Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interésestructural, basados en secuencias ricas en glicinas

Laura García García

MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA

Tutores: Jesús Manuel Peregrina García y Francisco Corzana LópezFacultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Curso 2011-2012

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural, basados ensecuencias ricas en glicinas, trabajo fin de estudios

de Laura García García, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Francisco CorzanaLópez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA Centro de Investigación en Síntesis Química (CISQ) Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural,

basados en secuencias ricas en glicinas.

Trabajo de investigación Proyecto Fin de Máster

Laura García García Junio 2012

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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

CSI

A mis padres, por su cariño y apoyo en todo momento

A mi hermano, por su comprensión y su afecto

A mi novio, por su cariño y por su ánimo incondicional

A mi familia y amigos, que siempre están ahí

Apenas han pasado dos años desde que formo parte de este grupo y en

este tiempo he aprendido multitud de cosas, tanto a nivel académico como a nivel

personal, la convivencia diaria, el compañerismo y la ayuda que siempre que la he

necesitado se me ha prestado.

En primer lugar agradecer a Alberto, Pere, Héctor y Marimar los

conocimientos adquiridos durante mi primera etapa de licenciatura y su confianza

y formación en esta segunda etapa. Y especialmente a Paco, por su paciencia, su

ayuda en todo momento tanto dentro como fuera del laboratorio y por transmitir

ese entusiasmo por la Química que le hace tan especial.

Y por supuesto a todos mis compañeros, empezando por Victor S. y

Nuria que me han ayudado mucho en mi trabajo. A David e Ivan por sus risas y

buen humor. A Victor R. por su gran responsabilidad y comportamiento modelo, y

por ayudarme a quitar burbujas cuando el ultrasonidos no podía con ellas. A

Claudio e Ismael por compartir mañanas y tardes intensas de máster y de

laboratorio. Sin olvidarme de los más veteranos (Lara, Charlie, Eva y Fer) y de los

que acaban de llegar (Iris, Victor P. y Nuria). Muchas gracias chicos.

También agradecer a mis vecinos fotoquímicos Alegría, Héctor, Marina,

Pedro, Miguel Ángel, Diego y Anselmo los momentos compartidos.

Al resto de mis compañeros del máster, analítica e inorgánicos: Laura,

Rocio, Justo, Jesús y Sábel.

Sin olvidar a mis padres y a mi hermano, gracias a vosotros estoy donde

estoy y sin vuestro cariño, animo, afecto y comprensión no estaría aquí, aunque

no entendaís de química

A mi novio, por su cariño, su paciencia, y sobre todo por sus abrazos

cuando más lo he necesitado.

Por último a toda mi familia (especialmente a mi abuela) y a mis amigos,

que no han dejado de apoyarme en ningún momento.

Finalmente, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la

ayuda económica aportada a la realización de este proyecto:

Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto COLABORA

2010/05.

Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica al

proyecto CTQ2009-13814/BQU.

Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y científico

idóneo para el desarrollo de este trabajo.

ÍNDICE

Abreviaciones I

1. Introducción y objetivos 1

2. Antecedentes 13

2.1. Estructura de péptidos y glicopéptidos 18

2.2 Síntesis

2.2.1. Formación del enlace peptídico 28

2.2.2. Síntesis de péptidos en fase sólida 31

2.2.3. Formación del enlace O-glicosídico 34

2.3. Trabajos previos 38

3. Discusión de resultados 43

4. Conclusiones 61

5. Experimental 65

6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 87

I

Abreviaciones

desplazamiento químico 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón

13C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13

Ac acetilo

Ac2O anhídrido acético

AcOEt acetato de etilo

Ala, A alanina

Arg, R arginina

Asp, D ácido aspártico

Bn bencilo

Boc terc-butoxicarbonilo

Boc2O di-terc-butil dicarbonato

BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(dimetilamino)fosfonio tBu terc-butilo

BuOH butanol tBuOK terc-butóxido potásico

c concentración (g/100 mL)

col. colaboradores

COSY COrrelated SpectroscopY d doblete, día

DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida

DCM Diclorometano

dd doblete de dobletes

DIC N, N’-diisopropilcarbodiimida

DIEA diisopropiletilamina

DM dinámica molecular

DMF dimetilformamida

Et etilo

Et3N trietilamina

EtOH etanol

Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo

II

GalNAc N-acetilgalactosamina

Gly, G glicina

HBTU hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-

dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio

His, H histidina

HOBt 1-hidroxibenzotriazol

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

J constante de acoplamiento

M molaridad

m multiplete

Me metilo

MeOH metanol

MeONa metóxido de sodio

MeSer metilserina

MeSer * metilserina glicosilada con α-O-GalNAc

mmol milimol

NMP N-metilpirrolidona

NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

Pro, P prolina

PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(pirrolidin)fosfonio

R sustituyente alquilo o arilo, arginina

RMN resonancia magnética nuclear

s singlete, ázucar (del inglés, sugar)

Ser, S serina

Ser* serina glicosilada α-O-GalNAc

SPPS solid-phase peptide synthesis

t triplete, tiempo

TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-

tetrametiluronio

TFA ácido trifluoroacético

TfO triflato

THF tetrahidrofurano

TIS triisopropilsilano

Thr, T treonina

III

Thr* treonina glicosilada α-O-GalNAc

TMS trimetilsililo, tetrametilsilano

TSP Propionato de trimetilsililo

Val, V valina

1. Introducción y objetivos

3 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Actualmente se sabe que todos los seres vivos están formados por el

mismo tipo de moléculas y que éstas gobiernan cada una de sus funciones. En

este contexto, la Química ha tratado de correlacionar las funciones que realizan

las biomoléculas con su estructura. En concreto, a esta característica se la conoce

como relación estructura-actividad. Este concepto ya fue estudiado a finales del

s.XIX por Emil Fisher (1852-1919), quien propuso el famoso modelo de la llave-

cerradura en 1884 (Figura 1a). Este modelo considera que la estructura del

sustrato y del centro activo enzimático son complementarias, del mismo modo

que una llave encaja en su cerradura. Con esto, la estructura de la enzima es

rígida, es un modelo válido en muchos casos, pero no siempre es acertado.

Posteriormente, en la década de los 60, Daniel Koshland, propuso el modelo de

ajuste inducido que considera que el centro activo adopta la conformación idónea

sólo en presencia del sustrato (Figura 1b), se considera por lo tanto a la enzima

flexible y capaz de cambiar de forma al interaccionar con el sustrato adecuado.

a b

Figura 1. Modelos enzimáticos de llave-cerradura (a) y ajuste inducido (b)


Por lo tanto, hoy en día, es muy importante conocer la estructura de las

biomoléculas para así poder inducir en ellas cambios estructurales que

modifiquen y mejoren sus funciones biológicas.

En este sentido, la estructura de una proteína viene definida en 4 niveles

independientes. Estos niveles son:

Estructura primaria. Corresponde a la secuencia de

aminoácidos, unidos entre sí por enlaces amida. Nos indica qué

aminoácidos forman parte de la cadena polipeptídica y el orden

en que están unidos

Figura 2. Estructura primaria de un péptido simulado

Estructura secundaria. Consiste en el plegamiento de la

cadena polipeptídica gracias a la formación de puentes de

hidrógeno entre los átomos del enlace peptídico; apareciendo

estructuras de menor energía libre, y por tanto más estables,

como hélices α y láminas β.


Figura 3. Estructuras secundarias de péptidos, a la izquierda una hélice α y la derecha

una lámina β.

Estructura terciaria. Informa sobre la disposición de la

estructura secundaria del polipéptido, al plegarse sobre sí

misma, originando una conformación globular o fibrilar.

Figura 4. Mioglobina humana, ejemplo de estructura terciaria


Estructura cuaternaria. Está representada por el

acoplamiento de varias cadenas polipeptídicas iguales o

diferentes, con estructuras terciarias que quedan

autoensambladas.

Figura 5. Hemoglobina, ejemplo de estructura cuaternaria.

En la actualidad, las técnicas más utilizadas para la determinación

estructural de biomoléculas son la resonancia magnética nuclear (RMN) y la

difracción de rayos X. Si bien, esta última sólo aporta información del estado

sólido, mientras que la RMN es una técnica capaz de determinar la estructura en

disolución acuosa, reproduciendo así el medio en el que se encuentran estos

compuestos.

Los estudios estructurales de RMN en proteínas constan, en general, de

tres fases. La primera es la adquisición de espectros; la segunda consiste en la

asignación y extracción de información estructural útil y la tercera consiste en el

“modelado” de la molécula, de acuerdo con la información experimental. Estas

tres etapas no son totalmente independientes. Así, a veces puede ser necesario

realizar cálculos preliminares para ayudar en la asignación, o adquirir


experimentos en diferentes condiciones para discernir alguna restricción que

puede resultar clave en el cálculo de la/s estructura/s.

Las principales fuentes de información estructural de las que se dispone con la

técnica de RMN1 son las medidas de efecto nuclear Overhauser (NOE), las

constantes de acoplamiento escalar (3J), tanto homo- como heteronucleares, y los

desplazamientos químicos (δ) homo- y heteronucleares. Todos estos parámetros

están promediados para todas las posibles conformaciones presentes en

disolución.

Si nos centramos en los desplazamientos químicos, pese a que son

fácilmente asequibles, su relación con la estructura tridimensional es compleja, ya

que sus valores son afectados por muchos factores como son las corrientes de

anillo, efectos electrostáticos y anisotropía de enlace, entre otros. Por tanto, su

uso en determinación estructural de biomoléculas ha sido, hasta ahora, muy

limitado, y se han aplicado principalmente al estudio de proteínas. En este

sentido, los desplazamientos químicos de los aminoácidos proteicos comunes,

formando parte de pequeños péptidos sin estructura (random coil), son la

referencia básica para el análisis de las proteínas.

1 (a) Neuhaus, D.; Williamson, M. P. “The Nuclear Overhauser Effect in Structural and

Conformational Analysis”, VCH Publishers, New York, 1989. (b) Wijmenga, S. S.; Mooren, M. M. W.; Hilbers, C. W. “NMR in Macromolecules”, 1993, G. C. Robert, IRL, Press, Oxford. (c) Case, D. A.; Dyson, A. J.; Wright, P. E. “Methods in enzymology”,1994, 239C, 392-416. (d) Seip, S.; Balbach, J.; Kessler, H. J. Magn. Reson. B. 1994, 104, 172-179. (e) Haselhorst, T.; Weimar, T.; Peters, T. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10705-10714. (f) Dyson, H. J.; Wright, P. E. Annu. Rev. Biophys. Chem. 1991, 20, 519-538. (g) Marco, A.; Llinas, M.; Wuthrich, K. Biopolymers. 1978, 17, 617-636. (h) Vuister, G. W.; Bax, A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7772-7777.


