine kinase en bleu, NLS : séquence de localisation nucléaire). (Coulombe and Meloche 2007)
27
En amont, les voies de signalisation activant les MAPK sont nombreuses. Dans une large
proportion, elles activent les petites protéines G de la superfamille Ras qui activent les MAPK
kinase kinases comme les protéines Raf (Chong, Vikis et al. 2003). Les MAPKKK
phosphorylent les résidus sérine et thréonine au niveau des motifs Ser-xxx-Ser/Thr des
MAPK kinases comme les MEK. Enfin, les MAPKK phosphorylent les MAPK au niveau des
résidus Thr-xxx-Tyr qui, à leur tour phosphorylent les motif Pro-xxx-Ser/Thr des facteurs de
transcription ou d’autres protéines des voies de signalisation (Biondi and Nebreda 2003).
ERK 1/2
Les Extracellular signal regulated kinases 1 et 2 (ERK) respectivement de 42 et 44 kDa ont
été les premières MAPK mises en évidence et sont les plus étudiées. Elles sont activées par
les facteurs de croissances, les hormones, les chocs osmotiques, les cytokines, les GPCR
(récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques) et les phorbolesters. Elles jouent un
rôle majeur dans la prolifération et la différenciation cellulaire y compris pour les myocytes
cardiaques (Kang and Sucov 2005; Kim, Cho et al. 2007). L’activation de la voie ERK
entraîne l’induction des gènes conduisant à l’hypertrophie cellulaire, à l’augmentation de la
synthèse protéique et à la formation de sarcomères (Aoki, Richmond et al. 2000; Kim, Cho et
al. 2007). L’inhibition de cette voie n’est pas suffisante pour inhiber complètement la réponse
hypertrophique. L’activation de cette seule voie ne permet pas non plus d’atteindre une
hypertrophie maximale. Cette voie n’est donc pas la seule responsable de l’hypertrophie des
myocytes (Ruwhof and van der Laarse 2000; Molkentin 2004). L’inhibition de la PKC
entraîne une diminution de 80% de l’activation de ERK. Le rôle de la PKC est donc majeur
dans l’activation de ERK (Zou, Komuro et al. 1996). L’activation des PKC par les différents
stimuli tels que l’angiotensine II ou l’endotheline 1, entraîne l’activation de la protéine Raf
(Chong, Vikis et al. 2003). Cette activation n’est pas encore complètement comprise. En effet,
la multiplicité des stimuli et la complexité des interconnections entre les différentes voies
d’activation des MAPK rend l’étude de l’activation d’une voie particulièrement compliquée.
L’activation de Raf serait due à son interaction avec la forme activée de Ras. Elle nécessite
également une séquence de phosphorylation et de déphosphorylation précise. L’activation de
Raf lui permet d’activer les MAPKK de ERK : MEK1 et MEK2. Les MEK1/2 phosphorylées
donc activées peuvent enfin activer ERK1 et ERK2 (Davis 1993; Seger and Krebs 1995).
28
ERK activé peut phosphoryler des facteurs de transcription tels que NF-IL6, ELK1, ATF2,
NFAT (Morton, Davis et al. 2004; Sanna, Bueno et al. 2005; Yang, Xiong et al. 2005) mais
peut également activer des protéine kinases telles que p9ORSK, MAPKAP, c-Raf, MAPKK
ou des protéines proches de la surface cellulaire comme l’EGFR ou cPLA2. Les MAPK
peuvent également phosphoryler les protéines du cytosquelette et participent ainsi à la
régulation du cycle cellulaire et à la dynamique des microtubules (Harrison and Turley 2001).
Enfin, l’application d’une surcharge au niveau du cœur entier entraîne l’activation de ERK
(Baba, Stypmann et al. 2003).
JNK 1/2 ; SAPK
Les 3 isoformes des c-jun N-teminal kinases (JNK) ou stress-activated MAP kinase (SAPK)
sont moins connues que les ERK. Elles sont activées en réponse à de nombreux stimuli
comme par le stress physique (la chaleur, les UV, les chocs osmotiques), les facteurs
chimiques (pH, ROS), les facteurs métaboliques (ischémie), les facteurs biologiques
(protéines bactériennes, cytokine). La cascade des JNK reprend le schéma classique des voies
des MAPK avec l’activation des MAPKKK (MEKK1-4) qui activent les MAPKK (MKK4,
MKK7), activant à leurs tours les MAPK (JNK1/2). Comme pour les ERK, l’activation des
JNK conduit à l’expression des gènes par la phosphorylation des facteurs de transcription
parmi lesquels c-jun, ATF-2, Elk-1, MEF-2. Les voies des JNK sont prépondérantes dans les
réponses cellulaires initiées par les récepteurs adrénergiques couplés aux protéines G et par
les récepteurs tyrosine kinase tels que les récepteurs aux facteurs de croissance. Les JNK sont
impliquées dans l’activation de l’apoptose. Elles peuvent avoir un rôle pro-apoptotique mais
également anti-apoptotique en fonction du type cellulaire étudié et de la nature de la
stimulation. Comme pour l’apoptose, leurs rôles dans la physiologie cellulaire sont nombreux
et dépendent du domaine étudié. Elles interviennent dans le développement du système
nerveux comme dans la régulation de l’insuline et de l’obésité mais également dans
l’hypertrophie et dans l’insuffisance cardiaque.
Le rôle des JNK dans l’hypertrophie cardiaque est reconnu mais l’activation des cascades de
phosphorylation des JNK est encore mal connue. L’activation de la voie JNK entraîne une
hypertrophie tandis que l’utilisation de dominant négatif des MAPKK entraîne une diminution
de l’hypertrophie dans des modèles cellulaires. En revanche, le rôle des JNK dans la
signalisation pro- et anti-apoptotique est encore sujette à controverse. In vivo l’utilisation d'un
dominant négatif de MKK4 bloque l’activation de JNK et l’hypertrophie due à une surcharge
29
de pression. De même, le croisement de souris KO MEKK-/- avec des souris transgéniques
présentant une hypertrophie du myocarde produit des souris présentant peu d’hypertrophie et
moins de dysfonction contractile. La surexpression de formes inactives de JNK bloque
également l’hypertrophie induite par l’augmentation de pression. Les JNK ont donc un rôle
protecteur de l’hypertrophie démontré au niveau cellulaire comme au niveau de l’animal
entier. L’activation des cascades de phosphorylation des JNK demeure néanmoins incertaine.
Les p38MAPK
Les 4 isoformes des p38 sont des sérines thréonine kinases activées selon les voies de
signalisation des MAPK. La stimulation des p38 est semblable à celles de JNK. Dans un
premier temps, ces 2 MAPKs ont été regroupées sous le terme SAPK. Les stimuli tels que les
chocs osmotiques, les UV ou l’irradiation, les stress oxydatifs, les agents anticancéreux
peuvent activer la cascade de phosphorylation des p38. Les différents stimuli peuvent activer
les MAPKKK (ASK, TAK, PTK), qui activent les MAPKK (MEK3, MEK6 mais également
des MAPKK d’autres cascades telles que MEK4, MEKK1, 2 et 5, ASK), leur permettant de
phosphoryler les p38. Les p38 sont activées par des stimuli hypertrophiques tels que le LIF, la
phénylephrine, ou l’endothéline 1. Comme pour les autres MAPK, les p38 ont notamment
pour cible des facteurs de transcription (ATF, MEF2, Elk1). Elles peuvent aussi phosphoryler
des protéines d’autres voies de signalisation en aval ou en amont des voies des MAPK telles
que la phospholipase A2, la protéine Tau ainsi que d’autres kinases. La réponse cellulaire peut
néanmoins être différente en fonction des isoformes de p38 qui sont activées. Par exemple,
l’activation de l’isoforme γ entraînerait la cellule vers l’apoptose tandis que l’isoforme β la
conduirait vers un phénotype hypertrophique. In vivo, l’expression d’un dominant négatif des
MAPKK de la p38 a montré que la p38 module l’expression des gènes et sa surexpression ou
son activation constitutive entraînent une diminution de l’hypertrophie. Comme pour la p38,
la surexpression de MKK6 ou l’expression d’une forme constitutivement active inhibe
l’hypertrophie. Les modèles de souris transgéniques ont permis de montrer que les p38 sont
impliquées dans la régulation de l’expression des gènes en réponse aux stimuli. L’extinction
des gènes de la p38 est létale au stade embryonnaire. Néanmoins, l’expression d’un dominant
négatif au niveau des cardiomyocytes n’a pas d’effet sur l’hypertrophie cardiaque induite par
une augmentation de pression mais protège de la fibrose. D’autres études ont montré que la
voie des p38 inhibe la translocation nucléaire de la calcineurine et que la MAPK peut avoir un
30
rôle dans les signaux apoptotiques en interagissant avec la p53. Dans le cœur, l’activation de
la voie de p38 est impliquée dans la régulation des gènes, dans l’hypertrophie des myocytes,
dans la réponse inflammatoire, dans le métabolisme énergétique, dans la contractilité, la
prolifération et dans la régulation de la mort cellulaire.
Les autres MAPK
D’autres MAPK tels que la p70 S6 protéine kinase (p70S6K) les ERK5 et ERK3/4 sont
impliquées dans l’hypertrophie cardiaque mais leurs rôles sont moins connus. La p70S6K fut
l’une des premières kinases mises en évidence. Elle peut être activée par un étirement des
cardiomyocytes de 20% pendant 15 minutes. De plus, son inhibition inhibe l’hypertrophie
induite par l’étirement. Son rôle est de phosphoryler la protéine S6 des ribosomes 40S
induisant ainsi la synthèse protéique. L’activation de la p70S6K nécessite l’activation de la voie
PI3K mais de grandes incertitudes persistent quant aux rôles et aux voies d’activation de cette
kinase.
ERK5 ou BMK (Big MAPK) est l’une des dernières MAPK mises en évidence. Elle diffère
des autres ERK par son domaine C-terminal. L’activation de ERK5 nécessite l’activation des
MAPKKK MEKK2 et MEKK3 et en aval l’activation de la MAPKK MEK5. ERK5 est
impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire en réponse aux différents stress et aux
facteurs de croissance. Les modèles transgéniques montrent que ERK5 a plutôt un rôle au
niveau vasculaire. Cependant, ERK5 peut être activée par la cardiotrophine-1 ou le LIF
conduisant ainsi à l’hypertrophie cardiaque in vivo. De plus, ERK5 régulerait l’expression des
gènes au niveau du noyau. Le rôle de ERK5 n’est pas encore défini de façon certaine mais
aurait un rôle important dans la survie cellulaire et dans la prévention des dysfonctions
myocardiques.
Contrairement à ERK1 et ERK2, les ERK3 et ERK4 ne sont exprimées que chez les chordés
et les vertébrés et ont un rôle dans la différenciation des neurones ou des muscles. Ces MAPK
sont majoritairement exprimées dans le cerveau mais sont exprimées de façon réduite dans le
colon, les yeux, le cœur, les reins, les poumons, les ovaires, le pancréas, le placenta, la
prostate et la peau. La régulation des ERK3 et ERK4 reste encore largement inexplorée.
31
D’autres MAPK sont encore moins connues telles que les MAPK ERK7 ou NLK dont les
voies d’activation n’ont pas encore été mises en évidence.
Facteurs de croissances, Stress (osmotique, mecanique) FASL, cytokine, facteur de différenciation
RTK
GPCR
Ras
GEF
Ras
Rac
Raf1
A-Raf
B-Raf
MEK1
MEK2
ERK1
ERK2
MEKK1-4
MTK1
DLK, ZPK
MKK7
MEK4
JNK1
JNK2
JNK3
ASK1
TAK1
PTK
MEK3
MEK6
MEKK1
MAPKKK2,3,8
MEK5
ERK5
P38α
P38β
P38δ
P38γ
Autres MAPK :
RSK1-3Facteurs de transcription
MNK1-2, MSK1-2
Elk1, c-FOS, c-JUN, ATF2
SP1, STAT1, MEF2, c-MYC
CREB, MAX, c/EPB
Autres MAPK :
MAPKAPK2-3
PRAK
MSK1
Autres voies de
signalisation :
IKK / NFκB
EGF-R
MLK
LZK
MAPKKK6,10,13
MEK1
MEK2
ERK3
MAPKKK
MAPKK
MAPK
Effecteurs
Stimulus
Figure 12 : Les voies des MAPK
La complexité de l’étude des voies des MAPK est due aux nombreuses interconnexions
existantes entre les différentes cascades de phosphorylation et au nombre de protéines
impliquées. Les rôles hypertrophiques des ERK et JNK et les rôles protecteurs et apoptotiques
des JNK et des p38 font des voies des MAPK des cibles potentielles de traitement par des
inhibiteurs chimiques qui permettent d’une part l’étude des voies de signalisation des MAPK
dans les différents modèles de prolifération, apoptose, hypertrophie, processus cancéreux et
d’autre part le traitement lors d’études cliniques (Malemud 2007).
32
Toutefois, bien qu’extrêmement importante, la connaissance des voies des MAPK reste
incomplète notamment quant aux interactions avec leurs partenaires dans les conditions
basales et lors de différentes stimulations.
La régulation des MAPK
Les phosphatases des MAPK
La régulation de la réponse cellulaire à de nombreux stimulus dépend de l’activation des
MAPK mais également de leurs inactivations par des phosphatases qui sont également
étroitement régulées. Les MAPK activées sont déphosphorylées par 3 types de phosphatases :
les sérines / thréonine phosphatases, les tyrosine phosphatases et les dual spécificity
phosphatases (DSP). Ces 3 types de phosphatases comprennent plusieurs membres. Les sérine
/ thréonine phosphatases comprennent les PP2A et PP2C, les tyrosine phosphatases
comprennent les STEP, HePTP et les PTP-SL, enfin les DSP comprennent plusieurs MAPK
phosphatases (MKP)(Keyse 2000) (Farooq and Zhou 2004)
Les sérines / thréonine phosphatases forment 2 groupes : les PPP et les PPM. Les PPP
comprennent les protein phosphatases 1 (PP1), 2A (PP2A) et 2B (PP2B ou calcineurine). Les
PPM comprennent les PP2C-like sensibles au Mg2+ et au Mn2+(Cohen 1997) .
Les tyrosines phosphatases (PTP) sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires
et leur dérégulation peut être la cause de plusieurs maladies. Plus de 30 PTP ont été
répertoriées et divisées en 2 groupes : les receptor-like transmembrane PTP (group R1–R8) et
les non-transmembrane PTP (group NT1–NT9). La partie N-terminale contient une séquence
KIM (kinase interaction motif) au niveau du domaine phosphatase. Le site KIM des
phosphatases interagit avec les sites de liaison aux phosphatases des kinases entraînant la
liaison du site actif de la phosphatase avec les sites phosphorylés de la kinase active.
L’activation des PTP est complexe. L’activité des PTP est régulée par la phosphorylation de
multiples sites par les protéines kinases telles que la PKA, la PKC, ERK. La phosphorylation
d’une sérine proche du domaine KIM inhibe l’interaction de la PTP avec les MAPK, entraîne
l’inactivation de la phosphatase et donc permet l’activation des MAPK. (Camps, Nichols et al.
2000; Barr and Knapp 2006)
Les dual spécificity phosphatases (DSP) sont les plus connues des phosphatases des MAPK.
Elles sont divisées en 4 sous-groupes en fonction de leurs domaines fonctionnels, mais
peuvent également être divisées selon leurs modes de régulations enzymatiques ou leurs
33
mécanismes de reconnaissances de leurs substrats. (Camps, Nichols et al. 2000; Dickinson
and Keyse 2006; Kondoh and Nishida 2007; Owens and Keyse 2007)
Figure 13 : Structure des phosphatases des MAPK (NLS : nuclear localization signal, NES nuclear export signal, MKB domain : MAPK binding domain, DSP domain : dual spécificity phosphatase domain). (Kondoh and Nishida 2007) La séquence des phosphatases et notamment la présence de domaines NLS et NES permettent
la localisation des différentes phosphatases. Les MKP de type I ont été les premières à être
mises en évidence. Elles comprennent les MPK-1, MPK-2, PAC1, hVH3 et comportent toutes
une séquence NLS de localisation nucléaire. L’inactivation de MKP-1 est similaire à
l’activation de ERK et la surexpression de MKP1 entraîne l’inhibition de l’activation de ERK.
Les MKP de types II comprennent les MPK-3, MPK-X, MPK-4. Les MKP de types II
possèdent un groupement NES de localisation cytoplasmique. Les MKP de types III
possèdent les séquences de localisation cytoplasmique et nucléaire et peuvent donc être
localisées dans les 2 compartiments. Elles comprennent les MKP-5, MKP-7 et M3/6. Chacune
des MKP déphosphoryle des cibles spécifiques qu’elles lient en fonction de leurs séquences.
Enfin, les MKP de type IV ou atypiques comprennent les VHR (Vaccinia H1-related) et les
MKP de faible poids moléculaire car elles ne sont composées que du domaine DSP. Elles
comprennent aussi les MKP-6, DUSP18, DSP-2 MKP-8. Elles peuvent déphosphoryler
spécifiquement les ERK, JNK et p38 (Kondoh and Nishida 2007).
34
L’activation des MKP nécessite l’interaction de la phosphatase avec la kinase. Lorsque les 2
protéines sont libres, le site actif de la phosphatase est dans une conformation inactive. La
liaison de la phosphatase à la kinase par le site de liaison aux kinases (MKB) qui reconnaît le
site de liaison de la kinase entraîne un changement de conformation du domaine phosphatase
qui peut interagir avec les sites phosphorylés de la kinase.
Figure 14 : mécanisme de liaison nécessaire à la signalisation des MAPK (Biondi and Nebreda 2003)
Dans le cœur, plusieurs phosphatases ont largement été étudiées parmi lesquelles la MKP1 et
la calcineurine. La réponse transcriptionnelle induite lors de l’hypertrophie est dépendante de
l’état d’activation de MKP1 et notamment de son rôle dans la régulation des MAPK (Fuller,
Davies et al. 1997). L’activation des MAPK par l’activation des récepteurs AT1 par
l’angiotensine II est connue mais l’activation de ces récepteurs entraîne également une
augmentation de l’expression des ARNm de MKP-1. La phosphatase bloque la transcription
des gènes induite par l’angiotensine. L’activation de la MKP permet de réguler les effets
hypertrophiques de l’activation par l’angiotensine (Hiroi, Hiroi et al. 2001). L’augmentation
de l’expression de MKP-1 est associée à l’inactivation des p38 (Lim, New et al. 2001). Les
souris transgéniques exprimant MKP-1 dans le cœur ne présentent pas d’activation des
MAPK ERK, JNK, et p38 mais présente également une diminution de la croissance du cœur
ainsi qu’une diminution de l’hypertrophie en réponse à une constriction aortique (Bueno, De
Windt et al. 2001). Le rôle régulateur de l’hypertrophie cardiaque de la calcineurine a été
largement démontré.
Les voies de d’activation et d’inactivation des MAPK sont donc interconnectées et
étroitement régulées par les différentes voies qui sont activées par un même stimulus ainsi que
35
par une signalisation de rétro-contrôle assurant le contrôle de l’activation des MAPK
(Molkentin 2004; Sanna, Bueno et al. 2005).
3. Activation des facteurs de transcription et de l’expression génique
L'ensemble des activations induites par l'étirement conduit à la stimulation de l'expression des
gènes par l'intermédiaire de nombreuses voies intranucléaires qui sont schématisées dans la
figure ci-dessous. Je ne les décrirai pas ici car elles sortent du cadre des travaux que j'ai
effectués.
Figure 15 : Activation des facteurs de transciption lors de l’étirement cellulaire.(Pikkarainen, Tokola et al. 2004)
36
III - Méthodes d’étude de l’étirement Les études biochimiques, électrophysiologiques, ou de biologie moléculaire des effets de
l’étirement ont nécessité la mise au point de différentes méthodes parmi lesquelles le système
de Languendorff pour l’étude du cœur entier, plusieurs méthodes d’étirement de cellules
isolées et enfin l’étirement de cultures cellulaires.
A. Etude de l’étirement du cœur entier
▫ Système de Langendorff
L’étude de l’étirement sur le cœur a débuté par l’étude de surcharge directement appliquée sur
l’organe comme l’a fait Starling sur les systèmes cœur-poumon isolés de chien. La pression
systémique dans le système est augmentée entraînant une surcharge. Cette surcharge entraîne
un étirement du cœur qui répond par une augmentation de la contraction musculaire et de la
fréquence. Depuis les expériences de Starling, les méthodes d’étude du cœur sur l’animal
vivant ont évolué et permettent l’étude des paramètres fonctionnels du cœur in situ. D’autres
méthodes ont été développées pour étudier l’organe entier. Le cœur peut être isolé et perfusé
selon la méthode mise au point par Oscar Langendorff en 1897 et qui est toujours utilisée
aujourd’hui.
Figure 16 : Représentation schématique d’un cœur isolé perfusé à pression constante sur un système expérimental de type Languendorff. (Skrzypiec-Spring, Grotthus et al. 2007)
37
Cette méthode permet d’appliquer au cœur isolé, donc dépourvu de régulation nerveuse, une
pression ou un volume imposé et d’étudier la réponse du muscle (Skrzypiec-Spring, Grotthus
et al. 2007).
B. Méthodes d’étude de l’étirement cellulaire
L’étude de l’étirement du muscle est intimement liée à l’étude de l’hypertrophie cardiaque
mais le muscle est un système complexe composé de plusieurs types cellulaires qui
interagissent entre eux. Il est donc nécessaire d’étudier l’effet de l’étirement sur les cellules
elles mêmes. Plusieurs modèles d’étude ont été mis au point pour l’étude biochimique,
structurale, électrophysiologique et moléculaire.
▫ Etirement d'une cellule isolée
Plusieurs méthodes existent pour étirer des cellules isolées. Certains laboratoires utilisent des
méthodes dérivées du patch-clamp afin de tirer sur une partie de la cellule et enregistrer les
courants ioniques impliqués dans la signalisation du stimulus (Sasaki, Mitsuiye et al. 1992;
Zeng, Bett et al. 2000).
Figure 17 : Etirement d’une cellule fixée à 2 pipettes dont une est mobile (le point blanc indique un point fixe).
D’autres méthodes ont été développées pour étudier l’étirement au niveau d’une cellule isolée
telle la cytométrie magnétique qui consiste à fixer sur la cellules des micro-billes magnétiques
recouvertes par des groupements moléculaires pouvant se lier aux récepteurs à la surface des
cellules ou aux intégrines pour l’étude des effets de la déformation du cytosquelette ou le rôle
de la liaison de la matrice extracellulaire. Cette méthode peut être réalisée sans modification
de la structure complète de la cellule ou sur certains types cellulaires par l’internalisation des
billes dans la cellule. L’application d’un champ magnétique perpendiculaire à celui d’origine
38
entraîne une rotation des billes et donc un étirement uniquement au niveau des molécules liées
au billes. Cette méthode a permis la mise en évidence du rôle des intégrines β1 et de la liaison
de ces intégrines avec le cytosquelette (Tagawa, Wang et al. 1997; Chen, Fabry et al. 2001).
Figure 18 : A : cardiomyocyte sur lequel sont fixées des microbilles magnétiques liées aux intégrines de la cellule, B : Représentation schématique du cytomètre magnétique, C : exemple de d’enregistrement de contrainte avec et sans rotation des billes. (Tagawa, Wang et al. 1997) Enfin, plus récemment, ont été mises au point des méthodes permettant l’étude de la surface
cellulaire et l’application d'une force au niveau de régions localisées de la cellule. La
microscopie de force atomique (AFM) permet l’application de cette force grâce à un stylet en
contact avec la cellule. Cette méthode permet l’étude des caractéristiques cellulaires
indépendamment des molécules impliquées dans des méthodes telle que la rotation des billes
magnétiques (Lieber, Aubry et al. 2004).
Figure 19 : A : Microscope de force atomique, B : représentation chématique de l’AFM (A : contrôle du stylet, B : scanner piezoélectique, C : platine 2D, D : échantillon, E : pointe, F : cantilever, G : laser émis, H : source laser, I : mirroir, J : photodetecteur, K : système de contrôle). C : schéma de l’application d’une force par la pointe.
39
▫ Etirement de cellules en culture
Les études biochimiques de la signalisation cellulaire, de l’expression génique, ou les études
protéomiques nécessitent un grand nombre de cellules. Les cellules sont dissociées et
cultivées sur des supports souples, la déformation de ce support entraine une déformation des
cellules. De nombreux laboratoires utilisent cette méthode de culture sur support déformable
(Sadoshima, Jahn et al. 1992).
Figure 20 : schéma de la culture cellulaire et protocole d’étirement utilisé en 1992 pour les travaux de Sadoshima et. al. (Sadoshima, Jahn et al. 1992) Cette méthode, utilisée au laboratoire est détaillée dans le chapitre suivant.
40
Matériels et méthodes
41
L’étude de la signalisation cellulaire induite par l’étirement a été réalisée au laboratoire sur
des cultures de cardiomyocytes de rats nouveaux nés. Les cellules sont cultivées pendant
plusieurs jours puis traitées et étirées. Ces méthodes sont communes aux différents travaux
qui suivent.
I. Culture de cardiomyocytes de rats nouveaux nés
Principe :
Les cellules de mammifères nouveaux nés ne se divisent que 8 à 10 fois puis adoptent un
comportement hypertrophique. Grâce à ces caractéristiques, ces cellules sont plus faciles à
cultiver que les cellules d’un cœur adulte qui ne se divisent pas et en font un modèle d’étude
de l’hypertrophie des cellules cardiaques reconnu.
L’étude des cellules cardiaques a commencé au début du 20ème siècle avec Carrel et Burrows
qui cultivèrent des morceaux de cœur embryonnaire de poulet, leur permettant d’étudier le
comportement de plusieurs types cellulaires en culture notamment la capacité de prolifération
des fibroblastes. Ils constatèrent également que la prolifération des cardiomyocytes est
limitée. Néanmoins, ils ne séparèrent pas les différents types cellulaires.
L’étude des cardiomyocytes n’a pu vraiment commencer que lorsque ceux-ci ont été isolés
des autres types cellulaires. En 1960 Harrary et Farley (Harary and Farley 1960) ont isolé
pour la première fois des cardiomyocytes de rats nouveaux-nés par digestion enzymatique du
cœur comme l’avait fait Cavanought sur l’embryon de poulet quelques années plus tôt. Ils
purent ainsi étudier par simple observation les différents types cellulaires, ils réussirent à
conserver des cellules battantes pendant plus de 40 jours, ils étudièrent également les réponses
à des stimulateurs ou inhibiteurs chimiques tels que l’acétylcholine et l’ouabaïne.
Néanmoins, l’enrichissement de la culture en cardiomyocytes est nécessaire pour leur étude
car bien que les cardiomyocytes représentent la plus grande partie de la masse du tissu
cardiaque, les cellules musculaires ne représentent que 20 à 30 % du nombre de cellules. 2
méthodes sont utilisées pour purifier les cardiomyocytes : 1) selon la densité des cellules à
l’aide d’un gradient discontinu de percoll ; 2) selon leur capacité à adhérer au substrat.
42
Aujourd’hui, les cultures de cardiomyocytes de rats nouveau nés sont des expériences de
routine. Au laboratoire, nous préparons ces cellules selon de protocole de Iwaki et al 1990 qui
utilise un gradient discontinu de percoll pour séparer les types cellulaires.
Protocole :
Les culture de cardiomyocytes de rats nouveaux-nés sont réalisées selon un protocole adapté
des travaux publiés par Iwaki et. al. (Iwaki, Sukhatme et al. 1990)
Les cœurs sont prélevés sur des rats Wistar fournis par la société Charles Rivers ou par
l’élevage par l’animalerie à raison de 40 à 70 ratons soit 4 à 6 portées par isolement.
Les cœurs sont prélevés le plus rapidement possible et plongés dans une solution ADS1X
froide conservée sur glace. Les oreillettes sont retirées afin de n’isoler que les cardiomyocytes
des ventricules, ces derniers sont coupés en morceaux aussi petits que possible afin
d’augmenter le contact avec la solution enzymatique. Bien que cette préparation ne soit pas
stérile, la suite de l’isolement a lieu sous hotte à flux laminaire pour éviter toute
contamination bactérienne. Ces morceaux sont ensuite incubés 6 minutes dans une solution
enzymatique (ADS1X, collagènase (Roche), pancréatine (Sigma) filtrée à 0.22µm afin
d’éliminer les impuretés de la solution) à 37°C sous 5% CO2 avec une agitation modérée afin
de ne pas dissocier les cellules trop rapidement. Quelques secondes suffisent pour laisser
décanter les cœurs. Le surnageant est récupéré dans un tube contenant 1 ml de sérum de veau
nouveau-né (newborn calf serum : NCS) (Gibco) afin d’inactiver les enzymes et est ensuite
centrifugé à 350g pendant 6 min. Le culot est repris dans 2ml de NCS éliminant ainsi les
enzymes de la solution contenant les cellules. Les morceaux de cœurs restants sont repris dans
20ml de solution enzymatique et incubés 20 min. A nouveau le surnageant est récupéré dans
un tube contenant 1ml de sérum, centrifugé et les cellules sont reprises dans 2ml de sérum.
