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Silvia VendettiDipartimento di Malattie Infettive Parassitarie ed Immuno-mediateReparto Immunità anti-infettiva

Roma 15/05/2013

Adjuvanti e immunomodulatori

Vaccines

the concept of vaccination originated several hundred years ago (400 B.C.)

from historical observations. Individuals that survived a disease rarely got

the same disease a second time (Finley, 1951; Plotkin and Plotkin, 2008).

The first recorded attempts at immunization occurred in the 16th century

when the process of variolation was used to prevent smallpox (Plotkin and

Plotkin, 2008).

The major breakthrough in vaccination came in 1796 when Jenner used

cowpox as a vaccine against smallpox.

Vaccination remains the most effective method of preventing infectious

diseases and represents the most relevant contribution of immunology to

human health

By O’Hagan D, Enc. Of life Sciences, 2007.

Vaccini necessari e non ancora disponibili

• HIV

• HCV

• RSV

• Neisseria meningitides B

• Streptococchi group A e B

• Tubercolosi (TB)

• Malaria

• SARS

• Ebola

• Dengue

• Influenza a livello pandemico

• Organismi resistenti ai farmaci

• Bioterrorismo

• Cancro e malattie infettive croniche

Vaccines work by eliciting an immune response and consequent immunological memory that mediates protection from infection or disease.

Immunological memory is the ability of the immune system to respond with greater vigor upon re-encounter with the same pathogen and constitutes the basis for vaccination (Ahmed and Gray, 1996).

Risposta immunitaria

Spe

cific

cells

naivememory

Modified by Sallusto F et al, Immunity 2010

Risposte immunitarie naturali, sempre presenti, intervengono subito, in modo aspecifico verso il diverso dal “self”

Risposte immunitarie adattative, si attivano solo in alcuni casi, tardivamente, sulla base dei segnali delle risposte naturali, in modo estremamente specifico verso il diverso dal “self che le ha indotte

L’immunità può essere innata (naturale) odacquisita (adattativa o specifica).

L’immunità naturale è rivolta ad interi gruppi di microorganismi patogeni (cioè non è finemente specifica). Le cellule responsabili posseggono recettori (Pattern Recognition Receptors) che riconoscono strutture molecolari comuni adinteri gruppi di patogeni.

Essa si basa su:- barriere anatomiche o funzionali che impediscono orallentano la penetrazione dei microorganismi- su meccanismi, come l’infiammazione, la fagocitosi, ilcomplemento, le cellule NK, che combattono precocementei microorganismi invasori o le cellule alterate.

L’immunità acquisita si sviluppa progressivamente durante la vita e deriva dal tipo di esperienze biologiche condotte dall’individuo, ovvero dalle sostanze estranee (antigeni) con cui esso viene in contatto.

Proprietà Immunità innata Immunità acquisit a

•caratteristiche non specifica Antigene-specifico

rapida(pochi minuti) lento(giorni)

assenza di memoria Memoria

•componenti barriere naturali(cute) Linfociti

fagociti BCR/TCR

mediatori solubili(complemento)

mediatori solubili(anticorpi)

recettori dei profili molecolari

IFNγγγγ

IL-4IL-5IL-13

TH1-polarizingfactors

TH2-polarizingfactors

Peptide-MHC class II

CD40 CD80/CD86

TH17IL-17

Treg

The term adjuvant is derivedfrom the latin “adjuvare”, meaning to help

Adjuvants are usually defined as compounds that canaccelerate, prolong and enhance the quality of specific immune response to vaccine antigens

Why do vaccines need help? and

why do new vaccines need morehelp than vaccines that are well established?

