Simplexa EBV - Focus Diagnostics .Il saggio Simplexa EBV di Focus Diagnostics è studiato per la

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Simplexa EBV

REF MOL2400

Rev. G

Un saggio basato su PCR in tempo reale per la quantificazione in vitro del virus di Epstein-Barr (EBV).

Per uso diagnostico in vitro

USO PREVISTO

Il saggio Simplexa EBV di Focus Diagnostics studiato per la quantificazione in vitro degli acidi nucleici del virus di Epstein-Barr

in campioni di sangue intero mediante il 3M Integrated Cycler.

Questo dosaggio, da utilizzarsi insieme allesame clinico e ad altri marcatori di laboratorio della progressione della malat tia, utile nella gestione clinica di pazienti infettati da EBV.

Il saggio non indicato per lo screening di donatori..

RIASSUNTO E SPIEGAZIONE

Il virus di Epstein-Barr (EBV), un herpesvirus umano molto diffuso con un caratteristico tropismo per i linfociti B, lagente eziologico della mononucleosi infettiva ed fortemente associato nelluomo a diversi tipi di neoplasie maligne. Linfezione da EBV comune e generalmente subclinica, o d luogo ad una malattia autolimitante della durata di 2-3 settimane. Essendo un virus erpetico, l'EBV pu rimanere latente per lunghi periodi di tempo, riattivandosi in un momento successivo. Anche se linfezione iniziale pu dare luogo ad una sindrome relativamente benigna, la riattivazione del virus in individui immunocompromessi pu tradursi in esiti pi gravi. Gli acidi nucleici o le proteine di EBV sono stati identificati in tessuti affetti da linfoma di Burkitt

1, linfoma

di Hodgkin2-4

, carcinoma nasofaringeo1,5

, disordini linfoproliferativi post-trapianto6-8

, linfoma primario del sistema nervoso centrale legato ad AIDS

9,10 e altri linfomi a cellule B e T

11,12.

I metodi diagnostici convenzionali sono di raro utili nella valutazione di disordini legati alla presenza di EBV in pazienti immunosoppressi. L'uso di colture non pratico n utile a fini clinici, mentre i metodi sierologici danno risultati difficilmente interpretabili in un quadro di immunosoppressione

13. I metodi diagnostici basati sulluso della reazione polimerasica a catena

(PCR) offrono la possibilit di rilevare velocemente la presenza di EBV nei campioni. Il monitoraggio della carica virale di EBV pu essere daiuto nellidentificazione di disordini linfoproliferativi post-trapianto e nel monitoraggio di linfomi in pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita.

14-15

PRINCIPI DELLA PROCEDURA

Il test basato su un sistema di amplificazione e identificazione tramite PCR in tempo reale, che sfrutta una sonda-primer bifunzionale fluorescente per il rilevamento del DNA del virus di Epstein-Barr in campioni di sangue intero. Il saggio prevede due fasi principali: (1) estrazione del DNA dai campioni ottenuti dai pazienti e (2) utilizzo di una sonda-primer bifunzionale fluorescente che, insieme ad un primer inverso, permette di amplificare un target specifico (per lanalita e per il controllo interno). Il saggio fornisce un risultato univoco; per identificare il DNA virale nel campione si utilizza come bersaglio una regione ampiamente conservata del gene Lmp2A del genoma di EBV. Un controllo interno permette di monitorare il processo di estrazione e rilevare leventuale inibizione della PCR. Il segnale di amplificazione ottenuto per ogni campione viene messo a confronto con una curva di calibrazione e quantificato.

MATERIALI FORNITI

Il kit SimplexaTM

EBV di Focus Diagnostics contiene reagenti sufficienti per 100 reazioni.

Descrizione del kit

Nome del componente REF Simbolo CE Sulletichetta

Nome abbreviato

Colore del

tappo

Numero di

flaconcini

Reazioni per

flaconcino /kit

Volume per

flaconcino

Simplexa EBV Primer Mix MOL2401 REAG A PM Marrone 2 50/100 50 l

Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50/100 200 l

Simplexa Extraction & Amplification Control DNA

MOL9001 CONTROL IC IC Blu 3 50/150 250 l

Simplexa EBV Low Positive Control MOL2402 CONTROL + LPC Bianco 6 1/6 200 l

Simplexa EBV High Positive Control MOL2403 CONTROL ++ HPC Rosso 6 1/6 200 l

Simplexa EBV pagina 2

Descrizione dei componenti Componente Descrizione

Simplexa EBV Primer Mix (PM) (Miscela di primer)

Primer marcati con colorante fluorescente specifici per la quantificazione di EBV e per il controllo interno.