Ces opérations sont répétées 6 fois, jusqu'à la digestion complète des cœurs. Ces étapes sont
sujettes à modification car plusieurs facteurs peuvent influencer la qualité et la quantité des
cellules isolées comme la vitesse de l’agitation, la qualité des enzymes qui peut varier selon
les lots, l’efficacité des enzymes. En effet, bien que conservées dans la glace, l'efficacité des
enzymes se dégrade en solution. Une 2ème solution enzymatique préparée en cours de culture
peut améliorer le rendement de celle-ci.
Afin de séparer les différents types cellulaires, nous utilisons un gradient de percoll
(Amersham). 2 solutions de densité différente sont préparées, déposées l’une sur l’autre. Les
cardiomyocytes ont une densité intermédiaire tandis que les fibroblastes qui représentent la
43
population majoritaire des cellules du tissu ont une densité inférieure aux 2 solutions de
percoll.
Lors des digestions enzymatiques, on prépare une solution de percoll stock, à partir de
laquelle sont ensuite préparées les 2 solutions de percoll : top percoll et bottom percoll.
Le dépôt des 4ml de top percoll sur les 3ml de bottom percoll doit être effectué le plus
lentement possible lors de la dernière digestion afin d’éviter autant que possible la diffusion
des solutions. Une moyenne de 1 gradient pour 10 cœurs de rat permet d’obtenir le meilleur
rendement.
Les solutions contenant les cellules sont regroupées et centrifugées à 350g pendant 6 min. Le
culot est repris dans 2ml d’ADS 1X par gradient de percoll afin d’éliminer le sérum dont la
densité interférerait avec les gradients de percoll. 2ml d’ADS contenant les cellules sont
déposés très lentement sur chaque gradient. Ils sont ensuite centrifugés 30min à 1500g à
température ambiante.
Après centrifugation, les cellules sont séparées par le gradient de percoll, les cardiomyocytes
se trouvant entre les top et bottom percoll. Une fraction enrichie en fibroblastes se trouve au
dessus du top percoll tandis que les hématies se trouvent au fond du tube. La bande de
cardiomyocytes est récupérée dans 1 ou 2 tubes de 50ml selon le nombre de gradient. Le
percoll résiduel est dilué au maximum afin que sa densité ne gène pas la récupération des
cellules après centrifugation. 2 lavages sont ainsi effectués dans l’ADS1X, les cellules étant
récupérées par centrifugation 6min à 350g. Le culot de cellules est repris dans 20ml de milieu
de culture J0.
Top percoll
Bottom percoll
Cellules, ADS
Cardiomyocytes
Autres cellules (Fibroblastes)
Autres cellules (Hématies)
Centrifugation 1500G, 30 min
Figure M1 : schéma des gradients de percoll
44
Les cellules sont ensuite comptées à l’aide d’un hématimètre de Malassez. On peut prévoir en
moyenne 1,5 million de cellules par cœur de rats nouveau-né.
Les cellules sont ensemencées à raison de 5.105 cellules par ml puis incubées à 37°C et 5%
CO2. Le milieu de culture est changé 24h plus tard. Les cellules sont déprivées en serum après
48h de culture et au moins 24h avant toute stimulation afin d’éviter toute interférence des
facteurs de croissance présents dans les sera.
Si le substrat le permet et si la confluence des cellules atteint les 80% du support, les cellules
battent spontanément et régulièrement dès le 2ème jour de culture.
De précédents travaux réalisés au laboratoire estimaient à 95% la proportion de cellules
battantes. J’ai retrouvé cette proportion en observant en microscopie à fluorescence les
cellules marquées à l’aide d’anticorps dirigé contre l’α-actinine spécifique des
cardiomyocytes ainsi que d’anticorps dirigés contre la vimentine présente principalement dans
les fibroblastes.
ADS 10X solution enzymatique
NaCl 17g ADS1X 60
HEPES 11,9g Collagènase 26mg
NaH2PO4 0,3g Pancréatine 30mg
KCl 1g filtrer 22µm
glucose 2,5g
MgSO4 (anhydre) 0,25g
ajuster pH 7,35
qsp 250 ml
filtrer 0,22µm
Percoll stock Top percoll Bottom percoll
pour 4 gradients pour 4 gradients pour 4 gradients
percoll 18ml percoll stock 8,1 percoll stock 9,1
ADS10X 2ml ADS1X 9,9 ADS1X 4,9
45
fournisseurs Milieu de culture J0 Milieu de culture J1 Milieu de culture J3
DMEM Gibco 68ml 75,4ml 78,15ml
M199 Gibco 17ml 17ml 19,75ml
Horse serum Gibco 10ml 5ml
Newborn calf serum
Gibco 5ml 500µl
Penniciline / Streptomycine
Gibco 2ml 2ml 2ml
Figure M2 : composition des solutions nécessaires à la culture de cardiomyocytes de rats nouveaux-nés
II. Méthode d’étirement cellulaire
L’étirement des cardiomyocytes isolés est réalisé par déformation du support de culture. Les
cardiomyocytes sont ensemencés dans des boites de culture 6 puits à raison de 5.105 cellules
par puit Flexcell de 3 cm de diamètre pour l’étude biochimique et dans des boites 6 puits
Bioflex à raison de 1 million de cellules par puits de 6cm de diamètre. Ces 2 types de boites,
pourvus de fonds formés d’un élastomère déformables, sont préalablement traités au
collagène de type 1. La déformation des membranes se fait par occlusion des puits et injection
d’air à l’aide d’une pompe. L’augmentation de la pression dans les puits entraîne une
déformation de la membrane et donc des cellules qui y ont adhéré. De précédents travaux
réalisés au laboratoire ont montré par une méthode de sonomicrometrie qu’une augmentation
de la pression de 140 à 160mmHg entraîne un étirement de 15% de la membrane (Dassouli,
Sulpice et al. 1993). Cette valeur reste dans des proportions physiologiques et correspond à
l’étirement déjà appliqué par d’autres laboratoires (Sadoshima, Jahn et al. 1992).
Pour chaque expérience, tous les puits d’une même boite subissent le même traitement. 3
puits sont étirés et 3 puits servent de contrôle.
46
Figure M3 : Schéma du système d’étirement cellulaire
La principale critique de cette méthode est l’augmentation de pression dans les puits qui
pourrait entraîner une réponse cellulaire. En utilisant des boites identiques mais possédant un
fond non déformable mais également traité au collagène de type 1, j’ai pu vérifier que
l’augmentation de pression jusqu'à 250mmHg n’entraînait pas de signalisation cellulaire en
utilisant la phosphorylation de la MAPK ERK qui est l’un des témoins de la signalisation de
l’hypertrophie cardiaque qui nous intéresse.
Pour les études biochimiques, les cellules des boites Flexcell sont lavées dans 1ml de PBS1X
froid puis les cellules sont lysées dans 100µl de tampon de lyse.
Pour les expériences d’immunomarquage, les cellules sont directement incubées dans la
solution de fixation.
Puits étirés
Puits contrôles
Puits étirés
Puits contrôles
ManomètreManomètre
47
III. Transfection, infection et traitements chimiques des cellules
A. Transfection
Les séquences codantes pour les protéines mutées constitutivement actives ou les protéines
mutées inactives sont insérées dans des vecteurs pcDNA3. Les vecteurs sont extraits de
cultures bactériennes : les bactéries compétentes sont transformées par choc thermique, 50µl
de bactéries incubées avec 2µl de plasmides sont chauffées à 42°C pendant 35 secondes puis
placées dans la glace pendant 2 min. Les bactéries sont incubées pendant 1h à 37°C puis,
après centrifugation, les bactéries dans 100µl de milieu sont étalées sur une boite de Petri
contenant 14ml de milieu LB-agarose et l’antibiotique auquel sont résistantes les bactéries
transformées. Les cultures sont incubées sur la nuit à 37°, à l’envers. Une colonie de bactéries
est prélevées à l’aide d’un cône et incubée 8h dans 4ml de LB/antibiotique. La culture est
transférée dans 200 ml de LB et incubée sur la nuit. Les cultures sont centrifugées à 3000rpm
pendant 15’ à 4°.
Les plasmides produits par les bactéries sont récupérés selon le protocole de Maxiprep
(Quiagen) qui repose sur la lyse des bactéries et le passage sur des colonnes qui permettent
une élution des plasmides.
La concentration des plasmides est déterminée par la densité optique à 280nm.
Les cellules sont transfectées en présence de lipofectamine 2000. 2µg d’ADN ont été utilisés
pour la transfection de 1 million de cellules. L’ADN et 8µg de lipofectamine sont incubés
séparément dans 100µl de milieu Optimem (Gibco) pendant 4 min. Les 2 milieux sont réunis
et incubés 20min. Le milieu des cellules est changé par 1ml de milieu Optimem contenant
l’ADN et la lipofectamine. La culture est ainsi incubée 4h puis le milieu est remplacé par un
milieu sans sérum. L’étirement des cellules à lieu 24h après la transfection.
B. Infection
Les virus sont utilisés a raison de 10 à 500 MOI (multiple of infection). La concentration de
chaque virus est déterminée empiriquement. Une concentration de 100MOI à été utilisé pour
les virus codant pour les protéines RapGAP et RapQ63E.
48
IV. Quantification de la concentration protéique
Afin d’effectuer les expériences sur des quantités normalisées de protéines, les concentrations
protéiques de chaque échantillon sont mesurées par la méthode BCA. Cette méthode,
similaire à la réaction de Buiret, est basée sur l’interaction de 2 molécules d’acide
bicinchoninique (BCA) avec l’ion Cu2+ (smith 1985). Dans un premier temps, les protéines
réagissent avec l’ion Cu2+ pour former des ions Cu+ qui, dans un second temps, réagissent
avec 2 molécules de BCA pour former un composé qui colore la solution en violet de façon
proportionnelle à la quantité de protéines dans l’échantillon dosé. Une gamme étalon est
réalisée à partir d’une solution mère d’albumine de sérum bovin (BSA).
Protocole : sur plaque 96 puits, une solution de 97µl d’eau, 3µl de lysat cellulaire, 100 µl de
solution BCA (2%solution cuivre, 98% BCA) est disposée dans chaque puit. La plaque est
incubée 20min à 60°C puis la densité optique est lue à 562nm à l’aide d’un spectrophotomètre
(Biorad). Les valeurs de densité optique sont rapportées à la droite étalon afin de connaître la
concentration protéique des lysats cellulaires.
Figure M4 : réaction chimique du dosage BCA
Pour un lysat de culture de cardiomyocytes de rats nouveaux-nés, une concentration de 1µg/µl
est attendue et permet de réaliser la plupart des expériences.
Cette méthode est préférée à la méthode de bradford car elle a pour avantage de ne pas
interférer avec des solutions pouvant contenir des détergents, or nos tampons de lyse
contiennent du SDS, du triton X100 et de l’Igépal NP40 pouvant saturer la réaction
permettant le dosage selon la méthode de Bradford.
49
V. Immunoprécipitation
1) Principe :
Cette méthode a été mise au point initialement pour enrichir les solutions protéiques en
protéines d'intérêt, cependant, elle permet aussi de mettre en évidence des complexes
comprenant au moins 2 protéines recherchées. Dans un premier temps, l’une des protéines du
complexe est précipitée à l’aide d’un anticorps spécifique couplé à des billes d’agarose. Dans
un second temps, les partenaires protéiques de cette protéine peuvent être détectés par
Western blot.
2) Protocoles :
Après traitement et stimulation, les cellules sont lavées dans 1ml de PBS (9.1mM dibasic
sodium phosphate, 1.7mM monobasic sodium phosphate, 150mM NaCl, pH 7.4) par puit puis
lysées dans 100µl de tampon de lyse RIPA ((9.1mM dibasic sodium phosphate, 1.7mM
monobasic sodium phosphate, 150mM NaCl, pH 7.4, 1% Igepal CA-630, 0.5% sodium
déoxycholate, 0.1% sodium dodecylsulfate, 0.5mM PMSF, 10µg/ml Aprotinine, 1mM
Na3VO4). Les lysats cellulaires sont disposés sur une roue à 4° afin d’améliorer la lyse. Les
échantillons sont centrifugés pendant 10min à 10 000g pour éliminer les débris cellulaires et
l’ADN qui interfèreraient avec la spécificité du signal.
Les lysats cellulaires sont dosés par la méthode du BCA. 20µg de protéines sont prélevés puis
la quantité maximale et égale pour chaque échantillon est utilisée pour l’immunoprécipitation.
50 µl de billes d’agarose pour chaque échantillon et 100µl pour les 2 contrôles sont lavés 3
fois dans 1ml de PBS et centrifugés 1min à 800g entre chaque lavage.
Les lysats cellulaires sont prélavés avec 20µl de billes nues afin de précipiter les protéines
pouvant se lier non spécifiquement aux billes d’agarose. Les lysats sont centrifugés 1min à
800g pour éliminer les billes.
Les surnageants sont incubés avec les anticorps spécifiques de la protéine à précipiter qui se
fixent à cette dernière. Un lysat cellulaire qui sert de contrôle est incubé sans anticorps afin de
détecter le signal non spécifique et un volume de tampon de lyse équivalent aux échantillons
est incubé avec les anticorps pour déterminer le signal dû aux anticorps. 0.5 à 10 µg
d’anticorps pour chaque échantillon peuvent être nécessaires. Les échantillons sont incubés
1h30 ou sur la nuit selon la spécificité et l’efficacité des anticorps.
50
Les complexes protéiques couplés aux anticorps sont précipités en ajoutant aux lysats
cellulaires des billes d’agarose couplées à des protéines G qui reconnaissent et se lient au
anticorps présents dans le lysat. Le complexe protéine – anticorps – bille est récupéré par
centrifugation et lavé 3 fois comme précédemment. Les billes sont asséchées et reprises dans
25µl de tampon Laemmli puis les échantillons sont chauffés 5min à 95° afin de dénaturer les
protéines. Les échantillons sont centrifugés 6min à 1500g pour précipiter les billes, les
surnageants contenant les protéines dénaturées sont récupérés et déposés sur un gel
d’électrophorèse (décrit dans le chapitre Western blot)
Plusieurs Western blot sont réalisés simultanément en divisant la membrane selon le poids
moléculaire ou consécutivement après déshybridation. Les protéines susceptibles de former
des complexes seront détectées à l’aide d’anticorps spécifiques ainsi que la protéine précipitée
afin de contrôler la présence et l’égalité de la quantité de cette protéine dans tous les
échantillons.
La mise au point de cette expérience est nécessaire car la qualité et le rendement de
l’immunoprécipitation sont souvent des facteurs limitants de cette méthode. Afin de
déterminer la quantité d’anticorps permettant la meilleure précipitation et la meilleure
révélation, une expérience préliminaire avec plusieurs quantités d'anticorps est réalisée. Une
quantité insuffisante d’anticorps ne permet pas de précipiter suffisamment de protéines pour
les détecter ou détecter ses partenaires et une quantité trop importante d’anticorps peut couvrir
la détection des protéines recherchées. Si la reconnaissance de l’anticorps avec les protéines G
ou si la stabilité du complexe immunoprécipité n’est pas suffisante, le rendement de
l’immunoprécipitation peut être diminué. Ce rendement peut être amélioré en utilisant des
anticorps directement couplés aux billes d’agarose et permet d’éviter plusieurs étapes
susceptibles d’entraîner une perte du signal.
Le défaut majeur de cette méthode se situe au niveau de la révélation du Western blot. Les
anticorps les plus couramment utilisés détectent les chaînes lourdes et les chaînes légères
d’une espèce donnée. Ils reconnaissent donc les anticorps utilisés pour la révélation du
Western blot mais également les chaînes lourdes et les chaînes légères des anticorps utilisés
pour l’immunoprécipitation. Par conséquent, même pour l’immunoprécipitation et la détection
d’une même protéine, il est préférable d’utiliser des anticorps provenant de 2 espèces
distinctes. Même dans ces conditions, il arrive que les chaînes lourdes et légères appariassent
lors de la révélation du Western blot masquant la présence d’une protéine de même poids
moléculaire que ces chaînes. Des solutions commerciales existent telles que des anticorps
secondaires spécifiques des chaînes légères pour révéler une protéine de 50kDa environ.
51
Inversement, des anticorps spécifiques des chaînes lourdes sont utilisés pour révéler les
protéines de 30kDa environ. Enfin, les chaînes des anticorps et les billes peuvent être liées
covalamment à l’aide d’un « cross-linker » tel que le DMP (Dimethyl pimelimidate) et donc
ne pas être séparées lors du chauffage des échantillons à 95°.
VI. Précipitation par affinité
L’activation des petites protéines G est mesurée par précipitation par affinité. La forme
active de la petite protéine G, donc couplée à un GTP, est précipitée à l’aide d’un peptide
homologue au site de liaison des petites protéines G avec leurs effecteurs : Raf1RBD (Ras
binding domain de Raf1) pour la précipitation de Ras et RalGDS (Ral guanine nucleotide
dissociation stimulator) pour la précipitation de Rap. Ces peptides sont couplés à un
groupement GST permettant de les lier à des billes de sepharose afin de les faire précipiter.
1) Production de protéines recombinantes
Les protéines de fusion GST-RalGDS et GST-Raf1RBD sont produites à partir de
cultures de bactéries transformées. Les bactéries sont décongelées, une partie du lot est
prélevée et le reste est immédiatement recongelé à -80°C. Les bactéries décongelées sont
cultivées dans 11ml de milieu LB stérilisé à l’autoclave et chauffé à 37° auquel a été ajouté
100µg/ml d’ampicilline afin de sélectionner et de ne cultiver que les bactéries transformées
possédant le gène de résistance à l’ampicilline et celui de la protéine recombinante. Les
bactéries sont cultivées sur la nuit à 37° sous agitation.
10ml de la culture sont dilués au 1/10e et incubés 1h à 37°. 1ml est ajouté à 1ml de
solution de stockage (65% glycérol, 0.1M MgSO4, 25mM tris pH8.0) et congelé à -80°C.
1mM IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) est ajouté au 100ml de culture
bactérienne. L’IPTG inhibe le répresseur du promoteur de la β-galactosidase qui précède le
gène de la protéine recombinante. Il faut laisser incuber pendant 4h minimum à 37°.
Dans la glace, il faut ensuite récupérer la culture, centrifuger le milieu et les bactéries à
3000 g 15min à 4°C, éliminer le surnageant pour ne garder que les bactéries. Les bactéries
sont lysées dans 6ml de tampon de lyse (20% sucrose, 10% glycerol, 50mM tris pH 8.0, 0.2M
Na2S2O3, 2mM MgCL2, 2mM DTT (Dithiothreitol), 1mM PMSF (Phenylmethanesulfonyl
fluoride), 10µgml de leupeptine, 10µg/ml d’aprotinine) pour 100ml de culture. Le culot est
52
resuspendu plusieurs fois avec une micropipette de 5ml afin d’améliorer la lyse. Les bactéries
sont lysées par ultrasons à l’aide d’un sonificateur pendant 1minute comprenant plusieurs
cycles de 10s de lyse et 10s de repos afin de ne pas faire chauffer les lysats. Les lysats sont
centrifugeés à 15000g pendant 20min à 4°. Le surnageant est divisé en aliquots et congelé à -
80°.
Afin de vérifier l’expression de la protéine d’intérêt par les bactéries, une
électrophorèse est réalisée : un gel d’acrylamide 12% est coulé, une gamme de BSA ainsi que
10 à 40µg de lysat bactérien sont déposés dans les puits du gel. Le système est mis sous
tension 200V, 500mA pendant 1h puis le gel est coloré au bleu de coomasie : il est incubé
dans une solution colorante (65% eau, 30% methanol, 5% acide acétique, 0.025% bleu de
coomasie) pendant 2h puis décoloré dans une solution décolorante (65% eau, 30% methanol,
5% acide acétique) jusqu'à ce que les bandes apparaissent.
Si la production de protéines de fusion est trop faible ou absente et que les différentes
étapes de l’expérience ont été vérifiées, une resélection d’un clone bactérien sur boite de Pétri
contenant l’antibiotique de sélection permet l’isolement et la multiplication d’un clone
efficace.
2) Pull down assay
Les cellules sont stimulées puis lavées dans le PBS froid et enfin grattées dans un
tampon de lyse (0.5% DOC (sodium déoxycholate), 0.1% SDS (sodium dodecylsulfate),
50mM tris pH 7.5, 500mM NaCl, 20mM MgCl2, 1% triton X100, 1mM PMSF, 10µg/ml
leupeptine, 10µg/ml aprotinine). Les lysats sont placés sur une roue 30min à 4° afin
d’améliorer la lyse puis les échantillons sont centrifugés 10min à 10 000g à 4° pour éliminer
les débris cellulaires et l’ADN. La quantité de protéines dans les surnageants est mesurée par
colorimétrie par la méthode de BCA (bicinchoninic acide).
20µg de lysat total de chaque échantillon sont conservés afin de réaliser un Western
Blot de la forme totale de la petite protéine G recherchée. La quantité maximale de protéines
est utilisée pour la précipitation par affinité (environ 250 à 500µg par échantillon).
La solution mère de billes gluthatione-sépharose est homogénéisée. A l’aide de cônes
de micropipette étêtés, 30µl de billes par échantillons sont prélevés et 60µl sont également
prélevés pour les contrôles de l’expérience. Les billes sont centrigugées à 5000g pendant
1min à 4° afin d’éliminer le tampon de concervation puis elles sont lavées 3 fois dan 1ml de
tampon de lavage (50mM tris pH 7.5, 150mM NaCl, 20mM MgCl2, 1% triton X100, 0.1mM
53
PMSF, 10µg/ml leupeptine, 10µg/ml aprotinine) et centrigées 1min à 5000g à 4°C entre
chaque lavage. 30µl de billes sont prélevés pour l’échantillon incubé avec les billes nues dans
le but de connaître la part de liaisons non spécifiques des protéines aux billes.
1.5ml de lysat bactérien contenant la protéine de fusion est ajouté aux billes. Les
groupements GST se lient aux groupements gluthatione des billes de sépharose. Les billes
sont incubées 2h sur une roue à 4°C.
Les billes couplées aux protéines sont lavées 3 fois dans 1.5ml de tampon de lavage et
centrifugées à 5000g pendant 1min à 4° entre chaque lavage. Les billes sont reprises dans
30µl de tampon de lavage par échantillon. La solution est homogénéisée régulièrement afin de
répartir équitablement les billes dans les échantillons. 30µl de billes sont ajoutés à chaque
échantillon et dans un volume équivalent de tampon de lyse afin de déterminer le signal qui
ne sera dû qu’aux billes, indépendamment des échantillons cellulaires.
Les échantillons sont incubés avec les billes pendant 1h sur la roue à 4° puis ils sont
centrifugés. Les surnageants peuvent être conservés à -80° mais devront être dosés à nouveau.
Les complexes billes-protéines de fusion-petite protéine G activée sont lavés 3 fois dans 1ml
de tampon de lavage et centrifugés à 5000g pendant 1min à 4° entre chaque lavage. Les
complexes sont assèchés après la dernière centrifugation et repris dans 25 µl de tampon de
charge laemmli.
Les échantillons sont chauffés à 95°C pendant 5min pour dénaturer les protéines et
donc dissocier les protéines associées aux billes. Les surnageants peuvent être congelés à-
80°C.
Les échantillons de lysats totaux et ceux issus de la précipitation sont déposés sur des
gels d’électrophorèse à 12,5% d’acrylamide et un Western blot des petites protéines G est
réalisé.
VII. Western blot
1) Principe
Le Western Blot permet séparer par électrophorèse à partir d’un échantillon protéique
total une protéine d’intérêt et de révéler sa présence et sa quantité à l’aide d’anticorps qui lui
sont spécifiques.
54
2) L’électrophorèse
Dans un premier temps, l’extrait protéique est déposé sur un gel d’acrylamide et
soumis à un courant électrique. Les protéines dénaturées par la présence de SDS dans le
tampon de charge (Tris 2M, SDS4%, β-Mercapto-ethanol 10%, glycerol 20%, bleu de
bromophénol 0.75%) et dans le gel sont chargées négativement et migrent d’autant plus
rapidement qu’elles sont courtes et par conséquent de faible poids moléculaire. Cette
migration permet de séparer les différentes protéines de l’extrait selon leur poids moléculaire.
Le dispositif de migration (mini protean 3 de Biorad) est monté et testé avec de l'eau puis le
gel de migration (tableau 1) est coulé entre 2 plaques de verre et couvert d'eau pour éviter
tout dessèchement durant la polymérisation. Lorsque les gels de migration sont polymérisés,
les gels de concentration (tableau 2) sont coulés. La disposition d’un peigne permet de former
des puits dans le gel de concentration lors de sa polymérisation. Quand les gels sont
entièrement polymérisés, ils sont montés sur le système de migration (BIORAD) et celui ci est
placé dans une cuve contenant le tampon de migation (Tris (0.25M), HCl fumant (pH 8.3),
glycine, SDS 1%, H2O) permettant le passage du courant. La migration ne doit pas être trop
rapide afin d’avoir la meilleur résolution lors de la révélation du Western blot.
Tableau 1 : Composition des gels de migration
Tableau 2 : Composition du gel de concentration
Gel de migration 10% d'acrylamide Gel de migration 12% d'acrylamide
- H2O : 4.9ml - lower gel buffer (tris (18.15g), HCl fumant (pH 8.8), SDS (0.4g), H2O qsp 100ml) : 2.5ml - Acrylamide 40% : 2.5ml - APS 10% : 120µl - Temed : 7.8µl
- H2O : 4.3ml - lower gel buffer (tris (18.15g), HCl fumant (pH 8.8), SDS (0.4g), H2O qsp 100ml) : 2.5ml - Acrylamide 40% : 3ml - APS 10% : 120µl - Temed : 7.8µl
Gel de concentration
- H2O : 3.1ml - Upper gel buffer (tris (6.05g), HCl fumant (pH 6.8), SDS (0.4g), H2O qsp 100ml) : 1.25ml
- Acrylamide 40% : 565µl - APS 10% : 50µl -Temed : 5µl
55
Figure M6 : Schéma de la migration des protéines
Le marquage des protéines par les anticorps ne peut se faire sur le gel. Les protéines
sont donc transférées sur une membrane de PVDF (polyvinyl difluoride). Les protéines
peuvent également être transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est plus résistante
et plus facile à colorer. Néanmoins, l’utilisation de membranes de PVDF permet de réduire les
signaux non spécifiques et permet également une meilleure conservation des membranes dans
le temps à 4°C ou -20°C
3) Le Transfert
Plusieurs systèmes de transfert existent tels que les système semi-secs ou de transfert
en milieu liquide. Le second est préféré au premier car bien que moins rapide, il présente un
meilleur transfert des protéines de haut poids moléculaire. Cependant de nouveaux produits
arrivent sur le marché et permettent un transfert en moins de 10min. L’utilisation des ces
systèmes nécessite d’être améliorée car les tests préliminaires ne montrent un transfert que de
50% environ des protéines contenues dans le gel.
Le gel et la membrane sont mis en contact et l’application d’un courant
perpendiculairement au gel permet le passage des protéines toujours chargées sur la
membrane. Le système de transfert est plongé dans une cuve contenant le tampon de transfert
(glycine (14.4g), Tris (3.03g) méthanol (200µl), H2O (qsp 1L) pH 8.3) permettant le passage
56
du courant. Le transfert peut etre effectué en voltage constant à 35V sur la nuit à 4°C ou à
120V en 2h à 4°C.
glace
+-
sens du transfert
éponges
papiers absorbants
gel d’acrylamide
membrane PVDF
anode
tampon de transfert
cathode
cuve
système de maintien
glace
+-
sens du transfert
éponges
papiers absorbants
gel d’acrylamide
membrane PVDF
anode
tampon de transfert
cathode
cuve
système de maintien
éponges
papiers absorbants
gel d’acrylamide
membrane PVDF
anode
tampon de transfert
cathode
cuve
système de maintien
Figure M7 : Schéma du transfert des protéines
4) Coloration des membranes au rouge Ponceau
Afin de vérifier que les protéines ont été transferées correctement sur la membrane et
que la quantité de protéines déposées est bien identique pour tous les échantillons, toutes les
membranes sont colorées dans une solution de rouge Ponceau (rouge Ponceau 0.2%, acide
trichloroacétique 3%) pendant 5min, colorant ainsi les protéines de façon non spécifique. Le
surplus de coloration est lavé à l’eau déminéralisée. Contrairement à la coloration au bleu de
Coomasie, cette coloration est réversible par 2 lavages de 5min dans une solution de Tween /
Tris buffer saline (TTBS) (Tris (2.4g=20nM), NaCl (8g=0.137nM), Tween 20 (0.1%), H2O
(qsp 1L) pH 7.6). Si un bruit de fond persiste au moment de la révélation, le lavage des
membranes au TBS 0,3 ou 0,5% de tween peut améliorer le signal.
57
5) Détection
Les membranes décolorées sont incubées dans une solution de TTBS contenant 5% de
lait afin de saturer les sites non spécifiques de la membrane avec les protéines du lait telle que
la caséine. Cette saturation permet de couvrir les sites qui fixeraient les anticorps
indépendamment de la reconnaissance de protéines spécifiques.