New generation vaccines compared with previous whole-cellor virus-based vaccines

have a more defined composition

highly purified recombinant proteins

lower immunogenicity

Adjuvants are therefore required to assist new vaccines to induce potent and persistent immune responses

Advantages of use of Adjuvants

direct and optimize immune responses that areappropriated for the vaccine by promoting differenttypes of immune responses (humoral/cellular)

enable delivery of vaccine

Enhance the immunogenicity of weaker antigens

Decrease the dose of antigen in the vaccine

Decrease the frequency of immunization required toelicit protective immunity

Improve the efficacy of vaccines in newborn, aged andimmuno-compromised vaccine recipients, who oftenrespond poorly to vaccines

Adjuvant safety

Local reactions

Systemic reactions

Autoimmune diseases

Carcinogenicity

Teratogenicity

Come agiscono gli Adiuvanti e come possono essere classificati?

Gli adiuvanti sono definiti tali in base agli effetti che producono e non appartengono ad una classe di molecole definita. Possono essere raggruppati in ampi gruppi in base alla loro azione

I segnali necessari per ottenere una buona risposta immune ad

un vaccino sono i seguenti:

Segnale 1 –presentazione dell’Antigene

Segnale 2- co-stimolazione da parte delle cellule in

particolare le Antigen presenting cells (APCs)

Segnale 3- immunomodulazione

Segnale 0- attivazione delle risposte innate

presentazione dell’Antigene

Co-stimolazione

attivazione delle risposte innate

Modified by Guy B, Nat Rev Immunol, 2007.

New generation of Vaccines Adjuvants


Principali classi di Adiuvanti


Montanide MF59



Sono sostanze che si legano a recettori specifici e riconoscono strutture microbiche conservate

Recettori che riconoscono con precisionecaratteristiche tipiche delle molecolediffusamente utilizzate dai microbi

“pattern recognition receptors“ (PRRs)

Immunostimolatori

I RECETTORI CITOPLASMATICI DELL’IMMUNITA ’NATURALE

E DELL’INFIAMMAZIONE

I recettori NOD legano il muralpeptide di alcuni batteri!

I RECETTORI DI MEMBRANA DELL’IMMUNITA ’NATURALE E DELL’INFIAMMAZIONE

�RECETTORI PER I PEPTIDI FORMILATI�RECETTORI C-type Lectin (es. per il mannosio)

�RECETTORI SPAZZINI/SCAVANGER�RECETTORI TOLL-LIKE

•Recettori per il frammento cristallizzabile delle imm unoglobuline•Recettori integrinici

I RECETTORI PER I PEPTIDI FORMILATI

Type I C-type lectins (MMR, macrophage mannose receptor and DEC-205) contengono and 8–10 carbohydraterecognition domains (CRDs), Che legano zuccheri in maniera calcio dipendente.

Type II C-type lectins contengono solo un CRD nella loro porzione extracellulare (carbossiterminale)

La Famiglia dei recettori C-type lectin

Scavenger receptors for oxidized and glycated proteins (AGE)I RECETTORI SPAZZINI/SCAVANGER

I RECETTORI A TIPO TOLL“TOLL LIKE RECEPTORS”

(TLR)

Christiane Nüsslein – Volhard, Premio Nobel 1995

Christiane Nüsslein – Volhard, Premio Nobel 1995

Using Drosophila Nüsslein-Volhard and

Wieschaus were able to identify and classify a

small number of genes that are of key

importance in determining the body plan and

the formation of body segments.

EVOLUZIONE DEI TOLL-LIKE R!

Sono i pattern recognition receptors meglio Sono i pattern recognition receptors meglio Sono i pattern recognition receptors meglio Sono i pattern recognition receptors meglio caratterizzati nei mammiferi caratterizzati nei mammiferi caratterizzati nei mammiferi caratterizzati nei mammiferi

La risposta dei mammiferi a La risposta dei mammiferi a La risposta dei mammiferi a La risposta dei mammiferi a (virtualmente) tutti i microorganismi (virtualmente) tutti i microorganismi (virtualmente) tutti i microorganismi (virtualmente) tutti i microorganismi dipende dipende dipende dipende ab initioab initioab initioab initio dai TLRdai TLRdai TLRdai TLR

"Toll"Toll"Toll"Toll----like receptorslike receptorslike receptorslike receptors““““ (TLR)(TLR)(TLR)(TLR)

