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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SÍNTESE E ATIVIDADE DE COMPOSTOS
POTENCIALMENTE LARVICIDAS FRENTE AO Aedes aegypti
SANDRA REGINA LIMA SANTOS
São Cristóvão-SE
Abril, 2014
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SÍNTESE E ATIVIDADE DE COMPOSTOS
POTENCIALMENTE LARVICIDAS FRENTE AO Aedes aegypti
SANDRA REGINA LIMA SANTOS
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Sergipe como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti
São Cristóvão-SE
Abril, 2014
iii
SANDRA REGINA LIMA SANTOS
SANDRA REGINA LIMA SANTOS
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20
14
.
iv
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237s
Santos, Sandra Regina Lima Síntese e atividade de compostos potencialmente larvicidas
frente ao Aedes aegypti / Sandra Regina Lima Santos ; orientador Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti. – São Cristóvão, 2014.
94 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, 2014.
1. Farmacologia. 2. Essências e óleos essenciais. 3.
Inseticidas. 4. Dengue. 5. Aedes aegypti. I. Cavalcanti, Sócrates Cabral de Holanda, orient. II. Título.
CDU 615.285.7
v
SANDRA REGINA LIMA SANTOS
SÍNTESE E ATIVIDADE DE COMPOSTOS POTENCIALMETE
LARVICIDAS FRENTE AO Aedes aegypti
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Sergipe como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Aprovada em: _____/_____/_____
__________________________________________________
Orientador: Professor Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti
_________________________________________________
1º Examinador: Professor. Dr.Marcelo Cavalcante Duarte
__________________________________________________
2º Examinador: Professora. DrªRosilene Morretti Marcal
PARECER
vi
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho as minhas mães Joaninha
(In memoriam) e Lindete, aos meus irmãos
Paulo e Jaqueline, ao meu esposo Robson e
minha querida tia Amélia, pelo incentivo, apoio
e amor.
vii
AGRADECIMENTOS
Á Deus, sempre presente em minha vida, me dando forças e fé para continuar a
busca por um futuro melhor. Meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de
alguma forma doaram um pouco de si para que a conclusão deste trabalho se
tornasse possível.
As minhas mães, Joaninha (in memoriam) e Lindete, pelo exemplo de amor e
incentivo constantes. A vocês que juntas compartilharam os meus ideais e os
alimentaram, incentivando a prosseguir na jornada, mostrando que o nosso caminho
deveria ser seguido sem medo, fossem quais fossem os obstáculos. Minha eterna
gratidão vai além dos meus sentimentos, sem a dedicação e força de vocês, com
certeza eu não seria ninguém.
Aos meus irmãos Paulo e Jaqueline, pelas palavras de apoio e carinho.
Ao meu querido esposo Robson, por todas as formas de afeto, motivação e apoio.
Sou muito grata por tudo, minha vida, pelos seus ensinamentos,paciência e amor.
À minha tia Amélia, pelo exemplo, incentivo, confiança e amor.
Aos meus primos Kaio, Beatriz e Isis pelas palavras de carinho.
As minhas queridas amigas Géssica, Verônica e Karine pelo carinho e
companheirismo.
As colegas de trabalho pelo apoio e compartilhamento de dificuldades, Isabela,
Patrícia, Thiara, Tereza, Karina, Larissa e Grazi.
À Lilian, Lari e João pela ajuda estrutural deste trabalho, obrigado!
Ao meu orientador prof. Dr. Sócrates Cabral, pelo incentivo de anos de pesquisa e
mestrado, pelos ensinamentos e principalmente pela paciência, a minha eterna
gratidão!
À equipe LQF, Manu, Dani, Thaysnara, Viviane, Marília e Rafael, agradeço pelos
momentos que passamos no laboratório, obrigada pelos ensinamentos e colaboração.
À equipe do laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical, em especial a prof.
Dr. Roseli La Corti, pela cessão das larvas utilizadas neste trabalho.
A Ulisses Martins e Departamento de Química da UFS, pelas análises de UV,
realizadas.
Ao prof. Dr. Norberto Peporine Lopes pela análise EM dos compostos sintetizados.
viii
Ao prof. Dr. Emmanuel Costa e profª. Angelita Nepel pelas análises de RMN dos
compostos sintetizados.
ix
“Faz-se ciência com os fatos, como se faz uma casa
com pedras; mas uma acumulação de fatos não é
ciência, assim como um monte de pedras não é
uma casa. ”
Henri Poincaré
x
Sandra Regina Lima Santos. Síntese e atividade de compostos potencialmentelarvicidas frente ao Aedes aegypti. [Dissertação de Mestrado]. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Sergipe. Orientador: Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti, 2014.
RESUMO
A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui um
sério problema de saúde pública mundial, estando seu controle voltado, basicamente,
no manejo do principal vetor, o Aedes aegypti. Na ausência de uma vacina eficaz e
segura para prevenção desta enfermidade, a principal medida de prevenção
disponível para as infecções causadas pelo vírus da dengue é o controle vetorial
através do uso de inseticidas e larvicidas químicos. Essa estratégia, entretanto, tem
se mostrado seletiva no que concerne à manutenção de populações resistentes do
mosquito frente aos inseticidas convencionalmente utilizados. Nesse contexto, o
desenvolvimento de novas tecnologias e estratégias alternativas no controleao Aedes
aegypti é fundamental para reduzir a incidência da doença. Sendo assim, o objetivo
do presente estudo foi avaliar a atividade de novos compostos frente às larvas do
Aedes aegypti e para tal utilizou-se de duas vertentes: a avaliação de monoterpenos e
derivados, fenilpropanóides,e substâncias derivadas da via do metabolismo do
triptofano.Inicialmente foram selecionados 21 compostos comercialmente disponíveis,
subdivididos em dois grupos: 10 compostos aromáticos e 11 alifáticos bicíclicos. Os
bioensaios foram realizados utilizando-se 20 larvas por teste, em copos descartáveis
contendo 20 mL de uma solução aquosa com concentrações variadas dos compostos
teste, em triplicata. Dentre os compostos aromáticos o p-cimeno apresentam-se mais
potentes, CL50 = 51 ppm e o Resorcinol exibiu a menor potência CL50 = 577 ppm.
Dentro do grupo dos alifáticos o (–)-canfeno apresentou a melhor atividade CL50 = 220
ppm e o 1,8-cineol exibiu a menor potência CL50 = 1419 ppm. Identificamos que as
caracteristicas estruturais dos derivados de oléos essencias podem contribuir para
potencializar a atividade larvicida destes compostos. Neste sentido, relatamos a
importância da presença de grupos lipofilicos no incremento da potência destas
substâncias assim como a diminuição do potencial larvicida em derivados que
detinham hidroxila em sua molécula. Posteriormente, doze compostos derivados da
quinurenina foram sintetizados de acordo com diversas metodologias, seguido da
identificação por cromatografia em camada delgada e ponto de fusão, além de serem
purificados em coluna cromatográfica de sílica gel 60 e caracterizados por RMN de13C
e 1H, EM e IV. Todos os intermediários de síntese foram avaliados quanto à atividade
larvicida e observou-se que os compostos 2-amino-α-cloroacetofenona
substituídatestados demonstraram serem potentes agentes larvicidas contra o Ae.
aegypti, sendo que os valores das CL50 variaram entre 4,29 a 11,71 ppm. Entretanto,
os compostos 2-acetilamino-2-[2-(2-amino-fenilas-substituídas)-2-oxoetila] ácido
malônico-dietil-éster ederivados da quinurenina, não apresentaram atividade
significativa contra as larvas do Ae. aegypti.
Palavras-chave: Dengue, Aedes aegypti e atividade larvicida.
xi
Sandra Regina Lima Santos. Síntese e atividade de compostos potencialmente larvicidas frente ao Aedes aegypti.[Dissertação de Mestrado]. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Sergipe. Orientador: Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti, 2014.
ABSTRACT
Nowadays, themost importantarboviral diseaseaffecting humans is dengue.The
Dengue constitutesa serious problem of public health in the world; its managementis basically restrictedto the controlling of themain vector, Aedes aegypti. In absence of an effective and safe prevention vaccine for this disease, the main preventive measureavailablefor infections causedby dengue virusisvector controlthrough the use of chemicalinsecticides andlarvicides. This strategy, however, hasshownselectivity inmaintenanceofresistant mosquitopopulations against insecticidesconventionallyused. In this context, the development of new technologies and alternative strategies to combat Aedes aegypti is essential to reduce the disease incidence.Thus, theobjective of this studywas to evaluatethe activity of new compoundsagainst larvaeof Aedesaegyptiand it was addressed two aspects:the evaluationof terpenesand derivatives, as well as the synthesis ofcompoundswith the potentialto acttowardsofmetabolism oftryptophan. Initially were selected 21 commercially compounds available, subdivided into two groups: 10 aromatic and 11 aliphatic bicyclic. Bioassays were performed using 20 larvae per test in cups containing 20 ml of an aqueous solution containing varying concentrations of test compounds in triplicate. Among the aromatic compounds the p-cymene demons the best potency LC50 = 51 ppm and the Resorcinol exhibited the lower potency LC50 = 577 ppm. Within the aliphatic group the (–)-camphene showed the best activity LC50 = 220 ppm and 1,8-cineole exhibited lower potency LC50 = 1419 ppm. It was Identified that the structural characteristics of the derivatives of essential oils may contribute to the understanding the larvicidal activity of these compounds. In this sense, we report the importance of the lipophilic groups presence increasing the potency of these substances as well as reducing the potential larvicide in derivatives held hydroxyl in the molecule. Subsequently, twelve compoundskynureninederivativesweresynthesized according tovariousmethods, followed bythe identificationby thin layer chromatography and melting point, purified by silica gel 60 column chromatography and characterized by 13C and1H NMR , MS and IR. Allsynthetic intermediateswere evaluated forlarvicidal activityandobserved thatcompounds 2-amino-α-chloroacetophenone replacedtested proved tobepotent larvicides agentsagainstAe. aegypti, with LC50valuesranged from4.29 to 11.71ppm. However, thecompounds 2-acetylamino-2-[2 - (2-amino-fenilas-substituted)-2-oxoetila] malonic aciddiethylester andkynurenine derivatives, showed nosignificant activity againstlarvaeof theAe.aegypti.
Keywords: Dengue, Aedesaegypti andlarvicidal activity.
xii
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA..................................................................................................
AGRADECIMENTOS...........................................................................................
RESUMO.........................................................................................................
ABSTRACT......................................................................................................
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................ ..............
ÍNDICE DE TABELAS..........................................................................................
ÍNDICE DE ESQUEMAS.......................................................................................
LISTA DE SÍMBOLOS, FÓRMULAS E NOMENCLATURAS............................................
vi
vii
x
xi
xiv
xv
xvi
xvii
LISTA DE SÍMBOLOS......................................................................................... xix
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 21
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................... 24
2.1 DENGUE............................................................................................................. 24
2.2 CICLO BIOLÓGICO DO VETORAedes aegypti.................................................. 26
2.2.1 Os ovos....................................................................................... 26
2.2.2 A Larva.................................................................................................. 27
2.2.3 Apupa.................................................................................................... 28
2.2.4 O adulto................................................................................................. 29
2.3 CONTROLE DO VETOR.......................................................................... 30
2.4 ÓLEO ESSENCIAL: CONSIDERAÇÕES GERAIS E ATIVIDADE
LARVICIDA.....................................................................................................
34
2.5 INTRODUÇÃO AO REA........................................................................... 39
2.6 VIA DAS QUINURENINAS – ASPECTOS GERAIS................................. 42
3. OBJETIVOS................................................................................................... 47
3.1 Gerais....................................................................................................... 47
3.2 Especificos.......,....................................................................................... 47
4. EXPERIMENTAL............................................................................................ 48
4.1 ESPECIFICAÇÕES DOS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS................... 48
4.1.1 Aparelhos utilizados.................................................................. 48
4.1.2 Substâncias, reagentes e outros materiais utilizados........................... 48
4.1.3 Métodos cromatográficos...................................................................... 50
4.1.4 Métodos espectrométricos.................................................................... 50
4.2 TERPENOS, FENILPROPANÓIDES E COMPOSTOS
RELACIONADOS...........................................................................................
51
4.3 SÍNTESE DE DERIVADOS DA QUINURENINA...................................... 53
xiii
4.3.1 Síntese da 2-amino-α-cloroacetofenona substituída A (2a-2d)............. 53
4.3.2 Síntese da 2-acetilamino-2-[2-(2-amino-fenilas-substituídas)-2-
oxoetila] ácido malônico-diétil-éster B (3a-3d)...............................................
55
4.3.3 Síntese dos derivados da quinurenina C (4a-4d)................................. 57
4.4 ENSAIO LARVICIDA................................................................................... 57
4.4.1 Obtenção dos ovos.................................................................... 57
4.4.2 Obtenção das larvas.................................................................. 58
4.4.3 Ensaio de toxicidade.................................................................. 58
4.4.4 Preparo das soluções-estoque.................................................. 59
4.4.5 Análise estatística...................................................................... 59
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 60
5.1 ESTRUTURAS DOS TERPENOS, FENILPROPANÓIDE E SEUS
COMPOSTOS RELACIONADOS QUANTO À ATIVIDADE LARVICIDA .................
60
5.2 RELAÇÃO ESTRUTURA E ATIVIDADE DOS COMPOSTOS AROMÁTICOS
E ALIFÁTICOS..........................................................................................................
62
5.3 SÍNTESE E ATIVIDADE DOS COMPOSTOS DERIVADOS DA
QUINURENINA.........................................................................................................