Les membranes sont incubées dans une solution TTBS 2% lait contenant un anticorps
spécifique de la protéine recherchée. La concentration de cet anticorps peut être adaptée en
fonction des résultats obtenus. La dilution de l’anticorps améliore le bruit de fond mais risque
de diminuer le signal, l’augmentation de la concentration peut améliorer le signal mais peut
aussi augmenter le bruit de fond. Une expérience de mise au point est préférable pour tester
tout nouvel anticorps. 5 lavages de 5min sont nécessaires pour laver tout excès d’anticorps
primaire.
Les membranes sont ensuite incubées dans une solution contenant un anticorps
reconnaissant l’anticorps primaire. A nouveau, 5 lavages de 5min sont nécessaires pour
éliminer l’excès d’anticorps secondaire. Si un bruit de fond persiste, le nombre et la durée des
lavages peuvent être augmentés. L’anticorps secondaire est couplé à un groupement HRP
(Horse Raddish Peroxidase) qui réagit avec le réactif de révélation ECL (enhanced
chemioluminescence). Cette réaction émet une luminescence qui peut être visualisée à l’aide
d’un film autoradiographique (Amerscham) ou par l’intermédiaire d’une caméra (système
Chemidoc de BIORAD). (Figure M8).
58
Figure M8 : Schéma de la révélation du Western Blot
6) Deuxième détection
Si un autre marquage des membranes est nécessaire avec des anticorps différents de ceux
utilisés pour le précédent western blot, les membranes de PVDF blot peuvent être
déshybridées. Les membranes sont lavées plusieurs fois dans le TTBS et incubées dans une
solution de lavage (Tris SDS b mercapto-ethanol) pendant 30 min à 50°C. Les membranes
sont lavées plusieurs fois dans l’eau et dans le TTBS afin d’éliminer la solution de lavage qui
interfèrerait avec le marquage de la membrane. Les membranes sont ensuite saturées et
marquées selon le même protocole que lors du premier Western blot. Généralement, le second
marquage est moins efficace que le premier et donc il sera effectué avec les anticorps les plus
efficaces. Cependant, certains signaux sont difficiles à détecter lors du second Western blot
car les protéines peuvent être altérées ou perdues lors des différents traitements. Si les poids
moléculaires des protéines recherchées sont suffisamment différents, la diminution de la durée
peracide
enzyme forme oxidée+
luminol+
activateur
lumière
produit oxydé
Film ou
caméraProtéine X
Membrane PVDF
Protéine XAnticorps
primaire
Anticorps
secondaire
couplé HRP
peracide
enzyme forme oxidée+
luminol+
activateur
lumière
produit oxydé
Film ou
caméraProtéine X
Membrane PVDF
Protéine XAnticorps
primaire
Anticorps
secondaire
couplé HRP
59
d’incubation de la membrane dans la solution de lavage et la diminution de la concentration
de β mercapto-ethanol peuvent améliorer le signal.
7) Quantification des résultats et analyse statistique
Les résultats obtenus par Western blot et développés sur films autoradiographiques sont
numérisés puis quantifiés par densitométrie à l’aide du logiciel NIH image 1.34. L’intensité et
la taille de chaque bande sont mesurées. La valeur 100% est attribuée aux conditions contrôles
non traitées et non stimulées qui servent de références. Les résultats représentent la moyenne
± l’erreur standard. L’analyse statistique est réalisée à l’aide d’un test t de Student non pairé.
La différence entre 2 groupes est considérée comme étant significative si la valeur de p est
inférieure à 0,05.
VIII. Immunomarquage
1. Préparation des cellules
Pour les expériences d’immunomarquage, la qualité de la culture et de la préparation
cellulaires sont particulièrement importantes. De nombreuses mises au point sont nécessaires
et doivent parfois être renouvelées lorsque les paramètres de l’expérience changent. Les
cardiomyocytes sont ensemencés dans des boites 6 puits Bioflex (BF-3001C) à fond déformable
en silicone couvert par du collagène de type I (Dunn laboratories). Ces boites possèdent un
fond qui permet l’observation des cellules en microscopie inversée et qui laisse passer la
lumière, y compris celle des lasers. Cette membrane est prévue pour n’émettre qu’une très
faible autofluorescence et présente une neutralité immunohistochimique afin de réduire au
maximum les marquages non spécifiques qui pourraient interférer avec l’observation des
cellules.
Les membranes sont préalablement couvertes de collagène I afin d’améliorer la fixation des
cellules sur le substrat. Néanmoins, certains lots de boites ne sont pas traités uniformément.
L’incubation des membranes pendant 4h avec une solution de PBS 0,1% gélatine peut
améliorer les conditions de culture et la fixation des cellules. 750 000 sont ensemencées dans
chaque puit de 10cm² afin que les cellules de se superposent pas et qu’elles ne soient pas
confluentes afin d’avoir des images de cellules isolées. Les conditions de culture de
cardiomyocytes de rats nouveaux nés doivent être reproductibles car la physiologie de ces
cellules change rapidement pendant la culture. Les cellules doivent donc être fixées au même
stade lors de toutes les cultures. Le milieu de culture est changé 24h après la dissociation et
60
les cellules sont déprivées 24 h avant la fixation. Le marquage de cellules adultes ne nécessite
pas de longues cultures après l’isolement car les cellules ont déjà acquis un phénotype stable.
Le marquage peut être fait après la déprivation des cellules.
2. Fixation des cellules
Les cardiomyocytes de rats nouveaux-nés cultivés sur les membranes déformables sont étirés
15 min en augmentant la pression dans les puits à 80mmHg. La méthode de fixation au
paraformaldehyde (PFA) est préférée à celle de fixation par le méthanol qui déshydrate les
cellules, donnant de bons résultats de colocalisation mais pouvant modifier les structures de la
cellule. Après étirement, le milieu est rapidement jeté et remplacé par une solution froide de
PBS contenant 4% de PFA qui fixe les cellules. Le PFA crée des liaisons covalentes entre les
protéines, permettant la conservation des localisations tout en conservant les différentes
structures des cellules. Les cellules sont incubées 5 min dans la solution PBS4%PFA à
température ambiante sous une pression de 80mmHg. La fixation par le PFA ne perméabilise
pas les cellules. Néanmoins, il se peut que cette fixation entraîne une dégradation des
structures et des membranes. Ces problèmes peuvent être résolus par la diminution de la
concentration en PFA jusqu’à 0,5% et l’augmentation de la durée de la fixation. Les cellules
sont placées sur la glace ensuite lavées 2 fois 5min dans une solution froide d’inactivation du
PFA (PBS, NH4Cl 0,5M, pH7,4) puis elles sont lavées 2 fois 5 min dans du PBS froid.
Les cellules doivent être perméabilisées pour permettre l’accès des structures intracellulaires
aux anticorps. Les cellules sont incubées dans une solution de PBS 1% TritonX100 pendant 5
min. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois au PBS froid.
3. Marquage
L’immunomarquage utilise le même principe que le Western blot : les sites non spécifiques
du support et des cellules sont saturés par une protéine. Les protéines cibles sont marquées par
un premier anticorps qui leur est spécifique puis cet anticorps est reconnu par un anticorps
secondaire couplé à un fluorochrome.
La première étape de saturation des sites non spécifiques est réalisée en incubant les cellules
dans une solution de PBS contenant 5% de bovin serum albumine (BSA) purifiée sans
immunoglobuline et sans protéase (Jackson laboratories) afin de limiter au maximum tout le
signal aspécifique.
Les cellules sont ensuite incubées dans une solution de PBS contenant 1% de BSA et
l’anticorps primaire spécifique de la protéine recherchée. Les anticorps monoclonaux comme
61
les polyclonaux peuvent être utilisés lors de l’immunomarquage. Néanmoins, les anticorps
polyclonaux, issus de plusieurs clones donc reconnaissant plusieurs épitopes, sont, bien que
moins précis, plus sensibles. Les anticorps monoclonaux sont moins efficaces mais plus précis
et génèrent moins de bruit de fond. De plus, les expériences avec différents lots d’anticorps
monoclonaux sont plus reproductibles car les anticorps sont issus d’une seule souche
cellulaire contrairement aux anticorps polyclonaux issus d’un ensemble de souches
difficilement reproductible. Les cellules sont incubées dans la solution contenant les anticorps
primaires à température ambiante pendant 1h30. Certains marquages peuvent être améliorés
par une incubation à 4°C pendant la nuit. Les cellules sont lavées 2 fois dans une solution de
PBS pendant 10min afin d’éliminer l’excès d’anticorps primaire.
Les cellules sont ensuite incubées dans une solution de PBS contenant 1% de BSA et
l’anticorps secondaire. Il est possible d’utiliser des anticorps primaires directement couplés à
un fluorochrome. Cependant, l’utilisation d’anticorps secondaire permet d’amplifier le signal
et permet de faire varier les fluorochomes pour un même anticorps secondaire.
Les anticorps secondaires sont couplés à des fluorochromes tels que la rhodamine ou la
fluorescéine. De nouvelles molécules existent dont les plus connues aujourd’hui sont fournies
par la société Alexa Fluor (invitrogen) qui produit des anticorps couplés à des fluorochromes
avec de meilleures performance : une fluorescence plus élevée, une meilleure photostabilité,
un insensibilité au pH et une meilleure conservation dans le temps en solution ou sur les
préparations. 2 facteurs sont primordiaux pour le choix des anticorps primaires lors de
marquages multiples : les spectres d’absorption et d’émission de chaque anticorps. Afin de ne
pas avoir de signaux croisés, les spectres d’émission et d’absorption des anticorps doivent être
suffisamment éloignés pour ne pas se chevaucher. Dans le cas contraire, les signaux de
chaque anticorps seront identiques. Les incubations avec les anticorps secondaires sont
réalisées à l’obscurité et à température ambiante pendant 1h. Les cellules sont lavées 3 fois 10
min.
Lors des doubles marquages, les incubations des anticorps sont réalisées consécutivement.
Dans un premiers temps, les cellules sont incubées dans les solutions contenant les anticorps
primaires successivement en commençant par le plus stable. Dans un second temps, les
cellules sont incubées dans les solutions contenant les anticorps secondaires successivement
en commençant par le plus stable ou le marquage le plus fort.
62
anticorps primaires
protéines concentration espèce
PKC 1/100 lapin
14-3-3b 1/100 lapn
14-3-3z 1/500 souris
tubuline 1/100 souris
GM130
anticorps secondaires
anticorps espèces absorbtion emission concentration
rabbit goat 1/300
rabbit 1/300
mouse 1/300
mouse 1/300
goat
4. Montage des lames.
Les membranes en silicone laissent passer la lumière mais sont trop épaisses pour
l’observation au microscope confocal. Après les lavages, les membranes sont découpées puis
déposées sur une lame en verre. Les cellules sont couvertes par 100µl de milieu de montage
Vectashield (vector) puis une lamelle est déposée sur les cellules. L’observation des cellules
sur le microscope inversé confocal s’effectue à travers la lamelle après avoir retourné le
montage.
L’espace entre la lame et la lamelle est comblé par du vernis rendant le montage hermétique.
Les lames peuvent être conservées plusieurs semaines à 4° dans l’obscurité.
Figure M9 : schéma de montage des membranes en silicone pour observation microscopique
membrane
vernis
lamelle
lame
membrane
vernis
lamelle
lame
63
5. Observation des cellules et acquisition des images
L’observation des préparations cellulaires a été effectuée à la plateforme imagerie de
l’IFR141 sur un microscope confocal LSM 510 ZEISS + composé d’un microscope inversé
(Axiovert 100 M) avec platine motorisée xy avec trois canaux de détection de la fluorescence
dont un détecteur META (8 canaux) et équipé de 3 lasers : un Argon multiraies (458 / 488 /
514 nm) 30 mW, un Hélium-Néon 543 nm de 1mW, un Hélium-Néon 633 nm de 5 mW. Le
microscope est équipé de plusieurs objectifs : Plan-Néofluar10X / 0.30 Sec, Ouverture
Numérique : 0.30 ; Plan-Apochromat 20X / 0.75 Sec, Ouverture Numérique : 0.75 ; C-
Apochromat 40X / 1.20 Eau, Ouverture Numérique : 1.20 ; Plan-Apochromat 63X / 1. 40
Huile, Ouverture Numérique : 1.40. Les objectifs 20X, 40X et 63X sont équipés d’un système
de contraste interférentiel différentiel (DIC) ou Nomarski. Le signal est enregistré et analysé à
l’aide des logiciels LSM 510 version 3.2 et LSM Image Browser version 4.
Figure M10 : Obstervation microscopique d'un double marquage
495nm
519nm
590nm
617nm
64
Partie I
Rôles des récepteurs tyrosine kinases et des petites protéines G
lors de l’étirement des cardiomyocytes.
65
L'étirement du muscle cardiaque entraîne de nombreux mécanismes décrits dans
l’introduction. Dans la première étude présentée ici, nous nous sommes intéressés aux voies
d'activation des MAPK avec en particulier l'étude du rôle éventuel de la petite protéine G Ras
ainsi qu'au rôle du récepteur de l'EGF et à celui de la voie de la PI3 kinase. Avant d'exposer
les buts spécifiques de l'étude, nous décrirons plus en détail les protéines de la superfamille
Ras et l'EGFR.
I. Les petites protéines G
A. Structure et fonction
Les petites protéines G sont des GTPase qui forment une superfamille comptant plus de 150
membres de 20 à 40kDa répartis en 5 sous-groupes (figure I.1) selon leur séquence et leurs
similitudes fonctionnelles.
Toutes les petites protéines G fonctionnent selon le même principe semblable à celui des
sous-unités α des protéines G hétérotrimériques. Elles peuvent former un complexe avec les
nucléotides à base guanine. Elles fixent le GTP (guanine tri phosphate) et peuvent
l’hydrolyser en GDP (guanine di phosphate) mais leur activité hydrolytique est faible. Elles
peuvent donc former des complexes stables avec l’un ou l’autre des nucléotides. La fixation
des nucléotides détermine leur état actif ou inactif car elle entraîne un changement de
conformation de la protéine au niveau de son domaine catalytique (Vetter and Wittinghofer
2001). Les différentes petites protéines G peuvent avoir des séquences de modification post-
traductionnelles différentes. Ces modifications telles les palmitoylations, farnésylations,
methylations, géranylgéranylations permettent de moduler la localisation des différentes
petites protéines G, leur permettant de moduler les réponses cellulaires en fonction des
protéines ou des récepteurs membranaires avec lesquelles elles peuvent interagir. Les petites
protéines G interviennent dans de nombreuses fonctions cellulaires (Konstantinopoulos,
Karamouzis et al. 2007) (figure I.1).
66
sous groupe nombre de membres fonctions cellulaires
Ras 36 expression gènique
Rho 20 expression gènique; organisation du cytosquelette
Arf 27 transport vésiculaire
Rab 61 transport vésiculaire
Ran 1 transport nucléaire et régulation du cyle cellulaire
autres 9 Figure I.1 : répartition des protéines des petites protéines G dans les sous-familles de la superfamille Ras
(Wennerberg, Rossman et al. 2005)
Les modifications post traductionnelles des petites protéines G ont été étudiées y compris
dans le but de développer des inhibiteurs de l’activation de ces protéines.
Les petites protéines G lient le GTP et le GDP en présence de Mg2+ au niveau du domaine de
liaison, conservé pour toute protéines G. L’affinité des protéines pour les nucléotides diffère
en fonction des protéines. Néanmoins, de façon générale, les protéines G ont une plus grande
affinité pour le GTP que pour le GDP (Vetter and Wittinghofer 2001). L’échange entre le
GTP et le GDP peut également varier de quelques minutes à plusieurs jours.
La liaison du GTP par les petites protéines G permet la stabilisation de 2 régions charnières
nécessaires à la reconnaissance des effecteurs. De façon générale, les petites protéines G liées
au GTP sont actives et peuvent interagir avec leurs protéines cibles tandis que celles qui fixent
un GDP ne peuvent interagir avec leur substrat et donc sont inactives. L’hydrolyse du GTP
entraîne la libération de l’effecteur. Cette activité GTPasique des petites protéines G peut être
catalysée par la fixation d’une protéine GAP (GTPase activating protein) (Vetter and
Wittinghofer 2001).
B. Modifications post traductionnelles des petites protéines G
La plupart des petites protéines G sont soumises à des modifications post-traductionnelles sur
certains résidus cystéine de leur partie carboxy-terminale. Pour certaines protéines G, ces
modifications sont nécessaires à la localisation des protéines au niveau de la membrane et à
leur activité. Elles peuvent également participer aux interactions avec les protéines
régulatrices.
H-Ras et N-Ras sont palmitoylées et farnésylées, l’extrémité C-terminale est clivée par
protéolyse et la dernière cystéine est méthylée. K-Ras est modifiée comme H-Ras mais n’est
pas palmitoylée. Rap1 est géranyl-géranylée et la partie C-terminale est également clivée et
67
méthylée. Enfin Rab est géranyl-géranylée au niveau de 2 résidus cystéine (Paduch, Jelen et
al. 2001).
Les protéines de la sous-famille Rho sont également modifiées par ajout de groupements
lipidiques au niveau d’une séquence CAAX de leur partie C-terminale. Elles peuvent être
modifiées comme les protéines de la sous famille Ras. Par exemple, les protéines RhoA,
RhoC, Rac1, Rac3 sont géranyl-géranylée, la protéine RhoB est palmitoylée au niveau d’une
cystéine et est soit géranyl-géranylée, soit farnésylée, ces modifications participant à la
régulation de l’expression et de l’activité de la protéine (Wennerberg and Der 2004).
Une même modification post-transcriptionnelles peut avoir une importance variable selon les
petites protéines G modifiées. De plus ces modifications peuvent être constitutives ou
inductibles. Ces caractéristiques confèrent une spécificité variable aux inhibiteurs de
transférases. L’inhibition des transférases nécessaires aux modifications des petites protéines
G permet l’inhibition d’une partie de ces protéines (Appels, Beijnen et al. 2005).
C. Activation et inactivation des petites protéines G
Les petites protéines G peuvent lier le GDP et le GTP. 3 groupes de protéines participent au
cycle d’activation des petites protéines G (Paduch, Jelen et al. 2001; Vetter and Wittinghofer
2001) :
- Les GTPase dissociation inhibitors (GDI) qui maintiennent la protéine liée au GDP
dans une conformation inactive. 2 GDI sont connues : RabGDI et RhoGDI.
- Les GTPase activating proteins (GAP) qui catalysent l’activité GTPasique intrinsèque
de la protéine G et donc participent à l’inactivation de la protéine G.
- Les guanines nucléotides exchange factor proteins (GEF) qui catalysent l’échange du
GDP par un GTP et donc entraînent l’activation de la protéine G.
1. Les GEF
La dissociation du GDP et des petites protéines G nécessite l’intervention d’une GEF qui
participe à l’échange du GDP par un GTP en stabilisant les protéines G non liée au GTP ou en
catalysant la dissociation du GDP de son site de fixation et en favorisant l’interaction avec le
GTP. Cependant, la stabilisation de la forme non liée de la petite protéine G augmente
l’exposition du site de fixation du GTP mais également favorise la dissociation de la GEF.
Les GEF possèdent plusieurs sites d’interaction protéine-protéine et protéine-lipide. Ces sites
68
leur permettent d’être recrutées à la membrane et agissent en réponse à un signal
extracellulaire.
2. Les GAP
Les GAP interagissent avec le domaine GTPase de la protéine et favorisent la réaction
d’hydrolyse du GTP. Elles favorisent l’alignement des molécules d’eau avec le site
catalytique des protéines accélérant ainsi la catalyse du GTP. De plus, elles favorisent la
stabilité de la protéine et facilitent l’interaction de la protéine avec le GTP.
3. Les GDI
Les GDI peuvent se lier avec les protéines possédant un résidu géranylgéranylé, libérant ainsi
ces protéines de leur ancrage à la membrane. Cet éloignement de la membrane participe à
l’inhibition des petites protéines G dont la probabilité d’activation dans le cytosol est plus
faible. De plus, les GDI couvrent le site de fixation des effecteurs, empêchent l’échange des
nucléotides et inhibent l’hydrolyse du GTP par les petites protéines G. 2 GDI ont été mises en
évidence : RhoGDI et RabGDI qui, bien que structurellement différentes, ont le même rôle.
Petite protéine G-GDP
GDI
GDI
PP R
G
PP P R
G
PP R
GPetite protéine G-GTP
PP P R
G
Petite protéine G-GDP
PP R
G
GEFPP P R
G
GAP
GTP GDP P
Etat inactif Etat actif Etat inactif
effecteur
Signal
Petite protéine G-GDP
GDI
GDI
PP R
G
PP R
G
PP P R
G
PP P R
G
PP R
G
PP R
GPetite protéine G-GTP
PP P R
G
PP P R
G
Petite protéine G-GDP
PP R
G
GEFPP P R
G
GAP
GTP GDP P
Etat inactif Etat actif Etat inactif
effecteur
Signal
Figure I.2 : Mécanisme d’activation / inactivation des petites protéines G
69
D. Les différents groupes de petites protéines G
Bien que possédant des caractéristiques communes, les sous-groupes des petites protéines G
diffèrent par une partie de leur séquence et leurs modifications post-traductionnelle
déterminant leur localisation et leur fonction (Wennerberg, Rossman et al. 2005).
1. La famille des protéines Ras
La plus connue et l’une des familles de petites protéines G les plus étudiées est la famille des
protéines Ras (Ras sarcoma oncogene) qui compte 36 membres. Elles ont un rôle reconnu
dans des pathologies telles que les cancers dans lesquels plusieurs mutations ont été mises en
évidence (Repasky, Chenette et al. 2004). Les protéines Ras permettent la transduction de
nombreux signaux extracellulaires conduisant à l’expression des gènes, à la régulation de la
prolifération de la différenciation et de la survie cellulaire.
L’activation de Ras participe à une voie de signalisation qui a été largement étudiée : Comme
décrit dans le paragraphe précédent, l'EGFR est un récepteur tyrosine kinase qui se lie à la
GEF de Ras SOS. Cette GEF active Ras, entraînant la translocation de l’effecteur de Ras.
L’une des protéines effectrices de Ras est la protéine Raf1 qui à son tour va activer les
MAPKK, dont MEK1/2, conduisant à l’activation des MAPK, notamment ERK1/2. Raf1
possède un domaine de 80 acides aminés (résidus 51-131), le Ras binding domain (RBD) qui
permet sa liaison à Ras et à Raf1. L’interaction entre les petites protéines G et leurs effecteurs
peut être modulée par des protéines telles que 14-3-3 qui interagit avec Raf1 et facilite son
interaction avec Ras. La phosphorylation de ERK entraîne sa translocation vers le noyau et
l’activation de facteurs de transcription (Repasky, Chenette et al. 2004).
Le rôle de la protéine Ras est bien détaillé dans la littérature. Cependant, d’autres protéines de
la famille Ras ont également été étudiées parmi lesquelles Ral et Rap.
2. La famille Rho
Les protéines de la famille Rho (Ras homologue) sont également impliquées dans la
régulation du cycle cellulaire, dans l’expression des gènes mais également dans la régulation
de l’actine. Plus de 20 membres ont été identifiés, les plus connus étant RhoA, RhoB, Rac1,
Cdc42 (Etienne-Manneville and Hall 2002). Néanmoins, d’autres protéines de la famille telles
que TC10, TLC, Rif, Rnd, RhoBTB ou Miro peuvent avoir un rôle biologique. De plus, les
différentes isoformes de Rho ou Rac peuvent participer à des réponses cellulaires différentes.
Comme les protéines Ras, une multitude de signaux peut les activer, impliquant plusieurs
70
protéines GEF et GAP. D’autres mécanismes sont nécessaires à leur activation parmi lesquels
des modifications transcriptionnelles (Wennerberg and Der 2004).
3. La famille ARF
Les protéines de la famille ARF sont impliquées dans le transport vésiculaire, le trafic
membranaire et la signalisation liée à l'actine (Nie, Hirsch et al. 2003). Contrairement à la
plupart des petites protéines G dont les modifications post-traductionnelles sont constitutives,
la localisation de Arf à la membrane est inductible et n’est possible que lorsque la protéine est
liée au GTP. Certaines protéines de la famille Arf ont également un rôle dans la formation de
complexes multi-protéiques. Elles participent à la formation des vésicules comprenant les
protéines COPI et COPII dont les interactions sont impliquées dans le transport vésiculaire
entre le Golgi et le réticulum endoplasmique.
4. La famille Rab.
La famille Rab (Ras like proteins in brain) regroupe 61 membres qui sont impliqués, comme
Arf, dans le transport vésiculaire ou le trafic des protéines entre les différents organites de la
cellule. Elles participent à la sécrétion vésiculaire et sont donc particulièrement importantes
au niveau des neurones. Leurs modifications post-traductionnelles permettent leur localisation
au niveau de compartiments membranaires particuliers comme au niveau des vésicules ou au
niveau de l’appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique (Pereira-Leal and Seabra 2001).
5. La famille Ran
La protéine Ran (Ras like nuclear) est principalement connue pour son rôle dans le transport
des protéines et de l’ADN vers le noyau. Elle est activée par une GEF nucléaire qui lui est
spécifique et est régulée par des GAP au niveau du cytoplasme. Elle intervient dans les
transports depuis et vers le noyau. La localisation de Ran lui permet d’intervenir dans de
nombreux événements nucléaires telles que la formation de la membrane nucléaire ou la
réplication de l’ADN.
E. Voies de signalisation des petites protéines G
Les petites protéines G peuvent être activées par les récepteurs tyrosine kinase ou par les
récepteurs associés aux protéines G (GPCR). Les stimuli hypertrophiques tels que
l’angiotensine II, la phénylephrine, les agonistes β-adrénergique et enfin les stimuli
71
mécaniques activent Ras, RhoA ou Rac en quelques minutes dans les cardiomyocytes de rats
nouveaux-nés par l’intermédiaire des protéines G hétérotrimériques, de l’activation de la
phospholipase C (PLC) qui clive le phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) en inositol
triphosphate (IP3) et diacylglycerol (DAG), ce dernier activant la PKC (Chiloeches, Paterson
et al. 1999).
Certaines protéines peuvent avoir une activité GEF. AKAP-Lbc est une protéine d’ancrage
pouvant lier la PKA mais possédant également une activité GEF (Diviani, Abuin et al. 2004;
Diviani, Baisamy et al. 2006). L’inhibition de cette protéine peut également induire un
phénotype hypertrophique. D’autres GEF sont impliquées dans les phénotypes
hypertrophiques comme la protéine Epac qui est une GEF de la famille Ras. Bien que la
signalisation de l’activation de Epac ne soit pas entièrement connue, une modification de sa
liaison avec la protéine d’ancrage mAKAP entraîne une modification de la signalisation des
petites protéines G (Dodge-Kafka and Kapiloff 2006).
La voie en aval de Ras la mieux caractérisée est celle de la MAPK ERK. Elle a été détaillée
dans l'introduction générale.
F. Rôle des petites protéines G dans l’hypertrophie cardiaque
Les protéines Ras sont connues pour être impliquées dans l’oncogénèse. Elles ont un rôle
majeur dans la croissance et la division cellulaire. Les petites protéines G ont également un
rôle important dans la transduction du signal hypertrophique en réponse aux signaux
extracellulaires (Sugden and Clerk 2000; Yamazaki and Yazaki 2000). Les principales
familles étudiées dans l’hypertrophie cellulaire sont les familles Ras et Rho. Le rôle de ces
protéines dans le remodelage myocardique a largement été étudié depuis que le rôle
hypertrophique de la forme constitutivement active de ces protéines a été montré. L’activation
des petites protéines G dans les cardiomyocytes de rats nouveaux-nés peut entraîner
différentes réponses en fonction de la protéine qui est étudiée. La transfection de la forme
constitutivement active de Ras, comme d’autres protéines pro-hypertrophiques telles que
RhoA ou Rac, entraîne l’expression génique spécifique de l’hypertrophie marquée par une
expression de gènes fœtaux tels que ceux de l’ANF (atrial natriuretic factor) ou du BNP (B-
type natriuretic peptide) (Clerk, Pham et al. 2001). L’activation ou l’inhibition des petites
protéines G au niveau cellulaire ou dans des modèles de souris transgéniques a permis de
72
mettre en évidence un rôle majeur de ces protéines dans le système cardiovasculaire tant au
niveau de l’hypertrophie, des cardiopathies dilatées ou de façon plus générale dans la
régulation de l’expression génique conduisant à un phénotype hypertrophique (Clerk and
Sugden 2000).
La signalisation cellulaire des petites protéines G dans l’hypertrophie n’est pas encore
parfaitement connue et le rôle pathologique de certaines d’entre elles reste à définir. La
signalisation de l’activation de la voie des MAPK ERK via l’activation de différentes
isoformes de Ras (H-Ras, K-Ras), de Raf et des MEK1/2 serait impliquée dans les
cardiomyopathies hypertrophiques. De plus, des études génétiques de patients présentant
divers syndrômes (Costello, Noonan ou cardio-facio-cutané) présentant notamment une
cardiomyopathie hypertrophique ont montré que ces individus présentent une mutation de
gènes codant pour les protéines de la cascade Ras-Raf-MEK-ERK (Nava, Hanna et al. 2007).
Le rôle des GEF dans les différentes pathologies est moins bien connu et reste à étudier.