La identificación de una conformación preferente en un péptido (estructuras

secundarias fundamentalmente) a partir de los desplazamientos químicos se basa

en la existencia de una diferencia apreciable entre los desplazamientos químicos

observados de cada uno de los aminoácidos en el péptido investigado y los de un

péptido de referencia sin estructura (random coil):

Δδ = (δ - δR) ppm.

Este concepto recibe el nombre de “índice de desplazamiento químico”

abreviado como CSI (las siglas de Chemical Shift Index).2

Este índice nos permite la identificación de estructuras secundarias en

péptidos teniendo en cuenta el desplazamiento químico de distintos núcleos

(1Hα, 13Cα) del esqueleto peptídico, comparándolos con los valores de referencia.

(Figura 2).

2 3. (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. J. Mol. Biol. 1991, 222, 311-333. (b)

Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry 1992, 31, 1647-1651. (c) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180. (d) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. Methods in Enzymol. 1994, 239, 363-392. (e) Wishart, D. S.; Bigam, C. G.; Holm, A.; Hodges, R. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1995, 5, 67-81. (f) Ösapay, K.; Case, D. A. J. Biomol. NMR 1994, 4, 215-230. (g) Wishart, D. S.; Nip, A. M. Biochem. Cell Biol. 1998, 76, 153-163. (h) Schwarzinger, S.; Kroon, G. J. A.; Foss, T. R.; Wright, P. E.; Dyson, H. J. J. Biomol. NMR. 2000, 18, 43-48. (i) Wishart D. S.; Case D. A. Meth. Enzymol. 2001, 338, 3-34. (j) Schwarzinger, S.; Kroon, G. J. A.; Foss, T. R.; Chung, J.; Wright, P. E.; Dyson, H. J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2970-2978. (k) Mielke, S. P.; Krishnan, V. V. J. Biomol. NMR. 2004, 30, 143–153. (l) Dyson, J. H.; Wright, P. E. Chem. Rev. 2004, 104, 3607-3622. (m) Dyson, J. H.; Wright, P. E. Methods Enzymol. 2005, 394, 299-321. (n) Avbelj, F.; Kocjan, D.; Baldwin, R. L. PNAS 2004, 101, 17394-17397. (o) Montgomerie, S.; Sundararaj, S.; Gallin, W. J.; Wishart, D. S. BMC Bioinformatics. 2006, 7, 301-314. (p) Carlisle, E. A.; Holder, J. L.; Maranda, A. M.; De Alwis, A. R.; Selkie, E. L.; McKay, S. L. Biopolymers. 2007, 85, 72-80.


Figura 6. Estructura del aminoácido serina en el que se han etiquetado

algunos átomos relevantes de este trabajo

Los pentapéptidos en forma de diamidas Ac-Gly-Gly-Xxx-Gly-Gly-NH2,

donde Xxx representa a cada uno de los 20 aminoácido protéicos, se han

propuesto como las mejores referencias por no estar influenciados por los grupos

carboxilo- o amino-terminales. Análisis estadísticos de los desplazamientos

químicos de 1H, 13C y 15N tanto de los péptidos referencia anteriores como del

gran número de proteínas asignadas en los últimos años han puesto de manifiesto

la existencia de una correlación entre el tipo de estructura secundaria (hélice α o

lámina β) y Δδ. Esta correlación permite identificar elementos de estructura

secundaria de una proteína. Por ejemplo, uno de los resultados más interesantes

que surgen de estos trabajos es el hallazgo de que los 20 aminoácidos naturales

experimentan un ΔδHα aproximado de 0.39 ppm hacia campos más altos cuando

se encuentran en conformación helicoidal. De la misma manera, se encuentra

ΔδHα químico promedio de 0.37 ppm hacia campos más bajos cuando el residuo

se dispone en conformación extendida. También se observan cambios similares

para desplazamientos químicos de 13C y 15N.

En la figura 3 se muestra la representación gráfica del CSI de un péptido

simulado con distintas estructuras secundarias, donde las hélices-α tienen valores

de CSI negativos y las láminas-β tienen valores positivos.


Figura 7. Representación del valor CSI de disitintos residuos de un péptido con la correspondiente

estructura secundaria (valores positivos dan láminas-β y valores negativos dan hélices-α)

Es importante resaltar que no existen estudios exhaustivos al respecto

para el caso de péptidos con aminoácidos no naturales, como por ejemplo los

que incorporan aminoácidos cuaternarios en sus estructuras y mucho menos para

el caso de glicopéptidos. Es más, en la bibliografía científica se han publicado

trabajos donde se aplica el protocolo de las proteínas a las glicoproteínas, con el

correspondiente error que ello conlleva. Ya que la presencia del carbohidrato

puede afectar al desplazamiento químico, por lo que es necesario profundizar en

el estudio de RMN de glicopéptidos.

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CSI


Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo del presente trabajo es la

síntesis de los tres glicopéptidos (compuestos 1, 2 y 3) representados en la figura

4 con secuencias ricas en glicinas. Con el fin de establecerlos como glicopéptidos

de referencia para la identificación de una estructura preferente en

glicoproteínas. De esta forma obtendremos los CSI de los glicosilaminoácidos

derivados de α-GalNAc, los cuales aparecen en un gran número de glicoproteínas

con interesantes propiedades biológicas, como son las mucinas y las proteínas

anticongelantes. Adicionalmente, con fines comparativos, se sintetizaron y

estudiaron también los péptidos análogos sin glicosilar (compuestos 1´, 2´ y 3´).


Figura 8. Glicopéptidos y péptidos objeto de síntesis y estudio (* = α-O-GalNAc).

2. Antecedentes

15 ANTECEDENTES

En el presente capítulo se describe la importancia de los glicopéptidos en

los procesos biológicos y su importancia estructural así como las técnicas para su

elucidación estructural y los procedimientos sintéticos más habituales para la

formación de enlaces peptídicos y glicosídicos, algunos de los cuales han sido

empleados para la obtención de los glicopéptidos objetivo de este trabajo.

Además se recoge una breve explicación de la síntesis en fase sólida, así como de

los trabajos previos y conclusiones importantes en este campo.

De entre todas las biomoléculas conocidas, las glicoproteínas son

compuestos de suma importancia biológica, están formadas por una parte

peptídica unida a un carbohidrato de naturaleza simple o compleja, mediante un

enlace denominado glicosídico.1

Figura 1. Glicoproteina MUC 1, donde la cadena peptídica se encuenta glicosilada en el

fragmento PDTR.

1 (a) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol.

Biol. 1998, 33, 151–208. (b) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683–720. (c) Angata, T.; Varki, A. Chem. Rev. 2002, 102, 439–470. (d) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317–11362. (e) Helzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495–4537. (f) Nicolaou, K. C.; Mitchell, H. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 1576–1624. (g) Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58–68. (h) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97–130.

16 ANTECEDENTES.

Existen numerosos tipos de glicoproteínas importantes, entre ellas están

las glicoproteínas anticongelantes,2 que permiten sobrevivir a temperaturas muy

bajas a muchos animales que habitan en aguas polares, ya que dichas proteínas

evitan la congelación de los fluidos de estos organismos inhibiendo el crecimiento

de cristales de hielo en su interior. Estas proteínas están siendo muy estudiadas

ya que tienen aplicaciones muy importantes, como es la mejor conservación de

células, tejidos,2c alimentos2d e incluso la destrucción de tumores.2e

Otras de las glicoproteínas de suma importancia son las mucinas, las

cuales están involucradas en diversos procesos biológicos,3 como la inflamación,

la respuesta inmunológica, la comunicación célula-célula, el crecimiento celular, la

adherencia celular y la actividad anticongelante, entre otros. Además, las mucinas

son moléculas de gran interés desde el punto de vista terapéutico,4 especialmente

en el desarrollo de vacunas para el tratamiento del cáncer.5

2 a) Chen, L.; Devries, A. L.; Cheng, C.-H. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 3817-3822; b) Tsvetkova, N. M.; Phillips, B. L.; Krishnan, V. V.; Feeney, R. E.; Fink, W. H.; Crowe, J. H.; Risbud, S. H.; Tablin, F.; Yeh, Y. Biophys. J. 2002, 82, 464-473; c)F. Tablin, A. E. Oliver, N. J. Walker, L. M. Crowe, J. H. Crowe,J. Cell Physiol. 1996, 168, 305–313; d)J. H. Wang, Cryobiology 2000, 41, 1–9; e) R. E. Feeney, Y. Yeh, Trends Food Sci. Technol. 1998, 9, 102–106; f)Y. Tachibana, G. L. Fletcher, N. Fujitani, S. Tsuda, K. Monde,S. I. Nishimura, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856–862.3 a) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720; b) Sears, P.; Wong, C.-H. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 223-252. 4 a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601; b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.; Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814; c) Lui, H.; Wang, L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703; d) Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 116, 827-833; e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482. 5 a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205; b) Moingeon, P. Vaccine 2001, 19, 1305-1326; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 836-863; d) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054; e) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630-7635; f) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16, 113R-136R; g) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488; h) Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60; i) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; j) Kim, Y. J.; Varki, A. Glycoconjugate J. 1997, 14, 569-576; k) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim. Biophys. Acta 2008, 1780, 546-563.

17 ANTECEDENTES

Atendiendo a la naturaleza del enlace glicosídico, tenemos dos grandes

grupos de glicoproteínas (figura 2):

N-Glicoproteínas: En ellas, el carbohidrato se

encuentra unido mediante un enlace N-glicosídico a un residuo

de asparragina (Asn) de la cadena peptídica.

O-Glicoproteínas: El carbohidrato se une al resto

peptídico mediante un enlace O-glicosídico con el grupo

hidroxilo de la serina (Ser) o de la treonina (Thr) de la cadena

peptídica.

Figura 2 Tipos principales de glicosilación atendiendo a su naturaleza.

Por otro lado, atendiendo a la disposición espacial del enlace glicosídico,

éste puede ser de tipo α ó β; según el enlace se encuentre en axial (α) o en

ecuatorial (β) del carbohidrato (Figura 3).

18 ANTECEDENTES.

Figura 3. Aminoácidos Ser/Thr glicosilados con N-acetilgalactosamina (GalNAc) y glucosa

(Glc) mediante un enlace α-O-glicosídico y β-O.glicosídico, respectivamente

ESTRUCTURA DE PÉPTIDOS Y GLICOPÉPTIDOS .

La actividad biológica que presentan los péptidos y proteínas está

estrechamente relacionada con su estructura tridimensional, de hecho, la

estructura terciaria de una proteína puede definirse como la conformación

tridimensional biológicamente activa. En este sentido, un péptido o proteína sólo

puede asumir un número limitado de conformaciones a pesar de que cada uno de

los residuos que componen la cadena puede adoptar, por separado, varias

conformaciones posibles.