65
6. CONCLUSÃO................................................................................................. 78
7. BIBLIOGRAFIA.............................................................................................. 79
ANEXOS………………………………………………………………..……......... 94
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Ovos do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)............................................ 27
Figura 2: Larva no quarto estádio Aedes aegypti................................................ 29
Figura 3: Pupa do Aedes aegypti(Linnaeus, 1762)............................................. 29
Figura 4: Mosquito adulto do Aedes aegypti(Linnaeus, 1762)............................ 29
Figura 5: Estrutura química do temefós.............................................................. 31
Figura 6: Estrutura química metopreno............................................................... 32
Figura 7: Estrutura química do diflubenzuron..................................................... 33
Figura 8:Exemplos de fenilpropanóides.............................................................. 36
Figura 9: Exemplos de monoterpenos................................................................ 37
Figura 10: Estrutura dos 18 fenilpropanóides avaliados..................................... 39
Figura 11:Estruturas de monoterpenóides e seus derivados acetilados............. 41
Figura 12:Estrutura doscompostos aromáticos................................................... 52
Figura 13:Estrutura dos compostos alifáticos bicíclicos...................................... 52
Figura 14:Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 2a – d................. 71
Figura 15: Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 3a – d................ 72
Figura 16: Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 4a – d................ 74
Figura 17: Estrutura química dos compostos derivados da quinurenina
avaliados............................................................................................................... 75
xv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1.Atividades larvicida (CL50) e Intervalo de confiança (IC) 95% dogrupo
dos aromáticos avaliados frente às larvas do Ae. aegyptino terceiro
estadio................................................................................................................... 60
Tabela 2: Atividades larvicida (CL50) e Intervalo de confiança (IC) 95% do
grupo dos alifáticos biciclícos avaliados frente às larvas do Ae. aegyptino
terceiro estadio................................................................................................... 61
Tabela 3: Massa molecular, faixa de fusão e rendimento dos derivados da
quinurenina............................................................................................................ 70
Tabela 4. Atividades larvicida (CL50) e intervalo de confiança de (IC 95%) dos
derivados da quinurenina frente às larvas de Aedes aegypti............................... 77
Tabela 5: Dados do estudo estatístico submetido a análise probítica dos
compostos aromáticos.......................................................................................... 94
Tabela 6: Dados do estudo estatístico submetido a análise probítica dos
compostos alifáticos biciclicos............................................................................... 96
Tabela 7: Dados do estudo estatístico submetido a análise probítica dos
compostos derivados da quinurenina ativos......................................................... 97
xvi
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1:Aspecto geral da via das quinureninas............................................ 43
Esquema 2:Via do metabolismo do triptofano em mosquitos............................. 44
Esquema 3: Esquema das reações das anilinas substituídas............................ 53
Esquema 4: Mecanismos da reações 2a – 2d.................................................... 66
Esquema 5: Mecanismos das reações 3a – 3d.................................................. 68
Esquema 6: Mecanismos das reações 4a – d.................................................... 69
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh – acetilcolina
AChE - acetilcolinesterase
Ae- Aedes
AHJ – Análogos do Hormônio Juvenil
BPU – Benzoil-Fenil-Uréias
Bti - Bacillus thuringiensis israelensis
CC – Cromatografia em coluna
CCDA – Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CL50 - concentração letal que mata 50 % da população em estudo
DDT – dicloro difenil tricloroetano
DFB - Diflubenzuron
EM – Espectrometria de Massas
FHD – Febre Hemorrágica da Dengue
FUNASA – Fundação Nacional da Saúde
3-HK – 3 – hidroxi-quinurenina
Hz – Hertz
IC – Intervalo de Confiança
IGR – Insect Growth Regulator
IPT - Instituto de Pesquisas Tecnológicas
IV- Infra-Vermelho
J - constante de acoplamento
KAT – Quinurenina aminotransferase
KMO – Quinurenina monooxidase
L. gracilis – Lippia gracilis
LEPaT – Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical
LQF-Laboratório de Química Farmacêutica
MM – Massa Molecular
MS - Ministério da Saúde
nm – nanômetro
OMS - Organização Mundial da Saúde
P.A. – Para análise
pF – Ponto de fusão
xviii
ppm – partes por milhão
RMN¹H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN¹³C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze
SAR – Relação estrutura-atividade
SCD – Síndrome de Choque da Dengue
TMS – Tetrametilsilano
UFPR- Universidade Federal do Paraná
USP – Universidade de São Paulo
XA – Ácido Xanturênico
xix
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC – Graus Celsius
- deslocamento químico
% - porcentagem
AcOEt - Acetato de etila
AlCl3– Tricloreto de Alumínio
BCl3 – Tricloreto de Boro
cm-1 – inverso do centímetro
C – Carbono
CDCl3 – Clorofórmio Deuterado
ClCH3CN - Cloroacetonitrila
C2H6SO - Dimetilformamida
C7O4H12-Dietilacetamidomalonato
d - dupleto
dd - dupleto de dupletos
ddd- triplo dupletos
DCM - Diclorometano
DMF – Dimetilformamida
dt - dupleto de tripleto
DMSO - Dimetilsufóxido
g – grama
H – Hidrogênio
h - hora
H20 - Água
HCl - Ácido clorídrico
Hz – Hertz
J - constante de acoplamento
KBr - Brometo de Potássio
L – Litro
m- multipleto
mL - Mililitro
MgSO4 - Sulfato de magnésio anidro
MHz- Mega Hertz
xx
m – multipleto
Na2SO4- Sulfato de sódio anidro
NaH - Hidreto de sódio
pt – pseudo tripleto
q – quarteto
s- singleto
t- tripleto
THF-Tetrahidrofuno
21
1. INTRODUÇÃO
A dengue é uma doença infecciosa febril aguda causada por um vírus da família
Flaviridae e é transmitida no Brasil, através do mosquito Aedes aegypti, também
infectado pelo vírus. Na atualmente, a dengue é considerada um dos principais
problemas de saúde pública mundial.São conhecidos quatro tipos de dengue com
quatro sorotipos antignicamente distintos: DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4.
A dengue manifesta-se clinicamente sob duas formas principais: a dengue clássica
(também chamada febre da dengue) e a forma hemorrágica ou febre hemorrágica da
dengue (FHD). A dengue clássica apresenta sintomas semelhantes aos de uma forte
gripe, como dor de cabeça, cansaço, dores musculares e nas articulações, entre
outros. A forma hemorrágica é na maioria dos casos letal e caracteriza-se por febre
alta (ocasionalmente 40 a 41ºC) mantendo-se elevada por um período de dois a sete
dias quando então, apresenta queda súbita; hepatomegalia, a qual surge no inicio do
quadro febril; dores abdominais fortes e contínuas; vômitos persistentes; pele pálida e
fria (principalmente extremidades); insuficiência circulatória; sonolência; sede
excessiva e boca seca; pulso rápido e fraco; perda de consciência; dificuldade
respiratória; agitação; confusão mental; choques; manifestações cutâneas como
equimoses e petequias. A gravidade da FHD em comparação a dengue clássica
ocorre em virtude do extravasamento plasmático causado pelo aumento da
permeabilidade vascular, podendo levar o indevíduo ao óbito.
A ação mais simples para prevenção da dengue é evitar o nascimento do
mosquito, já que não existem vacinas ou medicamentos que combatam a
contaminação. Como a proliferação do mosquito da dengue é rápida, além das
iniciativas governamentais é importante à participação da população para interromper
o ciclo de transmissão e focos do vetor. É necessário ressaltar que um único mosquito
pode contaminar até 300 pessoas em 45 dias de vida.
A estratégia mais antiga para o controle do vetor e ainda a mais utilizada, é
baseada no uso de inseticidas, substâncias de origem natural ou sintética utilizadas
para diminuir a incidência de insetos em diferentes fases do seu ciclo de vida. Até
recentemente, o larvicida mais utilizado para controle do Ae. aegypti no Brasil era o
organofosforado temefós, o qual age no sistema nervoso do inseto bloqueando a
enzima acetilcolinesterase. O uso contínuo desse larvicida fez com que surgissem
22
polpulações resistentes como conseqüência do uso irracional, além dos efeitos
indesejáveis como aumento da frequência de aplicação, dosagens crescentes,
permanência por longos períodos de tempo no meio ambiente, afetando os
ecossistemas e surgimento de doenças, quando os vetores não podem ser
controlados.
Diante da importância epidemiológica deste vetor e dos problemas enfrentados
com seu controle em todo mundo, estudos tem apresentado a viabilidade de adoção
de medidas adicionais.
Produtos alternativos com potencial de utilização no controle do Ae. aegypti,
incluindo o biolarvicida Bti (Bacillus thuringiensis var. israelensis) e alguns reguladores
do desenvolvimento de insetos, como BPU (inibidores de síntese de quitina) e AHJ
(Análogos de Hormônio Juvenil) são útilizados como inseticidas alternativos, nas
regiões onde não há mais respostas positivas com o uso do temefós. Além do custo
mais elevado, se comparado ao organofosforado, em algumas regiões já foi relatada
a resistência aos larvicidas bioativos.
A resistência é uma característica genética que se insere numa população em
função do uso de inseticidas. Ou seja, quanto mais o inseticida for utilizado, mais
rápido e maior é a seleção de insetos resistentes na população e, consequentemente,
maior o nível de resistência atingida. A capacidade dos insetos de tolerar
concentrações inicialmente letais promove uma redução gradual na eficácia dos
inseticidas, até a sua completa ineficiência.
As plantas podemseruma fonte alternativa deagentesinseticidas, pois as
mesmasbiosintetizam e emitem inúmeros compostos como ácidos, aldeídos e
terpenos para atrair polinizadores e se defender de herbívoros. Produtos naturais
provenientes de plantas poderão ser candidatos alternativos às medidas de controle
pela baixa toxicidade aos mamíferos e pela ausência de impacto ambiental. Nesse
contexto os óleos essenciais e seus constituintes majoritários são importantes
candidatos para a busca de um larvicida ambientalmente seguro, eficaz, ativo e
economicamente viável.
Frente a este cenário, tem-se aumentado esforços em explorar as
possibilidades de desenvolver inseticidas obtidos a partir de plantasou seus derivados
semi-sintéticos. Outra vertente de pesquisa de novos agentes larvicidas é a síntese
23
de derivados da quinurenina, um importante intermediário da via de oxidação do
aminoácido, triptofano.
Uma importante reação na via das quinureninas no gêneroAedes é a
conversão do aminoácido triptofano em uma substância atóxica, o ácido xanturênico,
responsável pela produção dos ovos e coloração dos olhos dos mosquitos.A oxidação
do triptofano em 3-hidroxiquinurenina (3-HK) é uma importante via de metabolismo do
triptofano em mosquitosAedes aegypti.A 3-hidroxiquinurenina, um intermediário deste
metabolismo,é facilmente oxidadasob condições fisiológicas, a espécies reativas de
oxigênio. Logo, uma possível inibição da enzima3-hidroxiquinurenina
aminotransferase, responsável pela conversão da 3-HK em ácido xanturênico noAe.
aegypti pode promover um acúmulo de 3-HK, cessando o desenvolvimento larval e
levando a morte da mesma.
Vale salientar que a descoberta de compostos inibidores desta enzima seria de
suma importância na busca por novas alternativas para o controle do Ae. aegypti,
além de apresentarem um mecanismo de ação diferenciado com relação aos
compostos inseticidas mais utilizados na atualidade.
Com base no potencial larvicida dos terpenos e derivados, assim como
estudosque se traduzam em novos mecanismos para o controle do vetor e tendo em
vista à necessidade de um controle mais efetivo da dengue; o presente trabalho teve
como principal objetivo sintetizar e avaliar a atividade larvicida de três conjuntos de
compostos, visando identificar as características estruturais e funcionais que
contribuiem para a atividade larvicida.
24
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1Dengue
A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui
um sério problema de saúde pública mundial. A incidência dadoençatem crescido
drasticamenteem todo o mundonas últimas décadas. Mais de 2,5 bilhões de pessoas -
40%da população domundo- vivem em áreas onde a dengue pode ser transmitida.
Essas áreas estão centradas, especialmente, nos países de clima tropical, onde as
condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do Aedes
aegypti, principal transmissor da doença. Não existe um tratamento específico, masa
detecção precoce eacesso à assistência médica adequada reduzemas taxas de
mortalidade para valores menores que 1% (WHOa, 2013; BARRETO, 2005).
A dengue se manifesta como uma doença febril aguda de evolução benigna na
forma clássica, e grave, quando se apresenta na forma hemorrágica. O agente
etiológico da dengue é um arbovírus, do gênero Flavivírus, pertencente à família
Flaviviridae. A dengue possui quatro sorotipos antigenicamente relacionados, no
entanto, distintos designados por: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 (BARRETO
e TEIXEIRA, 2008).
O quadro clínico da dengue clássica envolve sintomas como febre, enxaqueca,
mialgia, artralgia, fraqueza e anorexia, vômitos e diarréia moderada são comuns. A
forma hemorrágica é caracterizada por uma febre súbita, náusea, vômitos, todos os
tipos possíveis de manifestações hemorrágicas, sinais de vazamento capilar difuso e
queda da pressão arterial (MARZOCHI, 1994; MONATH, 1994).
Os primeiros registros de dengue no mundo foram feitos no fim do século XVIII,
no Sudoeste Asiático, em Java, e nos Estados Unidos, na Filadélfia. Mas a OMS só a
reconheceu como doença neste século (MS, 2010). Antes de 1970, apenas
novepaísestinham registradoepidemias de dengue. A doença é endêmica em mais de
100 países na África, nas Américas, no Mediterrâneo Oriental, Sudeste Asiático e
Pacífico Ocidental. Casos nas Américas, Sudeste Asiático e Pacífico Ocidental
ultrapassaram 1,2 milhões de casos em 2008 e mais de 2,3 milhões em 2010 (com
base em dados oficiais apresentados pelos Estados-Membros). Recentemente, o
número de casos tem continuado a aumentar.Em 2010, 1,6 milhões de casos de
dengue foram notificados somente nas Américas, dos quais 49000 casos foram de
25
dengue grave (WHOb,2013).
A ameaça de um possível surto de dengue já existe na Europa, a transmissão
local da dengue foi relatada pela primeira vez na França e Croácia em 2010. Em
2013, os casos ocorreram na Flórida (Estados Unidos da América) e na província de
Yunnan da China. A dengue também continua a afetar vários países da América
central como Honduras, Costa Rica e México (WHOb, 2013).
Estima-se que 500.000 pessoas com dengue hemorrágica necessitam de
hospitalização a cada ano,uma grande parte dos quais são crianças. Cerca de 2,5%
das pessoas afetadas morrem (WHOb, 2013).
Segundo os dados, até15ª semana de 2013, foram notificados 742.475 casos
no Brasil. Deste total, 1.825 foram notificados como casos graves e 185 óbitos.
Comparando esses resultados com igual período de 2012, o que se nota é uma
aumento de 205% nos casos notificados (243.785casos em 2012), uma redução de
4% nos casos graves (1905 casos em 2012) e aumento de 5% nos óbitos (SVS,
2013).
As regiões sudeste e centro-oeste lideram em número de notificações, com
388.246 e 208.671casos, respectivamente, o que equivale a 80,4% dos casos
notificados no país, devido a densidade populacional. Nas demais regiões foram
notificadas os seguintes números: Norte (39.594), Nordeste (48.872) e Sul (57.092)
(SVS, 2013).
O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) é o principal vetor da dengue,
entretanto, outro mosquito que tem mostrado potencialidade de transmitir o vírus da
dengue é o Aedes albopictus (DE LIMA,et al., 2006). No Brasil, foi detectado em
1986, e identificado em mais de mil municípios. Esse vetor não é doméstico como Ae.
aegypti, prefere os ocos de árvores para depositar seus ovos e tem hábitos zoofílicos
diurnos e fora dos domicílios (TEXEIRA, 1999; TAUIL, 2001, 2002;DE LIMA,et al.,
2006; BRAGA & VALLE, 2007; BARRETO & TEIXEIRA; 2008).
O vírus da dengue é transmitido aos seres humanos através da picada da
fêmea de mosquitos infectados. Após a incubaçãodo vírus por 4-10 dias, um mosquito
infectado é capaz de transmitir o vírus para o resto da vida.
Humanos infectados são os principais transportadores e multiplicadores do vírus. Os
pacientes que já estão infectados com o vírus da dengue podem transmitir a infecção,
26
após os primeiros sintomas aparecerem (por 4-5 dias; máximo de 12), através do
principal vetor, a fêmea do mosquito Aedes (WHOb, 2013).
O mosquito Aedes aegypti vive em habitats urbanos, principalmente em
recipientes artificiais. Ao contrário de outros mosquitos o Ae. aegypti tem o hábito de
alimentar-se pelo dia, seus períodos de pico de picadas são: início da manhã e antes
do anoitecer. A fêmea do Ae. aegypti pica várias pessoas durante cada período de
alimentação (WHOb, 2013).
2.2 CICLO BIOLÓGICO DO VETOR
O Ae. aegypti (Linnaeus,1762) pertencem ao Filo Arthropoda (pés
articulados), Classe Hexapoda (três pares de patas), Ordem Diptera (um par de asas
anterior funcional e um par posterior transformado em halteres) e da Família Culicidae
(NATAL, 2002). São insetos holometábolos; portanto, apresentam metamorfose
completa,o seu ciclo de vida compreende quatro estágios: ovo, larva, pupa e adulto
(REGAZZI, 2003)
Do ovo à forma adulta, o ciclo de vida do Ae. aegypti varia de acordo com a
temperatura, disponibilidade de alimentos e quantidade de larvas existentes no
mesmo criadouro, uma vez que a competição de larvas por alimento (em um mesmo
criadouro com pouca água) consiste um obstáculo ao amadurecimento do inseto para
a fase adulta. Em condições ambientais favoráveis, após a eclosão do ovo, o
desenvolvimento do mosquito até a forma adulta pode levar um período de 10 dias
(IOC/FIOCRUZ).
2.2.1 O ovo
Os ovos de Ae. aegypti são elípticos, alongados e não ultrapassam 1 mm de
comprimento (Figura 1). Logo após a postura, a membrana externa dos ovos é flexível
e de cor clara. Em seguida, torna-se rígida e negra ao entrar em contato com o
oxigênio, conferindo proteção mecânica e contra a perda excessiva de água pelo
embrião nele contido. A membrana permite ainda que aconteçam trocas gasosas com
o meio externo (FORATTINI, 2002). Esse revestimento é formado na sua maioria por
proteínas e alguma parte por quitina (Li & Li 2006; MOREIRAet al., 2007).
27
Figura 1. Ovos do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)
Fonte:http://www.ioc.fiocruz.br/dengue
Os ovos adquirem resistência ao ressecamento muito rapidamente, em apenas
15h após a postura. A partir de então, podem resistir a longos períodos de
dessecação – até 450 dias, em locais secos (FUNASA, 2001). Esta resistência é uma
grande vantagem para o mosquito, pois permite que os ovos sobrevivam por muitos
meses em ambientes secos, até que o próximo período chuvoso e quente propicie
assim sua eclosão (SILVA et al.,1999).