J'ai participé à un travail présentant une revue générale sur les petites G. L'article est sous
presse au J Mol Cell Cardiol. Il est fourni en Annexe de ce mémoire.
II. Les facteurs de croissance et leurs récepteurs
A. Les facteurs de croissance
De nombreux facteurs de croissance sont impliqués dans la signalisation de l’hypertrophie
parmi lesquels le TGFβ (Takahashi, Calderone et al. 1994) (Parker, Packer et al. 1990), l’IGF
(Shioi, Kang et al. 2000; DeBosch, Treskov et al. 2006), les FGF (Jiang, Jeyaraman et al.
2007) et l’EGF qui induisent l’activation des différentes voies de signalisation comme les
MAPK ou la voie PI3K (Markou, Cullingford et al. 2007) (Bogoyevitch, Glennon et al. 1994;
Jiang, Jeyaraman et al. 2007).
B. Les récepteurs aux facteurs de croissance
La plupart des facteurs de croissance (exceptés les TGF-β qui interagissent avec des
récepteurs ser / thr kinase et l’IGF-II) interagissent avec des récepteurs transmembranaires
possédant une fonction tyrosine kinase. La fixation du ligand sur les récepteurs entraîne leurs
73
dimérisation permettant aux 2 domaines cytoplasmiques de se phosphoryler au niveau de
plusieurs sites tyrosine. Les sites phosphorylés des récepteurs sont des sites de fixation de
nombreuses protéines de signalisation intracellulaire. Ces protéines possèdent généralement
des sites de liaison de type SH2 et SH3 (Src homology). La fixation des effecteurs sur les
récepteurs activés permet également le recrutement à la membrane des substrats
cytoplasmiques. Les récepteurs peuvent avoir un rôle de protéine échafaudage en se liant à
leurs effecteurs mais peuvent également lier des protéines qui à leur tour ont un rôle de
protéine échafaudage. L’activation des récepteurs aux facteurs de croissance entraîne
l’activation de multiples voies de signalisation (figure I.3). La PLC-gamma peut se lier aux
récepteurs des PDGF, FGF, EGF. Sa phosphorylation entraîne l’activation de l’activité
catalytique de la PLC et donc des voies de signalisation en aval. La PI3K peut également se
lier aux récepteurs tyrosine kinase activés et sa phosphorylation entraîne l’activation de la
voies PI3K / Akt (McCubrey). D’autres protéines telles que Src, Nck, Shp2 peuvent
également se lier aux récepteurs activés et induire une réponse cellulaire. La PKC, la PI3K et
Src sont impliquées dans les voies de signalisation de l’hypertrophie des cardiomyocytes
(Hefti, Harder et al. 1997).
Figure I.3 : multiples voies de signalisation cellulaire induites par les récepteurs tyrosine kinase (Hefti, Harder et al. 1997)
74
Nous nous attacherons particulièrement ici au récepteur de l'EGF dont nous avons étudié le
rôle au cours de l'étirement.
C. L’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)
1. Structure et dimérisation des récepteurs
Les récepteurs de l'EGF sont des protéines de 170 kDa environ qui nécessitent une
maturation par clivage et glycosylation de leur domaine N-terminal afin de permettre leur
translocation au niveau de la membrane cellulaire et ainsi devenir fonctionnels. La partie
extracellulaire des récepteurs est formée de 4 domaines : I, III (ou L1 (ligand binding
domains), L2), II et IV (ou CR1 (cystein-rich domains), CR2). Ils possèdent un domaine
transmembranaire de 22 acides aminés. La partie intracellulaire est composée de 3 domaines :
JM (juxtamembrane domain) et CT(carboxy-terminal) et enfin un domaine tyrosine kinase
(figure I.4) (Fickova 2002; Jorissen, Walker et al. 2003).
I II III IV
Figure I.4 : Structure des EGFR.
Les ligands des récepteurs se fixent sur les domaines L1 et L2 qui forment une poche. Les
domaines CR1 et CR2 participent à la liaison entre les 2 domaines extracellulaires des
dimères. La fixation du ligand sur un récepteur monomérique entraîne un changement de
conformation nécessaire à la dimérisation des récepteurs (figure I.5) (Ogiso, Ishitani et al.
2002; Ferguson 2004).
75
Figure I.5 : conformation et mécanisme d’activation et de dimérisation des EGFR (Ferguson 2004).
Le domaine JM peut avoir une fonction régulatrice, y compris par internalisation des
récepteurs et peut lier des protéines telles que l’esp8 ou la calmoduline et ainsi induire une
signalisation intracellulaire.
Le domaine tyrosine kinase du récepteur est semblable aux autres tyrosines kinases ayant un
rôle de récepteur ou non. L’ATP peut interagir avec le domaine kinase en présentant son
phosphate en position γ qui peut être transféré à un résidu tyrosine accepteur du substrat. Le
domaine carboxy-terminal du récepteur à l’EGF contient des résidus tyrosine dont la
phosphorylation module l’activation du récepteur et la transduction du signal induite par cette
activation. La région C terminale possède également des sites de fixation à diverses protéines
dont l’actine qui peut être impliquée dans la formation des dimères et participer à la liaison
d’autres protéines lorsque le domaine kinase du récepteur est actif. Cette liaison au
cytosquelette peut être impliquée dans la localisation des récepteurs qui, lorsqu’ils sont
inactifs, sont majoritairement localisés dans les cavéoles et qui, lorsqu’ils sont activés,
migrent à la surface des cellules (Mineo, Gill et al. 1999).
Les EGFR sont divisés en 4 sous types (figure I.6) qui possèdent plus de 50% d’homologie.
Ces récepteurs sont activés par trans-phosphorylation de leurs domaines intracellulaires et
donc nécessitent une homo ou une hétéro dimérisation. Chaque sous-type de récepteurs a un
rôle spécifique dans le développement et entraîne une signalisation indépendante qui reste mal
connue. Les différents sous-types de récepteurs peuvent avoir des importances différentes.
76
Les récepteurs HER2 et HER4 ont des rôles fonctionnels dans le myocarde adulte. La délétion
du HER2 chez la souris adulte entraîne une cardiomyopathie et une insuffisance cardiaque
tandis que le récepteur HER4 participe à l’hypertrophie des cardiomyocytes néonataux et
adultes. A l’inverse les récepteurs de type HER3 n’ont pas de rôle connu et leurs expressions
ne sont plus détectables dès la fin de l’embryogenèse.
Les EGFR peuvent également former des hétéro-oligomères avec d’autre récepteur de surface
pour former des complexes multiprotéiques permettant l’interaction avec d’autres adaptateurs
ou protéines d’échafaudage impliqués dans la signalisation cellulaire.
2. Rôle des récepteurs à l’EGF dans la signalisation cellulaire
2.1 La liaison au ligand
Chaque sous-type de récepteurs peut être activé par plusieurs ligands (figureI.6).
Figure I.6 : Ligands des différentes sous-famille d’EGFR (Chan, Smith et al. 2006)
Certains précurseurs de ces ligands sont enchâssés dans la matrice extracellulaire ce qui
entraîne une régulation supplémentaire par les métalloprotéases mais également une
régulation spécifique par la matrice environnante et donc du tissu. La liaison du ligand aux
récepteurs induit la dimérisation des récepteurs mais également un changement de
conformation nécessaire à la formation du site actif des domaines kinase.
2.2 Transactivation de l’EGFR
L’EGFR participe à de nombreux processus cellulaires en tant que transducteur du signal.
L’activation de certains récepteurs cellulaires (récepteur à l’angiotensine, aux cytokines, à la
bradykinine, etc.) peut entraîner l’activation de voies de signalisation conduisant à la
77
phosphorylation du récepteur à l’EGFR et permettant l’activation des voies en aval (Zwick,
Hackel et al. 1999). En effet, l’activation de processus cellulaires tels que la prolifération et la
croissance induites par l’activation des GPCR est inhibée lorsque les cellules sont traitées
avec un inhibiteur de l’EGFR (AG1478). L’activation de l’EGFR implique le clivage de la
pro-HB-EGF membranaire par les métalloprotéases, libérant ainsi l’HB-EGF soluble qui peut
se lier à l’EGFR. Les métalloprotéases sont une famille d’endopeptidases capables de
dégrader la matrice extracellulaire (Perrella, Maki et al. 1994; Jorissen, Walker et al. 2003).
Plus de 20 métalloprotéases ont été mises en évidence dans le myocarde des mammifères et
groupées selon leur spécificité pour leurs substrats. De plus leur implication dans le
remodelage ventriculaire a été montrée par l’effet de la modulation de l’expression des
métalloprotéases (Blobel 2005; Chan, Smith et al. 2006). L’inhibition des métalloprotéases
entraîne une modification du réarrangement des cellules myocardiques lors du remodelage
tandis que la surexpression de métalloprotéases entraîne la mort des souris transgéniques qui
développent une hypertrophie cardiaque.
L’activation des MMP entraîne le clivage des pro-HB-EGF qui peuvent activer la cellule qui
les a produits mais pourrait également activer les cellules qui l’entourent (Jorissen, Walker et
al. 2003). La signalisation ainsi activée pourrait entraîner une réponse cellulaire dans la
cellule soumise à un stress mais également dans les autres cellules du tissu et éventuellement
au niveau d’autres types cellulaires. De même, la forme membranaire de l’HB-EGF peut
activer les récepteurs des cellules adjacentes. Les MMP et les ADAM (a disintegrin and
metalloprotease) sont impliquées dans la libération des ligands à partir de leurs précurseurs
membranaires. L’ADAM12 est impliquée dans la libération de HB-EGF et, par conséquent,
dans l’activation de l’EGFR consécutive à l’activation de GPCR (Asakura, Kitakaze et al.
2002). Cependant, les voies d'activation de l'EGFR par les GPCR, y compris les protéines G
impliquées et leurs rôles, ne sont pas encore parfaitement connues. Le rôle de la PKC reste
également à définir car la PKC peut interagir avec la protéine ADAM12 mais l’inhibition par
le calcium ou l’inhibition des PKC n’inhibe ni l’activation de l’EGFR par l’angiotensine II ni
l’activation des MAPK, ni l’hypertrophie. L’activation de l’EGFR peut donc impliquer
plusieurs mécanismes avec des redondances de signalisation (Sundberg, Thodeti et al. 2004).
La présence des précurseurs des ligands est aussi nécessaire. La délétion de l’HB-EGF
entraîne, comme la délétion des récepteurs à l’EGF, des défauts de la formation du cœur
(Iwamoto and Mekada 2006).
78
Figure I.7 : mécanisme de transactivation de l’EGFR impliquant les métalloprotéases. (Chan, Smith et al. 2006)
Plusieurs études ont montré que les ROS (Reactive oxygen species) peuvent être impliquées
dans l’activation de l’EGFR. Les ROS activent de multiples voies de signalisation telles les
voies de ERK ou de la PI3K. L’inhibition de ces voies atténue l’effet de la libération des ROS
induite par l’activation des GPCR. (Engelhardt 2007). Le rôle des ROS n’est pas limité à la
signalisation conduisant à l’activation des MMP, elles participent également à la signalisation
cellulaire régulant la transcription et l’expression de l’HB-EGF (Perrella, Maki et al. 1994).
2.3 Activation de l’EGFR et formation des complexes de
signalisation
Peu de protéines sont directement phosphorylées par le domaine kinase des EGFR.
Néanmoins, la transphosphorylation des récepteurs est nécessaire à la liaison avec de
nombreuses protéines partenaires qui participent à la transduction du signal parmi lesquelles
des protéines tyrosine kinases intracellulaires telles que Src et JAK-2 qui participent à la
phosphorylation des protéines cytoplasmiques mais également à la phosphorylation des
récepteurs EGFR. Les récepteurs sont autophosphorylés au niveau de 5 tyrosines du domaine
C-terminal permettant la formation de plusieurs sites de liaison et ainsi l’interaction avec
certaines protéines intracellulaires (figure I.8). L’EGFR à donc un rôle majeur dans la
formation de complexes de signalisation cellulaire et dans l’activation de nombreuses voies de
signalisation (Jorissen, Walker et al. 2003).
79
Figure I.8 : protéines adaptatrices associées au EGFR et leurs sites de fixation. (Jorissen, Walker et al. 2003)
D’autres protéines peuvent être associées aux complexes par leur fixation aux protéines
adaptatrices liées aux récepteurs telles que Clb, PI3K, Stat5.... Certaines protéines nécessitent
la présence de sous-types de récepteurs ou la formation d’hétérodimères ou d’homodimères
particuliers pour se lier aux récepteurs, participant ainsi à la spécificité du signal et à sa
régulation. L’EGFR peut participer à la formation des complexes protéiques comme une
protéine échafaudage ou s'associer à d’autres protéines participant à la signalisation cellulaire.
Par exemple, l’hétéodimère EGFR/ErbB3 permet la fixation de la protéine PI3K qui se fixe à
ErbB3 et entre en contact avec le domaine kinase de l’EGFR entraînant la phosphorylation de
PI3K. Cependant, cette réaction n’est permise que par la phosphorylation de la tyrosine 920
de l’EGFR phosphorylée par la protéine Src. L’activation de la voie PI3K est donc
nécessairement dépendante de la formation d’un complexe de signalisation impliquant Src
(Stover, Becker et al. 1995).
2.4 Signalisation induite par l’EGFR
De nombreuses voies de signalisation sont activées par les EGFR parmi lesquelles la voie de
la petite protéine G Ras qui active en aval les cascades des MAPK (Zwick, Hackel et al.
1999). L’activation de cette voie est initiée par la fixation de la protéine Grb2 aux EGFR
directement ou par l’intermédiaire de la protéine Shc (Batzer, Rotin et al. 1994). Grb2 est liée
au facteur d’échange de Ras SOS qui catalyse la libération du GDP lié à la protéine inactive et
favorise la liaison à un GTP. La formation de ce complexe avec le récepteur facilite la
localisation à la membrane de la protéine Ras, nécessaire à son activité. La protéine Ras active
80
ensuite les cascades de phosphorylation des MAPK vues précédemment conduisant à
l’activation des facteurs de transcription et à la régulation de cette même voie car les MAPK
peuvent phosphoryler la protéine SOS, entraînant la dissociation du complexe, exerçant ainsi
un rétrocontrol négatif (Sasaoka, Langlois et al. 1994).
Les protéines de la famille des kinases Src sont également impliquées dans la signalisation
cellulaire induite par l’activation des récepteurs membranaires dont les EGFR. Elles
participent à la phosphorylation des récepteurs, à la transduction du signal et à l’activation des
protéines GAP de Ras et de Rho mais également d’autres protéines telle que FAK (Roof,
Haskell et al. 1998). La protéine c-Src est souvent associée à l’activation de la voie PI3K car
Src participe à la fixation de PI3K sur l’EGFR mais peut également directement phosphoryler
la PI3K (Carpenter, Auger et al. 1993; Djordjevic and Driscoll 2002). L’activation de la PI3K
entraîne la production de PIP3 et l’activation de la Ser / Thr kinase Akt qui est l’un des
effecteurs majeurs de l’EGFR et est impliqué dans de nombreuses réponses cellulaires dont la
prolifération et la survie cellulaire (Nicholson and Anderson 2002).
L’activation de l’EGFR entraîne une réponse cellulaire via le métabolisme des phospholipides
en activant les protéines qui dégradent les lipides afin de produire les seconds messagers
nécessaires à l’activation des voies de signalisation en aval. L'EGFR peut se lier et activer les
phospholipases A, C et D en fonction de sa propre phosphorylation.
(Slaaby, Jensen et al. 1998; Chattopadhyay, Vecchi et al. 1999).
2.5 Rôle dans le cœur et dans l’hypertrophie cardiaque
L’angiotensine II peut induire l’hypertrophie de cellules en culture par l’intermédiaire des
activations des MMP et de l’EGFR. La surexpression d’un récepteur mutant ne pouvant pas
transactiver l’EGFR inhibe l’hypertrophie cardiaque in vivo (Zhai, Galeotti et al. 2006). Or
lors de l’hypertrophie du ventricule gauche chez les rats spontanément hypertendus ou après
un infarctus, les expressions de l’HB-EGF et du récepteur à l’EGF sont augmentées
(Higashiyama and Nanba 2005). Le rôle transactivateur des MMP suggère que ces protéines
pourraient être des cibles du traitement de l’hypertrophie cardiaque.
81
Introduction du 1er article
Les petites protéines G dans l’étirement et la mécano-transduction
L’activation de des récepteurs membranaires par l’étirement peut conduire à l’activation des
petites protéines G Ras, Rac ou Rho (Aikawa, Komuro et al. 1999; Zhou, Ziegler et al. 2006).
Les voies de signalisation induites par l’étirement des cardiomyocytes et le rôle des petites
protéines G, et plus particulièrement de Ras, sont étudiés depuis plus de 15 ans (Sadoshima
and Izumo 1993). De nombreux travaux ont montré que Ras est impliquée dans l’activation
des MAPK par l’angiotensine ou d’autres stimuli hypertrophiques. L’implication de Ras dans
l’activation des ERK a néanmoins été remise en cause par plusieurs travaux qui montrent que
l’endothéline qui est impliquée dans l’hypertrophie des cardiomyocytes induite par
l’étirement entraîne l’activation de ERK via la PKC et Raf1 mais indépendamment de Src et
Ras (Yamazaki, Komuro et al. 1999). De plus, certaines études ont montré que l’expression
du dominant négatif de Ras n’inhibe pas l’activation de ERK (Marais, Light et al. 1998). Le
rôle de Ras lors de l’activation de ERK par l’étirement reste donc controversé.
Rôle du récepteur à l’EGF (EGFR) dans l’étirement
Un rôle de l'EGFR a été trouvé dans un certain nombre d'organes lors de l'étirement. Dans les
cellules épithéliales une coopération induite par l’étirement entre les intégrines et de l’EGFR a
été montrée au niveau des complexes focaux d’adhésion (Knies, Bernd et al. 2006). Dans les
cellules épithéliales de poumon, l’étirement des cellules entraîne l’activation de ERK via le
récepteur à l’EGF et les protéines G. Cette voie inclut la voie Grb2-SOS-Ras-Raf1 ainsi que
les canaux ioniques (Correa-Meyer, Pesce et al. 2002; Sanchez-Esteban, Wang et al. 2004).
D’autres travaux réalisés dans le poumon ont montré le rôle de la voie PI3K en réponse à la
ventilation mécanique et donc à l’étirement des cellules (Papaiahgari, Yerrapureddy et al.
2007).
Une activation de la voie PI3K et en aval de la protéine Akt a été retrouvée dans les cellules
glomérulaires du rein stimulées par l’étirement. L’activation de cette voie serait indépendante
de l’activation par les intégrines et indépendante du cytosquelette mais dépendante de la
protéine Src et des protéines des cavéoles (Zhang, Peng et al. 2007). L’activation de la voie
82
PI3K par l’étirement a également été retrouvée lors de la stimulation des cellules
épidermiques. L’étirement de ces cellules entraîne l’activation de l’EGFR via les récepteurs à
l’angiotensine II (Kippenberger, Loitsch et al. 2005). Or l’activation des récepteurs de
l’angiotensine implique probablement l’activation des protéines G retrouvées dans les cellules
épithéliales et de la protéine Src. Enfin, au niveau des coronaires, d’autres travaux ont
retrouvé l’activation de ERK par l’étirement et ont montré le rôle de l’EGFR dans cette
signalisation cellulaire (Oeckler, Kaminski et al. 2003).
Indépendamment du type cellulaire étudié, ces travaux montrent que de nombreuses voies de
signalisation sont impliquées lors de l’étirement des cellules parmi lesquelles certaines voies
qui activent l’hypertrophie cellulaire. Néanmoins le rôle de l’EGFR lors de l’étirement des
cellules cardiaques a été peu étudié. A notre connaissance, 2 études seulement ont étudié le
rôle de l'EGFR lors de l'étirement des cardiomyocytes. Il a été montré que l’étirement des
intégrines des cardiomyocytes de lapin adulte par un choc osmotique entraîne l’activation de
courants ioniques et des voies de l’angiotensine II, de la PI3K, des ROS (Browe and
Baumgarten 2003; Browe and Baumgarten 2004; Browe and Baumgarten 2006; Ren, Raucci
et al. 2007) et Anderson et al ont montré que l’EGFR est impliqué dans la sécrétion du brain
natriuretic peptide (BNP) qui est un facteur de l'hypertrophie cardiaque (Anderson, Wang et
al. 2004). On ne sait pas encore si ces activations passent ou non par Ras.
Activation des MAPK lors de l’étirement cellulaire
Les MAPK ont un rôle majeur dans le développement du cœur et dans les processus
pathologiques. Néanmoins, de nombreuses controverses persistent, notamment le rôle de
chaque kinase en réponse à un stimulus spécifique (Wang 2007).
L’activation de ERK a largement été étudiée et implique les voies de la PKC, de la
calcineurine, des petites protéines G et de Raf1 mais les liens entre ces différentes protéines
sont mal connus.
Les voies d’activation de JNK sont moins connues que les voies d’activation des ERK. JNK,
comme ERK, est activée par l’étirement. Cependant, contrairement à ERK, l’inhibition des
récepteurs de l’angiotensine n’inhibe pas l’activation de JNK dépendante de l’étirement. Il
existe donc d’autres voies indépendantes des récepteurs à l’angiotensine qui conduisent à
l’activation des JNK.
83
But de l’étude :
Il persiste donc des incertitudes concernant le rôle de Ras lors de l'étirement ainsi que sur les
voies conduisant à la phosphorylation de ERK et de JNK. L’objectif de ces travaux a été
d’étudier le rôle de l'activation de Ras lors de l’étirement des cardiomyocytes ainsi que
plusieurs voies de signalisation, particulièrement celles des tyrosines kinases dont celle de
l'EGFR ainsi que la voie EGFR-PI3K-Akt.
84
Article 1
The EGF receptor activates ERK but not JNK through a Ras
independent pathway during cardiomyocyte stretch.
85
Conclusion et résultats complémentaires
Ces travaux nous ont permis de mettre en évidence le rôle du récepteur à l'EGF dans
l'activation de ERK mais pas de JNK. Lorsque les cellules ne sont pas traitées ni stimulées, il
participe à l'activation basale de ERK par une voie de signalisation dépendante de l'activation
de Ras, tandis que lors de la stimulation par l'étirement il est nécessaire à l'activation de la
protéine Akt et participe à l'activation de ERK par une voie de signalisation indépendante de
Ras. La transactivation du récepteur de l'EGF était connue (Anderson, Wang et al. 2004;
Kippenberger, Loitsch et al. 2005). Cependant, les voies de signalisation mises en jeu dans
l'activation de ERK et le rôle éventuel de l’EGFR dans l'activation de JNK n'avaient pas
encore été étudiés. Ces résultats sont en accord avec ceux de Kodama et al. lors de
stimulations par l'endothéline (Kodama, Fukuda et al. 2002; Kodama, Fukuda et al. 2003).
Nous avions initialement utilisé la manumycine pour évaluer le rôle de Ras dans l'actiovation
des MAPK induite par l'étirement. Comme le montre la Figure Supplémentaire de l'article,
nous avons obtenu un résultat surprenant: l'activation basale de ERK par le traitement par
manumycine. Nous avons montré que celle-ci est due à une libération de ROS par la cellule
(Pan, She et al. 2005). Néanmoins, nous avons aussi recherché un rôle éventuel d'une autre
protéine farnésylée, la protéine RhoB. En effet, il a été montré récemment que RhoB peut
limiter la proliferation cellulaire (Huang and Prendergast 2006) avec un effet répresseur de la
transcription lors de la stimulation par le transforming growth factor (Adnane, Seijo et al.
2002). RhoB peut donc avoir un effet inhibiteur sur l'activité basale de ERK qui serait
supprimée par inhibition de la farnesyltransferase par la manumycine.
86
0
100
200
300
Control Stretch Control Stretch
Empty vector RhoB N19
ERK2 activation (% of control)
JNK2
JNK1
**
0
100
200
300
400
Control Stretch Control Stretch
Empty vector DN RhoB N19
ERK2 activation (% of control)
ERK1
ERK2
**
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
pERK1/2
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
pJNK1/2
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
HA–DN RhoBN19
0
100
200
300
Control Stretch Control Stretch
Empty vector RhoB N19
ERK2 activation (% of control)
JNK2
JNK1
**
0
100
200
300
400
Control Stretch Control Stretch
Empty vector DN RhoB N19
ERK2 activation (% of control)
ERK1
ERK2
**
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
pERK1/2
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
pJNK1/2
C S C S
Empty
vector
DN RhoB
N19
HA–DN RhoBN19
Figure I.9 : Rôle de RhoB lors de l'activation de ERK et de JNK
La surexpression du dominant négatif de RhoB n'entraîne pas d'activation basale de ERK qui
aurait été constatée si l'activation de ERK et de JNK par la manumycine avait été une
conséquence de l’inactivation de RhoB. Cependant la surexpression du dominant négatif de
RhoB inhibe l’activation de ERK par l’étirement donc RhoB participe à l’activation des
MAPK lors de l'étirement.
Notre seconde approche de l'étude de Ras consistait à inhiber son activation en surexprimant
RasS17N. L'absence de rôle de Ras lors de l'activation des MAPK par l'étirement pouvait être
expliquée par le rôle de Rap1 qui peut être impliquée négativement ou positivement dans la
signalisation induite par Ras (Zwartkruis, Wolthuis et al. 1998). Nous avons donc recherché le
rôle de Rap en surexprimant, à l'aide d'une infection par adénovirus, la forme constitutivement
active de Rap ainsi qu'un dominant négatif.
87
Figure I.10 : Rap1 active ERK mais pas JNK et n'a par de role dans l'activation par l'étirement.
Ces résultats montrent que l'inhibition de Rap n'affecte pas l'activation de ERK par l'étirement
mais que Rap peut potentiellement être un activateur de ERK comme le montre York et al.
(York, Yao et al. 1998). En revanche, Rap n'intervient pas et ne peut intervenir lors de
l'activation de JNK. Cette indépendance de Rap a déjà été montrée dans les travaux de
Hochbaum et al. lors de l'activation de JNK par un facteur d'échange de Rap, Epac. Ils ont
conclu que Epac peut activer la voie de signalisation de JNK indépendamment de Rap par un
mécanisme qui n'est pas encore connu (Hochbaum, Tanos et al. 2003).
Les résultats présentés dans cet article montrent aussi le rôle des tyrosines kinases en général
car le traitement des cellules à la génistéine entraîne une inhibition de l'activation des MAPK
ERK et JNK. Cependant, la génistéine n'étant pas spécifique, elle inhibe de nombreuses voies
de signalisation pouvant être induites pas les récepteurs tyrosine kinases ou les protéines
tyrosines kinases n'ayant pas de fonction réceptrice. Plusieurs autres protéines peuvent donc
être concernées par l'inhibition par la génistéine comme certains récepteurs aux facteurs de
88
croissance, et des protéines tyrosine kinases comme Src ou la proline-rich tyrosine kinase-2
(Pyk2). C’est le sujet du 2ème article.
89
Introduction du 2ème article
La protéine Prolin-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) est une tyrosine kinase cytoplasmique de la
famille des Focal adhésion kinases (FAK) impliquée dans de nombreux processus cellulaires
comme l’apoptose, la prolifération ou la différenciation (Avraham, Park et al. 2000). Elle
possède plusieurs sites de phosphorylation dont une tyrosine en position 402 dont la
phosphorylation permet la formation d’un site de liaison à la protéine Src qui participe à la
phosphorylation d’une tyrosine en position 508 au niveau de la boucle régulatrice de pyk2
(Park, Avraham et al. 2004). La Pyk2 peut interagir et phosphoryler la Paxiline qui est
associée au FAK et au cytosquelette participant ainsi à transmission des signaux
extracellulaires aux éléments du cytosquelette (Hiregowdara, Avraham et al. 1997). Enfin,
Pyk2 peut être activée par les intégrines dans les mégacaryocytes entraînant son association
avec la protéine Src et donc son activation (J. Li, H. Avraham, R.A. Rogers, S. Raja and S.
Avraham. Blood 88 (1996), pp. 417–428)
L’étude du rôle de pyk2 dans les cardiomyocytes est assez peu détaillée. Néanmoins,
plusieurs études ont montré que la Pyk2 est impliquée dans le remodelage cardiaque
(Melendez, Welch et al. 2002) et que la phosphorylation et l’expression de Pyk2 sont
augmentées lors de l’hypertrophie induite par l’augmentation de pression (Bayer, Ferguson et
al. 2001; Bayer, Heidkamp et al. 2002; Bayer, Heidkamp et al. 2003).
Nous nous sommes intéressés à Pyk2 car elle peut être l'une des protéines inhibées par la
génistéine. Or, Pyk2 peut être impliquée dans la signalisation de ERK (Kodama, Fukuda et al.
2002) mais participe également à l'une des voies de signalisation majeures conduisant à
l'activation de JNK par l'endothéline (Kodama, Fukuda et al. 2003). L’activation de Pyk2 par
les intégrines et les complexes focaux d'adhésion (Butler and Blystone 2005), suggère qu’elle
peut avoir un rôle important dans la signalisation et l'activation des MAPK induites par
l'étirement.
Ce travail réalisé au laboratoire, auquel j'ai participé étroitement, a eu pour objectif de
montrer le rôle de Pyk2 lors de l’activation de JNK par l'étirement.