La conformación de cada residuo es función de una serie de ángulos de

torsión. Para poder conocer la estructura de un péptido o glicopéptido es

importante conocer los ángulos diedros que son relevantes desde el punto de

vista conformacional. Así, el carbono α del aminoácido va a actuar como pivote

que conecta dos planos contiguos, teniendo cada plano la posibilidad de rotación

alrededor del enlace que lo conecta con el carbono α. El ángulo de rotación del

enlace entre el Cα y el NH se denomina , mientras que el ángulo de rotación en

torno al enlace Cα y el C=O se denomina (Figura 4).

19 ANTECEDENTES

Figura 4. Ángulos / que definen la conformación del esqueleto peptídico.

Existe un gran número de combinaciones para los valores que

pueden tomar los ángulos y , sin embargo, sólo algunas de ellas van a dar lugar

a conformaciones energéticamente favorables. En este sentido, el bioquímico G.

N. Ramachandran ideó un gráfico bidimensional para representar la conformación

de una cadena polipeptídica de una manera más intuitiva.6 En dicho gráfico se

representan los valores de los ángulos diedros y de cada uno de los residuos

que componen la cadena peptídica. En el de la figura 5 se muestra la

representación de varias conformaciones consideradas plegadas, como la hélice

α, tanto levógira como dextrógira, así como las conformaciones extendidas,

fundamentalmente láminas β y la hélice denominada poliprolina de tipo II (PPII).

Esta última, a pesar de ser una hélice, se considera extendida debido que se

asemeja a un muelle muy extendido.

6 Ramachandran, G. N.; Sasisekharan, V. Adv. Prot. Res. 1968, 23, 283-438.

20 ANTECEDENTES.

Figura 5. Diagrama de Ramachandran donde se representan las

conformaciones más habituales para los péptidos.

Este tipo de conformaciones suelen estar conectadas entre sí mediante

secuencias pequeñas de aminoácidos que a su vez muestran unas conformaciones

determinadas, denominadas giros. En función de los valores de los ángulos

diedros y de cada uno de los aminoácidos que comparten el giro, éstos se

clasifican en distintos tipos, denominados giros α, β, ɣ y fundamentalmente, si

bien los más importantes suelen ser los giros de tipo β.

hélice (levógira)

hélice (dextrógira)

Lamina β

PP II

Conformaciones extendidas

Conformaciones plegadas

21 ANTECEDENTES

Figura 6. Ejemplos de estructuras de proteínas donde aparecen Hélices α y láminas beta

conectadas mediante giros.

Por otro lado, otro factor que también va a influir en la conformación de

cada residuo y por tanto en la de los péptidos o glicopéptidos de los que forme

parte, es la disposición espacial de la cadena lateral.7 Para la cadena lateral se

define el ángulo de rotación alrededor del enlace Cα-Cβ, tal como se muestra

en la figura 7.

Figura 7. Ángulo que define la conformación de la cadena lateral.

7 (a) Hruby, V. J.; Li, G.; Haskell- Luevano, C.; Shenderovich, M. Pept. Sci. 1997, 43, 219-266; (b) Hruby, V. J.; Cowell, S. M.; Lee, Y. S.; Cain, J. P. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 2785-2789.

Hélice α Lámina β (en amarillo)

Giro

22 ANTECEDENTES.

Por último, para el caso de los glicopéptidos existe un factor

adicional a tener en cuenta. Es la disposición espacial del carbohidrato, que va a

venir dada por los dos ángulos diedros. El ángulo diedro alrededor del enlace

entre el Cβ del péptido y el O del enlace glicosídico se denomina , mientras que

el diedro entre el O del enlace glicosídico y el C anomérico del carbohidrato se

denomina (figura 8). Para no confundirlos con los ángulos diedros que definen la

conformación del esqueleto peptídico, a partir de ahora se denominarán s y s,

donde la letra ‘s’ hace referencia a sugar, y los de la parte peptídica serán p y p,

donde la letra ´p´ hace referencia a peptide.

En general s, es un enlace rígico, débil al efecto exo-anomérico. Así para

enlaces glicosídicos α toma un valor próximo a 80o, mientras que para enlaces β el

valor es próximo a -80o. Por otro lado, s suele tomar, en general, valores

próximos a 180o.

Figura 8. Ángulos s/s que definen la conformación del enlace glicosídico.

Por tanto, en resumen, se puede concluir diciendo que la estructura

secundaria de péptidos y glicopéptidos es función, en último término, de los

valores de los ángulos diedros p, p, 1, s y s.

Para conocer estos valores de los ángulos diedros p, p, 1, s y s de

los péptidos y glicopéptidos y poder determinar su estructura existen varias

23 ANTECEDENTES

técnicas. En el caso del estudio en estado sólido, la técnica más potente es la

difracción de rayos X, mientras que para el estudio en disolución, la técnica más

empleada es, además de la espectroscopia de infrarrojo o el dicroísmo circular, la

resonancia magnética nuclear (RMN), complementada con cálculos teóricos como

la dinámica molecular.

Técnicas de información estructural basadas en RMN

Las principales fuentes de información estructural de las que disponemos

con la técnica de RMN son las medidas del efecto nuclear Overhauser (NOE),8 las

constantes de acoplamiento escalar (3J), tanto homo- como heteronucleares,9 y

los desplazamientos químicos (δ) homo- y heteronucleares.10 Todos estos

parámetros están promediados para todas las posibles conformaciones presentes

en disolución.

Efecto NOE

La principal fuente de información estructural viene dada por el

denominado efecto NOE.94 El efecto NOE es el resultado del cambio observable de

la intensidad de la señal de resonancia de un núcleo debido a la transferencia de

la magnetización, a través del espacio, de un spin a otro. Es una interacción

dipolo-dipolo y como tal, depende de la distancia (r-6). La intensidad del NOE entre

dos protones está relacionada con la distancia promedio que los separa. En

general, los protones situados a más de 5 Å de distancia proporcionan una señal

demasiado débil para ser observada.

8 Neuhaus, D.; Williamson, M. P. “The Nuclear Overhauser Effect in Structural and Conformational Analysis”, VCH Publishers, New York, 1989. 9 (a) Wijmenga, S. S.; Mooren, M. M. W.; Hilbers, C. W. “NMR in Macromolecules”. 1993, G. C. Robert, IRL, Press, Oxford; (b) Case, D. A.; Dyson, A. J.; Wright, P. E. “Methods in enzymology”. 1994, 239C, 392-416; (c) Seip, S.; Balbach, J.; Kessler, H. J. Magn. Reson. B. 1994, 104, 172-179. 10 (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry. 1992, 31, 1647-1651; (b) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180.

24 ANTECEDENTES.

Existen algunos patrones NOE característicos como son los patrones NOE

secuenciales, es decir NOEs de protones de aminoácidos unidos directamente en

la secuencia peptídica, que son claves en el estudio estructural de péptidos y

proteínas.

Constantes de acoplamiento

Las constantes más fáciles de obtener son las constantes entre protones

vecinales conectados por tres enlaces (3J). Estas constantes están relacionadas

con los correspondientes ángulos diedros de torsión a través de las ecuaciones de

Karplus,11 donde los valores de las constantes se ajustan empíricamente a cada

caso particular. En el caso de las proteínas, las constantes 3JNH,Hα dan información

acerca de la conformación del esqueleto peptídico (ángulo diedro p), mientras

que las constantes 3JHα,Hβ están relacionadas con la conformación de la cadena

lateral (ángulo 1).

Figura 9. Relación entre constantes de acoplamiento

3JH,H y ángulos diedros.

11 (a) Marco, A.; Llinas, M.; Wuthrich, K. Biopolymers. 1978, 17, 617-636; (b) Vuister, G. W.; Bax, A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7772-7777.

25 ANTECEDENTES

Desplazamientos químicos

Los desplazamientos químicos de 1Hα Y 13Cα de los aminoácidos proteicos

comunes, cuando forman parte de pequeños péptidos cuya cadena polipeptíditca

no muestra estructura (random coil), son la referencia básica para cualquier

análisis espectroscópico de las proteínas. La identificación de la presencia de una

conformación preferente en un péptido a partir de los desplazamientos químicos

se basa en la existencia de una diferencia apreciable entre los desplazamientos

químicos observados de cada uno de los aminoácidos en el péptido investigado y

los de un péptido de referencia sin estructura (random coil): = (ref) ppm.

Este concepto recibe el nombre de “índice de desplazamiento químico”

abreviado como CSI (del inglés Chemical Shift Index)12 como ya se ha mencionado

en la introducción.

Finalmente, es importante señalar que el análisis de moléculas pequeñas

basado en el efecto NOE13 y en las constantes de acoplamiento escalar (J)14 es a

menudo insuficiente para determinar las preferencias conformacionales de estas

moléculas. Además, la RMN falla a la hora de describir las propiedades dinámicas,

entre las que destacan las interacciones con el agua. Así, en este caso es necesaria

la utilización de cálculos computacionales para explicar correctamente los datos

experimentales provenientes de RMN. En este sentido, la dinámica molecular

(DM) permite introducir flexibilidad a la hora de interpretar los datos

experimentales, por lo que ha sido empleada con éxito en numerosos estudios

conformacionales.15

12 (a) Wishart, D. S.; Sykes, B. D.; Richards, F. M. Biochemistry. 1992, 31, 1647-1651; (b) Wishart, D. S.; Sykes, B. D. J. Biomol. NMR. 1994, 4, 171-180. 13 Kroonbatenburg, L. M. J.; Kroon, J.; Leeflang, B. R.; Vliegenthart, J. F. G. Carbohydr. Res. 1993, 245, 21-42. 14 Bose, B.; Zhao, S.; Stenutz, R.; Cloran, F.; Bondo, P. B.; Bondo, G.; Hertz, B.; Carmichael, I.; Serianni, A. S. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11158-11173. 15 Adcock S.A.; McCammon, J. A. Chem. Rev. 2006, 106, 1589-1615.

26 ANTECEDENTES.

Estudios de dinámica molecular (DM)

La DM es una herramienta para el estudio teórico de propiedades

dinámicas de las moléculas que ha tenido un gran desarrollo en el ámbito de las

biomoléculas a partir de los años 80. Al igual que en mecánica molecular (MM),

está basada en las ecuaciones de la mecánica clásica por lo que los átomos se

consideran esferas rígidas con una carga puntual centrada y los enlaces como

muelles. De esta forma, el orden de enlace está relacionado con una constante

elástica (figura 9).16

Figura 10. En MM y DM los átomos son considerados como esferas y los enlaces como

muelles.

El aspecto más importante de la DM es el campo de fuerzas (force field en

inglés). Está formado por las ecuaciones matemáticas que describen la energía

potencial (E) del sistema en función de las coordenadas atómicas y por un

16 (a) Machida K. “Principles of Molecular Mechanics”, Kodansha/John Wiley & Sons, Tokyo/New York, 1999; (b) Haile, J. M. “Molecular Dynamics Simulation” , John Wiley and Sons, New York, 1992; (c) Alexander, D.; Mackerell, J. R. J. Comput. Chem. 2004, 25, 1584-1604.