Uma fêmea pode dar origem a 1.500 mosquitos durante a sua vida. Os ovos
são distribuídos por diversos criadouros – estratégia que garante a dispersão e
preservação da espécie. Se a fêmea estiver infectada pelo vírus da dengue quando
realizar a postura de ovos, há a possibilidade das larvas filhas já nascerem com o
vírus, no processo chamado de transmissão vertical (IOC/FIOCRUZ).
2.2.2 A larva
A fase larvária do Ae. aegypti é o período de alimentação e crescimento. A
maioria das larvas alimenta-se principalmente de material orgânico acumulado nas
paredes e fundo dos depósitos (FUNASA, 2001).
As formas larvais dessa espécie são eucéfalas e ápodas. A cabeça é globosa,
pequena, parcialmente unida ao tórax, bastante esclerotizada e pouco pigmentada.
Na cabeça está inserido um par de antenas e o aparelho bucal do tipo mastigador-
raspador. O tórax das larvas é globoso e mais largo que a cabeça. Os três segmentos
torácicos são fundidos e revestidos por cerdas. As larvas apresentam dez segmentos
abdominais. No oitavo segmento localiza-se o sifão respiratório e no décimo,
conhecido por lobo anal, é onde termina o tubo digestivo das larvas (Figura 2)
(FORATTINI, 2002). As larvas movimentam-se em forma de serpente, fazendo um “S”
em seu deslocamento. A larva é sensível a movimentos bruscos na água e, sob feixe
28
de luz,deslocam-se com rapidez, buscando refugio no fundo do recipiente (fotofobia),
onde estão depositadas (FUNASA, 2001).
Figura 2. Larva no quarto estadio de Aedes aegypti.
Fonte: http://medent.usyd.edu.au/photos/aedes_aegypti_larvae.jpg
O período larvário compreende quatro estádios ou instares (L1 - 4). O quarto
instar (L4) culmina no próximo estádio de vida, a pupa. O desenvolvimento e a
duração da fase larvária sofrem interferências de vários fatores ambientais, tais como:
temperatura, luz, salinidade, movimento da água, poluentes orgânicos e inorgânicos,
entre outros (CONSOLI e OLIVEIRA, 1994).
2.2.2. A pupa
Este é o estágio de vida que representa a transição do indivíduo do meio
aquático para o terrestre, ou seja, é o último estágio da fase aquática, e geralmente
dura de 2 a 3 dias (FUNASA, 2001). As pupas (Figura 3) apresentam o formato de
vírgula, sendo formadas por cefalotórax (cabeça + tórax) e abdômen. A forma pupal é
destituída de mandíbulas funcionais, ou seja, não se alimentam nesse estágio,
tornando-se quiescentes. No cefalotórax estão inseridas duas trompas respiratórias,
que ficam constantemente acima da superfície líquida possibilitando trocas gasosas,
normalmente permanecem na superfície da água, flutuando, o que facilita a
emergência do inseto adulto. No último segmento abdominal situa-se um par de
paletas natatórias, que auxiliam na movimentação das pupas (FORATTINI, 2002).
29
Figura 3. Pupa do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)
Fonte:http://www.eliminatedengue.com/our-research/aedes-aegypti
2.2.3 O Adulto
Os mosquitos adultos (Figura 4) dessa espécie medem cerca de 3-6 mm de
comprimento, entretanto, os indivíduos do sexo masculino são, de maneira geral,
menores do que as fêmeas. O mosquito possui o corpo delgado, pernas longas,
cabeça globosa, tórax comprimido lateralmente e abdômen cilíndrico. O tórax, as
pernas, as asas e o abdômen são revestidos por escamas com tonalidade castanho-
escura e há presença de anéis prateados na porção basal de cada segmento das
pernas. O macho se distingue essencialmente da fêmea por possuir antenas
plumosas e palpos mais longos (FUNASA, 2001).
Figura 4. Mosquito adulto Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)
Fonte: portaldoprofessor.mec.gov.br
Os mosquitos adultos são de fase terrestre e são insetos voadores,
apresentam sexos separados e possuem caráter antropofílico. Após a emergência, os
mosquitos procuram abrigos para repouso, principalmente em domicílios humanos ou
no peridomicílio e têm preferência por locais pouco iluminados, com umidade elevada
e sem movimentação de ar. Nos abrigos ocorre o endurecimento da cutícula corporal
30
e o amadurecimento da genitália externa do macho, que dura até 24 horas. Após esse
período, os machos estarão aptos para a cópula, que ocorre durante o vôo
(FORATTINI, 2002).
Machos e fêmeas adultos se alimentam de água e substâncias energéticas,
geralmente hidratos de carbono. Procuram por substâncias açucaradas presentes no
néctar de flores, orvalho e gotículas presentes na superfície de frutas e excretadas
por afídeos (FORATTINI, 2002). Essas substâncias são requeridas em quantidades
suficientes para a realização de suas funções biológicas como vôo e dispersão, com
exceção à maturação dos ovos. As fêmeas possuem o hábito da hematofagia e são
necessários um ou mais repastos sanguíneos para conclusão do ciclo gonotrófico. Os
nutrientes provenientes do sangue ingerido são convertidos em substâncias proteícas
que serão transportados aos ovários e formarão o vitelo que será incorporado aos
oócitos (CLEMENTS, 2000). As fêmeas restrigem seus hábitos hematófagos aos
horários diurnos e seus picos de maior atividade são ao amanhecer (7:00-10:00 h) e
pouco antes do crepúsculo vespertino (16:00-19:00 h) (MS, 2009).
2.3 CONTROLE DO VETOR
Na ausência de uma vacina preventiva eficaz e de tratamento específico para a
dengue e febre hemorrágica da dengue, o controle do vetor é a principal estratégia
para controlar ou prevenir a transmissão do vírus da dengue (VIMALADEVI et al.,
2012).
As únicas garantias para que não haja transmissão da dengue são: a ausência
de circulação viral e a manutenção de níveis baixos de infestação do mosquito Ae.
aegypti. O controle do mosquito deve ser baseado em várias ações, como: o manejo
ambiental, promovendo mudanças no meio ambiente para a destruição de criadouros
potenciais do vetor; melhorias em saneamento básico e coleta de resíduos sólidos;
conscientização comunitária quanto à infestação domiciliar pelo mosquito e controle
químico das várias formas do vetor.
O Ministério da Saúde, através da Fundação Nacional de Saúde (FUNASA)
implantou diversos programas visando controlar a transmissão da doença. Essas
ações foram dirigidas à população e aos órgãos setoriais de saúde e saneamento,
buscando a eliminação dos focos de criação do mosquito Ae. aegypti no domicílio e
peridomicílio (OPAS, 1995). Em todos os programas houve uma associação entre
31
campanhas para a eliminação de criadouros e o emprego de inseticidas químicos e
biológicos.
O controle químico iniciou com o uso de um organoclorado sintético, o dicloro-
difenil-tricloroetano (DDT), inseticida de efeito prolongado ou residual que, quando
aplicado em paredes e tetos de casas, permanece ativo contra os insetos por vários
meses (ROZENDAAL, 1997). Outros inseticidas utilizados nos programas de controle
de doenças transmitidas por mosquitos pertencem aos grupos dos organofosforados,
carbamatos e piretróides. Todos atuam sobre o sistema nervoso central de insetos.O
organofosforado, temefós (Figura 5) é o larvicida sintético recomendado pela OMS
para tratamento focal em depósitos domiciliares de água potável (BRAGA E VALLE,
2007), sendo utilizado no controle de Ae. aegypti, porém em algumas regiões o uso
do temefós vem sendo substituído por outras classes de inseticidas, devido ao
desenvolvimento de espécies resistentes do vetor.
Figura 5. Estrutura química do temefós
Os organofosforados atuam inibindo a Acetilcolinesterase (AChE), importante
enzima do sistema nervosocentral. Essa enzima é fosforilada pelo inseticida, ficando
irreversivelmente inativada. A inibição de AChE resulta no acúmulo de acetilcolina nas
junções nervosas (ou sinapses), o que impede a interrupção da propagação do
impulso elétrico. Conseqüentemente, o sistema nervoso central continuará sendo
estimula- do, desencadeando o processo de paralisia que pode culminar com a morte
do inseto (BRAGA E VALLE, 2007).
Insetos resistentes a organofosforados apresentaram mutações na AChE, na
qual ocorre uma mudança de conformação no sítio ativo, impedindo que ocorra a
ligação dos organofosforados ao sítio ativo da enzima de forma efetiva, não ocorrendo
inativação da AChE, resultando numa diminuição da sensibilidade à inibição da
32
enzima por estes inseticidas (ANTHONY et al., 1995; HEMINGWAY & RANSON,
2000).
Muitos locais registraram a emergência de populações de Ae. aegypti
resistentes aos inseticidas químicos comumente utilizados. Devido a este fator, são
necessárias aplicações de doses crescentes de inseticidas para o controle efetivo
deste mosquito, o que pode aumentar o risco de intoxicação do homem, animais e
ambiente (MACORIS et al., 2003; HEMINGWAY& RANSON, 2000). Apesar desses
indícios, as medidas efetivamente empregadas para o controle de mosquitos ainda
são o uso de inseticidas sintéticos, o temefós para atividade larvicida e o malation e
piretróides para atividade adulticida, além de campanhas públicas para eliminação de
possíveis criadouros. Entretanto, nos últimos anos, estimuladas por esses fatores, são
realizadas pesquisas para o desenvolvimento de medidas integradas de controle de
dengue.
Uma alternativa para o controle de mosquitos são os reguladores de
crescimento (ou IGR, sigla derivada de “Insect Growth Regulator”), substâncias
químicas que atuam como análogos do hormônio juvenil, como Piriproxifen e
Metopreno (Figura 6), ou como inibidores da síntese da quitina durante o
desenvolvimento dos estágios imaturos e, consequentemente, interrompe o ciclo
larval e reduz a emergência de adultos, como Diflubenzuron (DFB) (Figura 7)
(MARTINS E SILVA, 2004) (BORGES, et al., 2012) e Novaluron, muito utilizados em
programas de controle de mosquitos. Esses reguladores impedem a ecdise e
ocasionam a morte de larvas (BORGESet al., 2004). Devido à atuação específica,
apresentam riscos reduzidos de toxicidade para vertebrados (BRAGAet al., 2005).
Figura 6:Estrutura química do Metopreno
33
Figura 7. Estrutura química do Diflubenzuron
O uso dos IGRs está sendo utilizado, desde a década de 90, contra uma vasta
classe de artrópodes. Os IGRS mais utilizados no controle de mosquitos pertecem ao
grupo das benzoil-fenil-uréias (BPU, inibidores de síntese de quintina) ou são
compostos quimicamente relacionados ao hormônio juvenil natural de insetos,
designados como análogos de hormônio juvenil (AHJ) (BRAGA & VALLE, 2007b).
Em 2005, foi lançado no Brasil, pela Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, a empresa Bthek Biotecnologia e o Instituto de Pesquisas Tecnológicas
(IPT), o larvicida Bt-Horus® para controle de larvas de Ae. aegypti (ANDRADEet al.,
2007). Bactérias, como o B. thuringiensis var. israelensis e o Bacillus sphaericus,
produzem endotoxinas proteicas, as quais, quando ingeridas pelas larvas, atacam e
destroem seu intestino médio, levando-as à morte. Entretanto, já foram registrados
casos de resistência de mosquitos às toxinas bacterianas (TABASHNIK, 1994).
Com relação ao controle de focos de formas larvárias de Ae. aegypti, a
Organização Mundial de Saúde e o Ministério da Saúde recomendam os seguintes
produtos: Temefós, como larvicida de primeira escolha; Bacillus thuringiensis var.
israelensis, como agente de controle biológico e Diflubenzuron, Novaluron e
Piriproxifen, como inibidores do crescimento. Para controle do mosquito adulto é
utilizada a aplicação espacial a Ultra Baixo Volume (UBV) de Malation. Devido à alta
dispersão dos aerossóis e ao risco de contato com organismos não alvo, esse tipo de
controle é somente utilizado para bloqueio da transmissão de vírus da dengue e para
controle de surtos e epidemias. A nebulização destes inseticidas químicos elimina, por
ação de contato, todos os mosquitos que estiverem voando pelo local. Portanto, para
aumentar a eficácia, é recomendado que o horário da aplicação do inseticida coincida
com o de maior atividade vetorial dos adultos. Os ovos são resistentes, de difícil
controle e não existem produtos químicos disponíveis no mercado com ação ovicida
para serem utilizados em campanhas de saúde pública (MS, 2009; OMS, 2009).
34
A descoberta de novos métodos para o controle do mosquito Ae. aegypti é de
suma importância. A resistência resulta no aumento da freqüência de aplicação de
inseticida, dosagens crescentes, rendimentos diminuídos, danos ambientais e
surgimento de doenças, quando os vetores não podem ser controlados. A exposição
continuada dos insetos a estes produtos constitui uma forte pressão de seleção, de
forma que, a espécie mais apta a reisitir podem produzir descendência capaz de
dominar a população não resistente (DONALÍSIO et al., 2002; CARVALHO et al.,
2004).
Genes de resistência aparecem depois de períodos prolongados de seleção.
O grau de domínio do gene de resistência influência no crescimento da população sob
pressão seletiva. Quanto maior for o coeficiente de variação desses genes, mais
heterogênea é essa população e mais resistente. Em contraste, a cepa Rockffeler,que
é uma população homogênea e sensível (CARVALHO et al., 2004).
Uma alternativa para os convencionais controles químicos é a utilização de
produtos naturais de plantas que sejam efetivas no controle ao mosquito adulto e/ou à
larva de Ae. aegypti, isentas de toxicidade para o meio ambiente, facilmente
biogradáveis e de baixo custo. Assim como a pesquisa de novos agentes larvicidas
com mecanismos de ação distintos aos disponíveis no mercado, na atualidade.
(CARVALHO, 2003; SIMAS et al., 2004; ALBUQUERQUE et al., 2004;
DHARMAGADDA et al., 2005; SILVA et al., 2008).
2.4 ÓLEO ESSENCIAL: CONSIDERAÇÕES GERAIS E ATIVIDADE LARVICIDA
As plantas podem ser uma fonte alternativa de agentes larvicidas e vários
estudos fitoquímicos têm sido relatados para demonstrar esta atividade (FEITOSA et
al., 2009; LOMONACO et al., 2009; SREELATHA et al., 2010; SEO et al., 2012.;
PANNEERSELVAM et al., 2012).
As plantas respondem a estímulos ambientais bastante variáveis, de natureza
física, química ou biológica. Fatores ambientais como tipo do solo, umidade, radiação
solar, vento, temperatura e poluição atmosférica, dentre outros, podem influenciar e
alterar a composição química dos vegetais. Além desses, há interações e adaptações
co-evolutivas complexas produzidas entre as plantas e o ecossistema. (MACIEL et al.,
2002). Nesta adaptação ao meio ambiente, são produzidas substâncias importantes
para sua manutenção e proteção. O metabolismo primário das plantas é o
35
responsável pela produção de celulose, lignina, proteínas, lipídios, açúcares e outras
substâncias responsáveis por suas principais funções vitais. Do metabolismo
secundário resultam substâncias de baixo peso molecular, comparadas as
substâncias derivadas do metabolismo primário, às vezes produzidas em pequenas
quantidades, como alcaloides, terpenóides e derivados de fenilpropanóides. Tais
estruturas funcionariam como agentes defensivos na luta contra predadores, a
exemplo de micro-organismos patogênicos. Os fenilpropanóides e, especialmente, os
terpenóides são os principais constituintes que estão envolvidos nas interações
planta-inseto (ALVES, 2001).
Óleos essenciais são uma mistura complexa de compostos voláteis com baixa
massa molecular, que possuem várias atividades biológicase são amplamente
utilizados nas indústrias farmacológicas e cosméticos (BAKKALI etal., 2008). São
constituídos de misturas complexas, contendo aproximadamente de 20-60 compostos
diferentes, onde um ou mais se destacam por estarem em maior concentração
(composto majoritário), estes geralmente definem as características dos óleos, como
odor e propriedades biológicas (BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais são extraídos de plantas frescas ou secas mediante
hidrodestilação por arraste de vapor, extração pura e simples, CO2 supercrítico, ou
com a utilização de solventes orgânicos ou gorduras. A composição química do óleo
essencial varia de acordo com a espécie em estudo. O rendimento do óleo essencial,
como também a composição química, depende de fatores como: localização
geográfica, condições ambientais, partes das plantas, fase de desenvolvimento da
planta, material genético, solvente usado para a extração, os métodos usados para
isolar os óleos essenciais, entre outros fatores (ALBUQUERQUE et al., 2004;
DHARMAGADDA et al., 2005; BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais produzidos pelos vegetais são formados por vários
caminhos biossintéticos que produzem moléculas dotadas de grande diversidade de
esqueletos e grupamentos funcionais, como, ácidos graxos e seus ésteres,
hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos e cetonas, compostos acetilênicos, alcalóides,
compostos fenólicos e cumarinas.