90
Article 2
91
Conclusion de l’article
Notre objectif était d’étudier les voies d’activation de JNK et plus particulièrement le rôle de
la tyrosine kinase Pyk2 pouvant ainsi apporter un élément de réponse à l’inhibition de JNK
par la génistéine présentée dans l’article 1.
Nous avons montré que la Pyk2 est activée par l’étirement et que les 2 types de récepteurs à
l’endothéline peuvent activer des voies différentes. Lors de la stimulation par l’étirement, seul
l’ET1B est responsable de l’activation de la Pyk2 tandis que les 2 types de récepteurs activent
JNK. Enfin, nous avons montré que Pyk2 est nécessaire à l’activation de JNK. L’inhibition de
la Pyk2 par la génistéine explique probablement en partie la diminution de l’activation de
JNK par ce traitement.
La voie PI3K, que nous avions étudiée lors de l’activation de ERK, peut être impliquée dans
l’activation de Pyk2 par l’endothéline. Le rôle de la PI3K lors de l’étirement avait déjà été
montré dans d’autre modèle, cependant, son rôle lors de l’activation de JNK n’est pas encore
bien connu. Nous montrons dans cet article que le traitement des cellules pas le LY294002, un
inhibiteur de la PI3K entraîne une inhibition de JNK. Ce résultat est apparemment
contradictoire avec ceux qui sont présentés dans l’article 1 qui montrent que la wortmannin,
un autre inhibiteur de la PI3K, n’inhibe pas l’activation de JNK. Nous en concluions que la
voie de la PI3K n’est pas une voie activatrice de JNK. Cette différence peut probablement être
expliquée par les doses de LY utilisées. Le traitement des cellules jusqu’à 10µM, qui est la
dose couramment utilisée, n’entraîne pas de diminution de l’activation de JNK par
l’étirement. Une diminution n’est observée que pour des doses 2 à 3 fois supérieures. Il est
possible que la voie de la PI3K active JNK mais que cette voie n’est qu’accessoire et par
conséquent, détectable uniquement lors d’une forte inhibition.
92
Partie II
Les complexes protéiques dans la signalisation cellulaire : Mise en
évidence d'un complexe PKCεεεε / calcineurine.
93
Les différents mécanismes activés par l'étirement cellulaire présentés dans l'introduction et la
première partie activent de nombreuses voies de signalisation entraînant l'activation des
facteurs de transcription. Plusieurs de ces voies sont primordiales parmi lesquelles la voie de
la PKC qui est activée par l'angiotensine II et dont le rôle lors de l'étirement cellulaire a déjà
été montré (Yamazaki, Komuro et al. 1995) et la voie de la calcineurine qui est également
impliquée dans l'activation de l'expression des gènes via le facteur de transcription NFAT
(van Rooij, Doevendans et al. 2002).
Lors des premières études au laboratoire sur les voies d'activation des MAPK lors de
l'étirement, le rôle de la PKC était déjà connu et le but était de rechercher l'isoforme de PKC
impliquée. D'autre part, d'autres voies étaient examinées, dont celle de la calcineurine dont
l'implication n'avait pas encore été décrite. Le résultat de l'inhibition partielle de l'activation
des MAPK par le FK506, un inhibiteur de la calcineurine, a fait rechercher plus en détail son
mécanisme d'activation, en particulier une interaction avec les autres voies, dont celle de la
PKC. Nous avons alors trouvé qu'elles interagissent, en partie par la formation d'un complexe
protéique. L'article contenant les résultats de nos travaux est précédé par une description
rapide des PKC, de la calcineurine et des complexes protéiques
I. La Protéine Kinase C
La PKC fait partie d’une superfamille de protéine kinases comprenant également la PKA et la
PKB /Akt. Ces protéines ont en commun une terminaison N-Terminale régulatrice et une
région C-terminale conservée comprenant 2 sites de phosphorylation. Leur région régulatrice
possède un site de liaison aux membranes cellulaires et un site d’inhibition du domaine
catalytique. Enfin, la partie C-terminale permet la liaison aux protéines cibles et est un
donneur / accepteur de phosphate (Newton 2003).
A. Structure des PKC
Les PKC forment une famille de sérine / thréonine kinases dont la première a été mise
en évidence dans des extraits de cerveau par M. Inoue et. al. en 1977 (Inoue, Kishimoto et al.
1977) et qui comprend maintenant 10 membres divisés en 3 groupes selon leurs structures
primaires. Cette dernière détermine leurs réponses aux seconds messagers desquelles
94
dépendent leurs translocations et l’activation de cibles qui peuvent être différentes en fonction
des isoformes activées.
Les PKC classiques (α, βI, βII et γ) possèdent, au niveau de leur domaine C1, 2
motifs riches en cystéines permettant la liaison au diacylglycerol (DAG) et la localisation de
la PKC au niveau des membranes. Elles possèdent également un domaine C2 pouvant lier le
calcium. Ces domaines font partie de la région régulatrice avec le domaine AI d’auto
inhibition qui est semblable à une séquence du site de phosphorylation des substrats de la
PKC et apparaît donc comme un pseudosubstrat. De plus, le domaine C1B des formes
classiques forme 2 doigts zinc par la combinaison des cystéines avec les histidines. Ces 2
doigts zinc permettent de réguler l’activité de la protéine, en particulier de la PKCγ, par
oxydation des résidus cystéine en réponse à un stress oxydatif. En continuité de la région
régulatrice se trouve une région charnière puis la région supportant l’activité kinase de la
protéine. Les domaines C3 et C4 permettent la fixation des substrats de la PKC et de l’ATP.
Les PKC nouvelles (δ, ε, η, et θ) contiennent les compartiment C1 et C2 dans l’ordre
inverse de celui des PKC classiques. Cependant, le domaine C2 ne peut pas lier les ligands et
n’est pas activé par le calcium.
Les PKC atypiques (ζ, λ, µ et ι) possèdent un domaine C1 ne contenant qu’une
séquence riche en cystéine et ne possèdent pas de domaine C2. Elles ont un domaine C4 plus
court que les autres PKC et sont dépourvues d’un important site accepteur de phosphate.
Cette structure les rend indépendantes du calcium et des phorbolesters (Barnett, Madgwick et
al. 2007; Kheifets and Mochly-Rosen 2007).
Classiques
α, βI, βII, γ
Nouvelles
ε, δ, η, θ
Atypiques
ζ, λ/ι, µ
PKA
PKB
N C
C3 C4C2C1BC1AAIN C
Domaine de régulation Domaine catalytique
hingePseudo-
substrat
DAG, PMA Ca2+, PS
RACK
ATP substrat
500 641 660
Boucle
d’activation
Turn
motif
Motif
hydro-
phobique
C3 C4Nouveau C2 C1AIN C566 710 729
C3 C4C1 atypiqueAIN C410 560 E
RAIN 197 338
PHN C308 450 473
C
Figure II.1 : Structures des protéines kinase A, B et C AI : domaine d’autoinhibition, DAG : diacylglycerol, PMA : phorbol 12-myristate 13-acetate, ATP : Adénosine triphosphate (Barnett, Madgwick et al. 2007; Kheifets and Mochly-Rosen 2007)
95
B. Activation des PKC
Les différents domaines des isoformes de la PKC déterminent leur régulation par les
différents activateurs : le DAG, le calcium et les phosphatidylsérines (PS). L’activation des
PKC par ces facteurs entraîne l’association des PKC à la membrane et l’activation de leur site
catalytique. Les voies les mieux caractérisées montrent que les récepteurs membranaires
activent les phospholipases C qui hydrolysent le PIP2 (phosphatidylinositol biphosphate) en
IP3 et DAG. Le DAG peut activer les PKC tandis que l’IP3 active les canaux calciques
sensibles à l’IP3, entraînant la libération de calcium par les différents réservoirs calciques de
la cellule (Dorn and Force 2005).
Figure II.2 : activation de la PKC par le calcium et le DAG (Dorn and Force 2005)
A l’état inactif, le site de liaison des substrats de la PKC est reconnu par le domaine pseudo-
substrat de la protéine, empêchant toute fixation d’une autre protéine. La suppression ou la
mutation de cette séquence rend la PKC constitutivement active (Smith and Smith 2002).
L’association du calcium au domaine C2 des PKC classiques augmente leur affinité pour les
PS au niveau du même domaine C2 et entraîne leur translocation et leur association à la
membrane, facilitant la fixation du DAG sur leur domaine C1 qui induit un changement de
conformation et la dissociation des domaines auto-inhibiteur et catalytique permettant
l’activation de la protéine. La liaison de la PKC à la membrane permet la phosphorylation de
certains résidus notamment par la 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1) qui se lie
au domaine V3 et phosphoryle la PKC (Sonnenburg, Gao et al. 2001; Cenni, Doppler et al.
2002). Ces phosphorylations sont nécessaires à la stabilité de la protéine et à l’activité du
96
domaine catalytique car elles entraînent la levée de l’auto-inhibition de la protéine, permettant
ainsi son autophosphorylation et la phosphorylation de ces substrats (Newton 2003).
L’activation de la PKC nécessite également de nombreuses interactions avec d’autres
protéines telles que les RACK (receptors for activated C-kinase) ou les protéines
d’échafaudage AKAP (A kinase anchoring protein) (Churchill, Budas et al. 2007).
C. Les protéines associées aux PKC
De nombreuses protéines peuvent s’associer et former des complexes avec la PKC de façon à
réguler son activité. Les RACK peuvent s’associer aux PKC et participer à la localisation
membranaire de la protéine. D’autres protéines participent à la formation des complexes
multiprotéiques telles que les AKAP ou les protéines 14-3-3. La liaison de la PKC aux
protéines du cytosquelette peut participer à la translocation de la kinase. Le domaine C1 a un
rôle important dans la localisation subcellulaire spécifique, notamment pour la localisation au
niveau du Golgi. Le domaine C1 de la PKCε possède une séquence spécifique, et accessible
uniquement quand la protéine est active, permettant la liaison de la protéine au cytosquelette
et plus particulièrement à l’actine (Churchill, Budas et al. 2007).
Figure II.3 : Domaine d’interaction des protéines se liant à la PKC (Churchill, Budas et al. 2007)
1. Les RACK : régulateurs de la protéine kinase.
Chaque isoforme de la PKC possède un nombre limité de substrats qui lui sont spécifiques.
Parmi ces substrats, les RACK assurent, par leur interaction spécifique aux isoformes de la
PKC, leur localisation à la membrane et participent à l’activation des PKC (Mackay and
97
Mochly-Rosen 2001). 2 RACK on été mises en évidence : RACK1 et RACK2. Or, Czukai et
al. ont montré que la protéine β’COP, analogue à RACK peut se lier avec la PKCε et participe
à son activation (Csukai, Chen et al. 1997). L’inhibition de la liaison de la PKC aux RACK,
par une courte séquence peptidique correspondant au site de liaison des RACK, entraîne
l’inhibition de la signalisation cellulaire impliquant la PKC. Le domaine C2 de la PKC
contient une séquence de 6 à 10 acides aminés homologues au site de liaison des RACK.
Cette séquence pseudo-RACK peut se lier au site de liaison au RACK et participer ainsi à
l’auto-inhibition de la protéine. La dissociation du domaine de fixation au RACK et du
domaine pseudo RACK permet l’activation de la protéine (Kheifets and Mochly-Rosen 2007).
Figure II.4 : interaction inter- et intra- moléculaire de la PKC (Kheifets and Mochly-Rosen 2007)
Le rôle des RACK dans l’activation de la PKC, dans sa localisation et en partie dans la
spécificité de la signalisation n’est que partiellement connu. Certains aspects de la
signalisation restent à définir, notamment le rôle des RACK dans la translocation de la PKC.
Les connaissances actuelles ont permis de mettre en place de nouveaux outils tels que les
peptides analogues au site de fixation des RACK de la PKC et de nouvelles stratégies de
recherche (Churchill, Budas et al. 2007). Ces outils permettront de compléter l’étude de la
PKC.
2. Les protéines 14-3-3
La protéines 14-3-3 a dans un premier temps, été identifiée sous le nom de KCIP1 comme un
inhibiteur de la PKC (Toker, Sellers et al. 1992). Cependant, le mécanisme d’inhibition a été
discuté (Robinson, Jones et al. 1994). Lorsque la PKC est dissociée de la membrane, la PKC
présente une conformation fermée permettant la reconnaissance du site pseudo-substrat par le
98
site de liaison au substrat. La PKC est alors localisée dans le cytoplasme où elle peut se lier
aux protéines telles que les 14-3-3.
D’autre travaux ont montré que 14-3-3 pouvait se lier à la PKC. Lorsque celle-ci est dans un
état de conformation active, 14-3-3 peut donc, in vitro, activer la PKC (Tanji, Horwitz et al.
1994; Gannon-Murakami and Murakami 2002)
La liaison entre la PKC et la protéine 14-3-3 a plusieurs fois été démontrée mais en utilisant
des modèles et des isoformes différentes des 2 protéines. Le rôle de cette liaison dans la
signalisation cellulaire est probablement dépendant du modèle et des protéines étudiés et peut
également être influencé par les modifications post traductionnelles des 2 protéines (Aitken,
Howell et al. 1995).
3. les AKAP
Le rôle des AKAP est décrit dans le chapitre des protéines d’ancrage. Plusieurs AKAP
peuvent s’associer à la PKC telles que l’AKAP150/79 ou la mAKAP et moduler l’activation
de la PKC (Faux, Rollins et al. 1999).
D. Rôle des PKC dans le coeur
Plusieurs PKC sont exprimées dans le cœur : les mieux caractérisées sont les PKC classiques
PKCα et PKCγ, les PKC nouvelles PKCδ et PKCε et la PKC atypique PKCλ. La présence et
le rôle de la PKCβ sont encore controversés (Puceat, Hilal-Dandan et al. 1994; Puceat and
Vassort 1996; Rouet-Benzineb, Mohammadi et al. 1996). D’autres travaux ont montré la
présence des isoformes η τ et ζ, cependant, l’expression des différentes isoformes peut varier
d’une espèce à une autre.
La PKCε est impliquée dans de nombreux processus cellulaires comme le préconditionnement
ou la résistance à l’ischémie (Kabir, Clark et al. 2006; Barnett, Madgwick et al. 2007).
Plusieurs études ont montré que l’isoforme ε a un rôle protecteur dans le tissu cardiaque et
que l’activation des GqPCR entraîne la translocation et l’activation des PKC nouvelles dont la
PKCε qui migre de la fraction cytoplasmique vers une fraction particulaire des
cardiomyocytes. En réponse à l’activation par les GPCR, la PKCε peut activer la petite
protéine G Ras et la cascade des MAPK (Chiloeches, Paterson et al. 1999; Ping, Zhang et al.
1999; Clerk and Sugden 2001).
99
Figure II.5 : signalisation intracellulaire activée par la PKC (Clerk, Cullingford et al. 2007)
La surexpression de la PKCε par des souris transgéniques entraîne un remodelage cellulaire
cardiaque et une hypertrophie concentrique mais n’influe pas sur la fibrose cardiaque. De
plus, ces souris ne présentent pas d’altération du développement et de la croissance néonatale
du cœur. La PKCε a donc un rôle majeur dans l’hypertrophie cardiaque sans être impliquée
dans le développement du cœur (Takeishi, Ping et al. 2000). D’autres travaux ont montré que
les différentes isoformes de la PKC peuvent être impliquées dans le développement et la
pathologie cardiaque : une augmentation de l’expression de certaines isoformes (α, β, ε, ζ) a
été constatée dans le cœur de fœtus puis leur expression diminue à l’âge adulte (Goldberg and
Steinberg 1996). De même, pour la pathologie, l’expression de certaines isoformes est
augmentée, cependant, le rôle de chaque isoforme n’est pas encore bien connu et l’expression
des PKC peut varier en fonction de la pathologie, du modèle et de l’espèce étudiés.
Les études de la signalisation cellulaire induite par l’activation des récepteurs membranaires
par les facteurs tels que l’angiotensine, l’endotheline ou les facteurs de croissance comme le
TGFβ ont montré le rôle majeur de la PKC dans la réponse cellulaire (Bogoyevitch, Parker et
al. 1993; Touyz and Berry 2002). Ces facteurs sont impliqués dans l’hypertrophie cardiaque
or la PKC est un médiateur potentiel des signalisations conduisant à l’hypertrophie. Le
100
traitement des cellules au PMA, phorbol ester qui active les PKC classiques et nouvelles,
entraîne l’hypertrophie des cellules. Cette hypertrophie peut être inhibée par un traitement
inhibant l’activation de la PKC (Vijayan, Szotek et al. 2004).
En aval de la PKC, plusieurs voies de signalisation peuvent être activées. La plus connue
parmi ces voies est la voie des MAPK. La protéine Raf interagit avec la petite protéine Ras au
niveau de la membrane plasmique. L’activation de Raf permet l’activation des cascades des
MAPK. Cependant, le rôle et le mécanisme d’activation de Ras dans cette voie ne sont pas
bien connus (Clerk, Cullingford et al. 2007). La PKC peut en effet activer Raf et la voie des
MAPK indépendamment de Ras (Liebmann 2001).
La PKC peut également être impliquée dans la signalisation cellulaire de la voie PI3K / Akt.
L’interaction entre ces 2 voies est moins bien connue que la voie Ras / MAPK. Cependant,
plusieurs études ont montré une interaction directe de la PKCε et de la protéine Akt. La
surexpression de la PKC dans les cardiomyocytes entraîne la phosphorylation de Akt et
l’activation des voies de signalisation impliquées dans la survie cellulaire (Ping, Zhang et al.
2001; Zhang, Baines et al. 2005). L’interaction entre la PKC et Akt peut être indirecte et faire
intervenir de nombreux mécanismes parmi lesquels les récepteurs cellulaires ou l’activation
des intégrines à la surface des cellules (Guo, Sabri et al. 2006). La stimulation des intégrines
entraîne l’activation de la voie PI3K / Akt et de la PKC en réponse aux stimulations
extracellulaires (Wen, Huang et al. 2003).
La PKC participe à la phosphorylation de nombreuses autres cibles tels que les canaux
membranaires et est impliquée dans d’autres voies de signalisation parmi lesquelles les voies
de la connexine 43, de la protéine PKD, et la voie mTOR / G6K1.
Les Gap jonctions sont composées de 8 connexines dont la forme majoritaire dans les
cardiomyocytes est la connexine 43. Or les Gap jonctions sont impliquées dans la régulation
du volume cellulaire. La perméabilité des connexons est régulée par le calcium intracellulaire,
le pH, l’ATP et par sa propre phosphorylation. Or la connexine 43 est une cible directe de la
PKCε. La PKC peut ainsi avoir un rôle régulateur de la perméabilité des Gap jonctions et
donc du volume cellulaire qui influe sur l’architecture de la cellule (Budas, Churchill et al.
2007).
La famille des PKD, qui appartient à la superfamille des Ca2+/Calmoduline dependent kinase
(CaMK), compte 4 membres dont certains étaient considérés comme des PKC atypiques.
L’activation des PKD est dépendante du DAG et de leur phosphorylation par les PKC. La
PKD est impliquée dans de nombreuses voies de signalisation, dans la modulation de
l’activation des voies des MAPK et dans le trafic intracellulaire. Elles sont impliquées dans
101
l'hypertrophie cardiaque car elles régulent la phosphorylation des HDAC et donc de l’export
du noyau de ces dernières, permettant l’expression des gènes impliqués dans l’hypertrophie
(Vega, Harrison et al. 2004; Harrison, Kim et al. 2006; Wang 2006).
Les PKC sont impliquées dans l’activation de mTOR et S6K1 soit par phosphorylation
directe, soit par l’intermédiaire de voies de signalisation telle que la voie de la MAPK ERK
(Moschella, Rao et al. 2007).
Les PKC participent à la signalisation cellulaire cytoplasmique. Néanmoins, la PKC peut
transloquer également vers le noyau où elle peut interagir avec de nombreuses molécules
telles que les HDAC et participer ainsi à la transcription des gènes (Vega, Harrison et al.
2004; Martelli, Evangelisti et al. 2006).
II. La calcineurine
A. Structure et localisation
La calcineurine est une sérine / thréonine phosphatase dépendante du calcium et de la
calmoduline. Elle a été mise en évidence par Wang et Desai en 1979. Ils isolèrent les 2 sous
unités de 58 et 18 kDa de la calcineurine mais sans l’identifier. Klee et al. l’identifièrent et la
nommèrent en fonction de sa dépendance au calcium et de sa localisation dans les neurones
(Klee, Crouch et al. 1979). Une autre étude a mis en évidence une protéine phosphatase
formée de 2 sous-unités nommée PP2B qui s’est révélée être la calcineurine {Stewart, 1982
#219}.
La calcineurine est un hétérodimère formé de la calcineurine A de 57 à 59 kDa et la
calcineurine B de 19 à 20 kDa activable par le calcium et la calmoduline. Elle nécessite
également des co-facteurs comme les ions Fe3+ ou Zn2+. Enfin, la calcineurine A est
phosphorylée tandis que la calcineurine B est myristoylée.
Le site catalytique de la protéine est porté par la calcineurine A. Cette sous-unité possède 3
domaines régulateurs dans sa partie C terminale. 2 de ces domaines sont nécessaires à son
interaction avec la sous unité B régulatrice et à la liaison avec la calmoduline, le 3ème est un
domaine d’autoinhibition qui se lie au site actif en absence de calcium et de la calmoduline.
La calcineurine B possède les sites de fixation du calcium.
La calcineurine est ubiquitaire dans les organes de mammifère mais en plus grande proportion
dans le cerveau. Au niveau cellulaire, elle est plus représentée dans le cytoplasme.
102
Néanmoins, cette localisation peut être dépendante du type cellulaire. Dans certaines cellules,
la calcineurine est exclusivement nucléaire (Rusnak and Mertz 2000).
B. Rôle de la calcineurine dans le coeur
La calcineurine participe à un grand nombre de fonctions cellulaires qui peuvent être
différentes selon le type cellulaire, depuis la motilité des spermatozoïdes jusqu’à
l’hypertrophie cardiaque (Rusnak and Mertz 2000).
L’augmentation du calcium dans la cellule entraîne l’activation de la calmoduline qui se lie à
la calcineurine. De plus, la calcineurine peut être phosphorylée par la PKC ou la CaMKII ce
qui diminue son activation et elle est déphosphorylée par la PP2A (Hashimoto and Soderling
1989). L’activation de la voie de la calcineurine conduit à l’activation de facteurs de
transcription tels que NFAT et MEF2. Lors de l’activation de voies de signalisation faisant
intervenir la calcineurine, cette dernière forme un complexe avec le nuclear factor activated
T-cell (NFAT). La déphosphorylation de NFAT permet l’exposition de sa séquence
nécessaire à sa translocation dans le noyau où le facteur de transcription peut s’associer à
d’autres protéines pour former un complexe transcriptionnel actif (Beals, Clipstone et al.
1997). NFAT activé se lie au facteur de transcription GATA4 et active ainsi la transcription
des gènes. La calcineurine peut également se lier à d’autres protéines parmi lesquelles
certaines protéines du cytosquelette telles que la tubuline, ou la dynamine (Lai, Hong et al.
1999) et d’autres facteurs de transcription tel que NFκB.
Les rôles de la calcineurine et de NFAT ont été montrés dans la morphogenèse du cœur et des
valves ainsi que dans la croissance du cœur en réponse à des stimuli hypertrophiques
(Molkentin, Lu et al. 1998; Zhu, Zou et al. 2000; Wu, Peisley et al. 2007).
La stimulation des cellules par différents antagonistes de l’hypertrophie entraîne une
augmentation de l’activation de la calcineurine (Miyashita, Takeishi et al. 2001). De plus,
l’activité de la calcineurine est augmentée dans les cœurs hypertrophiés (Molkentin, Lu et al.
1998; Shimoyama, Hayashi et al. 1999; Eto, Yonekura et al. 2000; Molkentin 2004). Enfin,
l’inhibition chimique ou la surexpression du dominant négatif de la calcineurine diminue
l’hypertrophie induite par constriction aortique (Zou, Hiroi et al. 2001). Néanmoins, les voies
d’activation de la calcineurine ne sont pas parfaitement connues.
103
C. L’inhibition de la calcineurine
L’acide okadaïque et le peptide cyclique microcyctin LR, qui inhibe la PP2A et la PP1
peuvent, à très forte dose, inhiber la PP2B. Cependant, d’autres substances ont un effet
inhibiteur plus spécifique (Rusnak and Mertz 2000). Les inhibiteurs chimiques de la
calcineurine les plus utilisés sont la cyclosporine A et le FK506 qui inhibent la formation des
complexes avec leurs partenaires spécifiques, respectivement la cyclophiline et le FKBP12.
Les domaines de liaison permettant la formation des complexes et l’association de la
calcineurine avec les complexes FKBP12-FK506 ou cyclophilin–cyclosporin sont en grande
partie identiques et se situent au niveau des 2 sous-unités de la calcineurine. La fixation des
complexes inhibiteurs bloque l’espace nécessaire à l’accès au site actif de la phosphatase. De
plus, ces 2 complexes peuvent interagir avec la boucle autoinhibitrice de la calcineurine (Ke
and Huai 2003).
Figure II.6 : inhibition de la calcineurine (Cam : Calmoduline, CyA : Cyclosporine A, CnA : Calcineurine A,
CnB : Calcineurine B) (Molkentin 2004)
D’autres protéines peuvent réguler l’activité de la calcineurine indépendamment de la
régulation par le calcium et la calmoduline. La fixation de la protéine d’échafaudage AKAP
79 (homologue de l’AKAP150 selon les espèces) inhibe l’activité phosphatase de la
calcineurine. De plus, la surexpression de AKAP79 inhibe la déphosphorylation de la
calcineurine et donc l’activation de NFAT (Kashishian, Howard et al. 1998).
104
D’autres protéines peuvent se lier à la calcineurine et l’inhiber telles que les MCIP
(modulatory calcineurin interacting protein) (Rothermel, Vega et al. 2003), la Cain
(calcineurin inhibitory proteinor Cabin), ou la DSRC1 (Down’s syndrome critical region).
L’inhibition de la calcineurine par ces protéines n’est pas une inhibition compétitive
cependant les sites d’interaction entre ces protéines et la calcineurine ne sont pas encore bien
définis.
De nombreux complexes protéiques sont impliqués dans la signalisation cellulaire telles que
les RACK ou les protéines d’échafaudage des MAPK. Certaines protéines telles que les
protéines d’échafaudage et les protéines d’ancrage ont pour rôle la formation des complexes
multiprotéiques.
III. Les complexes protéiques
De nombreuses protéines participent à la signalisation cellulaire en réponse à diverses
stimulations et conduisant à une grande variété de comportements cellulaires. Une importante
question qui se pose est de savoir comment ces protéines interagissent entre elles et quels sont
les facteurs qui déterminent les différents processus biologiques mis en jeu. L’un de ces
mécanismes est la formation de complexes multiprotéiques permettant l’association des
protéines et de leurs effecteurs. Les différentes membranes de la cellule ainsi que son
cytoplasme ne sont plus considérés comme étant uniformes mais formant de multiples
microdomaines nécessaires à la transduction des signaux dans la cellule. Les complexes
protéiques participent à la localisation des protéines de la signalisation dans la cellule.
Certaines protéines ont pour rôle la formation de ces complexes et peuvent intervenir
uniquement comme protéines de structure du complexe telles les protéines d’échafaudage ou
peuvent participer aux réactions de la signalisation comme les protéines d’ancrage.
A. Les protéines échafaudage
Les protéines échafaudage s’associent avec plusieurs protéines pour former un complexe
permettant l’activation séquentielle de chaque protéine.
105
Figure II.7 : Mécanisme des protéines échafaudage : ces protéines se lient au protéines d’une même voie de signalisation afin de permettre la transduction du signal. (Faux and Scott 1996) De nombreux processus cellulaires activent les voies des MAPK décrites précédemment.
Plusieurs protéines associées aux complexes sont impliquées dans la transduction du signal à
différents niveaux. La cascade de la MAPK ERK peut être activée par les petites protéines G
elles même activées par les protéines GEF, ces dernières pouvant dépendre de l’activation de
la PKC.
Plus en aval dans la signalisation cellulaire, les cascades de phosphorylations des MAPK sont
favorisées par la formation de complexes incluant les protéines d’échafaudage. De
nombreuses protéines participent ainsi aux cascade des MAPK telles que la MEK partner 1
(MP1), la Paxiline, la β-Arrestine, la KSR ou les JNK interacting protein (JIP), les JNK/Stress
activated protein kinase – associated protein 1 (JSAP1) qui peuvent lier les MAPKKK, les
MAPKK et les MAPK (Morrison and Davis 2003; Dhanasekaran, Kashef et al. 2007).
L’association des MAPK aux protéines échafaudage favorise les interactions entre les
protéines mais participe également à leur translocation vers les différents compartiments de la
cellule (Mor and Philips 2006).