• Famiglia di proteine strutturalmente simili al Famiglia di proteine strutturalmente simili al Famiglia di proteine strutturalmente simili al Famiglia di proteine strutturalmente simili al

recettore Toll della Drosophila e a ILrecettore Toll della Drosophila e a ILrecettore Toll della Drosophila e a ILrecettore Toll della Drosophila e a IL----1R1R1R1R

• Recettori omologhi sono Recettori omologhi sono Recettori omologhi sono Recettori omologhi sono presenti negli presenti negli presenti negli presenti negli

insetti, nelle piante e nei mammiferiinsetti, nelle piante e nei mammiferiinsetti, nelle piante e nei mammiferiinsetti, nelle piante e nei mammiferi

• Undici identificati nellUndici identificati nellUndici identificati nellUndici identificati nell’’’’uomo (TLR1 uomo (TLR1 uomo (TLR1 uomo (TLR1 –––– TLR11)TLR11)TLR11)TLR11)



S

• Proteine trasmembrana di tipo I

• 115 Kd

• Domini extracellulare e citoplamatico conservati


S

Diversi TLR contengono numeri e arrangiamenti diversi dei motivi nella porzione extracellulare

Motivi ricchi in leucina

Motivi ricchi in cisteina


S

Regione omologa TOLL/recettore dell’IL-1(Toll-IL1R = TIR)

Il dominio intracitoplasmatico


S


Il dominio intracitoplasmatico è essenziale per la trasduzione del segnale


S


Il dominio intracitoplasmatico è essenziale per la trasduzione del segnaleIl dominio TIR è presente anche nei recettore di IL-1 e IL-18


S

I vari TLR hanno specificità diverse:

TLR1: triacil lipopeptideTLR2: lipoproteine, peptidoglicani, taxoloTLR4: LPS, HSP60TLR5: flagellinaTLR6: diacil lipopeptidi, acido lipotecoicoTLR10: ligando sconosciutoTLR11: batteri uropatogeni

TLR3: dsRNATLR7: ssRNA viraleTLR8: ssRNA viraleTLR9: CpG non metilate

I LIGANDI DEI TLR


S

I vari TLR hanno specificità diverse e formando eterodimeri amplificano il repertorio dei ligandi

S


I vari TLR hanno specificità diverse e formando eterodimeri amplificano il repertorio dei ligandi

TLR1 + TLR2TLR2 + TLR6

S S


La specificità è anche influenzata dal coinvolgimento di molecole accessorie

S



S

LPSTLR4

S


LPS binding protein


S

LPS LBPTLR4

S



S

LPS

CD14

LBPTLR4

S


LPS binding protein

S

LPS

CD14

LBP

LPS

TLR4

S



S

CD14

TLR4

S

LPS



S

CD14

TLR4

S

LPS

MD2


Il coinvolgimento di tutte le proteine accessorie è necessario perché si abbia la trasduzione del segnale all’interno della cellula

S

CD14

TLR4

S

LPS

MD2


CD14 ed MD2 possono associarsi anche ad altri TLR


S

CD14

TLR2

S

MD2


In alcuni tipi cellulari TLR4 si associa a proteine accessorie diverse


S

RP105

TLR4

S

MD1

•Riconoscono molti – tutti- i microbi e molti parassiti (non i vermi)



•Alcuni TLR hanno localizzazione intracellulare, essendo espressi esclusivamente negli endosomi (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9)



•Riconoscono anche ligandi endogeni, proteina da stress, acido ialuronico ecc.