Os fenilpropanóides são compostos por uma cadeia lateral de três átomos de
carbono derivados de ácidos aminados aromáticos, provenientes da via do ácido
chiquímico. Na Figura 8 estão exemplificados alguns fenilpropanóides. O safrol,
36
componente majoritário do óleo volátil de Sassafrás (Sassafras albidum) e o eugenol
componente majoritário do cravo (Syzygium aromaticum) são exemplos de
alilbenzenos; os propenilbenzenos estão representados pelo isosafrol presente em
Jasminum officinalee anetol principal componente do óleo volátil do anis-estrelado
(Illicium verum); o cinamaldeído, um aldeído aromático, está presente no óleo da
casca da canela (Cinnamomum zeylanicum); e a cumarina (Dipteryx odorata)
(DEWICK, 2009).
Figura 8: Exemplos de fenilpropanóides
Os terpenos representam uma grande classe de produtos naturais com cerca
de 25.000 estruturas identificadas em plantas superiores (BOWSHER et al., 2008,
WINK, 2010). A classificação dos terpenos se baseia no número deunidades
isoprênicas: monoterpenos (C10, 2 unidades), sesquiterpenos (C15, 3 unidades),
diterpenos (C20, 4 unidades), sesterpenos (C25, 5 unidades), triterpenos (C30, 6
unidades) e tetraterpenos (C40, 8 unidades) sendo os monoterpenos e
sesquiterpenos os terpenos mais frequentes em óleos voláteis (MAHMOUD E
CROTEAU, 2002).
Os monoterpenos (Figura 9) podem ser classificados de acordo com a
ciclização: acíclicos (mirceno, linalol, geraniol), monocíclicos (alfa-terpineol,
terpinoleno), e bicíclicos (alfa-pineno, tujona, cânfora, fenchona), ou através do grupo
funcional: hidrocarbonetos insaturados (limoneno), álcoois (mentol), aldeídos (citral),
cetonas (carvona), lactonas (nepetalactona) e tropolonas (gama-tujaplicina).
37
Figura 9: Exemplos de monoterpenos (Simões & Spitzer 2003, adaptado)
As plantas, como organismos que co-evoluem com insetos e outros
microorganismos e que, portanto, desenvolvem mecanismos de defesa contra
predadores, são fontes naturais de substâncias inseticidas e antimicrobianas. Estas
também sintetizam inúmeros compostos voláteis para atrair polinizadores e se
defenderem de herbívoros (SIMAS et al., 2004). Desta forma, substâncias extraídas
da casca do caule, das folhas e dos frutos de diversas plantas têm demonstrado
propriedades larvicidas no controle de diversos culicídeos (ARRUDA et al., 2003;
GUSMÃO et al., 2002; SILVA et al., 2003; SILVA et al., 2004; SIMAS et al., 2004).
Os óleos essenciais podem atuar sobre os insetos, causando redução do
número de ovos, repelência, assim como inibição da oviposição, do desenvolvimento
e da alimentação (KNAAK; FIUZA, 2010). As toxinas botânicas podem penetrar nos
insetos pelas vias respiratórias, por ingestão e contato (KNAAK; FIUZA, 2010), neste
último caso sendo absorvidos pela quitina e exoesqueleto (CORREA; SALGADO,
2011). Os inseticidas botânicos podem ainda atuar sobre o sistema nervoso central do
inseto, apresentando ação tóxica e conseqüentemente a morte. Vários terpenos como
α-pineno, β-pineno, 3-careno, limoneno, mirceno, α-terpineno e canfeno já mostraram
toxicidade sobre vários insetos (NERIO; OLIVERO-VERBEL; STASHENKO, 2010).
α-pineno
38
Os monoterpenos cineol, eugenol, limoneno, citronelol, citronelal e timol são exemplos
de compostos isolados dos óleos essenciais de plantas que apresentam reconhecida
atividade repelente aos mosquitos (VIEGAS JR., 2003)
A extração de compostos isolados a partir de óleos essenciais não é viável
pela alta complexidade que a mistura dos óleos essenciais apresenta, os quais
podem conter de 20 a 60 compostos diferentes (BAKKALI et al., 2008) além do baixo
rendimento, logo neste trabalho, devido a quantidade de substâncias estudadas,
assim como o tempo para execução deste trabalho, optou-se pela compra dos
compostos presentes em algumas espécies vegetais na forma isolada e pura.
SIMAS et al., (2004), comparou a atividade do sesquiterpeno E-nerolidol, com
alguns terpenos e fenilpropanóides obtidos comercialmente. Foram relatados as
atividades de 3 fenilpropanóides e 9 terpenos, dentre os quais, o sesquiterpeno
farnesol, uma forma isomérica do nerolidol, mostrou atividade larvicida com CL50 de
13 ppm. Entretanto, o monoterpeno geraniol, precursor biossintético do farnesol,
mostrou- se menos ativo (CL50 = 81,6 ppm). Estes resultados sugerem que a maior
lipofilicidade dos sesquiterpenos testados, quando comparados aos monoterpenos, é
uma propriedade importante para a atividade em larvas do terceiro estádio de Aedes
aegypti. Os fenilpropanóides safrol, eugenol e aldeído cinâmico foram ativos com CL50
de 49,0; 44,5 e 24,4 ppm, respectivamente.
SAMARASEKERA et al., (2008), sintetizou derivados de L-mentol e alguns
monoterpenos análogos estruturalmente e realizou um estudo relação estrutura-
atividade (REA) contra três espécies de mosquito e modificações da hidroxila do L-
mentol mostrou aumentar a atividade larvicida. Os derivados de L-mentol forneceram
características estruturais que contribuíram para a atividade inseticida como: a
quantidade de haletos na estrutura, a presença e o tamanho do grupo éster, assim
como o grau de insaturações presentes influenciam na atividade larvicida.
BHARDWAJA et al., (2010) avaliou a atividade de 18 fenilpropanóides (figura
10), incluindo fenilpropenoato , fenilpropenal , fenilpropeno e os seus análogos semi-
sintéticos contra a lagarta do tabaco, Spodoptera litura (Fab.) , a fim de identificar as
estruturas mais promissoras quanto a atividade larvicida. Entre os vários
fenilpropanóides, o isosafroldemostrou a melhor atividade, com um valor de CL50 de
0,6 mg / cm2 folha, seguido por seu derivado hidrogenado denominado diidrosafrol (
CL50 2,7 mg / folha cm2) . A atividade larvicida de vários derivados do fenilpropeno foi
39
observada na seguinte ordem: isosafrol> diidrosafrol> safrol > anetol > metil-eugenol
>eugenol >β- asarona > diidroasarona > diidroanetol. O Diidrosafrol pode ser
considerado um composto promissor, pois embora apresente uma atividade larvicida
inferior ao Isosafrol possui maior estabilidade e resistência frente à degradação
oxidativa (devido à remoção da ligação dupla extremamente reativa com relação ao
Isosafrol).
Figura10: Estrutura dos 18 fenilpropanóides avaliados
2.5 Introdução ao REA
Uma abordagem para a previsão da toxicidade aguda (Lipnick et al., 1985;
Veith et al., 1984), bem como a genotoxicidade (Klopman et al.,1985) de substâncias
químicas é baseado na avaliação das suas configurações moleculares e propriedades
físico-químicas. Relação Estrutura - Atividade (REA) são as correlações entre alguma
atividade biológica mensurável(por exemplo, CL50) e sua estrutura. Estas relações
40
podem então permitir a previsão da atividade biológica de uma molécula semelhante,
mas não ainda avaliada (Veith et al., 1984).
Modelos matemáticos que relacionem a estrutura química e a atividade
biológica, de uma série de compostos análogos, tem sido o objetivo de muitas
pesquisas que envolvem planejamento racional de novos fármacos. Em geral, esses
compostos diferem entre si pela presença de um ou mais grupos substituintes em
posições definidas da estrutura química comum da série. Esses modelos
proporcionam o planejamento racional de novos fármacos mais ativos, mais potentes,
menos tóxicos e biologicamente mais específicos (BARREIRO E FRAGA,2001).
As relações estrutura atividade de produtos naturais com atividade larvicida
têm sido relatadas. Os ácidos anacárdicos isoladas da Anacardium occidentale
exibiram potência larvicida contra larvas de Ae. aegypti semelhante a vários
monoterpenos encontrados em óleos (Laurens et al., 1997, Lomonaco et al., 2009). A
hidrogenação de ligações duplas em tais frações de compostos resultou numa
diminuição das atividades larvicidas, demonstrando a importância das ligações duplas
nas cadeias laterais de tais compostos. Resultados semelhantes foram encontrados
por Belzile et al., 2000, que avaliou a atividade sinérgica de derivados dilapiol contra
Aedes atropalpus Coq. Quando a cadeia lateralalil do dilapiol foi modificada, a
atividade sinérgica foi reduzida ou eliminada em comparação com dillapiol.
Modelos REA são dependentes da disponibilidade de dados biológicos
adequados, que é geralmente derivada de estudos in vivo em animais de laboratório
ou in vitro. Por exemplo, PANDEY et al., 2012 relataram a derivatização de
monoterpenos (eugenol, geraniol, linalol, L-mentol e terpeniol figura 11), seguido de
estudos da relação estrutura-atividade dos cinco derivados acetilados, onde
observou-se aatividade larvicida contra larvas do quarto estádio de Aedes aegypti.
Segundo os autores, foi observado que houve um aumento na atividade nos
compostos aromáticos acetilados em comparação com compostos que continham o
grupo hidroxila não substituído. Com base nos valores de CL50(ppm), a atividade foi
colocada na seguinte ordem: acetato de eugenila (50,2) > acetato de linalila (119,7) >
acetato de terpinila (287,1) > acetato de mentila (308,4) > acetato de geranila (325,5),
quando comparados com monoterpenóides: eugenol (82,8) > linalol (242,6) >
terpineol (331,7) > L-mentol (365,8) > geraniol (415,0). No acetato de eugenila, a
presença de um anel aromático e uma cadeia lateral com uma ligação dupla alílica o
41
tornou mais ativo frente às larvas do Aedes aegypti. Os grupos funcionais bioativos
identificados no estudo podem contribuir para a compreensão da atividade larvicida
de derivados acetil e pode ajudar no desenvolvimento de larvicidas bioativos.
Figura 11 . Estruturas de monoterpenóides e seus derivados acetilados
KIM et al., (2008) avaliaram a atividade larvicida contra Aedes aegypti de 14
compostos isolados do caule da Kaempferia galangasendo os seus resultados
comparados com os controles fention e temefós. Com base nos valores de CL50 após
24h de exposição, etil-p-metoxicinamato (18,9mg L-1) foi o composto mais eficaz,
entretanto foi menos tóxico do que os controles fention (0,019mg L-1) ou temefós
(0,0079mg L-1). A atividade de 3-careno, (E)-cinamaldeido, cinamato de etila e ácido
p- metoxicinamico, foram consideradas de moderadas a fracas, variando de (39,5–
61,0mg L−1) seguido das atividades do (+) e (–)-borneol, (–)- canfeno, 1,8 - cineol, (+)
e (–)-terpineol >100 mg.L-1. A introdução de um grupo metoxi em etil cinamato (39,5
mg L−1) forma o etil p-metoxicinamato (18,9 mg L−1) que aumenta significativamente a
atividade larvicida.
42
2.6 Via das quinureninas – aspectos gerais
Mecanismos que levem ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio no organismo dos insetos constituem em uma poderosa arma no
controleao Ae. aegypti. Uma das vias metabólicas mais importantes na desintoxicação
de espécies reativas de oxigênio é a chamada “via das quinureninas”, a maior via de
metabolização do triptofano nos organismos vivos.
O metabolismo energético da grande maioria dos mosquitos, machos e
fêmeas, depende da ingestão de carboidratos, usualmente e provenientes de seivas,
flores e frutos. O acúmulo de glicogênio e triglicérides, que é determinante para o
potencial de atividade e longevidade, depende diretamente desses carboidratos
(NAYAR e SAUERMAN,1973). O repasto sanguíneo das fêmeas está relacionado
primordialmente ao desenvolvimento de ovos. Somente as fêmeas dos mosquitos são
hematófagas. Muitos trabalhos confirmam a necessidade de proteínas para a
produção de ovos nos mosquitos (CLEMENTS, 1963). Estudos indicam a
necessidade de pelo menos dez aminoácidos essenciais na dieta paraque ocorra a
produção normal de ovos: arginina, isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, treonina,
triptofano, valina, histidina e metionina.
O triptofano é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo,
portanto um dos componentes das proteínas dos seres vivos. É um aminoácido
aromático essencial para a nutrição humana. Estudos indicam também que o
triptofano é a substância responsável pela promoção da sensação do bem-estar, os
mosquitos absorvem esse aminoácido através do sangue humano (CONSOLIet al.,
1994).
Em seu aspecto geral, a via das quinureninas (Esquema 1) apresenta um
padrão ramificado peculiar, com dois ramos principais que podemos chamar de ramo
(ou linha) das quinureninas e ramo dos antranilatos, representados horizontalmente
no esquema. O ramo das quinureninas é formado pela N-formil-quinurenina, pela
quinurenina e pela 3- hidroxiquinurenina (3-HK)(HAN et al., 2007). Qualquer destas
quinureninas pode sofrer hidrólise, liberando uma molécula de alanina, e produzindo
seus correspondentes do ramo dos antranilatos: os ácidos n-formil-antranílico,
antranílico e 3-hidroxi-antranílico. O ramo das quinureninas e o ramo dos antranilatos
apresentam entre si uma relação de paralelismo e formam, juntos, o cerne da via das
quinureninas (MANTHEY et al.,1992).
43
Esquema 1: Aspecto geral da via das quinureninas
Tanto a quinurenina como a hidroxi-quinurenina podem ser desaminadas,
produzindo os representantes quinolínicos da via: o ácido quinurênico e o ácido
xanturênico. Acima do ramo dos antranilatos temos o que podemos chamar de ramo
da nicotinamida que parte do ácido 3-hidroxi-antranílico. Este é oxidado por uma
monooxigenase que abre seu anel aromático, formando um intermediário linear
instável. O intermediário se reciclisa espontaneamente, formando ácido quinolínico,
que por sua vez é descarboxilado para produzir ácido nicotínico, um importante
precursor na biossíntese dos carreadores de elétrons NAD e NADP (HILMAS et al.,
2001).
Uma das principais reações, na via das quinureninas em Aedes (Esquema 2), é
a conversão da substância 3-hidróxi-quinurenina (3-HK), substância nociva e que
pode ocasionar a morte cerebral do inseto, em ácido xanturênico (XA), substância
atóxica. Esta conversão é realizada pela enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase
(HKT). Nos mamíferos a quinurenina é o precursor imediato na via que conduz à
formação de ácido quinurênico, o qual serve como um antagonista de amplo espectro
em receptores ionotrópicos de aminoácidos excitatórios (receptores de NMDA) e
protege o sistema nervoso central (SNC) da estimulação excessiva por citotoxinas
(STONE, 2000). Portanto, não se tem investigado a via bioquímica que conduz a
“Linha” dos
Antranilatos
“Linha” das
Quinureninas
44
formação de ácido quinurênico e sim as consequências causadas pela sua deficiência
(MORONI, 1999; STONE 2001).
Esquema 2: Via do metabolismo do triptofano em mosquitos.
A quinurenina é oxidada sob condições fisiológicas, estimulando a produção
de espécies reativas de oxigênio, tóxicas para a maioria dos seres vivos (OKUDA et
al., 1998). No entanto, nos mamíferos a produção de 3-HK não parece causar
quaisquer problemas, uma vez que pode ser metabolizado na via dos antranilatos.