Figure II.8 : Rôle de la protéine échafaudage dans la signalisation des MAPK
106
Les protéines échafaudage participent à la formation des complexes mais peuvent également
être impliquées dans la spécificité de la signalisation cellulaire en favorisant la transduction
du signal au niveau des protéines auxquelles elles peuvent s’associer (Kolch 2005). De plus,
la phosphorylation de ces protéines peut modifier leur affinité pour les protéines associées et
ainsi moduler la spécificité, la durée ou l’amplitude du signal (Bogoyevitch and Kobe 2006)
Figure II.9 : exemple de spécificité de la signalisation associée aux interactions protéiques. A et B : 2 mécanismes d’interactions protéiques, C : protéines échafaudage impliquée dans la signalisation. (Tanoue and Nishida 2003)
De nombreuses protéines ne sont pas des protéines échafaudage mais peuvent participer à la
formation de complexes et participer ainsi à la signalisation cellulaire. Certains complexes
multiprotéiques associent plusieurs voies de signalisation et plusieurs protéines de régulation.
Parmi eux, le complexe MLK3 – B-Raf – Raf1 permet l’interaction entre les protéines Raf et
la modulation de leur activité respective mais permet également de coordonner l’activation
des voies de ERK et de JNK. De plus, MLK3 participe directement à la signalisation des
voies des MAPK car elle interagit avec MEK1. D’autres protéines régulatrices telles que la
protéine 14-3-3 peuvent participer à l’activation des protéines de ce complexe (partie III)
(Kyriakis 2007)
B. Les protéines d’ancrage
Les protéines d’ancrage permettent la formation de complexes protéiques et facilitent les
interactions entre les protéines possédant des rôles complémentaires, le plus souvent en
accord avec leur localisation sub-cellulaire. Elles peuvent également participer à la
signalisation cellulaire des protéines auxquelles elles sont associées (Faux and Scott 1996).
107
Figure II.10 : Mécanisme des protéines d’ancrage : La protéine d’ancrage lie les protéines ayant des activités complémentaires. (Faux and Scott 1996)
Plusieurs protéines telles que les A kinase anchoring protein (AKAP) et les RACK ont un
rôle majeur dans la signalisation cellulaire car elles peuvent s’associer aux kinases et aux
phosphatases et mettre en contact les différents sites d’interaction. Les RACK peuvent
notamment lier la PKC activée et les protéines du cytosquelette ou les protéines des sites
sous-membranaires modulant la localisation de la PKC. Comme décrit dans les paragraphes
précédents, la protéine RACK 1 peut se lier à la PKC mais elle peut également se lier à la
p120GAP inhibant ainsi, de façon PKC dépendante, l’activation et la localisation de la
p120GAP qui a pour rôle l’inactivation de la petite protéines G Ras. De même, l’Annexine 6
peut lier la PKC et la p120GAP et donc réguler l’activation de la GAP (Grewal and Enrich
2006). Certaines protéines telles que certaines petites protéines G nécessitent un ancrage
membranaire pour être activées et nécessitent leur translocation vers différents compartiments
tels que le Golgi ou la membrane plasmique (partie I).
L’exemple des AKAP
De nombreuses AKAP ont été mises en évidence. Elles sont impliquées dans des voies de
signalisation cellulaires variées telles que la signalisation de l’AMPc mais également la
régulation des voies de la PKA, de la PKC, de la calcineurine, ou de la petite protéine G Rho.
Parmi les AKAP, les mAKAP, AKAP-Lbc et AKAP79 ont particulièrement été étudiées. La
mAKAP participe à la formation du complexe multiprotéique indispensable à la signalisation
calcique liée à la signalisation de l’AMPc. Elle peut s’associée à la PKA et à la protéine
Exchange Protein Activated by cAMP (Epac) qui sont 2 protéines activées par l’AMPc et
participent aux voies de phosphorylation et à l’activation des petites protéines G. Elle se lie
également aux récepteurs canaux ryanodine qui participent à la libération de calcium et à la
contraction des myocytes et aux PDE qui dégradent l’AMPc, régulant ainsi le signal. Ce
complexe multiprotéique peut également participer à la régulation des voies des kinases et
108
phosphatases. En effet, elle peut s’associer à certaines MAPK et aux phosphatases PP2A et
PP2B. (Pare, Bauman et al. 2005; Dodge-Kafka, Langeberg et al. 2006)
Figure II.11 : complexe protéique basé sur les interactions avec mAKAP qui peut se lier une kinase (PKA), une phosphatase (CaN), une phosphodiestérase (PDE) un canal ionique (RyR : ryanodine réceptor) (Dodge-Kafka and Kapiloff 2006)
En plus de mAKAP, d’autres protéines d’ancrage peuvent réguler directement les petites
protéines G. La protéine AKAP-Lbc possède une activité GEF intrinsèque et peut activer la
petite protéine G Rho. L’activité GEF de l’AKAP-Lbc est régulée par sa propre
phosphorylation par la PKA, la dimérisation de la protéine d’ancrage et le recrutement de la
protéine 14-3-3 au niveau des sérines phosphorylées par la PKA permet une régulation
supplémentaire de l’activité GEF de l’AKAP (diviani 2006)
Figure II.12 : Régulation de l'activité GEF de AKAP par la protéine 14-3-3
De nombreuses études ont montré l’implication de l’AKAP 79 (homologue de l’AKAP150
chez le rat) dans un complexe protéique impliquant la PKA mais également la PKC, et la
calcineurine. La présence de phosphatases et de kinases dans le même complexes
multiprotéique suggère un régulation des phosphorylations des protéines cibles. (Malbon 2004
Faux 1997)
109
Les AKAP peuvent réguler les voies de signalisation en favorisant les interactions entre les
différentes protéines et elles peuvent interagir directement avec les protéines qu’elles lient.
Enfin, elles peuvent jouer un rôle régulateur en formant des complexes comprenant des
kinases et des phosphatases. Les protéines d’ancrage peuvent interagir avec les protéines de
structure et du cytosquelette participant ainsi à la localisation subcellulaire des protéines
qu’elles lient.
110
Introduction de l'article 3
Rôle de la PKC lors de l’étirement.
Lors de l’étirement des cardiomyocytes en culture, la plupart des voies de signalisation liées à
l’hypertrophie sont activées. L’étirement entraîne l’activation de la PKC qui entraîne
l’activation des MAPK (Komuro, Yamazaki et al. 1995; Yamazaki, Komuro et al. 1995). La
PKC peut activer les voies des MAPK en interagissant directement avec la protéine Raf ou en
participeant à l’activation des petites protéines G notamment Ras et Rho.
Rôle de la calcineurine lors de l’étirement.
Le rôle de la calcineurine lors de l’étirement et de l’hypertrophie est controversé. Elle a été
associée à une diminution de l’hypertrophie et de l’expression du BNP (kudoh akazawa
2003). Cependant d’autres travaux montrent que l’activation de la calcineurine entraîne une
hypertrophie du myocarde qui est inhibée par l’inhibition de son import nucléaire {Heineke,
2006 #7}{Hallhuber, 2006 #402})
Objectif de l’étude
La PKC et la calcineurine sont 2 protéines impliquées dans la signalisation de l’hypertrophie.
Ces protéines dont les activités sont opposées peuvent s’associer à des protéines telles que les
protéines d’ancrage afin de réguler la phosphorylation de protéines cibles (Sim and Scott
1999). Le but des ces travaux est de déterminer dans quelle mesure les 2 voies interagissent
lors de l’étirement des cardiomyocytes de rats nouveaux-nés et si des protéines parmi
lesquelles les protéines d’ancrage et d’échafaudage sont impliquées dans la formation de
complexes protéiques impliquant la PKC et la calcineurine. Nous avons donc recherché une
interaction de la PKC avec l’AKAP150 modulée par l’étirement qui pourrait moduler la
réponse cellulaire comme cela a précédemment été décrit dans d'autre modèle (Sim and Scott
1999; Hoshi, Langeberg et al. 2005).
111
Article 3
Dual level of interactions between calcineurin and PKC-epsilon in
cardiomyocyte stretch.
112
Conclusion
L'étirement des cardiomyocytes entraîne l'activation des MAPK et l'expression des gènes par
de nombreuses voies de signalisation dont les voies de la PKC et de la calcineurine. Ces 2
voies sont impliquées dans la signalisation de l'étirement cellulaire mais l'interaction entre ces
voies n'avait jamais été démontrée.
Ces travaux montrent l'activation par l'étirement de la PKC et son implication dans l'activation
des MAPK. L'activation de la PKC se traduit par la translocation de la protéine de la fraction
cytosolique vers la fraction membranaire des cardiomyocytes de rats nouveaux-nés (Rao,
Shiraishi et al. 2004) et adultes (Boivin and Allen 2003). Elle est reconnue comme étant
nécessaire à l'activation de la PKC et peut être modulée par l'utilisation de peptides inhibiteurs
analogues des RACK (Churchill, Budas et al. 2007). Ces peptides montrent l’importance de la
formation de complexes protéiques dans la signalisation et dans l’activation de la PKC
(Csukai, Chen et al. 1997). Or ces complexes sont également impliqués dans la signalisation
cellulaire de l'hypertrophie in vivo (Mochly-Rosen, Wu et al. 2000). Nous montrons dans ces
travaux que d’autres complexes peuvent se former notamment un complexe PKC /
calcineurine. Cette interaction est nécessaire à la translocation et à l’activation de la PKC.
Lors de l’étirement, les 2 protéines sont co-localisées dans la région périnucléaire,
probablement au niveau de l’appareil de Golgi. Csukai et al ont montré que la PKC activée
peut être transloquée vers cette structure mais cette translocation nécessite l’association de la
kinase avec les RACK. La formation de complexes est donc nécessaire à l'activation de la
PKC. Cependant d'autres protéines sont susceptibles d'interagir avec la PKC. Plusieurs études
ont montré l’association de la PKC et de AKAP (Faux, Rollins et al. 1999; Oliveria, Gomez et
al. 2003). Nous avons donc recherché une association des 2 protéines lors de l’étirement mais
nous n’avons pas constaté de coprécipitation des 2 protéines. L’absence d’association de la
PKC et de AKAP peut être dûe à l’état de phosphorylation de la PKC qui est
hypophosphorylée lorsqu’elle est inactive et ne peut se lier à AKAP que sous cette forme
(Takahashi 2000). Or l’étirement entraîne une activation de la PKC qui ne permettrait pas sa
liaison à la protéine d’ancrage.
Ces travaux apportent d'une part une meilleure compréhension des voies de signalisation
conduisant à l'activation des MAPK et d'autre part participent à la mise en évidence de
mécanismes de signalisation complexe.
113
Travaux en cours, perspectives et conclusion générale
114
En continuité avec les travaux présentés dans la partie II où nous montrons que la PKC et
l'AKAP150 n'interagissent pas lors de l'étirement, nous avons recherché d'autres protéines qui
pourraient interagir avec la PKCε et éventuellement moduler ses interactions avec les autres
protéines dont la calcineurine. Nous avons recherché une interaction de la PKC avec la
protéine 14-3-3 car 14-3-3 peut moduler l'activation ou l'activité des protéines qu'elle lie.
I. Interaction de la protéine 14-3-3 et de la PKC
A. Les protéines 14-3-3
Leur nom particulier est dû à leur élution en chromatographie sur DEAE-cellulose en 2
dimensions. Elles ont été identifiées la première fois par Moore et Perez en 1967. Les
protéines 14-3-3 forment une famille de protéines d’environ 30kDa exprimées dans un grand
nombre de tissus. Cette famille compte 7 isoformes majeures (β, ε, γ, η, σ, τ, ζ). Les
isoformes α et δ sont les formes phosphorylées de β et ζ. Les protéines 14-3-3 forment des
dimères et peuvent, en fonction de leurs propres phosphorylations, interagir avec un grand
nombre de protéines phosphorylées parmi lesquelles Raf1, Akt Bcr ou les protéines du
cytosquelette. Elles sont notamment impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, dans le
trafic intracellulaire et dans la transcription des gènes (Aitken, Baxter et al. 2002; Pozuelo
Rubio, Geraghty et al. 2004; Aitken 2006).
Les protéines 14-3-3 s’organisent en dimères qui peuvent, comme les protéines d’ancrage,
s’associer à 2 protéines afin de favoriser leurs interactions (figure C.1). Comme pour les
protéines d’ancrage, l'association de différentes protéines permet leurs interactions. Plusieurs
motifs consensus permettent l’interaction avec 14-3-3, principalement les motifs RSXpSXP et
RXY/FXpSXP. Chacun de ces motifs contient une sérine phosphorylée. Un 3ème motif a été
mis en évidence, -pS/pT X1-2-CO2 H. Les peptides permettant la reconnaissance des ces
motifs sont conservés dans toutes les isoformes de 14-3-3. Néanmoins, 14-3-3 peut
reconnaître d’autres sites qui ne correspondent pas à ces motifs et qui dans certain cas, ne
comportent pas de résidu phosphorylé (Fu, Subramanian et al. 2000; Dougherty and Morrison
2004).
115
Figure C.1 : Dimère de 14-3-3
Dans un premier temps, 14-3-3 (ou KCIP1) a été identifiée comme un inhibiteur de la PKC
(Toker, Sellers et al. 1992). Il a été montré ultérieurement que 14-3-3 peut s'associer à la PKC
et réguler son activité (Gannon-Murakami and Murakami 2002). Enfin, la PKC participe à la
phosphorylation de 14-3-3 (Aitken 2006).
B. Résultat : interaction de la protéine 14-3-3 et de la PKC
Nous avons recherché dans notre modèle une interaction de la PKC et de 14-3-3. Notre
hypothèse de départ étant que l'étirement pourrait moduler l'association de la PKC et de 14-3-
3 et ainsi participer à la formation du complexe de la PKC avec la calcineurine.
Résultat
Figure C.2 : Interaction de 14-3-3 et PKCε (PG : protéines G, C : contrôle, S : Stretch)
L'immunoprécipitation de la protéine 14-3-3 et la détection de la PKC montre que lors de
l'étirement, la PKC et la protéine 14-3-3 forme un complexe. Ces travaux complètent ceux de
l'article 2 et devront donc être complétés par la recherche de la formation d'un complexe
116
PKCε/14-3-3/calcineurine induite par l'étirement. Puis, dans un second temps il faudra
déterminer dans quelle mesure l'interaction de la PKC avec 14-3-3 est impliquée lors de
l'étirement.
Une extension de l’étude des partenaires de la PKC lors de l’étirement pourra également être
réalisée en précipitant la PKC par immunoprécipitation et en réalisant une étude protéomique
des protéines associées à la PKC.
II. Analyse protéomique des modifications induites par l'étirement
et résultats préliminaires
A. Analyse protéomique :
Parallèlement à l’étude des protéines associées à la PKC et en collaboration avec F. Pinet
(INSERM U508), nous avons utilisé une approche protéomique globale des modifications
protéiques impliquées lors d’un étirement de 15 minutes des cardiomyocytes de rats nouveaux
nés. 2 lots de lysats cellulaires ont été analysés : des lysats cellulaires de cardiomyocytes non
étirés et de cellules étirés. Ils sont soumis à une électrophorèse bidimensionnelle qui, dans un
premier temps sépare les protéines selon leur point isoélectrique (pI) puis selon leur poids
moléculaire. Pour la première migration, les échantillons sont déposés sur des gels à forte
porosité et présentant un gradient de pH. Les protéines des échantillons soumises à un courant
électrique migrent jusqu'à leur point d’électrofocalisation où leur charge devient nulle. Pour la
seconde migration, les protéines séparées selon leur pI sont soumises à un courant électrique
perpendiculaire au premier qui entraîne les protéines dans un gel contenant du sodium
dodécyl sulfate (SDS) qui charge les protéines négativement. Ces dernières migrent selon leur
poids moléculaire.
Les gels de chaque échantillon sont colorés afin de visualiser les protéines puis ils sont
numérisés et enfin analysés par informatique. L’analyse se fait par comparaison du gel
contenant les protéines du lysat de cellules contrôles et de celui contenant les protéines du
lysat de cellules étirées. L’objectif de ces méthodes est d’identifier les protéines
différentiellement exprimées.
117
Figure C.3 : Gel bidimentionnel après analyse informatique et identification des protéines différentiellement exprimées.
Chaque spot de protéines différentiellement exprimées est récupéré et analysé par
spéctométrie de masse afin d’identifier la ou les protéines qui le composent (Patterson 2000;
Patterson 2000).
L’analyse des gels a permis de mettre en évidence 7 protéines différentiellement exprimées.
Figure C.4 : Identification des protéines modifiées lors de l’étirement.
Pi Mr
(kDa)258
> 1,61 414
< 1,53 5,97
73,8
5,39
515,88
56,65,06
53,6
4,96
49,9
8,05
61,4
1311 < 5,97 4,6
29,2
1181 > 1,38 1284 < 1,38
Modulation
chez les C
étirées
Nom de la
protéine Accession
number
Spot non découpé
Spot non découpé
< 1,45 Stress-70 protein P48721
> 3,02 Heterogeneous
nuclear
P61980
> 1,75 Protein disulfide- isomerase A3
P11598
> 1,84 Vimentin P31000
< 1,22 Tubulin alpha-6
chain Q6AYZ1
14-3-3 protein
epsilon P62260
Non identifiée
< 1,57 Glutamate
dehydrogenase 1
P10860
Non identifiée
Non identifiée
N° du
spot
502
566
662
685
696
760
1134 < 1,64
118
L’étirement appliqué aux cellules est court et ne permet pas de mettre en évidence un
changement de la quantité de protéines synthétisées par les cellules. En revanche, la migration
sur gel 2 dimensions peut permettre de visualiser des changements de phosphorylation
(Sheffield and Gavinski 2003).
Parmi les protéines identifiées par spectrométrie, 3 sont particulièrement intéressantes : 14-3-
3 que nous étudiions déjà et 2 protéines du cytosquelette : la vimentine et la tubuline.
Le cytosquelette et son rôle ont été décrits dans l'introduction de ce mémoire.
La vimentine est une protéine des filaments intermédiaires qui est exprimée dans les
cardiomyocytes immatures mais son expression diminue au cours du développement. Dans les
cardiomyocytes adultes, les filaments intermédiaires sont majoritairement composés de
desmine (Wang, Chen et al. 2003). Le cœur n’est néanmoins pas dépourvu de vimentine qui
est exprimée dans les fibroblastes qui peuvent également être sensibles aux variations des
forces qui leur sont appliquées et dans des cellules épithéliales des vaisseaux dans lesquels la
vimentine est la protéine majoritaire des filaments intermédiaires et dans lesquels elle a un
rôle majeur dans la perception des forces de cisaillement (Pekny and Lane 2007). Chez
l’homme, la vimentine n’est pas exprimée dans les cardiomyocytes adultes (Heling,
Zimmermann et al. 2000). Elle n’est détectable que dans les cardiomycoytes du nouveau né.
La présence de la vimentine dans nos résultats de protéomique peut être due à une
contamination de nos cultures par les fibroblastes qui peuvent représenter 5% des cellules en
culture. Néanmoins, le co-marquage de la vimentine et de l’α-actinine, spécifiques des
cardiomyocytes, montre que les cardiomyocytes de rats nouveaux nés expriment la vimentine.
L’étude des modifications des filaments intermédiaires et de la vimentine pourront avoir une
relevance significative lors de l’étude de la signalisation et du comportement intracellulaire
des protéines et lors de l’étude des pathologies telles que les cardiopathies dilatées (Di
Somma, Marotta et al. 2000; Oriolo, Wald et al. 2007).
Nous avons porté un intérêt particulier à la tubuline car, comme il est décrit dans
l'introduction, elle participe à la structure du cytosquelette de la cellule. De plus, la protéine
14-3-3 peut se lier à la tubuline (Jin, Smith et al. 2004; Pozuelo Rubio, Geraghty et al. 2004).
Nous avons donc recherché une éventuelle association entre les 2 protéines induite par
l'étirement.
119
B. Résultat préliminaire : co-localisation de la protéine 14-3-3 et de la PKC
Figure C.5 : Immunomarquage de la tubuline et de 14-3-3 en condition contrôle et lors de l'étirement des cardiomyocytes de rats nouveaux-nés.
Les premiers résultats, présentés ci-dessus, montrent que dans les conditions contrôles, la
tubuline et la protéine 14-3-3 sont colocalisées dans la région périnucléaire tandis que, lors de
l'étirement, la colocalisation périnucléaire diminue. Ces résultats nous ont permis d’émettre
l’hypothèse de l’existence d’un rôle de 14-3-3 dans les modifications que subit le
cytosquelette lors de l’étirement. Ce travail pourra être complété par la détection des
modifications de la phosphorylation de la tubuline et de 14-3-3 induites par l’étirement mises
en évidence par l’étude protéomique.
Enfin, ces travaux devront être complétés par la recherche d’une modulation de l'interaction
entre la tubuline et 14-3-3 par co-immunoprécipitation et nous rechercherons un lien avec la
liaison de la PKC et de 14-3-3 induite par l'étirement. Le traitement des cellules par des
siRNA de 14-3-3 permettra ensuite de déterminer dans quelle mesure l’association de 14-3-3
et de la tubuline est nécessaire à la cellule lors de l’étirement.
Control
Stretch
α−Tubulin 14-3-3ε Merge
120
Conclusion
Nous avons montré au cours des différentes études rapportées dans ce mémoire que
l’étirement entraîne l’activation de plusieurs voies de signalisation parmi lesquelles les voies
de la PKC, de la calcineurine, des petites protéines G, de l’EGFR et nous avons tenté de
caractériser plus précisément les rôles de certaines protéines impliquées dans l’activation des
MAPK ERK et JNK. Ces travaux nous ont amenés à avoir 2 approches différentes de la
compréhension des voies de signalisation. D’une part, nous avons étudié les rôles de certaines
tyrosines kinases (EGFR et pyk2), de la voie PI3K/Akt et des petites protéines G en tant que
protéines potentiellement nécessaires à l’activation des MAPK lors de l’étirement. D’autre
part, nous avons cherché à mettre en évidence plusieurs interconnexions entre les différentes
voies activées par l’étirement cellulaire en montrant notamment la formation de complexes
protéiques nécessaires à l’activation des différents partenaires.
Signalisation cellulaire induite par l'étirement.
L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation
similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. Lors de
l'étirement, comme lors de l'hypertrophie, de nombreuses études montrent l'activation des
voies de MAPK. De nombreux travaux avaient déjà montré l'activation des MAPK par la voie
Ras-Raf-MEK mais d’autres remettaient en question le rôle de Ras en montrant une activation
directe de la protéine Raf ou même l’absence d’effet du dominant négatif de Ras. Notre
objectif était donc d'étudier plus en détail les voies d'activation des MAPK, notamment les
rôles des tyrosines kinases et le rôle de la petite protéine G Ras.
Les travaux présentés dans ce mémoire nous ont permis de confirmer que l’EGFR a un rôle
majeur dans l’activation de ERK. L'aspect le plus nouveau de ce travail a été de montrer qu'à
l'état basal l'EGFR active ERK par une voie dépendante de Ras alors que, lors de l’étirement,
l’EGFR active ERK par une voie indépendante de Ras. Parmi les voies de signalisation en
aval de l’EGFR, nous avons recherché l’implication de la voie PI3K et nous avons montré que
cette voie peut activer ERK. Ce résultat était intéressant dans la mesure où ces 2 voies sont
généralement considérées comme indépendantes. L'interaction trouvée entre la voie Ras-Raf-
121
MEK-ERK et la voie de la PI3 kinase est un exemple des multiples interactions entre des
voies de signalisation considérées jusque là comme indépendantes.
Cette complexité rend difficile l'étude des voies puisque l'inhibition d'une voie n'entraîne pas
obligatoirement l'inhibition de toutes les protéines en aval. Certaines inhibitions peuvent être
compensées par l'activation d'autres voies comme nous le montrons lors de l'inhibition de la
petite protéine G Ras. Une des bases de ces interconnexions peut être la formation de
complexes multiprotéiques qui a été l'autre approche de notre travail.
Formation de complexes protéiques
Comme en ce qui concerne les voies de la cascade des MAPK et de la PI3K, nous avons
montré que les voies de la calcineurine et de la PKC, qui sont considérées comme
indépendantes sont en réalité interconnectées, au moins dans notre modèle d'étirement des
cardiomyocytes. Nous avons mis en évidence la formation d'un complexe PKC/calcineurine
dans lequel pourraient s'associer des protéines comme les protéines échafaudage ou les
protéines d’ancrage. Ces protéines peuvent avoir un rôle dans la modulation de l’activation
des protéines qu'elles lient, elles peuvent favoriser les interactions entre ces protéines, enfin,
elles peuvent participer à leur localisation intracellulaire.
C'est ainsi que nous avons recherché d'abord AKAP150 en raison de sa nature de protéine
d'échafaudage. Nous n'avons pas retrouvé d'association de cette protéine avec la PKCε lors
de l'étirement. Nous nous sommes ensuite intéressés à la protéine 14-3-3 vcar elle lie de très
nombreuses protéines phosphorylées et elle a un rôle dans la régulation de la PKC. Des
résultats préliminaires semblent indiquer qu'une association existe entre 14-3-3 et la PKC, et
nous posons l'hypothèse d'une liaison mutuellement exclusive de la PKC avec soit sa protéine
d'ancrage RACK présente au niveau du Golgi soit avec 14-3-3. Des travaux complémentaires
seront nécessaires pour confirmer cette hypothèse.
Une autre approche pour rechercher d’autres protéines impliquées dans la formation des
complexes contenant la PKC est la protéomique. Nous avons utilisé cette approche pour
rechercher des modifications de l'expression des protéines lors de l'étirement mais la
protéomique peut aussi être utilisée pour rechercher d'autres partenaires d'une protéine. C'est
ainsi que des analyses informatiques complexes ont permis de mettre en évidence la
122
multiplicité des partenaires possibles de l'EGFR (Jones, Gordus et al. 2006). Bien qu'elles
soient très complexes, ces études ne prennent en compte la microcompartimentation
intracellulaire qui est un facteur supplémentaire pouvant limiter les interactions protéine-
protéine.
Une meilleure connaissance des voies de signalisation impliquées dans l'étirement des
cardiomyocytes et plus généralement dans l'hypertrophie ventriculaire n'est pas purement
cognitive. Elle peut permettre d'ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques basées non plus
sur l'inhibition d'une protéine mais sur l’inhibition d'une interaction entre 2 protéines
(Churchill, Budas et al. 2007). Un exemple est celui de l'interaction PKC/RACK qui a permis
de mettre au point des peptides analogues à leur site d'interaction. Développés comme outils
pour mieux comprendre les mécanismes d'activation de la PKC - et c'est de cette façon que
nous les avons utilisés – il est possible d'envisager qu'ils puissent être utilisés comme
inhibiteurs de la PKC. Ce type d'approche est représentatif de l'effort à réaliser dans la
perspective de mettre au point ces nouvelles voies thérapeutiques.
123
Références
Adnane, J., E. Seijo, et al. (2002). "RhoB, not RhoA, represses the transcription of the transforming growth factor beta type II receptor by a mechanism involving activator protein 1." J Biol Chem 277(10): 8500-7.
Ahuja, P., P. Sdek, et al. (2007). "Cardiac myocyte cell cycle control in development, disease, and regeneration." Physiol Rev 87(2): 521-44.
Aikawa, R., I. Komuro, et al. (1999). "Rho family small G proteins play critical roles in mechanical stress-induced hypertrophic responses in cardiac myocytes." Circ Res 84(4): 458-66.
Aitken, A. (2006). "14-3-3 proteins: a historic overview." Semin Cancer Biol 16(3): 162-72. Aitken, A., H. Baxter, et al. (2002). "Specificity of 14-3-3 isoform dimer interactions and
phosphorylation." Biochem Soc Trans 30(4): 351-60. Aitken, A., S. Howell, et al. (1995). "Post-translationally modified 14-3-3 isoforms and
inhibition of protein kinase C." Mol Cell Biochem 149-150: 41-9. Anderson, H. D., F. Wang, et al. (2004). "Role of the epidermal growth factor receptor in
signaling strain-dependent activation of the brain natriuretic peptide gene." J Biol Chem 279(10): 9287-97.
Aoki, H., M. Richmond, et al. (2000). "Specific role of the extracellular signal-regulated kinase pathway in angiotensin II-induced cardiac hypertrophy in vitro." Biochem J 347 Pt 1: 275-84.
Appaix, F., A. V. Kuznetsov, et al. (2003). "Possible role of cytoskeleton in intracellular arrangement and regulation of mitochondria." Exp Physiol 88(1): 175-90.
Appels, N. M., J. H. Beijnen, et al. (2005). "Development of farnesyl transferase inhibitors: a review." Oncologist 10(8): 565-78.
Asakura, M., M. Kitakaze, et al. (2002). "Cardiac hypertrophy is inhibited by antagonism of ADAM12 processing of HB-EGF: metalloproteinase inhibitors as a new therapy." Nat Med 8(1): 35-40.
Avraham, H., S. Y. Park, et al. (2000). "RAFTK/Pyk2-mediated cellular signalling." Cell Signal 12(3): 123-33.
Baba, H. A., J. Stypmann, et al. (2003). "Dynamic regulation of MEK/Erks and Akt/GSK-3beta in human end-stage heart failure after left ventricular mechanical support: myocardial mechanotransduction-sensitivity as a possible molecular mechanism." Cardiovasc Res 59(2): 390-9.
Bailey, B. A., K. Dipla, et al. (1997). "Cellular basis of contractile derangements of hypertrophied feline ventricular myocytes." J Mol Cell Cardiol 29(7): 1823-35.