27 ANTECEDENTES

conjunto de parámetros necesarios para describir de forma correcta dicha energía

(figura 10). Los parámetros se obtienen de datos experimentales (rayos X, IR, etc.)

o bien de cálculos ab initio.

Figura 11. Ecuación general de un campo de fuerzas donde se desglosan los distintos

términos que contribuyen a la energía potencial.

Para mejorar los resultados obtenidos con este método se combina la

RMN con los cálculos de DM, introduciéndose como restricciones los datos

experimentales disponibles de RMN

28 ANTECEDENTES.

SÍNTESIS

Formación del enlace peptídico.

El enlace peptídico se forma a partir de los grupos amina y ácido

carboxílico de los aminoácidos. Para que se dé este enlace, se necesita activar

previamente el grupo carboxilo para hacerlo más electrófilo frente al ataque

nucleófilo de la amina. 17

Para lograr dicha activación, se suelen utilizar agentes de acoplamiento,

siendo las carbodiimidas los más empleados en la síntesis de péptidos

convencional. Concretamente la N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC) fue la

primera descrita y todavía hoy sigue siendo la más popular. Sin embargo, uno de

los problemas asociados a su uso es la alta epimerización. Otra de las

carbodiimidas más empleadas es la N,N´-diisopropilcarbodiimida (DIC), debido a la

gran solubilidad de las ureas que se forman como subproductos. Cuando se

emplean las carbodiimidas como agentes de acoplamiento, se recomienda el

empleo de aditivos como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt),18 que aceleran la

reacción y reducen el riesgo de racemización. En la figura 11 se muestran las

estructuras de estos compuestos.

Figura 12. Estructura de las carbodiimidas y aditivos utilizados en la síntesis de péptidos.

17

Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537. 18

Konig, W.; Geiger, R. Chem. Ber. 1970, 103, 788-798.

29 ANTECEDENTES

En los últimos años, han surgido nuevos reactivos que funcionan como

agentes de acoplamiento y que minimizan la formación de subproductos no

deseados a la vez que reducen los tiempos de reacción, lo que hace que su

utilización se haya extendido considerablemente (Figura 12).

Figura 13. Estructura de algunas sales de fosfonio (BOP,PyBOP) y sales de uronio (HBTU,

TBTU) utilizadas como agentes de acoplamiento

La mayoría son sales de fosfonio o uronio que, en presencia de una base,

pueden convertir el carboxilato del aminoácido protegido en una especie

activada. Las más empleadas son el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris (dimetilamino)fosfonio (BOP) y el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il- N-

oxil-tris(pirrolidin)fosfonio (PyBOP),19 derivadas del HOBt. Entre las sales de

uronio se encuentran el hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-

19 Martínez, J.; Bali, J. P.; Rodríguez, M.; Castro, B.; Magous, R.; Laur, J.; Lignon, M. F. J. Med. Chem. 1985, 28, 1874-1879.

30 ANTECEDENTES.

dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio (HBTU)20 y el tetrafluoroborato de N-

óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio

(TBTU)21 entre los más comunes.

Esta metología, basada en los agentes de acoplamiento, ha sido muy

utilizada por nuestro grupo de investigación, en particular el empleo de TBTU y

HBTU, ya que se obtienen buenos rendimientos, especialmente cuando se

intentan acoplar aminoácidos que presentan Cα cuaternarios y por tanto

impedidos estéricamente. Por ello, es el procedimiento que se empleará en este

estudio para la formación del enlace peptídico (Esquema 1).

Esquema 1.

20 Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930. 21 Poulain, R. F.; Tartar, A. L.; Deprez, B. P. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1495-1498.

31 ANTECEDENTES

Otro factor que se debe tener en cuenta para la formación del enlace

peptídico es que, tanto la cadena peptídica creciente, como el aminoácido que se

desea incorporar a la misma son compuestos bifuncionales que posen un grupo

ácido y un grupo amino en sus extremos. Para asegurarnos de la formación del

enlace amida entre los grupos deseados, y evitar reacciones laterales y

polimerizaciones incontroladas, debemos bloquear o proteger convenientemente

la amina y el carboxilato que no deseamos que reaccionen. De este modo, en la

construcción de la cadena peptídica, se deben ir alternando pasos de protección,

formación de enlaces amida y desprotección, para liberar los grupos reactivos que

van a participar en la formación del siguiente enlace.

Los grupos protectores de aminas más empleados suelen ser el 9-

fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), sensible al medio básico o el terc-butoxicarbonil

(Boc), sensible al medio ácido, estos grupos dan lugar a carbamatos , fácilmente

eliminables cuando no son necesarios. Los grupos ácidos carboxílicos se protegen

comúnmente en forma de ésteres: terc-butílico (CO2tBu), alílico (CO2Allyl) ó

bencílico (CO2Bn), entre otros ejemplos.

Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, Solid-phase peptide synthesis)

En este trabajo la síntesis de péptidos se lleva a cabo en fase sólida (SPPS),

por lo que es importante hacer una breve introducción de la misma y ver qué

ventajas presenta sobre la síntesis clásica de péptidos (en disolución).

Cuando Bruce Merrifield se introdujo en el área de síntesis de péptidos, se

dio cuenta de lo extenuante y largo que significaba obtener el producto deseado,

por lo que imaginó que este proceso podría simplificarse. Así en 1963, describió

por primera vez la idea de una síntesis de péptidos en fase sólida22 (en inglés,

SPPS: solid-phase peptide synthesis) que actualmente es la manera más habitual y

sencilla de obtener péptidos. Este método se basa en la unión del aminoácido a

través del grupo carboxilo terminal a un soporte insoluble (denominado resina),

con lo cual la cadena peptídica iría creciendo anclada al soporte sólido mediante

22

Merrifield, R.B. J.Am.Chem.Soc.1963, 85, 2149-2154

32 ANTECEDENTES.

una estrategia de elongación secuencial, aminoácido tras aminoácido. Finalmente,

el producto deseado es desprendido del soporte, y su purificación y

caracterización se llevan a cabo en disolución. Esto permite que haya una rápida

filtración y lavados para deshacerse de reactivos y subproductos después de cada

etapa de síntesis, en consecuencia no habrá que purificar el producto intermedio.

El método de síntesis de péptidos en fase sólida presenta numerosas ventajas

respecto a la síntesis peptídica en disolución:

Buenos rendimientos ya que, debido a la fijación del péptido

al soporte sólido, se pueden emplear excesos de reactivos

que se eliminan fácilmente tras sencillos y rápidos procesos

de filtración y lavado. No se producen pérdidas de péptido

ya que éste está anclado al soporte sólido.

Las operaciones de lavado y filtrado son más sencillas y

susceptibles de automatización.

No hace falta purificar los productos intermedios, esto se

traduce en una reducción de tiempo y en un aumento de la

producción.

El crecimiento de la cadena peptídica siempre se da por el extremo amino

terminal mediante la adición sucesiva de aminoácidos que tienen el grupo ácido

libre, mientras que el extremo amino y las cadenas laterales están

convenientemente protegidos.

En función de los grupos protectores empleados, existen distintas

estrategias de trabajo; en este caso se ha empleado la conocida como Fmoc/tBu

que emplea el Fmoc como grupo protector temporal del grupo amino y grupos de

tipo terc-butil para la protección de las cadenas laterales de los aminoácidos.

La cadena peptídica se sintetiza sobre un soporte polimérico insoluble

(resina) por la unión del aminoácido C-terminal. El crecimiento de la cadena tiene

lugar desde el extremo carboxilo hacia el extremo amino del péptido. El conector

33 ANTECEDENTES

entre el soporte sólido polimérico y el primer aminoácido variará dependiendo del

tipo de péptido que se desee obtener (carboxilo, amida, aldehído, etc.).

Las etapas que se llevan a cabo en la síntesis en fase sólida son las

siguientes: desprotección de la resina para que quede libre el extremo amino y

pueda unirse el primer aminoácido mediante el grupo carboxilo, el extremo amino

está convenientemente protegido con Fmoc, a continuación el Fmoc se elimina

antes de la unión del siguiente aminoácido. La eliminación del Fmoc se realiza en

medio básico, con piperidina. Una vez que el grupo amino se encuentra libre, se

une al aminoácido siguiente, previa activación, al aminoácido anterior formando

el enlace peptídico. El proceso de acoplamiento requiere la activación del grupo

carboxilo del aminoácido entrante de modo que éste sea susceptible de

reaccionar con el grupo amino de la cadena de péptido creciente. Este proceso de

desprotección y acoplamiento se repite tantas veces como sea necesario hasta

completar la secuencia del péptido deseado. Una vez sintetizada la cadena

peptídica, ésta se separa del soporte polimérico y se eliminan los grupos

protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos, habitualmente en una

única etapa.

En el siguiente esquema se muestra una visión general de cómo es la

secuencia de reacciones que tienen lugar desde que se introduce la resina al

sintetizador junto con los aminoácidos hasta la obtención del péptido.

34 ANTECEDENTES.

Esquema 2- Etapas llevadas a cabo en SPPS para la obtención de un dipéptido.

Formación del enlace O-glicosídico

En las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran unidos a las

cadenas peptídicas mediante enlaces denominados glicosídicos.

En la formación de un enlace O-glicosídico pueden obtenerse dos

estereoisómeros distintos: los anómeros α y β. En general, para una silla 4C1,

35 ANTECEDENTES

presente en la mayor parte de los monosacáridos, el enlace α tiene el grupo OR

en axial, mientras que el enlace β-O-glicosídico tiene el grupo OR en posición

ecuatorial (Figura 13).

Figura 13. Anómeros y para un enlace O-glicosídico, en una silla 4C1.

El enlace O-glicosídico entre el GalNAc y el grupo hidroxilo de la L-serina o

la L-treonina muestra generalmente una configuración α. En la bibliografía ya se

han publicado varias revisiones acerca de la formación de enlaces O-

glicosídicos.1,23

A continuación, se describen algunas de las metodologías más habituales

para la formación del enlace α-O-glicosídico, con GalNAc.

Método del tricloroacetimidato

Uno de los métodos para obtener mayoritariamente el anómero α es el

desarrollado por Wong y colaboradores,24 utilizando el tricloroacetimidato como

activador para la glicosilación de un derivado de treonina. Con esta metodología

se forma el enlace -O-glicosídico en dos pasos, mejorando el rendimiento global

23

a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362; b) Boons, G. –J. Tetrahedron 1996, 52, 1095-1121; c) Davis, B. G. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 2137-2160; d) Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 2839-2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; f) Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4538. 24 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536.

36 ANTECEDENTES.

y obteniendo los anómeros y en proporción 2:1, respectivamente

(Esquema 3).