Estudos anteriores também demonstram que a concentração de 3-HK é bastante
diferente em insetos, em diferentes fases de desenvolvimento e para manter as
condições fisiológicas normais, nos mosquitos é essencial evitar o ácumulo de
espécies reativas (HAN et al., 2007)
Nos mamíferos, a quinurenina, formada durante a oxidação do triptofano, pode
ser hidrolisada para produzir o ácido antranílico, o que eventualmente pode ser
oxidado a dióxido de carbono e água, ou submete-se a complicados processos
bioquímicos para formar o ácido picolínico e o ácido quinolínico (SAITOet al., 1993).
Nos insetos o ácido antranílico não pode ser oxidado a dióxido de carbono e água,
por isso, a importância da quinurenina produzida durante a oxidação por um caminho
diferenciado. Desta forma, o organismo destes animais desenvolveu uma eficiente
TOD – Triptofano dioxigenase KFM – Quinurenina formilase KMO– Quinurenina monooxigenase KAT – Quinurenina aminotransferase HKT – 3-Hidroxi-quinurenina aminotransferase
45
estratégia para prevenir o acúmulo desta substância. A via metabólica é caracterizada
pela hidroxilação da quinurenina para produzir 3-HK com posterior transaminação da
3-HK para formar um componente estável, o ácido xanturênico.
Este fato pode ser comprovado através da alta concentração de XA
encontradas nas larvas, há um aumento linear ao longo da vida larval, decaíndo
bruscamente quando o inseto passa para a fase de pupa. A função do XA nas larvas
permanece um mistério (LI e LI, 1997; HAN et al., 2002).
A 3-hidroxi-quinurenina é um precursor dos omócromos, os pigmentos dos
insetos que conferem coloração a olhos e asas. Aedes aegypti mutantes deficientes
na quinurenina monooxigenase (KMO) apresentam olhos de coloração branca (HAN
et al.,2003). O ácido xanturênico foi identificado em extratos de cabeça, nas fezes e
em glândulas salivares de mosquito. Nas glândulas salivares sua concentração
diminui durante o repasto indicando que ele é secretado junto com a saliva e,
provavelmente ingerido com o sangue. Esta é a explicação corrente na literatura para
a presença desta molécula no intestino dos mosquitos (OKECH et al., 2006), pois até
hoje a concentração de XA na glândula salivar é considerada maior que na cabeça e
no intestino médio (OKECH et al., 2006)
A 3-HK oxida facilmente em condições fisiológicas e o acúmulo de altas
concentrações de 3-HK pode criar estresse oxidativo para os insetos. Em vários
estudos in vitro, a toxicidade da 3-HK às células neuronais pode ser explicada devido
a capacidade de auto oxidação da 3-KH o que leva à formação de H2O2 e por
consequência aos seus efeitos tóxicos (EASTMAN e GUILARTE, 1990; EASTMAN et
al, 1992). Isto pode de certa forma, explicar por que o nível de 3-HK precisa ser
estritamente regulada para que sua transaminação conduza à formação do ácido
xanturênico, um produto relativamente estável.Tais indícios levam a crer ser esta a
principal via a fim decontrolar os níveis de 3-HK em mosquitos durante o
desenvolvimento larval (LI e LI, 1997).
Nos mamíferos, a quinurenina aminotransferase (KAT) é responsável pela
transaminação da quiurenina em ácido quinurênico. Após estudos de caracterização
bioquímica percebeu-se que a KATno Aedes (KATAe.) compartilha de 45-50% de
identidade da seqüência com a KAT dos mamíferos ou humanos (FANG et al., 2002).
A Caracterização funcional da sua proteína recombinante, expressa em células de
baculovírus, em insetos, mostraram que a proteína é ativa para quinurenina. Em
46
contrapartida, este mesmo estudo mostrou que a KAT do mosquito possuia uma
atividade elevada para a quinurenina em mamíferos, mas não mostrava nenhuma
atividade para a 3-HK, com menos de 10% de semelhança, acarretando na mudança
de KAT para 3-hidroxiquinurenina transaminase (HKT).
A produção de ácido xanturênico (XA) resulta da transaminação de 3- HK,
através de uma transaminase particular que tem uma atividade específica muito mais
elevada para 3- HK que para a quinurenina nas larvas de mosquito. A concentração
de XA está intimamente relacionado com o nível de atividade desta transaminase. Os
resultados sugerem que esta transaminase especial, desempenha um papel
importante na regulação do nível de 3- HK no mosquito , Aedes aegypti , durante o
desenvolvimento das larvas (LI e LI, 1997)
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi sintetizar substâncias derivadas da
quinurenina que evitem a atuação da enzima HKT nesta reação de desintoxicação,
provocando, deste modo, um acúmulo da substância tóxica 3-HK no metabolismo do
inseto, o que acarretará na apoptose das células neuronais. Assim como, avaliar a
atividade larvicida de derivados sintéticos e estimar a atividade de compostos
derivados de óleos essenciais potencialmente larvicidas, bem como avaliar as
características moleculares que contribuem para o efeito larvicida destes, frente ao
Aedes aegypti.
47
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Realizar um estudo da atividade de compostos potencialmente larvicidas frente ao
Aedes aegypti.
3.2 ESPECÍFICOS
Avaliar a atividade larvicida (concentração letal média 50% das larvas - CL50)
de terpenos aromáticos, alifáticos bicíclicos, fenilpropanóide e derivados de
quinurenina sintetizados, frente às larvas do Aedes aegypti;
Sintetizar 2-amino-4-(2-fenilamina)-ácido-4-oxobutanóico;
Sintetizar 2-amino-4-(2-amino-5-clorofenil)-ácido-4-oxobutanóico;
Sintetizar 2-amino-4-(2-amino-3-clorofenil)-ácido-4-oxobutanóico;
Sintetizar 2-amino-4-(2-amino-5-fluorofenil)-ácido-4-oxobutanóico;
Caracterizar os produtos da síntese dos derivados da quinurenina por meio de
técnicas como: ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV),
Espectroscopia de massas (EM), Ressonância magnética nuclear de
Hidrogênio (1H) e Carbono (13C);
Realizar estudo de Relação Estrutura e Atividade (REA) para avaliar as
características estruturais e os grupos funcionais que contribuem para uma
potencial atividade larvicida dos compostos acima mencionados.
48
4. EXPERIMENTAL
A etapa química e biológica desta dissertação foi desenvolvida no Laboratório
de Química Farmacêutica (LQF) da Universidade Federal de Sergipe (UFS) e as
caracterizações químicas foram realizadas em parcerias com: Laboratório de
Ressonância Magnética Nuclear (Universidade Federal do Paraná-UFPr), Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Riberão Preto – USP e Departamento de Química da
Universidade Federal de Sergipe.
4.1 ESPECIFICAÇÕES DOS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
4.1.1 Aparelhos utilizados
Balança analítica (Marconi AW220)
Placa de aquecimento com agitação magnética (Fisatom modelo 753A)
Evaporador rotativo (logenscientific LSRE - 5299)
Banho ultra termostático (Quimis Q214M2)
Lâmpada de ultravioleta (VilberLourmat CN-6)
Ponto de fusão (Logenscientific PFM II)
Concentrador a vácuo (Labconco modelo 117)
Espectrometro de Ressonância Magnética Nuclear-RMN (Avance Bruker, DRX-
400)
Espectrometro de Infravermelho (Perkin Elmer FT-IR, System Spectrum BX)
Espectrômetro de massas (microtof II - ESI-TOF, bomba de infusão com fluxo
300µl/h.)
4.1.2 Substâncias, reagentes e outros materiais utilizados
Fenol99,0%(Sigma Aldrich)
Catecol 99,5%(Sigma Aldrich)
Resorcinol 99,0%(Sigma Aldrich)
Guaiacol98,9%(Sigma Aldrich)
p-cimeno 99,7%(Sigma Aldrich)
Timol99,0% (Synth)
Carvacrol 99,9%(Sigma Aldrich)
49
Eugenol99,0% (biodinâmica)
Aldeído salicílico 99,0%(Sigma Aldrich)
Vanilina 99,5%(Sigma Aldrich)
(+)-Canfeno97,2% (Sigma Aldrich)
(–)-Canfeno 84,6% (Sigma Aldrich)
(±)-Cânfora 99,0% (Proquímios)
Borneol75% (Sigma Aldrich)
Isoborneol99,0% (Sigma Aldrich)
1,8-cineol 99,7% (Sigma Aldrich)
1,4-cineol 98,5% (Sigma Aldrich)
5-norborneno-2-endo-3-endo-dimentanol 98,0 %(Sigma Aldrich)
5-norborneno-2-exo-3-exo-dimentanol 97,0% (Sigma Aldrich)
5-norborneno-2,2-dimetanol 98,0% (Sigma Aldrich)
5-norborneno-2-ol 98,7% (Sigma Aldrich)
Anilina (Vetec)
4-cloro-anilina (Alfa Aesar)
2-cloro-anilina (Alfa Aesar)
4-fluor-anilina (Sigma Aldrich)
Tricloreto de alumínio (AlCl3) (Flukaanalytical)
Tricloreto de boro (BCl3) (Sigma Aldrich)
Diclorometano DCM (CH2Cl2) (Fmaia)
Cloroacetonitrila (ClCH3CN) (Sigma Aldrich)
Ácido clorídrico (HCl) (Isofar)
Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) (Proquimios)
Hidreto de sódio 55% (NaH) (Fluka)
Dietilacetamidomalonato (C7O4H12) (Alfa Aesar)
Acetato de etilaAcOEt (C4H8O2) (Quimex)
Hexano (C6H14) (Fmaia)
Dimetilformamida DMF (C3H7ON) (Sigma Aldrich)
Sílica gel 60,ART 7734 (0,063 – 0,200 mm)(Fluka)
Cromatofolha de alumínio 20x20 cm gel de silício 60 PF254 ART 7749
(Merck)
50
Tween80(Vetec)
Dimetilsulfóxido (C2H6SO) (Synth)
Temefós 97,5% (Fersol)
Pipetas automáticas (EcopipetteTM)
Os reagentes e solventes empregados para a preparação dos compostos
foram de grau P.A. (Para Análise).
4.1.3 Métodos cromatográficos
A técnica de cromatografia em coluna (CC) foi realizada empregando 1/3 de
fase estacionária sílica gel 60 ART 7734, com dimensões de partículas entre 0,063 -
0,200 mm da Fluka, tendo como suporte colunas de vidro cilíndricas de dimensões
variadas a depender da quantidade de amostra a ser purificada. Foram ultilizados
como fase móvelos solventes diclorometano (DCM) e (Hexano/Acetato de etila), puros
ou em misturas binárias, com gradiente crescente de polaridade, conforme reações
detalhadas nos itens 4.3.1 e 4.3.2.
As Cromatografias em Camada Delgada Analítica (CCDA) foram realizadas
utilizando cromatofolhas de alumínio de gel de silício 60, PF254, ART 7749 da MERCK,
com indicador de fluorescência. A cromatofolha foi cortada nas dimensões 3x2 cm,
com auxílio de estilete e régua.
A revelação dos compostos na CCDA foi realizada pela exposição das placas à
lâmpada de irradiação Ultravioleta (UV) com comprimento de onda curto (254 nm) por
meio de lâmpada de ultravioleta VilberLourmat, modelo CN-6.
4.1.4 Métodos espectrométricos
Os derivados de síntese foram identificados por espectrofotometria de
Infravermelho (IV) e de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono
treze (RMN 1H e 13C, respectivamente) além Espectrometria de Massas (EM).
Os espectros de IV foram realizados no Departamento de Química da UFS e
obtidos em pastilhas de Brometo de potássio (KBr), sendo as absorções quantificadas
em unidades de cm-1.
Os espectros de RMN 1H e 13C foram realizados no Laboratório de
Ressonância Magnética Nuclear do Departamento de Química da UFPR, operando a
51
400 MHz (1H) e 100 MHz (13C). As amostras foram preparadas dissolvendo-se uma
pequena quantidade da mesma em clorofórmio deuterado CDCl3. Os deslocamentos
químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) em relação ao
tetrametilsilano (TMS), utilizado como padrão interno nos experimentos. Os
deslocamentos químicos foram referenciados para RMN 1H pelos picos característicos
dos Hidrogênios pertencentes às frações não deuteradas deste solvente: clorofórmio
(δH7,24 ppm). Para os espectros de RMN 13C foram utilizados os mesmos parâmetros
de solubilização da amostra: clorofórmio (δC77,0 ppm). As multiplicidades das bandas
de RMN 1H foram indicadas segundo as convenções: s (singleto), d (dubleto), dd
(duplo dubleto), ddd (triplo dubleto), t (tripleto), ps (pseudo tripleto) e m (multipleto). A
constante de acoplamento (J) foi expressa em Hertz (Hz) e o número de átomos de
Hidrogênios foi deduzido da integral relativa.
Os espectros de massas foram realizados na Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP. O método empregado para se obter os
espectros de Massas foi o de ionização por eletrospray (spray eletrostático, ESI/MS),
e o pico [M+H]+/ [M+Na]+/ [M+K]+ foram observados dentre os derivados de síntese
analisados.
Os pontos de fusão foram obtidos no Laboratório de Química Farmacêutica
(UFS). A faixa de fusão foi determinada através da visualização do início da fusão de
pequena alíquota do composto, onde se procura visualizar um fragmento sólido. A
fusão foi realizada dentro de capilares de vidro com auxílio de lente para amplificação
do campo visual, em aparelho de ponto de fusão.
4.2 Terpenos, fenilpropanóide e compostos relacionados
Os 21 compostos comercialmente disponíveis foram adquiridos através de
empresas fornecedoras, sendo utilizados sem purificação prévia.
52
Figura 12: Estrutura dos compostos aromáticos
Figura 13: Estrutura dos compostos alifáticosbicíclicos
53
4.3 Síntesedos derivados da quinurenina
As síntesesforam realizadas em três etapas, seguindo o esquema 3.
Esquema 3: Esquema das reações das anilinas substituídas
4.3.1 Síntese da2-amino-α-cloroacetofenonasubstituídaA(2a – 2d)
Flambou-se um balão de fundo redondo de 500 mL com agitador magnético,
vedando o mesmo com rolha de borracha natural injetando em seguida gás nitrogênio
com o auxílio de uma seringa. Em banho de gelo adicionou-se tricloreto de alumínio -
AlCl3 (8 g - 60 mmol) seguido do solvente diclorometano -DCM (30 mL anidro
destilado sobP2O5 ) e solução de tricloreto de boro BCl3 em DCM (1 M, 60 mL – 60
mmol). Em um balão de 25 mL foi adicionada anilina substituída 1a – 1d (6,37 g – 50
mmol) dissolvida com DCM (10 mL), em seguida a solução foi transferida gota a gota,
para um balão de 500 mL, seguido da adição de cloroacetonitrila - ClCH2CN (2,43 g
;7,89 mL – 32,2mmol). Terminada a adição, o balão foi retirado do banho de gelo e
deixado sob agitação por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a mistura
reacional foi colocada sob refluxo (100-130ºC) por vinte e duas horas, sob agitação.
Após este período, a reação foi retirada do aquecimento e esfriada até temperatura
B
B C
C
A
A
54
ambiente, acidificando-a com ácido clorídrico concentrado (HCl, 37% 60 mL), em
seguida a mistura reacional foi novamente levada a refluxo por 30 minutos. Retirou-se
do refluxo e foi resfriada até a temperatura ambiente. A fase orgânica foi extraída com
DCM (3x10 mL) e água (3x10 mL), seca com sulfato de magnésio anidro - MgSO4.
Em seguida, evaporou-se o solvente sob pressão reduzida e o produto resultante foi
purificado por cromatografia em sílica gel 60 no sistema Hexano/Acetato 9:1 de modo
a obter o produto final, 2-amino-α-cloroacetofenona-substituída que foi concentrado e
armazenado para a próxima reação. Após a purificação obteve-se:
2a(4,8g; 28,6mmol; 57,2%; pf: 98°-100°C). IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 3460,
3344, 1654.RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):δH7,62(1H, dd, J18,16 Hz e J2 1,35 Hz, H-C6);
7,30 (1H, ddd, J18,45Hz,J27,04 Hz e J3 1,47 Hz, H-C4); 6,66 (1H, pt, J 1,13 Hz, H-
C5);6,69 (1H, dd, J17,80 Hz e J2 0,99 Hz, H-C6); 6,31 (2H, s, -NH2-);4,69 (2H, s, -CH2).
RMN13C (CDCl3,100 MHz):δC192,4; 151,1; 135,3; 130,7; 117,6; 116,0; 115,1;46,6.EM
(ESI) m/z [M+H]+: 170, [M+Na]+:192.