Barki-Harrington, L., C. Perrino, et al. (2004). "Network integration of the adrenergic system in cardiac hypertrophy." Cardiovasc Res 63(3): 391-402.
Barnett, M. E., D. K. Madgwick, et al. (2007). "Protein kinase C as a stress sensor." Cell Signal 19(9): 1820-9.
Barr, A. J. and S. Knapp (2006). "MAPK-specific tyrosine phosphatases: new targets for drug discovery?" Trends Pharmacol Sci 27(10): 525-30.
Batzer, A. G., D. Rotin, et al. (1994). "Hierarchy of binding sites for Grb2 and Shc on the epidermal growth factor receptor." Mol Cell Biol 14(8): 5192-201.
Bayer, A. L., A. G. Ferguson, et al. (2001). "Pyk2 expression and phosphorylation in neonatal and adult cardiomyocytes." J Mol Cell Cardiol 33(5): 1017-30.
124
Bayer, A. L., M. C. Heidkamp, et al. (2003). "Protein kinase C epsilon-dependent activation of proline-rich tyrosine kinase 2 in neonatal rat ventricular myocytes." J Mol Cell Cardiol 35(9): 1121-33.
Bayer, A. L., M. C. Heidkamp, et al. (2002). "PYK2 expression and phosphorylation increases in pressure overload-induced left ventricular hypertrophy." Am J Physiol Heart Circ Physiol 283(2): H695-706.
Beals, C. R., N. A. Clipstone, et al. (1997). "Nuclear localization of NF-ATc by a calcineurin-dependent, cyclosporin-sensitive intramolecular interaction." Genes Dev 11(7): 824-34.
Biondi, R. M. and A. R. Nebreda (2003). "Signalling specificity of Ser/Thr protein kinases through docking-site-mediated interactions." Biochem J 372(Pt 1): 1-13.
Blobel, C. P. (2005). "ADAMs: key components in EGFR signalling and development." Nat Rev Mol Cell Biol 6(1): 32-43.
Bogoyevitch, M. A., P. E. Glennon, et al. (1994). "Endothelin-1 and fibroblast growth factors stimulate the mitogen-activated protein kinase signaling cascade in cardiac myocytes. The potential role of the cascade in the integration of two signaling pathways leading to myocyte hypertrophy." J Biol Chem 269(2): 1110-9.
Bogoyevitch, M. A. and B. Kobe (2006). "Uses for JNK: the many and varied substrates of the c-Jun N-terminal kinases." Microbiol Mol Biol Rev 70(4): 1061-95.
Bogoyevitch, M. A., P. J. Parker, et al. (1993). "Characterization of protein kinase C isotype expression in adult rat heart. Protein kinase C-epsilon is a major isotype present, and it is activated by phorbol esters, epinephrine, and endothelin." Circ Res 72(4): 757-67.
Boivin, B. and B. G. Allen (2003). "Regulation of membrane-bound PKC in adult cardiac ventricular myocytes." Cell Signal 15(2): 217-24.
Bookwalter, C. S. and K. M. Trybus (2006). "Functional consequences of a mutation in an expressed human alpha-cardiac actin at a site implicated in familial hypertrophic cardiomyopathy." J Biol Chem 281(24): 16777-84.
Brancaccio, M., E. Hirsch, et al. (2006). "Integrin signalling: the tug-of-war in heart hypertrophy." Cardiovasc Res 70(3): 422-33.
Browe, D. M. and C. M. Baumgarten (2003). "Stretch of beta 1 integrin activates an outwardly rectifying chloride current via FAK and Src in rabbit ventricular myocytes." J Gen Physiol 122(6): 689-702.
Browe, D. M. and C. M. Baumgarten (2004). "Angiotensin II (AT1) receptors and NADPH oxidase regulate Cl- current elicited by beta1 integrin stretch in rabbit ventricular myocytes." J Gen Physiol 124(3): 273-87.
Browe, D. M. and C. M. Baumgarten (2006). "EGFR kinase regulates volume-sensitive chloride current elicited by integrin stretch via PI-3K and NADPH oxidase in ventricular myocytes." J Gen Physiol 127(3): 237-51.
Budas, G. R., E. N. Churchill, et al. (2007). "Cardioprotective mechanisms of PKC isozyme-selective activators and inhibitors in the treatment of ischemia-reperfusion injury." Pharmacol Res 55(6): 523-36.
Bueno, O. F., L. J. De Windt, et al. (2001). "The dual-specificity phosphatase MKP-1 limits the cardiac hypertrophic response in vitro and in vivo." Circ Res 88(1): 88-96.
Butler, B. and S. D. Blystone (2005). "Tyrosine phosphorylation of beta3 integrin provides a binding site for Pyk2." J Biol Chem 280(15): 14556-62.
Calaghan, S. C., J. Y. Le Guennec, et al. (2004). "Cytoskeletal modulation of electrical and mechanical activity in cardiac myocytes." Prog Biophys Mol Biol 84(1): 29-59.
Calderone, A., N. Takahashi, et al. (1995). "Pressure- and volume-induced left ventricular hypertrophies are associated with distinct myocyte phenotypes and differential induction of peptide growth factor mRNAs." Circulation 92(9): 2385-90.
125
Camps, M., A. Nichols, et al. (2000). "Dual specificity phosphatases: a gene family for control of MAP kinase function." Faseb J 14(1): 6-16.
Carpenter, C. L., K. R. Auger, et al. (1993). "Phosphoinositide 3-kinase is activated by phosphopeptides that bind to the SH2 domains of the 85-kDa subunit." J Biol Chem 268(13): 9478-83.
Cazorla, O., G. Vassort, et al. (1999). "Length modulation of active force in rat cardiac myocytes: is titin the sensor?" J Mol Cell Cardiol 31(6): 1215-27.
Cenni, V., H. Doppler, et al. (2002). "Regulation of novel protein kinase C epsilon by phosphorylation." Biochem J 363(Pt 3): 537-45.
Chan, H. W., N. J. Smith, et al. (2006). "Tackling the EGFR in pathological tissue remodelling." Pulm Pharmacol Ther 19(1): 74-8.
Chang, A. N. and J. D. Potter (2005). "Sarcomeric protein mutations in dilated cardiomyopathy." Heart Fail Rev 10(3): 225-35.
Chattopadhyay, A., M. Vecchi, et al. (1999). "The role of individual SH2 domains in mediating association of phospholipase C-gamma1 with the activated EGF receptor." J Biol Chem 274(37): 26091-7.
Chen, J., B. Fabry, et al. (2001). "Twisting integrin receptors increases endothelin-1 gene expression in endothelial cells." Am J Physiol Cell Physiol 280(6): C1475-84.
Chiloeches, A., H. F. Paterson, et al. (1999). "Regulation of Ras.GTP loading and Ras-Raf association in neonatal rat ventricular myocytes by G protein-coupled receptor agonists and phorbol ester. Activation of the extracellular signal-regulated kinase cascade by phorbol ester is mediated by Ras." J Biol Chem 274(28): 19762-70.
Chong, H., H. G. Vikis, et al. (2003). "Mechanisms of regulating the Raf kinase family." Cell Signal 15(5): 463-9.
Choquet, D., D. P. Felsenfeld, et al. (1997). "Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages." Cell 88(1): 39-48.
Churchill, E., G. Budas, et al. (2007). "PKC Isozymes in Chronic Cardiac Disease: Possible Therapeutic Targets?" Annu Rev Pharmacol Toxicol.
Clerk, A., T. E. Cullingford, et al. (2007). "Signaling pathways mediating cardiac myocyte gene expression in physiological and stress responses." J Cell Physiol 212(2): 311-22.
Clerk, A., F. H. Pham, et al. (2001). "Regulation of mitogen-activated protein kinases in cardiac myocytes through the small G protein Rac1." Mol Cell Biol 21(4): 1173-84.
Clerk, A. and P. H. Sugden (2000). "Small guanine nucleotide-binding proteins and myocardial hypertrophy." Circ Res 86(10): 1019-23.
Clerk, A. and P. H. Sugden (2001). "Untangling the Web: specific signaling from PKC isoforms to MAPK cascades." Circ Res 89(10): 847-9.
Cohen, P. T. (1997). "Novel protein serine/threonine phosphatases: variety is the spice of life." Trends Biochem Sci 22(7): 245-51.
Correa-Meyer, E., L. Pesce, et al. (2002). "Cyclic stretch activates ERK1/2 via G proteins and EGFR in alveolar epithelial cells." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282(5): L883-91.
Coulombe, P. and S. Meloche (2007). "Atypical mitogen-activated protein kinases: structure, regulation and functions." Biochim Biophys Acta 1773(8): 1376-87.
Csukai, M., C. H. Chen, et al. (1997). "The coatomer protein beta'-COP, a selective binding protein (RACK) for protein kinase Cepsilon." J Biol Chem 272(46): 29200-6.
Dassouli, A., J. C. Sulpice, et al. (1993). "Stretch-induced inositol trisphosphate and tetrakisphosphate production in rat cardiomyocytes." J Mol Cell Cardiol 25(8): 973-82.
Davis, R. J. (1993). "The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway." J Biol Chem 268(20): 14553-6.
126
DeBosch, B., I. Treskov, et al. (2006). "Akt1 is required for physiological cardiac growth." Circulation 113(17): 2097-104.
Dhanasekaran, D. N., K. Kashef, et al. (2007). "Scaffold proteins of MAP-kinase modules." Oncogene 26(22): 3185-202.
Di Somma, S., M. Marotta, et al. (2000). "Changes in myocardial cytoskeletal intermediate filaments and myocyte contractile dysfunction in dilated cardiomyopathy: an in vivo study in humans." Heart 84(6): 659-67.
Dickinson, R. J. and S. M. Keyse (2006). "Diverse physiological functions for dual-specificity MAP kinase phosphatases." J Cell Sci 119(Pt 22): 4607-15.
Diviani, D., L. Abuin, et al. (2004). "Anchoring of both PKA and 14-3-3 inhibits the Rho-GEF activity of the AKAP-Lbc signaling complex." Embo J 23(14): 2811-20.
Diviani, D., L. Baisamy, et al. (2006). "AKAP-Lbc: a molecular scaffold for the integration of cyclic AMP and Rho transduction pathways." Eur J Cell Biol 85(7): 603-10.
Djordjevic, S. and P. C. Driscoll (2002). "Structural insight into substrate specificity and regulatory mechanisms of phosphoinositide 3-kinases." Trends Biochem Sci 27(8): 426-32.
Dodge-Kafka, K. L. and M. S. Kapiloff (2006). "The mAKAP signaling complex: integration of cAMP, calcium, and MAP kinase signaling pathways." Eur J Cell Biol 85(7): 593-602.
Dodge-Kafka, K. L., L. Langeberg, et al. (2006). "Compartmentation of cyclic nucleotide signaling in the heart: the role of A-kinase anchoring proteins." Circ Res 98(8): 993-1001.
Donker, D. W., J. G. Maessen, et al. (2007). "Impact of acute and enduring volume overload on mechanotransduction and cytoskeletal integrity of canine left ventricular myocardium." Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(5): H2324-32.
Dorn, G. W., 2nd and T. Force (2005). "Protein kinase cascades in the regulation of cardiac hypertrophy." J Clin Invest 115(3): 527-37.
Dougherty, M. K. and D. K. Morrison (2004). "Unlocking the code of 14-3-3." J Cell Sci 117(Pt 10): 1875-84.
Engelhardt, S. (2007). "Alternative signaling: cardiomyocyte beta1-adrenergic receptors signal through EGFRs." J Clin Invest 117(9): 2396-8.
Epstein, N. D. and J. S. Davis (2003). "Sensing stretch is fundamental." Cell 112(2): 147-50. Etienne-Manneville, S. and A. Hall (2002). "Rho GTPases in cell biology." Nature 420(6916):
629-35. Eto, Y., K. Yonekura, et al. (2000). "Calcineurin is activated in rat hearts with physiological
left ventricular hypertrophy induced by voluntary exercise training." Circulation 101(18): 2134-7.
Evans, H. J. and R. L. Goodwin (2007). "Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development." Mol Cell Biochem 303(1-2): 189-99.
Fabiato, A. and F. Fabiato (1976). "Dependence of calcium release, tension generation and restoring forces on sarcomere length in skinned cardiac cells." Eur J Cardiol 4 Suppl: 13-27.
Farooq, A. and M. M. Zhou (2004). "Structure and regulation of MAPK phosphatases." Cell Signal 16(7): 769-79.
Faux, M. C., E. N. Rollins, et al. (1999). "Mechanism of A-kinase-anchoring protein 79 (AKAP79) and protein kinase C interaction." Biochem J 343 Pt 2: 443-52.
Faux, M. C. and J. D. Scott (1996). "Molecular glue: kinase anchoring and scaffold proteins." Cell 85(1): 9-12.
127
Ferguson, K. M. (2004). "Active and inactive conformations of the epidermal growth factor receptor." Biochem Soc Trans 32(Pt 5): 742-5.
Fickova, M. (2002). "Structure and activation of EGF receptor: minireview." Endocr Regul 36(2): 87-93.
Force, T., A. Michael, et al. (2002). "Stretch-activated pathways and left ventricular remodeling." J Card Fail 8(6 Suppl): S351-8.
Fu, H., R. R. Subramanian, et al. (2000). "14-3-3 proteins: structure, function, and regulation." Annu Rev Pharmacol Toxicol 40: 617-47.
Fuchs, F. and Y. P. Wang (1996). "Sarcomere length versus interfilament spacing as determinants of cardiac myofilament Ca2+ sensitivity and Ca2+ binding." J Mol Cell Cardiol 28(7): 1375-83.
Fuller, S. J., E. L. Davies, et al. (1997). "Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 inhibits the stimulation of gene expression by hypertrophic agonists in cardiac myocytes." Biochem J 323 ( Pt 2): 313-9.
Fuller, S. J., J. R. Mynett, et al. (1992). "Stimulation of cardiac protein synthesis by insulin-like growth factors." Biochem J 282 ( Pt 1): 85-90.
Gannon-Murakami, L. and K. Murakami (2002). "Selective association of protein kinase C with 14-3-3 zeta in neuronally differentiated PC12 Cells. Stimulatory and inhibitory effect of 14-3-3 zeta in vivo." J Biol Chem 277(26): 23116-22.
Goldberg, M. and S. F. Steinberg (1996). "Tissue-specific developmental regulation of protein kinase C isoforms." Biochem Pharmacol 51(8): 1089-93.
Goldspink, G. (1999). "Changes in muscle mass and phenotype and the expression of autocrine and systemic growth factors by muscle in response to stretch and overload." J Anat 194 ( Pt 3): 323-34.
Goldspink, G. (2002). "Gene expression in skeletal muscle." Biochem Soc Trans 30(2): 285-90.
Goldstein, M. A. and M. L. Entman (1979). "Microtubules in mammalian heart muscle." J Cell Biol 80(1): 183-95.
Granzier, H. L. and S. Labeit (2004). "The giant protein titin: a major player in myocardial mechanics, signaling, and disease." Circ Res 94(3): 284-95.
Gray, M. O., C. S. Long, et al. (1998). "Angiotensin II stimulates cardiac myocyte hypertrophy via paracrine release of TGF-beta 1 and endothelin-1 from fibroblasts." Cardiovasc Res 40(2): 352-63.
Gregorio, C. C. and P. B. Antin (2000). "To the heart of myofibril assembly." Trends Cell Biol 10(9): 355-62.
Gregorio, C. C., K. Trombitas, et al. (1998). "The NH2 terminus of titin spans the Z-disc: its interaction with a novel 19-kD ligand (T-cap) is required for sarcomeric integrity." J Cell Biol 143(4): 1013-27.
Grewal, T. and C. Enrich (2006). "Molecular mechanisms involved in Ras inactivation: the annexin A6-p120GAP complex." Bioessays 28(12): 1211-20.
Guo, J., A. Sabri, et al. (2006). "Alpha1-adrenergic receptors activate AKT via a Pyk2/PDK-1 pathway that is tonically inhibited by novel protein kinase C isoforms in cardiomyocytes." Circ Res 99(12): 1367-75.
Harary, I. and B. Farley (1960). "In vitro studies of single isolated beating heart cells." Science 131: 1674-5.
Harrison, B. C., M. S. Kim, et al. (2006). "Regulation of cardiac stress signaling by protein kinase d1." Mol Cell Biol 26(10): 3875-88.
Harrison, R. E. and E. A. Turley (2001). "Active erk regulates microtubule stability in H-ras-transformed cells." Neoplasia 3(5): 385-94.
128
Hashimoto, Y. and T. R. Soderling (1989). "Regulation of calcineurin by phosphorylation. Identification of the regulatory site phosphorylated by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C." J Biol Chem 264(28): 16524-9.
Hattori, Y., K. Akimoto, et al. (2006). "Activation of AMP-activated protein kinase enhances angiotensin ii-induced proliferation in cardiac fibroblasts." Hypertension 47(2): 265-70.
Hefti, M. A., B. A. Harder, et al. (1997). "Signaling pathways in cardiac myocyte hypertrophy." J Mol Cell Cardiol 29(11): 2873-92.
Hein, S., S. Kostin, et al. (2000). "The role of the cytoskeleton in heart failure." Cardiovasc Res 45(2): 273-8.
Heineke, J. and J. D. Molkentin (2006). "Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways." Nat Rev Mol Cell Biol 7(8): 589-600.
Heling, A., R. Zimmermann, et al. (2000). "Increased expression of cytoskeletal, linkage, and extracellular proteins in failing human myocardium." Circ Res 86(8): 846-53.
Higashiyama, S. and D. Nanba (2005). "ADAM-mediated ectodomain shedding of HB-EGF in receptor cross-talk." Biochim Biophys Acta 1751(1): 110-7.
Hiregowdara, D., H. Avraham, et al. (1997). "Tyrosine phosphorylation of the related adhesion focal tyrosine kinase in megakaryocytes upon stem cell factor and phorbol myristate acetate stimulation and its association with paxillin." J Biol Chem 272(16): 10804-10.
Hiroi, Y., J. Hiroi, et al. (2001). "Two distinct mechanisms of angiotensin II-induced negative regulation of the mitogen-activated protein kinases in cultured cardiac myocytes." Hypertens Res 24(4): 385-94.
Hochbaum, D., T. Tanos, et al. (2003). "Activation of JNK by Epac is independent of its activity as a Rap guanine nucleotide exchanger." J Biol Chem 278(36): 33738-46.
Hoshi, N., L. K. Langeberg, et al. (2005). "Distinct enzyme combinations in AKAP signalling complexes permit functional diversity." Nat Cell Biol 7(11): 1066-73.
Hoshijima, M. (2006). "Mechanical stress-strain sensors embedded in cardiac cytoskeleton: Z disk, titin, and associated structures." Am J Physiol Heart Circ Physiol 290(4): H1313-25.
Huang, C. Y., W. W. Kuo, et al. (2004). "Transforming growth factor-beta induces the expression of ANF and hypertrophic growth in cultured cardiomyoblast cells through ZAK." Biochem Biophys Res Commun 324(1): 424-31.
Huang, M. and G. C. Prendergast (2006). "RhoB in cancer suppression." Histol Histopathol 21(2): 213-8.
Ikeda, Y., T. Nakamura, et al. (2000). "Angiotensin II-induced cardiomyocyte hypertrophy and cardiac fibrosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats." J Lab Clin Med 135(4): 353-9.
Inoue, M., A. Kishimoto, et al. (1977). "Studies on a cyclic nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissues. II. Proenzyme and its activation by calcium-dependent protease from rat brain." J Biol Chem 252(21): 7610-6.
Itoh-Satoh, M., T. Hayashi, et al. (2002). "Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy." Biochem Biophys Res Commun 291(2): 385-93.
Iwaki, K., V. P. Sukhatme, et al. (1990). "Alpha- and beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response." J Biol Chem 265(23): 13809-17.
Iwamoto, R. and E. Mekada (2006). "ErbB and HB-EGF signaling in heart development and function." Cell Struct Funct 31(1): 1-14.
129
Jiang, Z. S., M. Jeyaraman, et al. (2007). "High- but not low-molecular weight FGF-2 causes cardiac hypertrophy in vivo; possible involvement of cardiotrophin-1." J Mol Cell Cardiol 42(1): 222-33.
Jin, J., F. D. Smith, et al. (2004). "Proteomic, functional, and domain-based analysis of in vivo 14-3-3 binding proteins involved in cytoskeletal regulation and cellular organization." Curr Biol 14(16): 1436-50.
Johnson, G. L. and R. Lapadat (2002). "Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases." Science 298(5600): 1911-2.
Jones, R. B., A. Gordus, et al. (2006). "A quantitative protein interaction network for the ErbB receptors using protein microarrays." Nature 439(7073): 168-74.
Jonker, S. S., L. Zhang, et al. (2007). "Myocyte enlargement, differentiation, and proliferation kinetics in the fetal sheep heart." J Appl Physiol 102(3): 1130-42.
Jorissen, R. N., F. Walker, et al. (2003). "Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling." Exp Cell Res 284(1): 31-53.
Julian, F. J. and M. R. Sollins (1975). "Sarcomere length-tension relations in living rat papillary muscle." Circ Res 37(3): 299-308.
Kabir, A. M., J. E. Clark, et al. (2006). "Cardioprotection initiated by reactive oxygen species is dependent on activation of PKCepsilon." Am J Physiol Heart Circ Physiol 291(4): H1893-9.
Kang, J. O. and H. M. Sucov (2005). "Convergent proliferative response and divergent morphogenic pathways induced by epicardial and endocardial signaling in fetal heart development." Mech Dev 122(1): 57-65.
Kashishian, A., M. Howard, et al. (1998). "AKAP79 inhibits calcineurin through a site distinct from the immunophilin-binding region." J Biol Chem 273(42): 27412-9.
Kawamura, S., S. Miyamoto, et al. (2003). "Initiation and transduction of stretch-induced RhoA and Rac1 activation through caveolae: cytoskeletal regulation of ERK translocation." J Biol Chem 278(33): 31111-7.
Ke, H. and Q. Huai (2003). "Structures of calcineurin and its complexes with immunophilins-immunosuppressants." Biochem Biophys Res Commun 311(4): 1095-102.
Keyse, S. M. (2000). "Protein phosphatases and the regulation of mitogen-activated protein kinase signalling." Curr Opin Cell Biol 12(2): 186-92.
Khan, S. A., M. W. Skaf, et al. (2003). "Nitric oxide regulation of myocardial contractility and calcium cycling: independent impact of neuronal and endothelial nitric oxide synthases." Circ Res 92(12): 1322-9.
Kheifets, V. and D. Mochly-Rosen (2007). "Insight into intra- and inter-molecular interactions of PKC: design of specific modulators of kinase function." Pharmacol Res 55(6): 467-76.
Kim, H. S., J. W. Cho, et al. (2007). "Activation of MEK-ERK by heregulin-beta1 promotes the development of cardiomyocytes derived from ES cells." Biochem Biophys Res Commun 361(3): 732-8.
Kippenberger, S., S. Loitsch, et al. (2005). "Mechanical stretch stimulates protein kinase B/Akt phosphorylation in epidermal cells via angiotensin II type 1 receptor and epidermal growth factor receptor." J Biol Chem 280(4): 3060-7.
Klee, C. B., T. H. Crouch, et al. (1979). "Calcineurin: a calcium- and calmodulin-binding protein of the nervous system." Proc Natl Acad Sci U S A 76(12): 6270-3.
Knies, Y., A. Bernd, et al. (2006). "Mechanical stretch induces clustering of beta1-integrins and facilitates adhesion." Exp Dermatol 15(5): 347-55.
Kodama, H., K. Fukuda, et al. (2003). "Selective involvement of p130Cas/Crk/Pyk2/c-Src in endothelin-1-induced JNK activation." Hypertension 41(6): 1372-9.
130
Kodama, H., K. Fukuda, et al. (2002). "Role of EGF Receptor and Pyk2 in endothelin-1-induced ERK activation in rat cardiomyocytes." J Mol Cell Cardiol 34(2): 139-50.
Kohl, P., P. Hunter, et al. (1999). "Stretch-induced changes in heart rate and rhythm: clinical observations, experiments and mathematical models." Prog Biophys Mol Biol 71(1): 91-138.
Kolch, W. (2005). "Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors." Nat Rev Mol Cell Biol 6(11): 827-37.
Komuro, I., T. Yamazaki, et al. (1995). "Protein kinase cascade activated by mechanical stress in cardiocytes: possible involvement of angiotensin II." Eur Heart J 16 Suppl C: 8-11.
Kondoh, K. and E. Nishida (2007). "Regulation of MAP kinases by MAP kinase phosphatases." Biochim Biophys Acta 1773(8): 1227-37.
Konstantinopoulos, P. A., M. V. Karamouzis, et al. (2007). "Post-translational modifications and regulation of the RAS superfamily of GTPases as anticancer targets." Nat Rev Drug Discov 6(7): 541-55.
Kostin, S., S. Hein, et al. (2000). "The cytoskeleton and related proteins in the human failing heart." Heart Fail Rev 5(3): 271-80.
Krueger, J. W. and G. H. Pollack (1975). "Myocardial sarcomere dynamics during isometric contraction." J Physiol 251(3): 627-43.
Kyriakis, J. M. (2007). "The integration of signaling by multiprotein complexes containing Raf kinases." Biochim Biophys Acta 1773(8): 1238-47.
Lai, M. M., J. J. Hong, et al. (1999). "The calcineurin-dynamin 1 complex as a calcium sensor for synaptic vesicle endocytosis." J Biol Chem 274(37): 25963-6.
Lal, H., S. K. Verma, et al. (2007). "Stretch-induced MAP kinase activation in cardiac myocytes: differential regulation through beta1-integrin and focal adhesion kinase." J Mol Cell Cardiol 43(2): 137-47.
L'Allemain, G. (1994). "Deciphering the MAP kinase pathway." Prog Growth Factor Res 5(3): 291-334.
Leri, A., J. Kajstura, et al. (2002). "Myocyte proliferation and ventricular remodeling." J Card Fail 8(6 Suppl): S518-25.
LeWinter, M. M., Y. Wu, et al. (2007). "Cardiac titin: structure, functions and role in disease." Clin Chim Acta 375(1-2): 1-9.
Li, J., T. Hampton, et al. (1997). "Stretch-induced VEGF expression in the heart." J Clin Invest 100(1): 18-24.
Liao, G. and G. G. Gundersen (1998). "Kinesin is a candidate for cross-bridging microtubules and intermediate filaments. Selective binding of kinesin to detyrosinated tubulin and vimentin." J Biol Chem 273(16): 9797-803.
Lieber, S. C., N. Aubry, et al. (2004). "Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation." Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(2): H645-51.
Liebmann, C. (2001). "Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signalling pathway: paradigms of multiplicity." Cell Signal 13(11): 777-85.
Lijnen, P. and V. Petrov (1999). "Renin-angiotensin system, hypertrophy and gene expression in cardiac myocytes." J Mol Cell Cardiol 31(5): 949-70.
Lim, H. W., L. New, et al. (2001). "Calcineurin enhances MAPK phosphatase-1 expression and p38 MAPK inactivation in cardiac myocytes." J Biol Chem 276(19): 15913-9.
Linke, W. A. (2007). "Sense and stretchability: The role of titin and titin-associated proteins in myocardial stress-sensing and mechanical dysfunction." Cardiovasc Res.
Liu, S., D. A. Calderwood, et al. (2000). "Integrin cytoplasmic domain-binding proteins." J Cell Sci 113 ( Pt 20): 3563-71.
131
Long, C. S., C. J. Henrich, et al. (1991). "A growth factor for cardiac myocytes is produced by cardiac nonmyocytes." Cell Regul 2(12): 1081-95.
Mackay, K. and D. Mochly-Rosen (2001). "Localization, anchoring, and functions of protein kinase C isozymes in the heart." J Mol Cell Cardiol 33(7): 1301-7.
Malemud, C. J. (2007). "Inhibitors of stress-activated protein/mitogen-activated protein kinase pathways." Curr Opin Pharmacol 7(3): 339-43.
Marais, R., Y. Light, et al. (1998). "Requirement of Ras-GTP-Raf complexes for activation of Raf-1 by protein kinase C." Science 280(5360): 109-12.
Markou, T., T. E. Cullingford, et al. (2007). "Glycogen synthase kinases 3alpha and 3beta in cardiac myocytes: Regulation and consequences of their inhibition." Cell Signal.
Martelli, A. M., C. Evangelisti, et al. (2006). "Nuclear protein kinase C." Biochim Biophys Acta 1761(5-6): 542-51.
McNicholas-Bevensee, C. M., K. B. DeAndrade, et al. (2006). "Activation of gadolinium-sensitive ion channels in cardiomyocytes in early adaptive stages of volume overload-induced heart failure." Cardiovasc Res 72(2): 262-70.
Melendez, J., S. Welch, et al. (2002). "Activation of pyk2/related focal adhesion tyrosine kinase and focal adhesion kinase in cardiac remodeling." J Biol Chem 277(47): 45203-10.
Miller, M. K., H. Granzier, et al. (2004). "The sensitive giant: the role of titin-based stretch sensing complexes in the heart." Trends Cell Biol 14(3): 119-26.