Target Fluoroforo sonda (colorante) Eccitazione Emissione Gene bersaglio

EBV FAM 495 nm 520 nm Gene Lmp2A

Controllo interno Q670 644 nm 670 nm Gene di A. thaliana

Simplexa Master Mix (MM) (Miscela master) DNA polimerasi, tampone e dNTP Simplexa Extraction & Amplification Control DNA (IC) (DNA di controllo per lestrazione e lamplificazione)

Un frammento di DNA di 577 bp derivato dal gene codificante per la N-metiltransferasi della subunit grande della ribulosio-1,5-bifosfato carbossilasi/ossigenasi della pianta di Arabidopsis thaliana.

Simplexa EBV Low Positive Control (LPC) (Controllo positivo basso) EBV inattivato in una matrice di base di origine umana.

Simplexa EBV High Positive Control (HPC) (Controllo positivo alto) EBV inattivato in una matrice di base di origine umana.

Simplexa EBV Barcode Card (Card con codice a barre) Parametri specifici per il dosaggio.

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI

1. Simplexa EBV Quantitation Standards (standard di quantificazione), REF MOL2410

2. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 3.0 o superiore

3. Universal Discs per utilizzo su Integrated Cycler

4. Nastro di copertura per Universal Discs

5. a Sistema Roche MagNA Pure LC e materiali di consumo associati.

6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (numero di catalogo Roche 03038505001)

7. b Strumento bioMrieux NucliSENS

easyMAG con reagenti e materiali di consumo associati

8. b Pipetta multicanale Biohit/bioMrieux

9. b Piastra con strip per saggio ELISA

10. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 l, 10-100 l e 100-1000 l

11. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit)

12. Frigorifero da 2 a 8 C (per i campioni e i componenti del kit scongelati)

13. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni

14. Microcentrifuga

15. Miscelatore vortex

16. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore

17. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicato

18. Guanti monouso senza talco

19. Acqua priva di nucleasi, usata durante lestrazione e come No Template Control (NTC, controllo privo di templato) 20. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a Da utilizzarsi con la metodica di estrazione Roche MagNA Pure LC

b Da utilizzarsi con la metodica di estrazione bioMrieux easyMAG

PERIODO DI VALIDIT E MANIPOLAZIONE

1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Prima delluso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). 3. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza.

4. Dopo laggiunta della miscela master, utilizzare la miscela di reazione entro unora. Conservare la miscela di reazione tra 2 e 8 C fino al momento dellimpostazione della PCR.

5. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master e il DNA del controllo di estrazione e amplificazione a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non oltre 30 giorni

6. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master, il DNA del controllo di estrazione e amplificazione o i controlli positivi.

7. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti.

Simplexa EBV pagina 3

AVVERTENZE E PRECAUZIONI

1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Tutti i materiali di origine umana devono essere trattati come potenzialmente infettivi. I materiali di partenza da cui stato

derivato questo prodotto (inclusi i controlli) sono stati sottoposti a screening per lantigene di superficie dellepatite B e per la presenza di anticorpi contro lepatite C e HIV-1/2 (AIDS) con metodi approvati dalla FDA, e sono risultati negativi ai test. Siccome, per, nessun metodo conosciuto offre la totale certezza che i prodotti derivati da sangue umano non possano trasmettere questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e lattrezzatura che venga a contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi e decontaminati o smaltiti seguendo le precauzioni necessarie per i materiali che pongono un rischio biologico. I CDC (Centers for Disease Control) e i National Institutes of Health statunitensi raccomandano di manipolare gli agenti potenzialmente infettivi in strutture con un livello di biosicurezza 2.

16, 17 3. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo,

guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 4. Non pipettare con la bocca.

5. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani.

6. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali.

7. Il