2b (8,2g; 28,6mmol; 57,2%; pf: 130°-132°C); IV(KBr,4000 – 400 cm-1): 3349,
3334, 1654.RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):δH 7,74 (1H, d, J2,46 Hz, H-C6); 7,38 (2H, s, -
NH2-);7,30 (1H, dd, J19,00 Hz e J22,47 Hz, H-C4); 6,84 (1H, d, J 9,04, H-C3); 5,07
(2H, s, -CH2-). RMN 13C(100 MHz, CDCl3):δC 191,7; 150,3; 134,5;129,9;119,0; 117,4;
114,5;47,6.EM (ESI) m/z [M+H]+:204, [M+2]+:206
2c (9,5g; 46,6mmol; 93,3%; pf: 47°- 50°C); IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 3482,
3357, 1665, 1615. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):δH 7,59 (1H, dd, J18,19 e J21,31, H-C6);
7,45 (1H, dd,J17,70 e J21,36, H-C4); 6,85 (2H, s, -NH2-); 6,62 (1H, pt,J18,10 e J27,78,
H-C5); 4,68 (2H, s, -CH2-). RMN 13C(100 MHz, CDCl3): δH191,7;150,2; 134,5;129,8;
119,0;117,3; 114,5; 47,5. EM (ESI) m/z [M+H]+:204,[M+Na]+:226.
2d (6,1g; 10,1mmol; 56,5%; pf: 98°- 103°C). IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 3460, 3346,
1654, 1222. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):δC 7,29 (1H, dd, J1 9,60 e J2 2,87 Hz, H-C6);
7,09 (1H, ddd, J116,74,J27,62 e J32,89 Hz, H-C4);6,66 ( 1H, dd, J19,12 e J2 4,57Hz, H-
C3); 6,20 (2H, s, -NH2-); 4,62 (2H, s, -CH2-). RMN 13C: (100 MHz, CDCl3): δC191,7;
152,1; 147,8; 123,7; 118,9; 115,1; 46,4. EM (ESI) m/z [M+H]+:187.
.
.
.
.
.
.
.
.
. .
55
4.3.2 Síntese da 2-acetilamino-2-[2-(2-amino-fenilas-substituídas)-2-oxoetila]
ácido malônico-dietil-éster B (3a-3d)
Três balões foram flambados:
Balão 1 - 100 mL
Balão 2 - 50 mL
Balão 3 - 25 mL
Os balões foram vedados com rolhas de borracha natural injetando em seguida
gás nitrogênio e colocando uma bexiga com o mesmo gás para cada balão. No balão
1, foi adicionado um agitador magnético, em seguida foram acrescentados hidreto de
sódio –NaH 55% (0,19 g – 8,3 mmmol) e sob agitação o dimetilformamida - DMF (5,9
mL), respectivamente. Foram adicionados ao balão 2, o dietilacetamidomalonato –
C7O4H12 (1,93 g - 8,9 mmol) e o DMF (12 mL). Em banho de gelo transferiu-se via
seringa o conteúdo do balão 2 no balão 1. A mistura reacional foi agitada por um
período de 3 horas em banho de gelo. Adicionou-se no balão 3, o 2-amino-α-
cloroacetofenona-substituída 2a-2d (1 g - 5,9 mmol,) com DMF (4,2 mL). Em seguida
o balão 1 foi retirado do banho de gelo e após o aquecimento da reação, a
temperatura ambiente, adicionou-se a solução do balão 3 no balão 1. A reação foi
colocada sob agitação por 12 horas.
Após esse período, a mistura reacional foi lavada com 43 mL de água destilada e
transferida para um funil de separação, corrigindo-se o pH para 3,0 com HCl 2M. Em
seguida a fase orgânica foi extraída 3 (três) vezes com porções de 40 mL de acetato
de etila e seca com MgSO4 anidro, filtrada, rota-evaporada onde o produto resultante
foi concentrado e transferido para um funil de separação e extraiu-se com 3 porções
de salmoura, a fase orgânica foi seca com MgSO4 anidro, filtrada e evaporado o
solvente sob pressão reduzida e o produto resultante foi concentrado e guardado para
a próxima reação. Apósa purificação por cromatografia em sílica gel 60 com
diclorometano, obteve-se:
3a (3,7g; 10,8 mmol; 66,6%; pf: 117°- 120°C ); IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 2924, 1762,
1654. RMN 1H (DMSO, 400 MHz):δH 8,44 (1H, s, NH); 7,62 (1H, d, J8,19 Hz, H-C6);
.
56
7,26 (1H, dd, J18,28 e J27,06 Hz, H-C4); 7,19 (2H, s, -NH2);6,75 (1H, d, J8,42 Hz, H-
C3); 6,54 (1H, dd, J1 7,96 e J27,09 Hz, H-C5); 4,14 (4H, q,J7,07 Hz, 2-COOCH2-CH3);
3,94 (2H, s, -CH2-CO); 1,85 (3H, s, -CO-CH3); 1,14 (6H, t,J7,08 Hz, 2 -COOCH2-CH3).
RMN 13C(100 MHz, CDCl3): δC197,5; 169,6; 167,1; 166,4; 134,6; 130,8; 117,0; 115,9;
114,5; 63,9; 61,6; 42,4; 21,9; 13,7.EM (ESI) m/z [M+H]+:351, [M+Na]+:373.
3b (9,1g; 23,8mmol; 95,1%; pf: 115°- 118ºC); IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 3448, 3374,
3324, 1762, 1649. RMN 1H (DMSO, 400 MHz): δH 8,45 (1H, s, NH); 7,59 (1H, d,J
2,46 Hz, H-C6); 7,33 (2H,s, -NH2); 7,29 (1H, dd, J18,97 e J22,46 Hz, H-C4); 6,81
(1H,d, J 8,98 Hz, H-C3); 4,14 (4H, q,J 7,07 Hz, 2-COOCH2-CH3); 3,89 (2H, s, -CH2-
CO); 1,85 (3H, s, -CO-CH3); 1,14 (6H, t, J7,08 Hz ,2 -COOCH2-CH3). RMN 13C (100
MHz, CDCl3 ):δC 196,9; 169,3; 166,4; 146,4; 134,5; 130,3; 119,4; 117,7; 115,1; 64,0;
61,6; 56,1; 21,9; 13,7.EM (ESI) m/z [M+H]+:385, [M+ Na]+:407.
3c (12,0g; 31,2 mmol; 70,7%; pf: 69°- 72°C); IV (KBr, 4000 – 400 cm-1):3439, 3400,
3376, 1752, 1647.RMN 1H (DMSO, 400 MHz):δH 8,42 (1H, s,NH); 7,72 (1H, dd,J18,20
e J21,23 Hz, H-C6); 7,53 (1H, dd, J17,70 e J21,18 Hz, H-C6); 7,23 (2H, s, -NH2); 6,63
(1H, pt,J7,92 Hz, H-C5); 4,14 (4H, q,J 7,02 Hz,2-COOCH2-CH3); 4,00 (2H, s, -CH2-
CO); 1,85 (3H, s, -CO-CH3); 1,14 (6H, t,J 7,07 Hz, 2 -COOCH2-CH3).RMN 13C(100
MHz, CDCl3):δC197,9; 169,3; 166,4; 146,4; 134,5; 130,3;119,4; 115,1; 61,6; 42,8;
21,9; 13,8; 13,7.EM (ESI) m/z [M+ H]+:385, [M+ Na]+:407.
3d (3,7g; 10,1mmol; 95,0%; pf: 78°- 81°C). IV (KBr, 4000 – 400 cm-1): 3453, 3376,
3328, 1761, 1652. RMN 1H (DMSO, 400 MHz): δH8,36 (1H, s, NH); 7,37 (1H, dd,
J110,38 e J22,97 Hz, H-C6); 7,20 (1H, ddd, J117,13,J27,98 e J32,98 Hz, H-C4); 7,08
(2H, s, -NH2); 6,80 (1H, dd,J 4,88 Hz, H-C3); 4,14 (4H, q,J 7,08 Hz,2-COOCH2-CH3);
3,89 (2H, s, -CH2-CO); 1,85 (3H, s, -CO-CH3); 1,14 (6H, t,J7,07Hz, 2 -COOCH2-CH3).
RMN 13C (100 MHz, CDCl3): δC196,9; 169,2; 166,4; 150,7; 148,14; 123,1; 118,6;
114,8; 61,6; 56,0; 42,5; 21,9; 13,8; 13,6. EM (ESI) m/z[M+H]+: 369, [M+ Na]+:391.
4.3.3 Síntese dos derivados da quinurenina C (4a-4d)
Em um balão de fundo redondo de 100 mL com agitador magnético, foram
adicionados 2-acetilamino-2-[2-(2-amino-fenila-substituída)-2-oxoetila] (3a-3d) (1g –
.
. .
.
.
.
.
.
57
2,86 mmol) seguido de HCl concentrado (11,3 mL). Quando homogeneizado, a
mistura reacional foi refluxada a 100-130ºC por seis horas, sob agitação. Em seguida
a reação foi retirada do refluxo e esfriada até temperatura ambiente. Após o refluxo, a
mistura foi rota-evaporada até a secura. A reação foi lavada com água destilada e a
fase orgânica foi extraída com DCM (3x20 mL), seca com MgSO4 anidro, filtrada e em
seguida rota-evaporada. Ao final da reação adicionou-se a mistura reacional hidróxido
de sódio NaOH 2N até pH 6,5 e a solução resultante foi filtrada para a obtenção do
produto final. Após a purificação obteve-se:
4a (0,3g; 1,6 mmol; 59,7%; pf: 207°-210°-C com decomposição);
4b (8,2g; 34,1 mmol; 72,3%; pf:216°-220°C com decomposição);
4c (0,7g; 2,9mmol; 55,6%; pf: 239°-242°C com decomposição);
4d (0,5g; 2,3 mmol; 33,8%; pf: 184°-187°C com decomposição).
4.4 ENSAIO LARVICIDA
4.4.1 Obtenção dos ovos
As amostras de ovos utilizados no descrito estudo foram de duas linhagens
diferentes: Rockefeller, consideradas susceptíveis ao agente larvicida temefós,
cedidas pelo Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores (LAFICAVE,
FIOCRUZ, Rio de Janeiro), e a linhagem Porto Dantas, conhecidas por serem
resistentes ao temefós, coletadas no bairro Porto Dantas em Aracaju-SE, pelo
Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical (LEPaT) do Departamento de
Morfologia da UFS.
As larvas foram desenvolvidas no insetário LEPaT sob condições adequadas
de temperatura (26±2°C), umidade relativa (60±10%) e fotoperíodo de 12 horas. Os
ovos foram mantidos secos aderidos em tiras de papel até o momento em que foram
utilizados para eclosão.
4.4.2 Obtenção das larvas
As larvas de terceiro estádio (L3) de Ae. aegypti foram obtidas de uma colônia
estabelecida no LEPaT, para cada linhagem e foram gentilmente cedidas para estudo
em recipientes retangulares.
58
4.4.3 Ensaio de toxicidade
Os ensaios de toxicidade foram realizados seguindo a metodologia descrita por
THANGAM and KATHIRESAN (1991) com algumas modificações. Inicialmente, as
faixas de concentração utilizadas nos bioensaio de toxicidade foram pré-estabelecidos
por um ensaio piloto através de uma curva concentração resposta com apenas uma
replicata de 20 larvas para cada concentração, com o objetivo de verificar em qual
faixa de concentrações ocorria à mortalidade.
As larvas foram selecionadas, contadas (20 larvas por teste) e transferidas
com o auxílio de uma pipeta de Pasteur para uma proveta de 50 mL. O volume de
água foi completado para 20 mL e, em seguida, as larvas foram transferidas para
copos descartáveis. Para aplicação dos compostos utilizou-se pipetas automáticas da
ecopipetteTM. Inicialmente, os compostos foram pré-solubilizados em
aproximadamente 5mL da água dos copos contendo as larvas e, em seguida, as
larvas foram vertidas lentamente para evitar a morte das mesmas por uma agitação
vigorosa. Após o ensaio piloto, o teste foi realizado em triplicata para todas as
concentrações analisadas, assim como o controle negativo.
O controle positivo foi realizado utilizando o organofosforado temefós (O,O’-
(ditio-4,1-fenileno) bis (O,O-dimetilfosforotioato)) em concentrações que variam de
0,015 ppm a 0,135 ppm e ocontrole negativo foi realizado com Tween 80, DMSO e
água mineral na maior concentração aplicada aos compostos.
As larvas foram expostas ás soluções por 24 horas e, ao final deste período,
registrou-se a taxa de mortalidade. Foram consideradas mortas às larvas que não
apresentaram nenhum movimento quando submetidas a estímulos (batidas
sucessivas nas paredes dos copos com uma pipeta de Pasteur).
4.4.4 Preparo das soluções-estoque
Todos os compostos testados foram pesados em balança analítica de alta
precisão (Marconi AW220). Para cada mililitro da solução estoque pesou-se 20 mg do
composto de interesse e, em seguida, adicionaram-se duas gotas de agente
tensoativo tween 80, sobre o composto, realizando uma prévia homogeneização. Em
seguida, foram adicionados 0,3 mL (30% v/v) de DMSO, seguido de uma nova
homogeneização. Por fim, adicionou-se 0,7 mL (70% v/v) de água destilada e
homogeneizou-se novamente. A partir das soluções-teste foram preparadas uma
59
série de diluições variando de 0,5 ppm a 2000 ppm. Os bioensaios seguiram o mesmo
padrão para todos os compostos testados, diferindo uns dos outros apenas nas
concentrações pré-determinadas pelo ensaio piloto.
4.4.5 Análise estatística
A partir dos dados de mortalidade obtidos nos bioensaios, foi realizada a
estimativa da concentração letal médiada população (CL50) e o intervalo de confiança
de 95% [IC 95%], utilizando o método de análise PROBIT com auxílio do software
MinitabTM (FINNEY, 1971). Em todos os casos onde ocorreu morte no experimento do
controle negativo entre 5 e 20% foi realizada a correção utilizando a fórmula de
Abbott´s ,1925:
% Eficiência= 1 - X100
Onde:
% Eficiência = taxa de mortalidade do experimento
nº Teste = número de mortes no teste
nº Controle = número de mortes no controle
Quando a taxa de mortalidade no experimento do controle negativo foi superior
a 20%, o teste foi descartado e repetido. A comparação da CL50 dos compostos foi
realizada através do intervalo de confiança ao nível de 95% de significância. A
atividade dos compostos foi considerada significativamente diferente quando o IC
95% não se sobrepôs.
nºTESTE
TESTE
nºCONTROLE
CONTROLE
60
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Estruturas dos terpenos, fenilpropanóide e seus compostos relacionados
quanto à atividade larvicida
Para avaliar as diferenças entreos 21 compostos selecionados, dois grupos
foram gerados: aromáticos e alifáticos biciclícos. O Fenol (Figura 11) foi usado como
um protótipo do grupo aromático e p-cimeno foi adicionalmente avaliado com o
objetivo de examinar os efeitos da retirada da hidroxila aromática. Foi selecionado um
conjunto diversificado de compostos bicíclicos alifáticos derivados do norbornano
(Figura 12) para estudar o comportamento das hidroxilas, ligações duplas e grupos
éteres.
Os compostos listados nas Figuras 11 e 12 foramt estados quanto à sua
atividade, frente às larvas resistentes de terceiro estádio de Ae.aegypti. A análise
probit foi utilizada para determinação da concentração letal que mata 50% da
população (CL50), expresso em ppm, com auxílio do software Minitab 16TM. Todos os
bioensaios foram realizados em triplicatas para cada concentração e os dados do
número de larvas mortas foram utilizados para o cálculo da CL50. A Tabela 1 e 2
demonstra os valores de CL50 e o intervalo de confiança (IC) de 95% dos compostos
dos grupos dos aromáticos e alifáticos bicíclicos, respectivamente.