Mineo, C., G. N. Gill, et al. (1999). "Regulated migration of epidermal growth factor receptor from caveolae." J Biol Chem 274(43): 30636-43.
Miyashita, T., Y. Takeishi, et al. (2001). "Role of calcineurin in insulin-like growth factor-1-induced hypertrophy of cultured adult rat ventricular myocytes." Jpn Circ J 65(9): 815-9.
Miyata, S. and T. Haneda (1994). "Hypertrophic growth of cultured neonatal rat heart cells mediated by type 1 angiotensin II receptor." Am J Physiol 266(6 Pt 2): H2443-51.
Mochly-Rosen, D., G. Wu, et al. (2000). "Cardiotrophic effects of protein kinase C epsilon: analysis by in vivo modulation of PKCepsilon translocation." Circ Res 86(11): 1173-9.
Molkentin, J. D. (2004). "Calcineurin-NFAT signaling regulates the cardiac hypertrophic response in coordination with the MAPKs." Cardiovasc Res 63(3): 467-75.
Molkentin, J. D., J. R. Lu, et al. (1998). "A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy." Cell 93(2): 215-28.
Mor, A. and M. R. Philips (2006). "Compartmentalized Ras/MAPK signaling." Annu Rev Immunol 24: 771-800.
Morrison, D. K. and R. J. Davis (2003). "Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals." Annu Rev Cell Dev Biol 19: 91-118.
Morton, S., R. J. Davis, et al. (2004). "Signalling pathways involved in multisite phosphorylation of the transcription factor ATF-2." FEBS Lett 572(1-3): 177-83.
Moschella, P. C., V. U. Rao, et al. (2007). "Regulation of mTOR and S6K1 activation by the nPKC isoforms, PKC(epsilon) and PKC(delta), in adult cardiac muscle cells." J Mol Cell Cardiol.
Nadruz, W., Jr., M. A. Corat, et al. (2005). "Focal adhesion kinase mediates MEF2 and c-Jun activation by stretch: role in the activation of the cardiac hypertrophic genetic program." Cardiovasc Res 68(1): 87-97.
Nava, C., N. Hanna, et al. (2007). "Cardio-facio-cutaneous and Noonan syndromes due to mutations in the RAS/MAPK signalling pathway: genotype-phenotype relationships and overlap with Costello syndrome." J Med Genet 44(12): 763-71.
132
Newton, A. C. (2003). "Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm." Biochem J 370(Pt 2): 361-71.
Nicholson, K. M. and N. G. Anderson (2002). "The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy." Cell Signal 14(5): 381-95.
Nie, Z., D. S. Hirsch, et al. (2003). "Arf and its many interactors." Curr Opin Cell Biol 15(4): 396-404.
Oeckler, R. A., P. M. Kaminski, et al. (2003). "Stretch enhances contraction of bovine coronary arteries via an NAD(P)H oxidase-mediated activation of the extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase cascade." Circ Res 92(1): 23-31.
Ogiso, H., R. Ishitani, et al. (2002). "Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains." Cell 110(6): 775-87.
Oliveria, S. F., L. L. Gomez, et al. (2003). "Imaging kinase--AKAP79--phosphatase scaffold complexes at the plasma membrane in living cells using FRET microscopy." J Cell Biol 160(1): 101-12.
Opie, L. H., P. J. Commerford, et al. (2006). "Controversies in ventricular remodelling." Lancet 367(9507): 356-67.
Oriolo, A. S., F. A. Wald, et al. (2007). "Intermediate filaments: a role in epithelial polarity." Exp Cell Res 313(10): 2255-64.
Ostrow, L. W. and F. Sachs (2005). "Mechanosensation and endothelin in astrocytes--hypothetical roles in CNS pathophysiology." Brain Res Brain Res Rev 48(3): 488-508.
Owens, D. M. and S. M. Keyse (2007). "Differential regulation of MAP kinase signalling by dual-specificity protein phosphatases." Oncogene 26(22): 3203-13.
Paduch, M., F. Jelen, et al. (2001). "Structure of small G proteins and their regulators." Acta Biochim Pol 48(4): 829-50.
Pan, J., M. She, et al. (2005). "Farnesyltransferase inhibitors induce DNA damage via reactive oxygen species in human cancer cells." Cancer Res 65(9): 3671-81.
Papaiahgari, S., A. Yerrapureddy, et al. (2007). "EGFR-activated signaling and actin remodeling regulate cyclic stretch-induced NRF2-ARE activation." Am J Respir Cell Mol Biol 36(3): 304-12.
Paradis, P., N. Dali-Youcef, et al. (2000). "Overexpression of angiotensin II type I receptor in cardiomyocytes induces cardiac hypertrophy and remodeling." Proc Natl Acad Sci U S A 97(2): 931-6.
Pare, G. C., A. L. Bauman, et al. (2005). "The mAKAP complex participates in the induction of cardiac myocyte hypertrophy by adrenergic receptor signaling." J Cell Sci 118(Pt 23): 5637-46.
Park, S. Y., H. K. Avraham, et al. (2004). "RAFTK/Pyk2 activation is mediated by trans-acting autophosphorylation in a Src-independent manner." J Biol Chem 279(32): 33315-22.
Parker, T. G., S. E. Packer, et al. (1990). "Peptide growth factors can provoke "fetal" contractile protein gene expression in rat cardiac myocytes." J Clin Invest 85(2): 507-14.
Parmley, W. W. and L. Chuck (1973). "Length-dependent changes in myocardial contractile state." Am J Physiol 224(5): 1195-9.
Pathak, M., S. Sarkar, et al. (2001). "Role of myocytes in myocardial collagen production." Hypertension 37(3): 833-40.
Patterson, S. D. (2000). "Mass spectrometry and proteomics." Physiol Genomics 2(2): 59-65. Patterson, S. D. (2000). "Proteomics: the industrialization of protein chemistry." Curr Opin
Biotechnol 11(4): 413-8.
133
Paul, K., N. A. Ball, et al. (1997). "Left ventricular stretch stimulates angiotensin II--mediated phosphatidylinositol hydrolysis and protein kinase C epsilon isoform translocation in adult guinea pig hearts." Circ Res 81(5): 643-50.
Pekny, M. and E. B. Lane (2007). "Intermediate filaments and stress." Exp Cell Res 313(10): 2244-54.
Pereira-Leal, J. B. and M. C. Seabra (2001). "Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins." J Mol Biol 313(4): 889-901.
Perrella, M. A., T. Maki, et al. (1994). "Regulation of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor mRNA levels by hypertrophic stimuli in neonatal and adult rat cardiac myocytes." J Biol Chem 269(43): 27045-50.
Petermann, A. T., J. Pippin, et al. (2005). "Mechanical stretch induces podocyte hypertrophy in vitro." Kidney Int 67(1): 157-66.
Pikkarainen, S., H. Tokola, et al. (2004). "GATA transcription factors in the developing and adult heart." Cardiovasc Res 63(2): 196-207.
Ping, P., J. Zhang, et al. (1999). "PKC-dependent activation of p46/p54 JNKs during ischemic preconditioning in conscious rabbits." Am J Physiol 277(5 Pt 2): H1771-85.
Ping, P., J. Zhang, et al. (2001). "Functional proteomic analysis of protein kinase C epsilon signaling complexes in the normal heart and during cardioprotection." Circ Res 88(1): 59-62.
Pozuelo Rubio, M., K. M. Geraghty, et al. (2004). "14-3-3-affinity purification of over 200 human phosphoproteins reveals new links to regulation of cellular metabolism, proliferation and trafficking." Biochem J 379(Pt 2): 395-408.
Puceat, M., R. Hilal-Dandan, et al. (1994). "Differential regulation of protein kinase C isoforms in isolated neonatal and adult rat cardiomyocytes." J Biol Chem 269(24): 16938-44.
Puceat, M. and G. Vassort (1996). "Signalling by protein kinase C isoforms in the heart." Mol Cell Biochem 157(1-2): 65-72.
Rao, V. U., H. Shiraishi, et al. (2004). "PKC-epsilon regulation of extracellular signal-regulated kinase: a potential role in phenylephrine-induced cardiocyte growth." Am J Physiol Heart Circ Physiol 286(6): H2195-203.
Rassier, D. E., E. J. Lee, et al. (2005). "Modulation of passive force in single skeletal muscle fibres." Biol Lett 1(3): 342-5.
Ren, Z., F. J. Raucci, Jr., et al. (2007). "Regulation of swelling-activated Cl current by angiotensin II signalling and NADPH oxidase in rabbit ventricle." Cardiovasc Res.
Repasky, G. A., E. J. Chenette, et al. (2004). "Renewing the conspiracy theory debate: does Raf function alone to mediate Ras oncogenesis?" Trends Cell Biol 14(11): 639-47.
Robinson, K., D. Jones, et al. (1994). "Mechanism of inhibition of protein kinase C by 14-3-3 isoforms. 14-3-3 isoforms do not have phospholipase A2 activity." Biochem J 299 ( Pt 3): 853-61.
Rogers, S. L. and V. I. Gelfand (2000). "Membrane trafficking, organelle transport, and the cytoskeleton." Curr Opin Cell Biol 12(1): 57-62.
Roof, R. W., M. D. Haskell, et al. (1998). "Phosphotyrosine (p-Tyr)-dependent and -independent mechanisms of p190 RhoGAP-p120 RasGAP interaction: Tyr 1105 of p190, a substrate for c-Src, is the sole p-Tyr mediator of complex formation." Mol Cell Biol 18(12): 7052-63.
Rosenkranz, S. (2004). "TGF-beta1 and angiotensin networking in cardiac remodeling." Cardiovasc Res 63(3): 423-32.
Rothermel, B. A., R. B. Vega, et al. (2003). "The role of modulatory calcineurin-interacting proteins in calcineurin signaling." Trends Cardiovasc Med 13(1): 15-21.
134
Rouet-Benzineb, P., K. Mohammadi, et al. (1996). "Protein kinase C isoform expression in normal and failing rabbit hearts." Circ Res 79(2): 153-61.
Rusnak, F. and P. Mertz (2000). "Calcineurin: form and function." Physiol Rev 80(4): 1483-521.
Ruwhof, C. and A. van der Laarse (2000). "Mechanical stress-induced cardiac hypertrophy: mechanisms and signal transduction pathways." Cardiovasc Res 47(1): 23-37.
Sadoshima, J. and S. Izumo (1993). "Mechanical stretch rapidly activates multiple signal transduction pathways in cardiac myocytes: potential involvement of an autocrine/paracrine mechanism." Embo J 12(4): 1681-92.
Sadoshima, J. and S. Izumo (1993). "Molecular characterization of angiotensin II--induced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts. Critical role of the AT1 receptor subtype." Circ Res 73(3): 413-23.
Sadoshima, J. and S. Izumo (1993). "Signal transduction pathways of angiotensin II--induced c-fos gene expression in cardiac myocytes in vitro. Roles of phospholipid-derived second messengers." Circ Res 73(3): 424-38.
Sadoshima, J. and S. Izumo (1996). "Autocrine secretion of angiotensin II mediates stretch-induced hypertrophy of cardiac myocytes in vitro." Contrib Nephrol 118: 214-21.
Sadoshima, J., L. Jahn, et al. (1992). "Molecular characterization of the stretch-induced adaptation of cultured cardiac cells. An in vitro model of load-induced cardiac hypertrophy." J Biol Chem 267(15): 10551-60.
Sadoshima, J., Z. Qiu, et al. (1995). "Angiotensin II and other hypertrophic stimuli mediated by G protein-coupled receptors activate tyrosine kinase, mitogen-activated protein kinase, and 90-kD S6 kinase in cardiac myocytes. The critical role of Ca(2+)-dependent signaling." Circ Res 76(1): 1-15.
Saji, K., Y. Fukumoto, et al. (2007). "Colchicine, a microtubule depolymerizing agent, inhibits myocardial apoptosis in rats." Tohoku J Exp Med 213(2): 139-48.
Sakata, R., T. Ueno, et al. (2004). "Mechanical stretch induces TGF-beta synthesis in hepatic stellate cells." Eur J Clin Invest 34(2): 129-36.
Samarel, A. M. (2005). "Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction." Am J Physiol Heart Circ Physiol 289(6): H2291-301.
Sanchez-Esteban, J., Y. Wang, et al. (2004). "Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway." Am J Respir Cell Mol Biol 30(1): 76-83.
Sanna, B., O. F. Bueno, et al. (2005). "Direct and indirect interactions between calcineurin-NFAT and MEK1-extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathways regulate cardiac gene expression and cellular growth." Mol Cell Biol 25(3): 865-78.
Sarkar, S., E. Vellaichamy, et al. (2004). "Influence of cytokines and growth factors in ANG II-mediated collagen upregulation by fibroblasts in rats: role of myocytes." Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(1): H107-17.
Sasaki, N., T. Mitsuiye, et al. (1992). "Effects of mechanical stretch on membrane currents of single ventricular myocytes of guinea-pig heart." Jpn J Physiol 42(6): 957-70.
Sasaoka, T., W. J. Langlois, et al. (1994). "The signaling pathway coupling epidermal growth factor receptors to activation of p21ras." J Biol Chem 269(51): 32621-5.
Sato, H., T. Nagai, et al. (1997). "Microtubule stabilization in pressure overload cardiac hypertrophy." J Cell Biol 139(4): 963-73.
Schaub, M. C., M. A. Hefti, et al. (1998). "Modulation of contractility in human cardiac hypertrophy by myosin essential light chain isoforms." Cardiovasc Res 37(2): 381-404.
Seddon, M., A. M. Shah, et al. (2007). "Cardiomyocytes as effectors of nitric oxide signalling." Cardiovasc Res 75(2): 315-26.
135
Seger, R. and E. G. Krebs (1995). "The MAPK signaling cascade." Faseb J 9(9): 726-35. Seko, Y., N. Takahashi, et al. (1999). "Pulsatile stretch stimulates vascular endothelial growth
factor (VEGF) secretion by cultured rat cardiac myocytes." Biochem Biophys Res Commun 254(2): 462-5.
Sen, S., G. Kundu, et al. (1990). "Myotrophin: purification of a novel peptide from spontaneously hypertensive rat heart that influences myocardial growth." J Biol Chem 265(27): 16635-43.
Sheffield, L. G. and J. J. Gavinski (2003). "Proteomics methods for probing molecular mechanisms in signal transduction." J Anim Sci 81 Suppl 3: 48-57.
Shimoyama, M., D. Hayashi, et al. (1999). "Calcineurin plays a critical role in pressure overload-induced cardiac hypertrophy." Circulation 100(24): 2449-54.
Shioi, T., P. M. Kang, et al. (2000). "The conserved phosphoinositide 3-kinase pathway determines heart size in mice." Embo J 19(11): 2537-48.
Sim, A. T. and J. D. Scott (1999). "Targeting of PKA, PKC and protein phosphatases to cellular microdomains." Cell Calcium 26(5): 209-17.
Skrzypiec-Spring, M., B. Grotthus, et al. (2007). "Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium." J Pharmacol Toxicol Methods 55(2): 113-26.
Slaaby, R., T. Jensen, et al. (1998). "PLD2 complexes with the EGF receptor and undergoes tyrosine phosphorylation at a single site upon agonist stimulation." J Biol Chem 273(50): 33722-7.
Smith, L. and J. B. Smith (2002). "Lack of constitutive activity of the free kinase domain of protein kinase C zeta. Dependence on transphosphorylation of the activation loop." J Biol Chem 277(48): 45866-73.
Smith, S. H. and F. Fuchs (2000). "Length-dependence of cross-bridge mediated activation of the cardiac thin filament." J Mol Cell Cardiol 32(5): 831-8.
Somogyi, K. and P. Rorth (2004). "Evidence for tension-based regulation of Drosophila MAL and SRF during invasive cell migration." Dev Cell 7(1): 85-93.
Sonnenburg, E. D., T. Gao, et al. (2001). "The phosphoinositide-dependent kinase, PDK-1, phosphorylates conventional protein kinase C isozymes by a mechanism that is independent of phosphoinositide 3-kinase." J Biol Chem 276(48): 45289-97.
Stelzer, J. E. and R. L. Moss (2006). "Contributions of stretch activation to length-dependent contraction in murine myocardium." J Gen Physiol 128(4): 461-71.
Stover, D. R., M. Becker, et al. (1995). "Src phosphorylation of the epidermal growth factor receptor at novel sites mediates receptor interaction with Src and P85 alpha." J Biol Chem 270(26): 15591-7.
Sugden, P. H. (2002). "Signaling pathways activated by vasoactive peptides in the cardiac myocyte and their role in myocardial pathologies." J Card Fail 8(6 Suppl): S359-69.
Sugden, P. H. (2003). "An overview of endothelin signaling in the cardiac myocyte." J Mol Cell Cardiol 35(8): 871-86.
Sugden, P. H. and A. Clerk (2000). "Activation of the small GTP-binding protein Ras in the heart by hypertrophic agonists." Trends Cardiovasc Med 10(1): 1-8.
Sundberg, C., C. K. Thodeti, et al. (2004). "Regulation of ADAM12 cell-surface expression by protein kinase C epsilon." J Biol Chem 279(49): 51601-11.
Tagawa, H., M. Koide, et al. (1998). "Cytoskeletal role in the transition from compensated to decompensated hypertrophy during adult canine left ventricular pressure overloading." Circ Res 82(7): 751-61.
Tagawa, H., J. D. Rozich, et al. (1996). "Basis for increased microtubules in pressure-hypertrophied cardiocytes." Circulation 93(6): 1230-43.
136
Tagawa, H., N. Wang, et al. (1997). "Cytoskeletal mechanics in pressure-overload cardiac hypertrophy." Circ Res 80(2): 281-9.
Takada, Y., X. Ye, et al. (2007). "The integrins." Genome Biol 8(5): 215. Takahashi, N., A. Calderone, et al. (1994). "Hypertrophic stimuli induce transforming growth
factor-beta 1 expression in rat ventricular myocytes." J Clin Invest 94(4): 1470-6. Takeishi, Y., P. Ping, et al. (2000). "Transgenic overexpression of constitutively active
protein kinase C epsilon causes concentric cardiac hypertrophy." Circ Res 86(12): 1218-23.
Tanji, M., R. Horwitz, et al. (1994). "Activation of protein kinase C by purified bovine brain 14-3-3: comparison with tyrosine hydroxylase activation." J Neurochem 63(5): 1908-16.
Tanoue, T. and E. Nishida (2003). "Molecular recognitions in the MAP kinase cascades." Cell Signal 15(5): 455-62.
Thienelt, C. D., E. O. Weinberg, et al. (1997). "Load-induced growth responses in isolated adult rat hearts. Role of the AT1 receptor." Circulation 95(12): 2677-83.
Toker, A., L. A. Sellers, et al. (1992). "Multiple isoforms of a protein kinase C inhibitor (KCIP-1/14-3-3) from sheep brain. Amino acid sequence of phosphorylated forms." Eur J Biochem 206(2): 453-61.
Torsoni, A. S., S. S. Constancio, et al. (2003). "Focal adhesion kinase is activated and mediates the early hypertrophic response to stretch in cardiac myocytes." Circ Res 93(2): 140-7.
Torsoni, A. S., T. M. Marin, et al. (2005). "RhoA/ROCK signaling is critical to FAK activation by cyclic stretch in cardiac myocytes." Am J Physiol Heart Circ Physiol 289(4): H1488-96.
Touyz, R. M. and C. Berry (2002). "Recent advances in angiotensin II signaling." Braz J Med Biol Res 35(9): 1001-15.
Trepat, X., L. Deng, et al. (2007). "Universal physical responses to stretch in the living cell." Nature 447(7144): 592-5.
van Kesteren, C. A., J. J. Saris, et al. (1999). "Cultured neonatal rat cardiac myocytes and fibroblasts do not synthesize renin or angiotensinogen: evidence for stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy independent of angiotensin II." Cardiovasc Res 43(1): 148-56.
van Rooij, E., P. A. Doevendans, et al. (2002). "Requirement of nuclear factor of activated T-cells in calcineurin-mediated cardiomyocyte hypertrophy." J Biol Chem 277(50): 48617-26.
van Wamel, A. J., C. Ruwhof, et al. (2001). "The role of angiotensin II, endothelin-1 and transforming growth factor-beta as autocrine/paracrine mediators of stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy." Mol Cell Biochem 218(1-2): 113-24.
van Wamel, A. J., C. Ruwhof, et al. (2002). "Stretch-induced paracrine hypertrophic stimuli increase TGF-beta1 expression in cardiomyocytes." Mol Cell Biochem 236(1-2): 147-53.
Vandroux, D., C. Schaeffer, et al. (2004). "Microtubule alteration is an early cellular reaction to the metabolic challenge in ischemic cardiomyocytes." Mol Cell Biochem 258(1-2): 99-108.
Vega, R. B., B. C. Harrison, et al. (2004). "Protein kinases C and D mediate agonist-dependent cardiac hypertrophy through nuclear export of histone deacetylase 5." Mol Cell Biol 24(19): 8374-85.
Vetter, I. R. and A. Wittinghofer (2001). "The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions." Science 294(5545): 1299-304.
137
Vijayan, K., E. L. Szotek, et al. (2004). "Protein kinase C-alpha-induced hypertrophy of neonatal rat ventricular myocytes." Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(6): H2777-89.
Wang, J., H. Chen, et al. (2003). "Mechanical force regulation of myofibroblast differentiation in cardiac fibroblasts." Am J Physiol Heart Circ Physiol 285(5): H1871-81.
Wang, N. and D. E. Ingber (1994). "Control of cytoskeletal mechanics by extracellular matrix, cell shape, and mechanical tension." Biophys J 66(6): 2181-9.
Wang, Q. J. (2006). "PKD at the crossroads of DAG and PKC signaling." Trends Pharmacol Sci 27(6): 317-23.
Wang, Y. (2007). "Mitogen-activated protein kinases in heart development and diseases." Circulation 116(12): 1413-23.
Watkins, S. J., L. Jonker, et al. (2006). "A direct interaction between TGFbeta activated kinase 1 and the TGFbeta type II receptor: implications for TGFbeta signalling and cardiac hypertrophy." Cardiovasc Res 69(2): 432-9.
Wen, H. C., W. C. Huang, et al. (2003). "Negative regulation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt signalling pathway by PKC." Cell Signal 15(1): 37-45.
Wennerberg, K. and C. J. Der (2004). "Rho-family GTPases: it's not only Rac and Rho (and I like it)." J Cell Sci 117(Pt 8): 1301-12.
Wennerberg, K., K. L. Rossman, et al. (2005). "The Ras superfamily at a glance." J Cell Sci 118(Pt 5): 843-6.
Whitmarsh, A. J. (2007). "Regulation of gene transcription by mitogen-activated protein kinase signaling pathways." Biochim Biophys Acta 1773(8): 1285-98.
Wick, P., X. Gansel, et al. (2003). "The expression of the t-SNARE AtSNAP33 is induced by pathogens and mechanical stimulation." Plant Physiol 132(1): 343-51.
Wollert, K. C. and H. Drexler (1999). "The renin-angiotensin system and experimental heart failure." Cardiovasc Res 43(4): 838-49.
Wozniak, M. A., K. Modzelewska, et al. (2004). "Focal adhesion regulation of cell behavior." Biochim Biophys Acta 1692(2-3): 103-19.
Wu, H., A. Peisley, et al. (2007). "NFAT signaling and the invention of vertebrates." Trends Cell Biol 17(6): 251-60.
Xiao, L., D. R. Pimental, et al. (2001). "MEK1/2-ERK1/2 mediates alpha1-adrenergic receptor-stimulated hypertrophy in adult rat ventricular myocytes." J Mol Cell Cardiol 33(4): 779-87.
Xiao, R. P. (2001). "Beta-adrenergic signaling in the heart: dual coupling of the beta2-adrenergic receptor to G(s) and G(i) proteins." Sci STKE 2001(104): RE15.
Yamazaki, T., I. Komuro, et al. (1998). "Role of ion channels and exchangers in mechanical stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy." Circ Res 82(4): 430-7.
Yamazaki, T., I. Komuro, et al. (1995). "Mechanical stress activates protein kinase cascade of phosphorylation in neonatal rat cardiac myocytes." J Clin Invest 96(1): 438-46.
Yamazaki, T., I. Komuro, et al. (1998). "Signalling pathways for cardiac hypertrophy." Cell Signal 10(10): 693-8.
Yamazaki, T., I. Komuro, et al. (1999). "Hypertrophic responses of cardiomyocytes induced by endothelin-1 through the protein kinase C-dependent but Src and Ras-independent pathways." Hypertens Res 22(2): 113-9.
Yamazaki, T. and Y. Yazaki (2000). "Molecular basis of cardiac hypertrophy." Z Kardiol 89(1): 1-6.
Yanagisawa, M., A. Inoue, et al. (1988). "Primary structure, synthesis, and biological activity of rat endothelin, an endothelium-derived vasoconstrictor peptide." Proc Natl Acad Sci U S A 85(18): 6964-7.
138
Yanagisawa, M., H. Kurihara, et al. (1988). "A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells." Nature 332(6163): 411-5.
Yang, T. T., Q. Xiong, et al. (2005). "Recruitment of the extracellular signal-regulated kinase/ribosomal S6 kinase signaling pathway to the NFATc4 transcription activation complex." Mol Cell Biol 25(3): 907-20.
Yasuda, N., S. I. Miura, et al. (2008). "Conformational switch of angiotensin II type 1 receptor underlying mechanical stress-induced activation." EMBO Rep.
York, R. D., H. Yao, et al. (1998). "Rap1 mediates sustained MAP kinase activation induced by nerve growth factor." Nature 392(6676): 622-6.
Yutao, X., W. Geru, et al. (2006). "Mechanical stretch-induced hypertrophy of neonatal rat ventricular myocytes is mediated by beta(1)-integrin-microtubule signaling pathways." Eur J Heart Fail 8(1): 16-22.
Zeng, T., G. C. Bett, et al. (2000). "Stretch-activated whole cell currents in adult rat cardiac myocytes." Am J Physiol Heart Circ Physiol 278(2): H548-57.
Zhai, P., J. Galeotti, et al. (2006). "An angiotensin II type 1 receptor mutant lacking epidermal growth factor receptor transactivation does not induce angiotensin II-mediated cardiac hypertrophy." Circ Res 99(5): 528-36.
Zhang, B., F. Peng, et al. (2007). "Caveolin-1 phosphorylation is required for stretch-induced EGFR and Akt activation in mesangial cells." Cell Signal 19(8): 1690-700.
Zhang, J., C. P. Baines, et al. (2005). "Functional proteomic analysis of a three-tier PKCepsilon-Akt-eNOS signaling module in cardiac protection." Am J Physiol Heart Circ Physiol 288(2): H954-61.
Zhang, W. and H. T. Liu (2002). "MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells." Cell Res 12(1): 9-18.
Zheng, M., Q. D. Han, et al. (2004). "Distinct beta-adrenergic receptor subtype signaling in the heart and their pathophysiological relevance." Sheng Li Xue Bao 56(1): 1-15.
Zhou, C., C. Ziegler, et al. (2006). "Angiotensin II and stretch activate NADPH oxidase to destabilize cardiac Kv4.3 channel mRNA." Circ Res 98(8): 1040-7.
Zhu, W., Y. Zou, et al. (2000). "Ca2+/calmodulin-dependent kinase II and calcineurin play critical roles in endothelin-1-induced cardiomyocyte hypertrophy." J Biol Chem 275(20): 15239-45.
Zimmer, H. G. (2002). "Who discovered the Frank-Starling mechanism?" News Physiol Sci 17: 181-4.
Zou, Y., H. Akazawa, et al. (2004). "Mechanical stress activates angiotensin II type 1 receptor without the involvement of angiotensin II." Nat Cell Biol 6(6): 499-506.
Zou, Y., Y. Hiroi, et al. (2001). "Calcineurin plays a critical role in the development of pressure overload-induced cardiac hypertrophy." Circulation 104(1): 97-101.
Zou, Y., I. Komuro, et al. (1996). "Protein kinase C, but not tyrosine kinases or Ras, plays a critical role in angiotensin II-induced activation of Raf-1 kinase and extracellular signal-regulated protein kinases in cardiac myocytes." J Biol Chem 271(52): 33592-7.
Zwartkruis, F. J., R. M. Wolthuis, et al. (1998). "Extracellular signal-regulated activation of Rap1 fails to interfere in Ras effector signalling." Embo J 17(20): 5905-12.
Zwick, E., P. O. Hackel, et al. (1999). "The EGF receptor as central transducer of heterologous signalling systems." Trends Pharmacol Sci 20(10): 408-12.
139
Bibliographie
Plusieurs éléments de l’introduction sont inspirés des ouvrages suivants :
- Molecular biology of the cell. Alberts B. et al. 2002 ed. Garland science, Taylor & Francis
group.
- Heart Failure: Pathophysiology, Molecular Biology and clinical Management. AM. Katz
2000 ed. Lippincott Williams & Wilkins
- The Heart: Physiology, from Cell to Circulation. LH. Opie 1998. Lippincott Williams &
Wilkins
- Biologie et Pathologie du Coeur et des Vaisseaux. F.Pinet et al. 2002 ed. Médecine-
Sciences, Flammarion
140
Annexe
f
Article 4
Small GTP-binding proteins and their regulators in cardiac hypertrophy