•Alcuni TLR hanno localizzazione intracellulare, essendo espressi esclusivamente negli endosomi (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9)

•Contattano i loro ligandi nello spazio extracellulare o nel lume degli endosomi


"Toll"Toll"Toll"Toll----like receptorslike receptorslike receptorslike receptors““““ (TLR)(TLR)(TLR)(TLR) TLR1TLR2TLR4TLR5TLR6TLR10TLR11

S

S

TLR3TLR7TLR8TLR9

"Toll"Toll"Toll"Toll----like receptorslike receptorslike receptorslike receptors““““ (TLR)(TLR)(TLR)(TLR) TLR1TLR2TLR4TLR5TLR6TLR10TLR11

proteine

lipidi

S

TLR3TLR7TLR8TLR9

Acidi nucleici

S


proteine

lipidi

S

Acidi nucleici

S


proteine

lipidi

S

Acidi nucleici

S

Il segnaleporta all’attivazionedi una particolarerisposta“pro-infiammatoria”

Figura 13.3 - I recettori dell'immunità innata e dell'infiammazione.

I RECETTORI SOLUBILI, DI MEMBRANA E CITOPLASMATICI DEL DANN ODELL’IMMUNITA’NATURALE E DELL’INFIAMMAZIONE ATTIVANO ME CCANISMI DISEGNALAZIONE E DI DIFESA

Adjuvant formulations tested in humans

Name Company Class Indications Stage

Generation 1 adjuvantsAlum Various Mineral salt Various LicensedMF59 Novartis O/W emulsion Influenza(Fluad)/pandemic flu Licensed(EU)Liposomes Crucell Lipid vesicles HAV, Flu Licensed (EU)Montanide Various W/O emulsion Malaria, cancer Phase IIIPLG Novartis Polymeric microparticle DNA vaccine (HIV) Phase IFlagellin Vaxinnate Flagellin linked to antigen Flu Phase IQS21 Antigenics Saponin Various Phase I

Combination adjuvants – generation 2AS01 GSK MPL + liposomes + QS21 Malaria, TB Phase IIAS02 GSK MPL + O/W emulsion + QS21 Malaria Phase IIAS03 GSK O/W emulsion + a tocopherol Pandemic flu (Pandemrix) Licensed (EU)AS04 GSK MPL + Alum HBV (Fendrix), HPV (Cervarix) Licensed (EU)RC-529 Dynavax Synthetic MPL + Alum HBV Phase IIIscom CSL, Isconova Saponins + cholesterol + phosphl. Various Phase IIC31 Intercell Peptide + oligonucleotides TB Phase 1ISS Dynavax Oligonucleotide Alum HBV Phase IIMF59 + MTP-PE Chiron/Novartis Lipidated MDP + O/W emulsion HIV, Flu Phase I

From O’Hagan D. et al. Drug Disc Today 2009

New generation of Vaccines Adjuvants

Many of the pathogens invade through or cause disease at mucosal surfaces

development of mucosal defences is very important for controlling infections and preventing diseases

Nature Reviews ImmunologyNagler-Anderson Vol 1: 59-67 (2003)

Advantages of mucosal vaccination

Induction of antigen-specific IgA antibodies at the site of infection

Induction of specific responses at distant mucosal sites

Induction of systemic immune responses

Induction of helper CD4+ and CD8+ cytotoxic T lymphocytes

Non-invasive and does not require the use of needles

Mucosal vaccines licensed for human use

Oral polio vaccine

Oral live-attenuated typhoid vaccine VivotifR (Berna)

Oral cholera vaccines DukoralR (SBL vaccin)

Oral live-attenuated rotavirus vaccines RotaRixR (GSK) and RotaTeqR

(Merck)

Nasal live-attenuated flu vaccine FluMistR (MedImmune Vaccine, Inc.)