Esquema 3

Otro ejemplo en el que se obtiene mayoritariamente el anómero α a

partir de tricloroacetimidatos es el realizado por Toyokuni y col., para la serina

debidamente protegida, donde la mezcla de anómeros se separa por

cromatografía flash (esquema 4).25

Esquema 4

25 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676.

37 ANTECEDENTES

Metodología de Schmidt

Otra de las metodologías más conocidas para la obtención del enlace α-O-

glicosídico con GalNAc es la metodología de Schmidt.26,27

Este método se basa en una adición de tipo Michael, en medio básico, por

parte del grupo alcohol de serina o treonina al 2-nitro-D-galactal adecuadamente

protegido, formándose los correspondientes productos de glicosilación (esquema

5).

Esquema 5

En general, este método permite obtener mayoritariamente el anómero

, si bien, el control de la selectividad depende de la base empleada. Así, se

obtiene una alta selectividad con bases fuertes como tBuOK, mientras que las

bases tipo amina, como Et3N, favorecen la formación del anómero

Metodología de Koenigs-Knorr

El método Koenigs-Knorr es uno de los procedimientos más antiguos y

sencillos de glicosilación.28 Se basa en el empleo de haluros derivados de

26

Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. 27

Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707. 28

Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981.

38 ANTECEDENTES.

carbohidratos, como grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo

aceptor. Un ejemplo de glicosilación α, mediante la metodología Koenigs-Knorr,

es el utilizado por Liebe y Kunz en la síntesis de un antígeno asociado a tumores

(esquema 6).29

Esquema 6

Este es el procedimiento experimental que se ha empleado en el presente

trabajo para la síntesis de los building blocks que aparecen en los compuestos

sintetizados.

TRABAJOS PREVIOS

Como se ha comentado anteriormente, los parámetros más accesibles y

fácilmente medibles en RMN son los desplazamientos químicos.

Cómo se ha mostrado en numerosas revisiones,30 existen numerosos

métodos (empíricos, mecano-cuánticos, tablas de desplazamiento químico,

compuestos de referencia, gráficas de referencia…) para el análisis de casos por

RMN. Con todo este abanico de opciones no existe dificultad a la hora de elegir un

método para un caso determinado, pero sí existe dificultad en seleccionar el

correcto.

29 Liebe, B; Kunz, H. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621. 30

a) Wishart, D.S; Skyes,B.D. Methods. Enzymol. 1994, 239, 363-392; b) Old field, E. J Biomol. NMR. 1995, 5, 217-225. c) Williamson, M.P; Asakamura, T. Methods Mol. Biol, 1997, 60, 53-59.

39 ANTECEDENTES

En la literatura existen 2 tipos de tablas de desplazamientos químicos de

aminoácidos: las tablas estadísticas y las tablas experimentales. En general las

tablas experimentales son más fiables que las anteriores.

En este sentido, es importante señalar que es fundamental controlar

tanto la temperatura como el pH a la hora de determinar el desplazamiento

químico de un Aa, especialmente para aquellos casos en los que los aminoácidos

poseen grupos funcionales cargados. Además, es necesario utilizar un compuesto

como referencia externa, siendo el más empleado el propionato de trimetilsililo

(TSP).

En la siguiente tabla se muestra el trabajo desarrollado por Wishart y

colaboradores, 31 donde aparecen los desplazamientos químicos de 1Hα Y 13Cα de

los 20 aminoácidos proteicos cuando forman parte de pequeños péptidos sin

estructura definida (“random coil”) a pH= 5 y 25o C, usando a TSP como referencia

externa.

31

Wishart, D.S; Nip, A.M. Biochem. Cell. Biol . 1998, 76, 153-163.

40 ANTECEDENTES.

Tabla 1. Desplazamientos de 1Hα y

13Cα para los 20 Aa

Curiosamente, no existen trabajos en la bibliografía para el caso de

glicopéptidos. Así, las estructuras secundarias de estos compuestos son calculadas

teniendo en cuenta los valores de referencia de péptidos y el error que ello

conlleva al no tener en cuenta la parte carbohidrato en el desplazamiento

químico. Asimismo, tampoco existen trabajos acerca de péptidos con aminoácidos

no naturales, en este sentido, nuestro grupo de investigación lleva varios años

realizando la síntesis de-aminoácidos -disustituidos, tal y como aparece en

Aa 1Hα 13Cα

Cys(red) 4.55 58.2

Cys(oxd) 4.71 55.4

Asp 4.64 54.2

Glu 4.35 56.6

Phe 4.62 57.7

Gly 3.96 45.1

His 4.73 55.0

Ile 4.17 61.1

Lys 4.32 56.2

Leu 4.34 55.1

Met 4.48 55.4

Asn 4.74 53.1

Pro 4.42 63.3

Gln 4.34 55.7

Arg 4.34 56.0

Ser 4.47 58.3

Thr 4.35 61.8

Val 4.12 62.2

Trp 4.66 57.5

41 ANTECEDENTES

las recientes revisiones,32 y más concretamente de aminoácidoshidroxi-

disustituidos.33

32 a) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 3517–3599; b) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry. 2000, 11, 645–732; c) Cativiela, C.; Díaz-de-Villegas, M. D. Tetrahedron: Asymmetry. 2007, 18, 569–623; d) Vogt, H.; Bräse, S. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 406–430. 33 a) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. J. Org. Chem. 1999, 64, 8220-8225; b) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 1999, 10, 4653-4661; c) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 2000, 11, 2195-2204; d) Avenoza, A.; Cativiela, C.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 949-957; e) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Cativiela, C.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry. 2003, 14, 399-405; f) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 719-724; g) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M. Synthesis. 2005, 575-578.

3. Discusión de resultados

45 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Como ya se ha comentado en el capítulo introducción, el objetivo de este

trabajo es la síntesis de tres glicopéptidos (compuestos 1, 2 y 3) con secuencias

ricas en glicinas de la forma Ac-Gly-Gly-Xxx-Gly-Gly-NH2 donde Xxx es serina,

treonina ó -metilserina glicosilados con α-O-GalNAc, con el fin de establecerlos

como glicopéptidos de referencia para la identificación de estructuras preferentes

en glicoproteínas.

1

3 2

Figura 1. Pentapéptidos objeto de síntesis y estudio (*= α-O-GalNAc)

La estrategia sintética seguida para la obtención de los glicopentapéptidos

fue idéntica para los tres y consistió en la síntesis del building block

correspondiente, acondicionando convenientemente el carbohidrato y el

aminoácido para llevar a cabo el acoplamiento de ambos mediante la reacción de

Koenigs-Knorr.


El siguiente paso es la síntesis en fase sólida (SPPS) combinada con la

síntesis en disolución para el acoplamiento de los building blocks, para la

obtención de los glicopentapéptidos deseados.

A Síntesis de los building blocks

Los glicosil-aminoácidos 4, 5 y 6 que aparecen en la figura 2 son el

objetivo de este apartado. Éstos serán los que se empleen para la síntesis de los

glicopentapéptidos objeto de estudio.

Figura 2. Building blocks empleados en la síntesis de los compuestos 1, 2 y 3


A.1 Preparación del carbohidrato

Para la síntesis de los building blocks, el primer paso es el

acondicionamiento del carbohidrato, para ello el galactal 7 se hace reaccionar

con nitrato de cerio y amonio (CAN) y azida de sodio (NaN3) a -20o C bajo

atmósfera inerte. Esta metodología1 ha demostrado ser bastante eficaz en este

tipo derivados, ya que tras su purificación por columna cromatográfica se obtiene

el compuesto 8 con un 56% de rendimiento (Esquema 1).

Esquema 1

El compuesto 8, que se obtiene como mezcla de varios isómeros posibles,

se hace reaccionar con LiBr y se obtiene el derivado que posee el bromo en α

(Esquema 2).2 La bromoazida (compuesto 9), es sensible a la luz y a la humedad.

Esquema 2

1 a) Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244.

b) Heggemann, C.; Budke, C.; Schomburg, B.; Majer, Z.; Wißbrock, M.; Koop, T.; Sewald, N.Amino Acids. 2010, 38, 213-222. 2 Liu, M.; Young Jr, V. G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G.Carbohyd. Res. 2005, 340, 1273-

1285.


A.2 Preparación del aminoácido

Para que la reacción de acoplamiento con el carbohidrato 9 sea óptima, el

aminoácido debe acondicionarse con los grupos funcionales adecuados. En este

caso como grupos protectores se han empleado Fmoc (para el grupo amino) y el

éster terc -butílico (CO2tBu) para la protección del grupo carboxilo.

Afortunadamente, los aminoácidos adecuadamente protegidos, derivados

de serina y treonina 10 y 11, están disponibles comercialmente (Figura 3).

Figura 3. Aminoácidos derivados de serina (Ser) y treonina (Thr), adecuadamente

protegidos, empleados en la síntesis de los compuestos 1, 2 y 3.

Sin embargo, para la síntesis del building block de -metilserina

(compuesto 6), ha sido necesaria la síntesis previa del aminoácido no natural

mediante la metodología descrita por nuestro grupo de investigación.3 Asimismo,

se han protegido los grupos amino y carboxilo en forma de carbamato (Fmoc) y

éster terc-butílico (CO2tBu),4 respectivamente (Esquema 3).

3 a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M.

Synthesis 2005, 575-578. b) Aydillo, C.; Avenoza, A; Peregrina J.M; Busto, J.H; Zurbano, M.M; Jiménez Osés, G. Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840-4848 4 Schultz, M; Kunz, H. Tetrahedron: Asymmetry. 1993, 4, 1205-1220


Esquema 3

A.3. Acoplamiento mediante koenigs-Knorr

Una vez obtenido el producto 9, se sigue la metodología descrita por

Koenigs-Knorr5 que emplea haluros de plata para que la reacción con los

compuestos 10, 11 y 12 tenga lugar con un rendimiento aceptable, como se

ilustra en el Esquema 4, obteniéndose el precursor del building block 4.

5 a) Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber.1901, 34, 957-981; b) Liebe, B.; Kunz, H. Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.


Esquema 4. Reacción de Koenigs-Knorr

A continuación, es necesario transformar la azida del carbohidrato a

amina para posteriormente acetilarla. El primer paso se realiza con Zn/HCl y AcOH

en mezcla de agua y THF a 0 oC,6 desechando dos métodos que antes se habían

empleado y fueron menos eficaces dando rendimientos más bajos (disolución de

trifenilfosfina 1M en agua7 ó ácido tioacético para reducir y acetilar en un solo

paso8).

Finalmente, el tratamiento de la amina resultante con anhídrido acético y

piridina, seguido de una posterior etapa de desprotección del grupo ácido con TFA

y CH2Cl2,permiten obtener el compuesto 4. Después de realizar una purificación

por columna cromatográfica se consigue aislar dicho compuesto con un

rendimiento del 64 % (Esquema 5).