Tabela 1. Atividades larvicida (CL50) e Intervalo de confiança (IC) 95% dosubgrupo dos aromáticosavaliados frente às
larvas do Ae.aegyptino terceiro estadio
Podemos observar a partir dos dados da Tabela 1 que os valores da CL50 dos
compostos aromáticos catecol (2), p-cimeno (5), carvacrol (7) e aldeído salicílico (9)
Composto CL50 ppm (IC) Composto CL50 ppm (IC)
Fenol(1) 194 (180-207) Timol(6) 81(76-86)
Catecol(2) 243 (248-269) Carvacrol(7) 69(65-72)
Resorcinol(3) 577 (519-629) Eugenol(8) 88(81-96)
Guaiacol(4) 177 (194-192) Aldeído salicílico(9) 136 (116-155)
p-cimeno(5) 51 (48 - 56) Vanilina (10) 513 (449-589)
Temefós 0,030 (0,025-
0,035)
61
foram diferentes uns dos outros. O fenol(1) e guaiacol (4), o resorcinol (3) e vanilina
(10), bem como o timol (6) e eugenol (8) não diferiram entre eles.
O p-cimeno causou uma mortalidade de 100% daslarvas de Ae.aegypti, após
24h, exibindo a maior atividade larvicida, CL50 = 51 ppm [48 – 56], seguido do
carvacrol CL50 = 69 ppm [65 - 72], o timol CL50 = 81 ppm [76 – 86] e eugenol CL50= 88
ppm [81– 96]. Ao passo que o resorcinol (3) exibiu a menor atividade do conjunto
aromático CL50 = 577 ppm [519 – 629], induzindo a 100% de mortalidade de Ae.
aegypti a 2000 ppm.
Tabela 2. Atividades larvicida (CL50) e Intervalo de confiança (IC) 95% do grupo dos alifáticos biciclícosavaliados frente
às larvas do Ae. aegyptino terceiro estadio
Em geral, o conjunto dos alifáticos bicíclicos (Tabela 2) exibiram perfis de
atividade mais baixos do que o conjunto aromático. Os valores de CL50 do (+) canfeno
(11), (–)-canfeno (12), cânfora (13),1,8-cineol (16) e 1,4-cineol (17) foram diferentes
uns dos outros. As atividades da cânfora (13), borneol (14), Isoborneol (15) e 5-
norboneno-2-exo-3-exo-dimetanol (19), bem como o 1,8-cineol (16) e 5-norboneno-2-
endo-3-endo-dimetanol (18) foram diferentes uns dos outros.O (–)-canfeno (12) exibiu
a maior atividade larvicida do conjunto dos alifáticos bicíclicos CL50 = 220 ppm [163–
301], seguido de (+)-canfeno CL50 = 406 ppm [317–526], isoborneol (15) CL50 = 598
ppm [522 – 665] e borneol (14) CL50 = 610 ppm [530–671], ao passo que 1,8-cineol
(16) exibiu a menor atividade larvicida CL50 = 1419 ppm [1307–1540], seguido de 5-
norborneno-2-endo,3-endo-dimetanol (18) CL50 = 1407 ppm [1258-1574]. 1,4-Cineol
Composto CL50 ppm [IC] Composto CL50 ppm [IC]
(+)-Canfeno (11) 406 [317-526] 1,4-cineol (17) 751 [717–790]
(–)-canfeno (12) 220 [163–301] 5-norboneno-2-endo,
3 - endo –dimetanol
(18)
1407 [1258–1574]
Cânfora (13) 657 [594–701] 5-norboneno-2-exo, 3
- exo –dimetanol (19)
717 [581-893]
Borneol (14) 610 [530–671] 5-norboneno-2,2-
dimetanol (20)
785 [711–891]
Isoborneol (15) 598[522–665] 5-norboneno-2-ol (21) 759 [722–796]
1,8-cineol (16) 1419 [1307-
1540]
Temefós 0,030 [0,025-0,035]
62
(17) e norbornenos 19 e 20 exibiram atividades intermédiarias. O controle positivo,
temefós, exibiu CL50 = 0,030 ppm [0,025-0,035].
5.2 RELAÇÃO ESTRUTURA ATIVIDADE DOS COMPOSTOS AROMÁTICOS E
ALIFÁTICOS BICÍCLICOS
As estruturas químicas dos compostos aromáticos (Figura 12), com a exceção
do p-cimeno usado para induzir as relações estrutura-atividade têm o fenol como
protótipo. O p-cimeno foi testado como objetivo de avaliar os efeitos da remoção de
grupos hidroxila do anel aromático. O Fenol (1) exibiu CL50 de 194 ppm e a adição de
grupos lipofílicos no anel aromático do mesmo resultou em um aumento na atividade
em mais de três vezes, também podemos destacar o timol (6) com uma CL50 de 81
ppm e carvacrol (7) CL50 de 69 ppm. A remoção da hidoxila (-OH) na estrutura do
carvacrol e timol resultou no p-cimeno, observando-se um aumento na atividade. Ao
deslocar a hidroxila do timol de C1 para C2, resultou na estrutura do carvacrol, o que
não alterou a atividade.
Em contraste, ao adicionar uma hidroxila na posição meta do fenol (CL50 =194),
obtendo-se o resorcinol (3) CL50 de 577 ppm, proporcionou uma diminuição
significativa da atividade. No entanto, a mesma hidroxila na posição orto, resultando
em catecol (2) CL50 = 243 ppm, aumentou a potência se comparado ao resorcinol. A
substituição do grupo hidroxila do catecol orto por um grupo lipofílico, o metoxi
(guaiacol, 4) resultou em um aumento na aividade.
Similarmente, a substituição do grupo hidroxila do catecol por um aldeído
(aldeído salicílico, 9) resultou em um aumento de duas vezes na atividade. No
entanto, a presença do aldeído na posição para do guaiacol resultou na diminuiçãode
mais de duas vezes na atividade (vanilina, 10, CL50 = 513 ppm), enquanto que a
adição de um grupo lipofílico, na mesma posição levou a um aumento de 3,5 vezes na
atividade (eugenol, 8, CL50 = 88 ppm). Em geral, a presença da hidroxila no anel
aromático resultou em compostos menos ativos. Uma explicação plausível para este
resultado pode ser compreendido pelo aumento do número de grupos hidroxila que
impedem a penetração das substâncias na cutícula das larvas e consequentemente a
atingir os seus alvos (LOPEZ et al. 2005). Consequentemente, a metilação das
63
hidroxilas conduziu a um aumento substancial na atividade, a qual pode estar
relacionada com a obstrução do grupo hidroxila acídico.
Os resultados deste trabalho foram substanciais quando comparamos o fenol
(1) com aldeído salicílico (9), mas não explica a diminuição da atividade por meio da
adição de um aldeído na posição para do guaiacol, resultando em um composto
menos ativo, a vanilina (10).
Semelhante aos resultados obtidos no conjunto dos aromáticos, a adição de
hidroxilas às estruturas do conjunto alifático biciclícos (Figura 13) resultou em
compostos menos ativos. Logo a falta de hidroxilas provavelmente contribuiu para as
atividades do (+) e (–)-canfeno,11 e 12 (CL50=406 ppm e 220 ppm, respectivamente).
Além disso, as atividades biológicas de enantiômeros (+) e (–)-canfeno foram
significativamente diferentes. De fato, o reconhecimento quiral de enzimas é bem
demostrado em pesquisas bioquímicas e produtos farmacêuticos, bem como as
diferenças biológicas entreos enantiômeros. A influência quiral de outros
monoterpenos opticamente ativos em modelos experimentais também foi
demonstrada (De SOUZA et al., 2007a, 2007b, Do AMARAL et al.,2007). No entanto,
o diastereoisômero, borneol, 14, (CL50 = 610 ppm) e isoborneol, 15, (CL50 = 598 ppm)
exibiram perfis de atividade semelhantes. A substituição da hidroxila a partir de
borneol ou isoborneol por carbonila, resultando em cânfora, 13, (CL50 = 657 ppm), não
alterou a atividade.
Os norbornenos estruturalmente relacionados exibiram diferentes perfis de
potência, variando 717 a 1407 ppm. Dentro dos derivados dos norbornenos,5-
norborneno-2,3-exo-exo-dimetanol, 19, (CL50=717 ppm) exibiu a atividade larvicida
mais elevada. No entanto, o seu isômero endo resultou em aproximadamente uma
atividade duas vezes menor, enquanto o 5-norborneno-2-ol, 21, (CL50 = 759 ppm), e
5-norborneno-2,2-dimetanol, 20, (CL50 = 785 ppm) exibiram atividades intermédiarias.
Curiosamente, os compostos de éter 1,8 e 1,4-cineol, não apresentaram atividades
relacionadas, logo observamos que o 1,8-cineol (16) foi menos tóxico do que o 1,4-
cineol (17). Ao contrário do grupo dos aromáticos, a presença de hidroxilas em outras
posições deste grupo, não apresentou uma diferença significativa na atividade.
Compostos aromáticos têm demonstrado maior potencial larvicida comparados aos
alifáticos.
64
WALIWITIYA et al., (2009) relataram a atividade larvicida de 14
monoterpenóides. Os compostos aromáticos trans anetol (CL50 = 67,1 ppm), timol
(CL50 = 27,3 ppm) e eugenol (CL50 = 82,2 ppm) apresentaram potentes atividades
larvicidas em comparação com os demais compostos relatados no estudo. Da mesma
forma, SIMAS et al., (2004) com o objetivo de comparar a atividade larvicida do
sesquiterpeno E-nerolidol com outros constituintes originados de óleos essenciais,
avaliaram alguns terpenos e fenilpropanóides obtidos comercialmente. O safrol,
eugenol e aldeído cinâmico foram ativos com CL50 de 49,0; 44,5 e 24,4 ppm,
respectivamente.Os álcoois insaturados lineares E, E-farnesol e E-cinamaldeído
exibiram as maiores atividades, CL50 13 e 17 ppm, respectivamente. Alguns dos atuais
valores de CL50 diferem de dados relatados por KIM et al., (2008), que podem ser
resultado de diferentes metodologias de análise. Além disso, as diferentes espécies, a
partir de nichos ecológicos diferentes, parecem ser mais susceptíveis ou resistentes
aos compostos específicos (WALIWITIYA et al., 2009). Os compostos avaliados foram
menos tóxicos do que temefos (0,030 ppm), piriproxifeno (CL50 = 0,000048 ppm), ou
diflubenzuron (CL50 = 0,00159 ppm) (SECCACINI et al., 2008). No entanto, os
conhecimentos adicionais sobre a relação estrutura atividade podem levar a
compostos mais potentes e seguros a saúde.
Utilizando as abordagens tradicionais de química medicinal, identificamos as
características estruturais que possam contribuir para a compreensão da atividade
larvicida de fenilpropanóides, terpenos, e seus derivados. A presença de grupos
lipofílicos no anel aromático ou na hidroxila resultou no aumento da potência. A
adição de uma hidroxila ao anel aromático resultou na diminuição da potência.
Semelhante aos resultados obtidos no conjunto aromático, a adição de grupos
hidroxila para as estruturas do conjunto alifático biciclícos resultou em compostos
menos potentes. A estereoquímica dos compostos selecionados desempenha um
papel importante na modulação da potência.
Embora existam diversos relatos na literatura mostrando a atividade inseticida de
óleos essenciais, poucos discutem a relação estrutura versus atividade biológica de
seus constituintes. Neste trabalho ficou evidente a importância da lipofilicidade de
terpenos para a atividade larvicida em Aedes aegypti, refletindo a enorme contribuição
que a natureza pode fornecer na busca por alternativas para os produtos inseticidas
65
sintéticos convencionais, motivados pela ausência de toxicidade dos produtos
derivados de plantas frente a mamíferos.
5.3 SÍNTESE E ATIVIDADE LARVICIDA DE DERIVADOS DA QUINURENINA
A etapa química deste trabalho fundamentou-se na obtenção de 12 compostos
2, 3, 4 (a-d) derivados da quinurenina com a execução de três tipos de reações:
acilação, substituição nucleofílica e descarboxilação. Todas as reações foram
descritas e baseadas no trabalho (VARASILet al., 1995), este se fundamenta numa
síntese seletiva, a partir de anilinas substituídas.
Para a obtenção da 2-amino-α-cloroacetofenona substituída (2a – 2d)
submeteu-se a anilina substituída (1 a – 1d) a uma reação de acilação sob as
condições de Houben-Hoesch usando cloroacetonitrila como reagente, AlCl3 como
catalisador e DCM como solvente polar aprótico. O resultado é uma cetimina que
pode ser facilmente hidrolisada, formando a fenilcetona. A reação de Hoesch (ou
Houben- Hoesch) é uma rota alternativa a acilação de Friedel-Crafts, funciona de
maneira satisfatória, pois a anilina aromática é uma espécie rica em elétrons
(ISENMANN, 2011). Porém a metodologia de Houben- Hoesch não explica a
regioseletividade, o que implicava em um baixo rendimento, logo SUGASAWA et al.,
1978 superou esta dificuldade com a ultilização do BCl3 na presença de AlCl3,
possivelmente através de um estado de transição cíclico envolvendo uma espécie
catiônica de boro estabilizada pelo Tetracloreto de alumínio (AlCl4-),este foi um grande
avanço em relação as sínteses já existentes, pois garantia a seletividade na
substituição alfa. Podemos observer o mecanismo no Esquema 4.
66
67
Esquema 4: Mecanismo das reações 2a – 2d
Por razões de ordem prática, optou-se em utilizar a adição acetamidomalonato
clássica, através de uma reação de substituição nucleofílica (Esquema 5), seguida da
descarboxilação e hidrólise (Esquema 6) para obtenção dos derivados da quinurenina
a partir dos intermediários (2a – 2d).
68
Esquema 5: Mecanismo das reações 3a – 3d
Dificuldades sintéticas decorrentes da metodologia de VARASI et al., na síntese
de 3a foram enfrentadas, levando ao desenvolvimento empírico de variações da
reação. Inicialmente foram ultilizados os reagentes etóxido de sódio 95% e como
solvente o etanol absoluto (VARASI et al., 1996), porém observou-se que a 2-Amino-
α-Cloroacetofenona não estava reagindo, não se observando o produto da reação em
cromatografia porcamada delgada (CCD), logo, substituiu-se o etóxido de sódio 95%
pelo preparo do mesmo, no momento da realização da síntese, através do sódio
metálico dissolvido em etanol anidro. Pôde-se perceber que mesmo com as
mudanças no preparo dos reagentes o rendimento da reação continuava baixo. Por
conseguinte, pesquisas foram realizadas e constatou-se que o solvente etanol anidro
poderia ser substituído pelo tetrahidrofurano (THF). Após a modificação na
metodologia, uma nova síntese foi realizada, porém sem bons resultados o que levou
a novas pesquisas e segundo (SUNIL et al.,2010) o THF poderia ser substituído pelo
Dimetilformamida (DMF) como solvente na reação, logo uma nova síntese foi
realizada com melhores rendimentos.
O produto 2-acetilamino-2-[2-(2-amino-fenila)-2-oxoetila] foi obtido.Tal resultado
pôde ser constatado através da realização de placas de CCDA, utilizando-se o
sistema Hexano/Acetato de etila 9:1. As mesmas foram reveladas em ultravioleta, e
mostravam a presença do produto desejado. Esta metodologia foi adotada para os
demais intermediários da síntese (3b-d).
69
Esquema 6: Mecanismo das reações 4a – d.
Os compostos 2,3 e 4 (a – d) apresentaram faixas de fusão com valores entre
47 – 242°C, os rendimentos da síntese dos compostos variaram de 33,8 a 95,1%. A
70
tabela 3 apresenta os valores da faixa de fusão e os rendimentos das reações de
síntese dos compostos obtidos. Os compostos são conhecidos na literatura e tiveram
os pontos de fusão confrontados com aqueles obtidos VARASI et al., 1996.
Tabela 3: Massa molecular, faixa de fusão e rendimento dos derivados da quinurenina.
Composto MM (g/mol) Faixa de fusão1 (ºC) Rendimento (%)
2a 169 98-100 57,2
2b 203 130-132 57,2
2c 203 47-50 93,3
2d 187 98-103 56,5
3a 350 117-120 66,6
3b 384 115-118 95,1
3c 384 69-72 70,7
3d 368 78-81 95,0
4a 208 207-210 59.7
4b 242 216-220 72,3
4c 242 239-242 55,6
4d 226 184-187 33,8
1A determinação da faixa de fusão dos compostos foi realizada ultilizando aparelho da marca
Logen cientifics PFM II.2MM (Massa Molecular).