None of them is based on subunits of pathogens

Lack of effective and safe mucosal adjuvants

Safety and Efficacy

To satisfy these criteria is very important to know the mechanisms of action of the

candidate molecules

Cholera Toxin

Cholera Toxin (CT) is a potent adjuvant for systemic and mucosal vaccination, however the exact mechanism

of action by which this toxin amplify the immune responses has not been completely clarified

If co-administred with an Ag at the mucosal sites, CT induces a strong mucosal and systemic immune response against the Ag

CT induces the maturation and migration of DCs, but inhibits IL-12 and TNFα production

CT is able to polarize a mixed Th1/Th2 T cell response with a strong bias towards Th2 cells

It requires the presence of CD4+ T cells for its adjuvant activity

CT+AgNasal mucosa

Mo

MoCT

epithelium

Modified from Neutra et al. Nature Rev Immunol. 2006

CT

Treg

TH1

TH2

TH17

Draining Lymph nodes

We asked which are the draining LN after

intranasal immunization

Intranasal immunization with Tetanus Toxoid (TT) and CT:

-Humoral systemic and mucosal Immune Responses

-Cellular Immune Response

Humoral Immune Responses

7Days 0

Antigen: Tetanus Toxoid (TT) 1µg/dose

Adjuvant: Cholera Toxin (CT) 0.5-1µg/dose

Immunization: intranasal

14

immunizations

I II III

Bleed Bleed+vaginal washes

IV

28Bleed+vaginal washes

ELISA Serum anti-TT-IgG Vaginal anti-TT-IgA

Bleed

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

Ant

i-TT

ser

um Ig

G ti

ter

(GM

T)

x10

-4

number of immunizations

Serum IgG

number of immunizations

Ant

i-TT

IgA

tite

r (G

MT

) x1

0-3

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3 4

Vaginal IgA

Cholera toxin induces serum IgG and mucosal IgA in BALB/c mice

Mediastinal LN

Submandibular LN

Axillary LNInguinal LN(right)

Inguinal LN(left)

Mesenteric LN

Spleen

CT+Ag(Intranasal)

Cellular Immune Response

Cellular Immune Response

7Days

0

Antigen: Tetanus Toxoid (TT) 1µg/dose

Adjuvant: Cholera Toxin (CT) 0.5-1µg/dose

Immunization: intranasal

14

immunizations

I II III IV

28

Cells collected from different lymphoid organs:

Spleen

Mediastinal LN

Submandibular LN

Disatal (axillary and inguinal) LN

Booster dose

Mediastinal LN

0

20

40

60

80

Medium TT0

20

40

60

80

Medium TT

Submandibular LN

0

20

40

60

80

Medium TT

Distal LN

0

20

40

60

80

Medium TT

Spleen

Pro

lifer

atio

n (C

PM

x10

-3)

Medium TT0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Medium TT

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Medium TT0

1

2

3

4

5

6

7

8

Medium TT

Per

cent

age

of p

rolif

erat

ing

CD

4+ T

cel

ls

Mediastinal LN Submandibular LN

Distal LN Spleen

Tetanus toxoid-specific T lymphocytes are induced in mediastinal Lymph nodes one week after the first intranasal immunization

Mice immunised with TT

Mice immunised with TT+CT

Vendetti S et al. Methods 2009

Distal LN

0

5

10

15

20

25

30

medium TT

0

5

10

15

20

25

30

medium TT

Mediastinal LN

0

5

10

15

20

25

30

medium TT

Submandibular LN

0

5

10

15

20

25

30

medium TT

Spleen

Per

cent

age

of p

rolif

erat

ing

CD

4+T

cel

ls

One week after the second intranasal immunization Ag-specific T lymphocytes are present also is submandibular lymph nodes

Mice immunised with TT

Mice immunised with TT+CT

Mediastinal LN

0

5

10

15

20

25

Medium TT0

5

10

15

20

25

Medium TT

0

5

10

15

20

25

Medium TT0

5

10

15

20

25

Medium TT

Submandibular LN

Distal LN SpleenP

erce

ntag

e of

pro

lifer

atin

g C

D4+

T c

ells

Vendetti S et al. Methods 2009

Summary

Mediastinal lymph nodes act as the draining primary lymph nodes following intranasal immunization with Ag and CT.

Antigen-specific T lymphocytes are detected in the mediastinal lymph nodes one week after intranasal immunization.

Progressively, with the increase of the doses of Ag and CT, antigen-specific T cells are detected in submandibular, distal lymph nodes and spleen.

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