6 Geiger, J.; Reddy, B.G.; Winterfeld, G.A.; Weber, R.; Przbylski, M.; Schmidt, R.R. Journal of

Organic Chemistry.2007, 72, 4367-4377 7 Avenoza, A.; Peregrina, J. M.; San Martín, E.Tetrahedron Lett.2003, 44, 6413-6416.

8 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.


Esquema 5.

El producto 4 es el building block adecuado para obtener el

glicopentapéptido 1.

Los productos 5 y 6 (Building blocks de Ser y MeSer, repectivamente) se

sintetizaron del mismo modo que el producto 4. En el Esquema 6 se muestra un

resumen de la síntesis de los 3 building blocks, junto con los rendimientos

obtenidos.


Esquema 6. Ruta sintética para la obtención de los glicosilaminoácidos 4, 5 y 6

B Síntesis en fase sólida (SPPS) automática y manual

Una vez obtenidos los building blocks (compuestos 4, 5 y 6), el siguiente

paso es la construcción del esqueleto peptídico mediante SPPS al que

posteriormente se acoplará el building block mediante la síntesis manual, también

en fase sólida. La finalidad es mejorar el rendimiento en el acoplamiento,

utilizando en este caso un menor número de equivalentes.

En el capítulo anterior se ha explicado la metodología de SPPS de un

modo ilustrativo ahora se aborda desde un punto de vista más práctico.


Una de las etapas clave en la síntesis en fase sólida es la elección de la

resina ya que, por un lado, determina cómo se va a obtener el extremo C-terminal

(en nuestro caso –CONH2) y, por otro, condiciona la etapa de cleaveage

(liberación del péptido) que en la mayoría de los casos desprotege

simultáneamente las cadenas laterales de los aminoácidos. El paso siguiente es la

activación de la resina, esto consiste en la liberación del grupo protector del grupo

amino, en nuestro caso –Fmoc, con piperidina (base) en DMF y así tener

preparada la resina para acoplar el primer aminoácido.

Figura 4. Resina utilizada en SPPS (Rink Amide MBHA resin, Novabiochem®)

A continuación, siguiendo la estrategia de Fmoc/tBu, se añade la glicina,

que es el primer aminoácido que se quiere acoplar, con el grupo amino protegido

en forma de –NHFmoc. Para que la unión sea efectiva se añade HBTU como

agente de acoplamiento y diisopropiletilamina (DIEA) como base en

dimetilformamida (DMF) como disolvente. Hay que tener en cuenta que se

trabaja con 10 equivalentes de amina por cada equivalente de resina.

Seguidamente, para que el proceso continúe, hay que desproteger el

grupo N-terminal de forma análoga a la desprotección de la resina.

El proceso de acoplamiento y desprotección de Fmoc se repite tantas

veces como aminoácidos se acoplen; en nuestro caso, sintetizamos previamente

un dipéptido de glicinas se repetirá dos veces este ciclo.

Posteriormente, se lleva a cabo el acoplamiento del building block de

forma manual. Para ello se disuelven 0,3 equivalentes de building block en 1mL de

DMF y se añaden 114mg (0,3 equivalentes) de HBTU y 1mL de DIEA, se deja


agitando durante media hora a temperatura ambiente. A continuación, el

dipéptido obtenido en fase sólida (Gly-Gly-resina) se trata con esta disolución y se

deja agitando suavemente a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, el

tripeptido unido a la resina se pasa nuevamente al sintetizador, uniendo en éste y

de forma automatizada las dos glicinas restantes.

De este modo tendríamos sintetizado nuestro glicopentapéptido con el

extremo N-terminal en forma de amina. Posteriormente, se procede a la

acetilación del último residuo con anhídrido acético y piridina (figura 5).

Figura 5. Acetilación del último residuo de la cadena peptídica

Finalmente, se procede a la liberación o cleavage del péptido de la resina

mediante la combinación de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano (TIS) y agua

(Figura 6). Después se añade éter frío y precipita el péptido que posteriormente se

purificará por HPLC.

Figura 6. Proceso de liberación del (Glico)péptido ( Cleavage).

Al introducir el building block como glicosil-aminoácido, los grupos hidroxilo del

carbohidrato están protegidos en forma de acetatos, esto implica una etapa extra de

liberación de los mismos con una mezcla de MeO-/MeOH que se añade antes de la

purificación del péptido.


En el apartado Experimental se encuentra explicado detalladamente el proceso

para cada uno de los glicopéptidos sintetizados de este trabajo. El esquema de la síntesis

de estos compuestos se refleja a continuación (Esquema 9).


Esquema 9. Estrategia sintética de obtención de los glicopentapéptidos


Finalmente se sintetizaron los 3 péptidos siguiendo la metodología SPPS

(para el caso de los compuestos 1´ y 2´) y para el compuesto 3´ se combinó la

metología SPPS con el acoplamiento del aminoácido no natural fuera del

sintetizador.

En el siguiente esquema se muestra la síntesis de 3´, donde el

acoplamiento del aminoácido no natural α-MeSer se realiza fuera del sintetizador.

Esquema 10. Estrategia sintética de obtención del péptido 3´


Determinación del desplazamiento químico

Para determinar el desplazamiento químico de los 1H y 13C de los

aminoácidos L-Thr, Ser y (S)-MeSer, cuando éstos forman parte de los péptidos o

glicopéptidos sintetizados, estos compuestos se disolvieron en agua deuterada, se

ajustó el pH a 5.2, se utilizó TSP como referencia externa y se realizaron los

correspondientes experimentos de RMN.

A partir de los espectros de RMN de 1H y 13C de los compuestos objeto de

este estudio, se obtuvieron los datos de desplazamiento químico de 1Hα y 13Cα y

se compararon con los datos bibliográficos.9

En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos:

COMPUESTO 1Hα 13Cα 1Hα 13Cα

1 4.65 60.50 -- --

2 4.71 * -- --

3 -- 62.86 -- --

1´ 4.41 62.40 4.35 61.8

2´ 4.50 58.38 4.47 58.3

3´ -- 63.45 -- --

Tabla 1. Tabla de resultados obtenidos, en rojo se muestran los resultados bibliográficos

En vista a los resultados obtenidos, se observa que los desplazamientos

químicos de 1Hα y 13Cα de los compuestos glicosilados (1, 2 y 3) difieren de sus

análogos sin glicosilar (1´, 2´ y 3´) y de los expresados en la bibliografía.

Este hecho sugiere que en aquellas ocasiones en las que se ha

determinado la estructura de glicoproteínas mediante el método CSI para

aminoácidos Ser y Thr glicosilados, se ha incurrido en errores. Así, para obtener el

valor adecuado de CSI, habría que haber restado de estos nuevos valores y no de

9 Wishart, D.S; Nip, A.M. Biochem. Cell. Biol. 1998, 76, 153-163.


los tabulados en la bibliografía; ya que no se estaba teniendo en cuanta el efecto

del carbohidrato sobre la conformación de la cadena peptídica.

Por tanto, se proponen estos nuevos valores como referencia para el

cálculo de CSI, al menos para el caso de proteínas glicosiladas con carbohidratos

que presenten enlaces α-O-glicosídicos.

Como continuación lógica de estas investigaciones y ya fuera del ámbito

de este Trabajo de Fin de Máster, en el futuro se estudiará el análisis

conformacional de los 6 péptidos presentados. Para ello, se hará uso de la DM y

de la RMN, especialmente de los datos proporcionados por los experimentos de

tipo NOESY.

4. Conclusiones

63 CONCLUSIONES

Se ha llevado a cabo la síntesis de los glicopentapéptidos (compuestos 1,

2 y 3) así como sus análogos sin glicosilar (compuestos 1´, 2´ y 3´)( Figura 1).

La síntesis de los glicopentapéptidos se ha realizado mediante una

metodología en fase sólida donde el primer paso ha sido la preparación del

building block a partir del carbohidrato GalNAc y el aminoácido correspondiente,

usando la reación de Koenigs-Knorr. Posteriormente, se llevó a cabo la síntesis en

fase sólida y el building block se incorporó fuera del sintetizador automático de

péptidos empleando HBTU como agente de acoplamiento y DIEA como base. Para

los péptidos no glicosilados la síntesis se ha llevado a cabo usando la metodología

en fase sólida.

Figura 1. Glicopéptidos y péptidos objeto de síntesis y estudio (* = α-O-GalNAc).

64 CONCLUSIONES

Todos los compuestos que aparecen en la Figura 1 fueron caracterizados

por técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y análisis de masas. Asimismo, se

ha determinado experimentalmente los desplazamientos químicos de 1Hα y 13Cα.

5. Experimental

67 EXPERIMENTAL

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se realizaron en un

espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los

desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes

de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo,

con TMS como referencia interna y agua deuterada, con TSP como referencia

externa.

Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se

realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización

ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.

La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel

(Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz

ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido

fosfomolíbdico en etanol.

La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06

mm (230-240 mesh).

Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes secos.

La síntesis en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Model

433A Peptide Synthesizer de Applied Biosystems, cuyo tratamiento de datos se

hizo con el software SynthAssist 2.0.

68 EXPERIMENTAL

Nitrato de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi--D-galactopiranosa (8)

Se añaden en un schlenk nitrato de cerio y amonio (30.20 g, 55.1 mmol)

y azida de sodio (1.90 g, 27.5 mmol) bajo atmósfera inerte a -20 °C. Se adiciona

gota a gota una disolución de tri-O-acetil-D-galactal (5.00 g, 18.6 mmol),

compuesto 7, en CH3CN seco (50 mL) dejándose 10 h en agitación. Se extrae con

éter (50 mL) y con H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con

Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de

columna sobre gel de sílice [hexano/AcOEt (6:4)] obteniéndose el compuesto 8

(3.2 g, 56.40%) como un aceite amarillo. Sus propiedades físicas y datos

espectroscópicos son idénticos a los descritos en la bibliografía.1

1 Liu, M.; Young Jr., V.G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G. Carbohydrate Research. 2005, 340,

1273-1285

69 EXPERIMENTAL

-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-bromo-2-desoxigalactosa (9)

Se hace reaccionar bajo atmósfera inerte y durante 8 h una disolución

del compuesto 8 (3.8 g, 6.68 mmol) en CH3CN seco (50 mL) con LiBr (2.90 g, 33.4

mmol). Se añade CH2Cl2 (100 mL) y H2O (50 mL), extrayéndose la fase orgánica con

H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se

filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel

de sílice en [hexano/AcOEt (1:1)] obteniéndose el compuesto 9 (3.4 g, 85%) como

un aceite amarillo. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos

a los descritos en la bibliografía.1

70 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (13)

Se añade el compuesto 10 (1.22 g, 3.04 mmol) y tamiz molecular a una

disolución de tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL), bajo atmósfera de argón, y la mezcla

se agita durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (922.74 mg,

3.35 mmol) y AgClO4 (81.15 mg, 0.393 mmol), manteniéndose la agitación durante

1 h. Se añade el compuesto 9 (1.2 g, 3.04 mmol) disuelto en una mezcla de

tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de

diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100

mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4

anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de

sílice [Tolueno/AcOEt (8:2)], obteniéndose el compuesto 13 (954 mg, 44%) como

una espuma blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son

idénticos a los descritos en la bibliografía.2

2 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.