O espectro de absorção de ondas eletromagnéticas na região do Infra
Vermelho (IV) auxilia na identificação de grupos funcionais presentes no produto de
síntese. Deste modo, ao analisar o espectro dos compostos 2a–d (Figura 14), foi
possível observar a presença de padrões muito semelhantes entre um espectro e
outro, caracterizando bandas de absorção marcantes, dentre estas se destacam: N-H
(3460-3334 cm-1) e C=O cetona (1665-1654 cm-1). Assim como o espectro dos
compostos 3a–d (Figura 15) apresentou bandas características: N-H (2924-3453 cm-
1), C=O éster (1752-1762cm-1) e C=O cetona (1647- 1654 cm-1).
71
Figura 14: Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 2 a – d.
De acordo com o deslocamento químico no espectro de RMN de¹H para o
composto 2aobservam-se 8 (oito) sinais, sendo: 4 (quatro) aromáticos, 2 (dois)
ligados ao nitrogênio e 2 (dois) ligados a cadeia lateral. Os sinais dos
quatrohidrogênios aromáticos apareceram entre δ 7,62 e 6,64 ppm, sendo:um dupleto
de dupletona região de δ 7,62 ppm, um triplo dupleto na regiãode δ7,30 pm, um
pseudo tripleto na região de δ 6,66 ppm e um dupleto de dupleto na região de
δ6,69ppm. Em δ 6,31 observa-se um singleto largode baixa intensidade referente aos
dois hidrogênios ligados ao nitrogênio aromático. Os dois hidrogênios da cadeia
lateral apresentaram um singleto com deslocamento químico de δ 4,69 ppm. Assim
como o espectro de hidrogênios dos compostos 2b-d, que apresentam em comum a
presença de 7 (sete) hidrogênios, sendo: 3 (três) aromáticos, 2 (dois) ligados ao
nitrogênio e 2 (dois) ligados a cadeia lateral. O sinal para os três hidrogênios
aromáticos apareceram entre δ 7,74 – 6,84 ppm (2b), δ 7,59 – 6,62 ppm (2c) e δ 7,29
– 6,66 ppm (2d). Os dois prótons ligados ao nitrogênio apresentaram picos com
deslocamento químico de δ 7,38 ppm (2b), δ 6,85 ppm (2c), δ 6,20 ppm (2d) e os 2
prótons da cadeia lateral apresentaram uma faixa de deslocamento de δ 4,62 – 5,07
ppm (CARRIE e MILLER, 2006).
Com relação ao espectro de RMN13C observou-se oito sinais que variam o seu
deslocamento químico de δ 46,4 – 192,4 ppm, nos quatro compostos analisados foi
72
constatando-se que os deslocamentos químicos eram semelhantes entre os
compostos analisados. Como: C-X (X= Cl e F) 2c (δ 46,5 ppm) e 2d (δ 46,4 ppm);
C=O 2c (δ 192,3 ppm) e 2d (δ 191,7 ppm) (CARRIE e MILLER, 2006).
Figura 15: Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 3a – d.
De acordo com o deslocamento químico no espectro de RMN ¹H para o
composto 3a, observa-se 22 (vinte e dois) sinais, sendo 4 (quatro) hidrogênios
aromáticos, 2 (dois) ligados ao nitrogênio aromático, 1 (um) ligado ao nitrogênio do
grupo amida e 15 (quinze) ligados a cadeia lateral. O sinal do nitrogênio da amida
apareceu com um deslocamento químico de δ 8,44 ppm apresentando um singleto
largode baixa intensidade,os 4 hidrogênios aromáticos apresentaram deslocamentos
entre δ 7,62 - 6,54 ppm, sendo: um dupleto na região de δ 7,62 ppm, um dupleto de
dupleto na região de δ 7,26 ppm, um dupleto na região de δ 6,75 ppm e um dupleto
de dupleto na região de δ 6,54 ppm.Os 2 hidrogênios ligados a amina aromática
apresentou um singleto largo de baixa itensidade na região de δ 7,19 ppm. Os 2
hidrogênios ligados ao H2C-C-C=O aparecem como um singleto de alta intensidade δ
73
6,54 ppm e os 4 hidrogênios do diéster apresentaram um quarteto com deslocamento
químico de δ 4,14 ppm. Os 3 hidrogênios do grupo acetal apresentaram um singleto
na região de δ 1,85 ppm e os 6 hidrogênios do diéster apresentaram um tripleto com
deslocamento químico de δ 1,14 ppm.
Assim como o espectro de hidrogênios dos compostos 3b-d, que apresentam
em comum a presença de 21 (vinte e um) hidrogênios, sendo 4 (quatro) aromáticos, 2
(dois) ligados ao nitrogênio aromático, 1 (um) ligado ao nitrogênio do grupo amida e
15 (quinze) ligados a cadeia lateral. Um singleto largo com deslocamento químico
entre δ 8,36 – 8,45 ppm refere-se ao hidrogênio ligado ao grupamento amida para 3b-
d. O sinal para os 3 hidrogênios aromáticos apareceram na faixa de δ 7,59 – 6,81
ppm (3b), δ 7,72 – 6,63 ppm (3c) e δ 7,37 – 6,80 ppm (3d). Os 2 prótons ligados a
amina aromática apresentou uma faixa de δ 7,08 – 7,33 ppm observando-se um
singleto de baixa intensidade e base alargada,os 2 prótons ligados ao C-C=O
aparecem como um singleto de alta intensidade com faixa de δ 3,89 – 4,00 ppm e os
4 prótons do diéster apresentaram pico com deslocamento químico δ 4,14 ppm para
os três compostos analisados, os 3 prótons do grupo acetal apresentaram um
deslocamento de δ 1,85 ppm e os 6 prótons do diéster apresentaram um
deslocamento de δ 1,14 ppm (VARASI, et al., 1996).
Com relação ao espectro de RMN13C observou-se 14 sinais que variaram de
δ 13,7 – 197,9 ppm, totalizando 17 átomos de carbono na molécula, porém observa-
se a presença de carbonos equivalentes no diéster. Nos 4 compostos analisados foi
constatado que os deslocamentos químicos eram semelhantes entre os compostos
analisados. Como: CH3COO- 3c (δ 13,7 ppm) e 3d (δ 13,6 ppm); COO 3c (δ 166,4
ppm) e 3d (δ 166,4 ppm) (VARASI, et al.,1996).
No espectro de absorção de ondas eletromagnéticas na região do IV dos
compostos 4a–d (Figura 16), foi possível observar a presença de padrões muito
semelhantes, entre um espectro e outro, caracterizando bandas de absorção
marcantes, dentre estas destacam-se: N-H (3469-3270 cm-1) e C=O ácido carboxílico
(1654-1647 cm-1).
74
Figura 16: Estruturas químicas dos derivados da quinurenina 4a – d.
Os compostos 4a-d foram enviados para análise de RMN 1H e 13C, porém os
resultados não foram conclusivos. Comparando-os com dados da literatura
observamos que os picos foram semelhantes, entretanto algumas dificuldades na
interpretação foram encontradas no que se refere à pureza do solvente utilizado para
análise, assim como a baixa intensidade dos picos nos espectros que em alguns
casos eram confundidos com ruído.
Os resultados aqui apresentados estão de acordo com os descritos na
literatura, VARASI et al., 1996, com algumas diferenças quanto a potência do
aparelho de RMN 1H e 13C utilizado neste trabalho (400 MHz) e pelo artigo (200
MHz), que possibilitou observar o espectro com mais detalhes.
O objetivo da etapa biológica consiste em investigar a atividade larvicida dos
derivados de síntese da quinurenina frente às larvas de terceiro estádio do Aedes
aegypti. A Figura 17 demostra a estrutura química dos compostos avaliados.
75
Figura 17: Estrutura química dos derivados da quinurenina avaliados.
76
A Tabela 4 demostra os valores de CL50 e o intervalo de confiança de 95% dos
derivados da quinurenina. Os resultados do ensaio larvicida revelam que os
compostos 2 a - d testados demonstraram ser potentesagentes larvicidas contra o Ae.
aegypti, sendo que os valores das CL50 variaram entre 4,29 a 11,71 ppm. As taxas de
mortalidade exibiram uma relação diretamente proporcional à concentração, ou seja,
houve um aumento das taxas de mortalidade conforme o aumento da concentração.
Apesar da excelente atividade apresentada pelos compostos 2a-d, os mesmos são
conhecidos na literatura, como anilinas aromáticas, apresentando alta toxicidade aos
mamíferos, o que limita o seu uso (SCOOT, 1962).
No que se refere à atividade larvicida dos compostos 3 e 4 (a-d) não apresentaram
atividade significativa contra as larvas do Ae. aegypti, devido a baixa solubilidade dos
mesmos ao solvente e detergente (DMSO e Tween) respectivamente, no que se
refere ao preparo da solução estoque para estudo. Algumas tentativas de
solubilização do composto foram realizadas:
utilizou-se diluições de 50% e 25% da solução estoque aplicando os
mesmos agentes (DMSO/Tween/água), porém sem sucessos na
atividade.
Em seguida testou-se a troca do agente desemulsificante e detergente,
Tween pelo cremofor, porém sem bons resultados.
E por fim a utilização de DMSO (90%)Tween(10% ) apenas para o
preparo da solução estoque, todavia não foi visualizado melhora na
atividade.
77
Tabela 4. Atividade larvicida (CL50) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) dos derivados da quinurenina frente às larvas de
Aedes aegypti
Compostos CL50 (ppm) IC 95% (ppm)
1-(2-aminofenil)-2-cloroetanona, 2a 10,20 [9,57 - 10,82]
1-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloroetanona, 2b 4,29 [3,85 - 4,76]
1-(2-amino-3-clorofenil)-2-cloroetanona, 2c 9,20 [8,33 - 10,05]
1-(2-amino-5-fluorofenil)-2-cloroetanona, 2d 11,71 [11,15 - 12,26]
dietil 2-acetamido-2-(2-(2-aminofenil)-2-
oxoetil)malonato, 3a
< 500 -
dietil 2-acetamido-2-(2-(2-amino-5-clorofenil)-2-
oxoetil)malonato, 3b
<500 -
dietil 2-acetamido-2-(2-(2-amino-3-clorofenil)-2-
oxoetil)malonato, 3c
<500 -
dietil 2-acetamido-2-(2-(2-amino-5-fluorofenil)-2-
oxoetil)malonato, 3d
<500 -
ácido-2-amino-4-(2-aminofenil)-4-
oxobutanóico, 4a
<500 -
ácido-2-amino-4-(2-amino-5-clorofenil)-4-
oxobutanóico, 4b
<500 -
ácido-2-amino-4-(2-amino-3-clorofenil)-4-
oxobutanóico, 4c
<500 -
ácido-2-amino-4-(2-amino-5-fluorofenil)-4-
oxobutanóico, 4d
<500 -
Não encontramos na literatura relatos da atividade larvicida dos derivados na
quinurenina frente às larvas do principal agente transmissor da dengue. É conhecido
apenas o metabolismo do triptofanos e seus intermediários em Aedes (Han et al.,
2008; Li and Li, 1997).
78
6. CONCLUSÃO
No presente trabalho avaliou-se a atividade larvicida de 21 compostos. No geral,
os compostos do grupo dos aromáticos foram mais potentes do que os compostos
dogrupo dos alifáticos bicíclicos, dando destaque à atividade do p-cimeno (CL50= 51
ppm);
A presença de gruposlipofílicosno anel aromático ou na hidroxila fenólica resultou
no aumento da potência.
A presença de hidroxilas ligadas ao anel aromático resultou na diminuição da
potência. Assim como a adição de grupos hidroxilasnas estruturas do conjunto
alifático biciclícos resultou em compostos menos potentes.
A lipofilicidade parece desempenhar um papel significativo na atividade larvicida
dos compostos analisados.
Todos os derivados da quinurenina foram obtidos com rendimentos aceitáveis. A
pureza foi avaliada através do ponto de fusão e comparada em literatura. A rota de
síntese ultilizada mostrou-se reprodutível.
A atividade larvicida dos derivados de síntese foram obtidas, dos 12 derivados
estudados, 4 mostraram-se ativos contra larvas do Aedes aegypti, 1-(2-aminofenil)-2-
cloroetanona, 1-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloroetanona, 1-(2-amino-3-clorofenil)-2-
cloroetanona e 1-(2-amino-5-fluorofenil)-2-cloroetanona.
79
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94
ANEXOS
Tabela 5:Dados do teste larvicida submetido a análise probítica dos compostos aromáticos
Composto Pontos de
mortalidade
Concentração
(ppm)
Número de larvas mortas
em triplicata
Vanilina
0
5
10
15
20
200
400
500
700
1500
0,0,0
5,8,3
10,10,9
15,15,17
20,20,20
Guaiacol
0
5
10
15
20
100
150
180
200
350
0,0,0
5,4,4
10,10,10
15,15,15
20,20,20
Timol
0
5
10
15
20
40
70
80
90
120
0,0,0
8,3,4
11,13,17
16,15,14
20,20,20
Eugenol
0
5
10
15
20
30
70
90
100
150
0,0,0
3,5,4
8,8,8
16,14,15
20,20,20
p-cimeno
0
5
10
15
20
30
45
50
60
130
0,0,0
7,5,3
9,9,14
15,15,13
20,20,20
Fenol
0
5
10
15
20
100
170
180
230
280
0,0,0
5,3,3
10,10,8
15,15,13
20,20,20
95
Composto Pontos de
mortalidade
Concentração
(ppm)
Número de larvas mortas
em triplicata
Resorcinol
0
5
10
15
20
150
500
600
800
2000
0,0,0
3,6,4
14,11,14
17,18,19
20,20,20
Carvacrol
0
5
10
15
20
30
60
70
80
90
0,0,0
2,2,2
11,14,12
15,14,20
20,20,20
Aldeído
Salicilico
0
5
10
15
20
50
100
150
200
300
0,0,0
6,5,7
10,10,10
16,16,16
20,20,20
Catecol 0
5
10
15
20
100
200
250
300
600
0,0,0
5,5,3
10,11,13
16,16,14
20,20,20
96
Tabela 6:Dados do teste larvicida submetido a análise probítica dos compostos alifáticos biciclicos
Composto Pontos de
mortalidade
Concentração
(ppm)
Número de larvas mortas
em triplicata
5-
Norboneno-
2-ol
0
5
10
15
20
500
700
780
800
1200
0,0,0
5,5,5
11,10,9
14,14,17
20,20,20
5-
Norboneno-
2-endo, 3-
endo
dimetanol
0
5
10
15
20
800
1200
1600
1800
3000
0,0,1
3,7,7
10,11,13
18,16,14
20,20,20
5-
Norboneno-
2,2-
dimetanol
0
5
10
15
20
500
600
700
1000
1800
0,0,0
6,5,4
9,8,11
16,13,13
20,20,20
5-
Norboneno-
2-exo, 3-exo
dimetanol
0
5
10
15
20
300
400
750
1300
2500
2,2,1
6,4,5
12,8,9
15,15,16
20,20,20
(-)-Canfora 0
5
10
15
20
40
100
200
500
1500
0,0,0
3,5,6
10,9,11
13,17,15
20,20,20
1,4 cineol
0
5
10
15
20
300
700
750
800
1400
0,0,0
6,5,4
10,11,9
15,14,14
20,20,20
97
Composto Pontos de
mortalidade
Concentração
(ppm)
Número de larvas mortas
em triplicata
(+)-Canfeno 0
5
10
15
20
100
200
350
600
2500
0,0,0
2,8,5
8,10,13
14,13,17
20,20,20
Tabela 7: Dados do estudo estátístico submetido a análise probítica dos derivados da quinurenina ativos.
Composto Pontos de
mortalidade
Concentração
(ppm)
Número de larvas
mortas em triplicata
2a
0
5
10
15
20
4
8
10
14
16
0,0,0
5,5,5
10,10,9
16,16,11
20,20,20
2b
0
5
10
15
20
1
3
4
8
10
0,0,0
5,7,4
10,10,9
16,16,14
20,20,20
2c
0
5
10
15
20
2
6
10
14
20
0,0,0
5,5,4
10,10,10
16,14,16
20,20,20
2d
0
5
10
15
20
4
10
12
14
25
0,0,0
5,5,5
11,10,11
15,15,17
20,20,20
98
Espectroscopia de IV do 1-(2-amino-5clorofenil)-2-cloroetanona.
99
Espectrofotometria de RMN 1Hem CDCl3do 1-(2-amino-5clorofenil)-2-
cloroetanona.
100
Espectrofotometria de RMN 13C do 1-(2-amino-5clorofenil)-2-cloroetanona.