71 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr(-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (4)

En un baño a 0 oC se disuelve el compuesto 13 (954 mg, 1.34 mmol) en

100 mL de THF, a continuación se añaden 40 mL de H2O, 4 mL de HCl y 24 mL de

AcOH. Seguidamente se añade Zn en polvo (2,11 g, 32.21 mmol), la mezcla se

agita durante 2h y el exceso de Zn se elimina por filtración. Se diluye la mezcla de

reacción con CH2Cl2 y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 y H2O hasta que el pH

de la fase acuosa quede neutro. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se

filtra y se evapora, obteniéndose el compuesto 16. Después se añade Ac2O (3 mL)

y piridina (6 mL) se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por

cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt: Hexano (8:2)]. Finalmente, se añade TFA

(2.5 mL) en CH2Cl2 (2.5mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de

éter dietílico, obteniéndose el compuesto 4 (0.590 g, 70%) como un sólido

blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los

descritos en la bibliografía.2

72 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (14)

Se añade el compuesto 11 (2.04 g, 5.32 mmol) y tamiz molecular a una

disolución de tolueno (15 mL) y CH2Cl2 (25 mL), bajo atmósfera de argón, y la

mezcla se agita durante 1 h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (1.61

g, 5.86 mmol) y AgClO4 (142 mg, 0.685 mmol), manteniéndose la agitación

durante 1 h. Se añade el compuesto 9 (2.1 g, 5.33 mmol) disuelto en una mezcla

de tolueno/CH2Cl2 1:1 (50 mL). Después de 8h, se filtra en tierra de diatomeas, se

evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100 mL) y H2O (2 x

100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y

se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice [hexano/AcOEt

(6.5:3.5)], obteniéndose el compuesto 14 (1.76 g, 47%) como una espuma

blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los

descritos en la bibliografía . 2

73 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser(-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (5)

En un baño a 0 oC se disuelve el compuesto 14 (1.76 g, 2.53 mmol) en

250 mL de THF, a continuación se añaden 75 mL de H2O, 7.6 mL de HCl y 45.5 mL

de HAcO. Seguidamente se añade Zn en polvo (4 g, 60.63 mmol), la mezcla se




filtra y se evapora, obteniéndose el compuesto 17. Después se añade Ac2O (6 mL)

y piridina (12 mL), se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por

cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt: Hexano (8:2)]. Finalmente, se añade TFA

(2.5 mL) en CH2Cl2 (2.5mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de

éter dietílico, obteniéndose el compuesto 5 (1.16g, 75%) como un sólido blanco.

Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la

bibliografía.2

74 EXPERIMENTAL

Fmoc-(S)-MeSer-O

tBu (12)

Se parte de α-MeSer (1.32 g, 11.08 mmol), sintetizada siguiendo la

metodología descrita por nuestro grupo de investigación,3 se añade NaHCO3

(2.33g, 27.70 mmol) y 50 mL de H2O y se comprueba que el pH sea básico. A

continuación se añaden 100 mL de CH3CN y FmocOSuc (5.61 g, 16.62 mmol). La

disolución se mantiene en agitación y calentamiento a 35 oC durante 2 días. Se

evapora el CH3CN, se hacen extracciones con éter y la fase acuosa se acidifica con

HCl, hasta pH neutro y se hacen extracciones con CHCl3/ iPrOH. La fase orgánica se

seca, y se evapora obteniéndose un sólido blanco (2.177g, 60%). Este sólido se

adiciona disuelto en CH2Cl2 seco bajo atmósfera inerte sobre una disolución de

DCC (4.863 g, 23.53 mmol), CuCl (52.3 mg, 0.523 mmol) y tBuOH (2.85 mL, 30.338

mmol) que había estado bajo agitación y atmósfera inerte durante 5 días.4 Se deja

bajo agitación durante 4 h. Se filtra con diatomeas y se hacen extracciones con

NaHCO3 (3x50 mL). Se seca la fase orgánica con Na2SO3 anhidro y se evapora. El

residuo corresponde al compuesto 12 (950 mg, 38 %) y se utiliza en la siguiente

reacción sin purificación previa.

3 a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Corzana, F.; Peregrina, J. M.; Sucunza, D.; Zurbano, M. M.

Synthesis 2005, 575-578. b) Aydillo, C.; Avenoza, A; Peregrina J.M; Busto, J.H; Zurbano, M.M; Jiménez Osés, G. Chem Eur J. 2007, 13, 4840-4848 4 Schultz, M; Kunz, H. Tetrahedron: Asymmetry. 1993, 4, 1205-1220

75 EXPERIMENTAL

Fmoc-(S)-MeSer(-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (15)

Se añade el compuesto 12 (950 mg, 2.39 mmol) con tamiz molecular,

tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL) bajo atmósfera de argón y la mezcla se agita

durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (750.30 mg, 2.65

mmol) y AgClO4 (64.24 mg, 0.309 mmol), manteniéndose la agitación durante 1 h.

Se añade el compuesto 9 (950 g, 2.41 mmol) disuelto en una mezcla de

tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de

diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100

mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4

anhidro, se filtra y se evapora. El residuo corresponde al compuesto 15 (672mg,

40%) como una espuma blanquecina y se utiliza en la siguiente reacción sin

purificación previa.

76 EXPERIMENTAL

Fmoc-(S)-MeSer(-O-D-tri-O-acetil- N-acetilgalactosaminil)-tBu (6)

En un baño a 0 o C se disuelve el compuesto 15 (672m g, 0.942 mmol) en

75 mL de THF, a continuación se añaden 30 mL de H2O, 3 mL de HCl y 18 mL de

HAcO. Seguidamente, se añade Zn en polvo (1.48 g, 22.69 mmol), la mezcla se




filtra y se evapora, obteniénsose el compuesto 18. Después se añade Ac2O (2 mL)

y piridina (4 mL) se deja reaccionar durante 2 h, se evapora y se purifica por

cromatografía sobre gel de sílice [AcOEt : hexano (8:2)]. Finalmente se añade TFA

(2 mL) en CH2Cl2 (2 mL), se agita durante 1 h y se evapora el TFA con ayuda de

éter dietílico, obteniéndose el compuesto 6 (355mg, 55 %) como un sólido

blanco.

77 EXPERIMENTAL

Procedimiento general para la obtención de péptidos y glicopentapéptidos por

SPPS.

En el reactor tipo Vessel del sintetizador automático de péptidos se

introduce la resina Rink Amide MBHA de Novabiochem® (178 mg, 0.1 mmol de

NH2). En los diferentes cartuchos se introduce 1 mmol del correspondiente

aminoácido o glicosil-aminoácido convenientemente protegidos.

El proceso se inicia lavando la resina con una disolución al 22% de

piperidina en N-metilpirrolidona (NMP) durante 10 minutos. Posteriormente, el

equipo expulsa el cartucho de iniciación y añade al reactor el del primer

aminoácido junto con DIEA (1 mL), HBTU (3.4 mg) y DMF (2 mL). Después de 10

min, hace lavados sucesivos con piperidina (1 mL) y DMF (3 mL) durante 30 min.

El proceso continúa con la expulsión del cartucho cogiendo el siguiente,

repitiéndose el proceso tantas veces como (glicosil) aminoácidos haya para

acoplar. Cuando se opera con un glicosil-aminoácido, el tiempo de acoplamiento

se eleva a 60 min. En este trabajo el acoplamiento del glicosil-aminoácido se ha

realizado fuera del reactor, para ello en primer lugar se retira la resina del reactor

y se introduce en un tubo de plástico. A continuación en un matraz se disuelven

0.3 equivalentes del glicosil-aminoácido en 1mL de DMF, se le añaden 114 mg (0.3

equivalentes de HBTU) como agente de acoplamiento y 1mL de DIEA, pasada

media hora de agitación se añade al tubo de plástico con la resina y se deja bajo

agitación 4 horas.

Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y con CH2Cl2 y se

introduce de nuevo al reactor, repitiendo el proceso de acoplamiento dentro del

sintetizador automático.

78 EXPERIMENTAL

Por último, se retira la resina del reactor y se introduce en un tubo de

plástico añadiéndose piridina (1 mL) y Ac2O (2 mL) manteniéndose la agitación

durante 2 h. A continuación, se filtra y se lava con DMF y CH2Cl2.

Seguidamente, se añade TFA (1.90 mL), TIS (50 L) y H2O (50 L) y se

deja agitando durante 2 h. Transcurrido este tiempo, se añade éter frío a la

mezcla, observándose la precipitación del péptido. Seguidamente, se filtra

lavándose con éter. El sólido se desecha y se lava con H2O, recogiéndose esta

disolución acuosa para obtener, tras la purificación por HPLC semipreparativo, el

péptido o glicopéptido deseado.

Si se trata de un glicopéptido, antes de la purificación se añade MeOH (2

mL) y una mezcla 0.5 M en MeO-/MeOH (1 mL) en agitación durante 1h. A

continuación, se añade resina Dowex®, que previamente ha sido lavada con DMF

y CH2Cl2, hasta que se comprueba que el pH es neutro. Finalmente, se filtra y se

lava con H2O, obteniéndose el glicopéptido tras su evaporación.

En la Imagen 1 se puede observar el modelo utilizado para llevar a cabo

la SPPS así como las diferentes partes y reactivos de las que dispone.

79 EXPERIMENTAL

Imagen 1. Fotografía del dispositivo instrumental Model 433A Peptide Synthesizer de Applied

Biosystems, utilizado para la síntesis de péptidos en el presente trabajo.

80 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil-glicinil-L-treoninil(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-

glicinamida (1)

Ac-Gly-Gly-L-Thr(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2

Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS, se

introduce en dos cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), seguidamente se acopla

el building block de Thr (compuesto 4) (189 mg, 0.3 mmol) fuera del sintetizador

usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y DIEA (1 mL)

durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y se introduce

de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol).

Posteriormente se realizan los pasos de acetilación, liberación de la resina

(cleveage) y desprotección de los acetatos, obteniéndose el glicopéptido 1 que

se purifica por HPLC semipreparativo.

HRMS (ESI) (m/z) 592.2676 [M+H]+; calculado C22H37N7O12 +: 592.2587 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.30 (d, 3H, CH3 Thr), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 3.75-3.79 (m, 2H, 2H6S), 3.89-4.13 (m, 12H, 4 CH2 Gly, H2S, H3S, H4S, H5S), 4.38-4.52 (m, 1H, Hβ Thr), 4.65 (d, 1H, J = 2.2 Hz, Hα Thr), 4.96 ( d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S). 13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 20.31 (CH3 Thr), 24.4, 24.75 (2 CH3CO), 44.88, 45.2, 45.5 (4CH2 Gly), 52.77 (C2S), 60.5 (Cα Thr), 64.1 (C6S), 70.46 (C3S), 71.45 (C4S), 74.29 (C5S), 78.12 (Cβ Thr), 101.68 (C1S), 173.69, 174.36, 174.97, 175.34,177, 177.98 (7 CO)

81 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil-glicinil-L-serinil(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-

glicinamida (2)

Ac-Gly-Gly-L-Ser(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2



el building block de Thr (compuesto 5) (185 mg, 0.3 mmol) fuera del sintetizador

usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y DIEA (1 mL)

durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y se introduce

de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol).

Posteriormente se realizan los pasos de acetilación,liberación de la resina


se purifica por cartucho C18.

HRMS (ESI) (m/z) 600.2350 [M+Na]+; calculado C21H35N7O12 Na+: 600.2344

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 2.04 (s, 3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 3.69-

4.07 (m, 15H, 4CH2 Gly, 2Hβ Ser, H3S, H4S, 2H6S, H5S), 4.13-4.28 (m, 1H, H2S), 4.71 (m,

1H, Hα Ser), 4.90 (d, 1H, J< 3 Hz, H1S).

*falta 13C

82 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil-glicinil-(S)-MeSer(-O-D-N-acetilgalactosaminil)-glicinil-

glicinamida (3)

Ac-Gly-Gly-(S)-MeSer(-O-D-GalNAc)-Gly-Gly-NH2



el building block de MeSer (compuesto 6) (189 mg, 0.3 mmol) fuera del

sintetizador usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y

DIEA (1 mL) durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y

se introduce de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg,

1mmol). Posteriormente se realizan los pasos de acetilación,liberación de la resina


se purifica por HPLC semipreparativo.

HRMS (ESI) (m/z) 592.2695 [M+H]+; calculado C22H37N7O12 +: 592.2587 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.54 (s, 3H, CH3 α-MeSer), 2.06 (s, 3H, COCH3), 2.07

(s, 3H, COCH3), 3.57-4.07 (m, 15H, 4CH2 Gly, 2H6S, H3S, H4S, H5S), 4.12-4.23 (m, 1H,

H2S), 4.90 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S)

13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 22.93 (CH3 MeSer), 24.37 (COCH3), 24.90 (COCH3), 45.17, 45.66, 45.75, 45.97 (4CH2 Gly), 52.72 (C2S), 62.86 (Cα MeSer), 64.31 (C6S), 70.37 (C3S), 71.58 (C4S), 73.2 (Cβ MeSer), 74.45 (C5S), 100.61 (C6S), 174.29, 175.27, 175.64, 176.92, 177.60, 177.98 (7 CO).

83 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil-glicinil-L-treoninil-glicinil-glicinamida (1´)

Ac-Gly-Gly-L-Thr-Gly–Gly-NH2

Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS,

se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1

mmol), Thr(OtBu)-Fmoc (341 mg, 1 mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol) y Gly-Fmoc

(297 mg, 1 mmol) . Finalmente, tras los pasos de acetilación y liberación de la

resina (cleaveage) se obtiene el péptido 1´ que se purifica por HPLC

semipreparativo.

HRMS (ESI) (m/z) 411,1584 [M+Na]+; calculado C14H24N6O7 Na+: 411,17

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.23 (d, 1H, J= 6.4 Hz, CH3 Thr), 2.07 (s, 3H,

COCH3), 3.84-4.10 (m, 8H, 4CH2 Gly), 4.24-4.35 (m, 1H, Hβ Thr), 4.41 (d, 1H, J = 3.9 Hz,

Hα Thr)

13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 21.90 (CH3 Thr), 24.91 (COCH3), 44.49, 45.97 (4

CH2 Gly), 62.4 (Cα Thr), 69.95 (Cβ Thr), 174.98, 175.66, 177.31, 178.29 (5 CO).

84 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil -glicinil-L-serinil-glicinil-glicinamida (2´)

Ac-Gly-Gly-L-Ser-Gly–Gly-NH2

Siguiendo la metodología general para la síntesis de péptidos en SPPS,

se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1

mmol), Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol) y Gly-

Fmoc (297 mg, 1 mmol) . Finalmente, tras los pasos de acetilación y liberación de

la resina (cleaveage) se obtiene el péptido 2´ que se purifica por HPLC

semipreparativo.

HRMS (ESI) (m/z) 397,1427 [M+Na]+; calculado C13H22N6O7 Na+:397,15

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 2.08 (s, 3H, COCH3), 3.83-4.08 (M, 10H, 4CH2 Gly,

2Hβ Ser), 4.50 (t, 1H, J = 5.0 Hz, Hα Ser).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 24.38 (COCH3), 44.33, 45.13 (4 CH2 Gly), 58.38 (Cα

Ser), 63.42 (Cβ Ser), 173.79, 174.28, 175.08, 176.30, 177.59 (5 CO).

85 EXPERIMENTAL

N-Acetil-glicinil-glicinil-(S)-MeSer-glicinil-glicinamida (3´)

Ac-Gly-Gly-(S)-MeSer-Gly–Gly-NH2



el aminoácido no natural de α-MeSer (compuesto 12) (189 mg, 0.3 mmol) fuera

del sintetizador usando HBTU (114 mg, 0.3 mmol) como agente de acoplamiento y

DIEA (1 mL) durante 4 h. Pasado este tiempo, se lava la resina con DMF y CH2Cl2 y

se introduce de nuevo al reactor y se introduce en 2 cartuchos Gly-Fmoc (297 mg,

1mmol). Finalmente, se realizan los pasos de acetilación y liberación de la resina

(cleaveage) para obtener el compuesto 3´ que se purifica por HPLC

semipreparativo.

HRMS (ESI) (m/z) 411,1609 [M+Na]+; calculado C14H24N6O7 Na+: 411,17

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm) 1.45 (s, 3H, CH3 MeSer), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.07

(COCH3), 3.90-4.16 (m, 10H, 4 CH2 Gly, 2Hβ MeSer).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm) 21.92 (CH3 MeSer), 24.575 (COCH3), 44.14, 45.50,

45.80 (4 CH2 Gly), 63.45 (Cα MeSer), 67.01 (Cβ MeSer), 173.95, 174.93, 176.96, 177.27,

178.32 (5CO).

6. Anexo: Espectros de Resonancia

Magnética Nuclear

89 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

A continuación se presentan los espectros de RMN 1D y 2D de los

productos glicosilados (1, 2, 3) y sus análogos sin glicosilar (1´, 2´, 3´).

Los espectros de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y representados

con el software MestreNova (5.2).


1H RMN 400 MHz en D2O

13

C RMN 100 MHz en D2O

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180

f1 (ppm)

- 0 . 0 0

2 0 . 3 5

2 4 . 3 5

2 4 . 8 8

4 4 . 2 0

4 5 . 2 3

4 5 . 6 9

5 2 . 5 1

6 0 . 2 8

6 4 . 2 8

6 9 . 8 3

7 1 . 1 0

7 4 . 1 1

7 8 . 3 9

1 0 1 . 0 0

1 7 3 . 8 1

1 7 4 . 3 0

1 7 4 . 5 9

1 7 5 . 3 3

1 7 7 . 8 5


COSY en D2O

HSQC en D2O

1.2 1.

4 1.6 1.

8 2.0 2.

2 2.4 2.

6 2.8 3.

0 3.2 3.

4 3.6 3.

8 4.0 4.

2 4.4 4.

6 4.8 5.

0 5.2 5.

4 5.6 5.

8

20

40 50 60 70 80 90 100

f 1 ( p m

0.5 1.

0 1.5 2.

0 2.5 3.

0 3.5 4.

0 4.5 5.

0 5.5 6.

0 6.5 7.

0 7.5 f2

(ppm)

1

2

3

4

5

6

7

8

f 1 ( p p m )



COSY en D2O

*Falta HSQC y 13C

1.

5 1.

7 1.

9 2.

1 2.

3 2.

5 2.

8 3.

0 3.

2 3.

4 3.

6 3.

8 4.

0 4.

2 4.

4 4.

6 4.

8 5.

0 5.

2 f1 (ppm)

5 . 5 0 1 5 . 0 0

1 . 0 7 1 . 0 8

1 . 0 4

2 . 0 5 2 . 0 6 3 . 7 4 3 . 7 5 3 . 8 6 3 . 9 1 3 . 9 3 3 . 9 5 3 . 9 8 4 . 0 1 4 . 0 2 4 . 0 4 4 . 7 0 4 . 7 9 4 . 9 0



13


0 1

0 20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200 f1

(ppm)

0 . 4 8 2 3 . 2 7

2 4 . 9 5

2 5 . 7 8

4 4 . 9 3

4 5 . 4 8

5 3 . 6 6

6 2 . 6 3

6 4 . 0 6

7 0 . 8 0

7 1 . 6 8

7 4 . 7 2

1 0 0 . 5 9

1 7 4 . 6 3

1 7 5 . 1 9

1 7 5 . 7 2

1 7 7 . 4 0

1 7 8 . 0 0

1 7 8 . 2 7

-0.4

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2 f1

(ppm)

3 . 1 6

5 . 3 1

1 5 . 0 0

1 . 0 9

1 . 0 4

0 . 0 0

1 . 5 5

2 . 0 6

2 . 0 7

3 . 7 7

3 . 7 9

3 . 9 1

3 . 9 5

3 . 9 7

3 . 9 9

4 . 1 5

4 . 1 8

4 . 8 1

4 . 9 1


COSY en D2O

HSQC en D2O



13



COSY en D2O

HSQC en D2O

0.6 0.8 1.0 1.2 1.

4 1.6 1.8 2.0 2.

2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.

2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.

2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.

2 f2 (ppm)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

f 1 ( p p m )



13C RMN 100 MHz en D2O


COSY en D2O

HSQC en D2O



13


-0.4 -

0.2 0.0 0.

2 0.4 0.

6 0.8 1.

0 1.2 1.

4 1.6 1.

8 2.0 2.

2 2.4 2.

6 2.8 3.

0 3.2 3.

4 3.6 3.

8 4.0 4.

2 4.4 4.

6 4.8 5.

0 f1 (ppm)

2 . 1 6 3 . 0 0 1 0 . 2 0

0 . 0 0 1 . 4 7 2 . 0 7 3 . 7 8 3 . 8 0 3 . 8 5 3 . 9 4 3 . 9 5 3 . 9 9 4 . 0 0 4 . 0 5 4 . 8 1


COSY en D2O

HSQC en D2O

Documents

Síntesis de pentapéptidos glicosilados de interés estructural