Šiuolaikinės molekulinės biologijos tyrimo metodai

D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.

Naujausi mokslini pasiekim biotechnologijos srityje mokslin studija Daiva Ambrasien

VADAS

iuolaikin molekulin biologija gali pasilyti daug ir vairi genomo tyrim metod,

tinkam vis taksonomini grupi organizm DNR genetinei analizei. Molekuliniai metodai sudaro

puikias galimybes vairi ri augal, gyvn, gryb bei mikroorganizm genetini pas

sukrimui. Genetinis pasas leidia atskirti ne tik tolim, bet ir artim skirting ri individus,

irykinti vidurinius atskir individ genetinius skirtumus. Ypatingai plaiai genetiniai ymenys

naudojami medicinos ir teismo medicinos praktikoje. Tiksli identifikacija ir atskir individ

giminysts ryi nustatymas molekulins biologijos metodais iandien yra naudojami medicinos ir

teismo medicinos praktikoje, mogaus palaik identifikacijai, tvysts-motinysts nustatymui,

asmens identifikavimui kriminalistikos praktikoje ir kt.. Labai danai individo identifikacijos ar

giminysts analizs praktikoje, yra naudojama genomo kintani sek polimorfizmo analiz. Iki

mogaus genomo markiravimo, panaudojant kintani sek polimorfizmo analiz, teismo

medicinos praktikoje buvo naudojami vairi baltym genetiniai markeriai: tai eritrocit antigenai,

eritrocit fermentai, serumo baltymai ir leukocit antigenai (HLA, angl. human leucocytes

antigens). i genetins analizs metod tikslumas, asmens identifikacijos ar atskir individ

giminysts ryius nustatyme, siekdavo 70 - 95 %, priklausomai nuo vieno ar keli baltym analizs

metod panaudojimo. mogaus genomo variabili sek polimorfizmo analiz leidia identifikuoti

asmen ar giminysts ry 99,9999 % tikslumu. Pastarj keleto met laikotarpiu enklus progresas

stebimas mogaus genomo markiravimo metod panaudojime onkohematologijoje, vertinant DNR

chimerizmo laipsn pacient kraujo ir kaul iulp lstelse po kaul iulp transplantacijos

operacij.

vairi genom markiravimo duomenys iandien panaudojami filogenetinje analizje,

populiaciniuose tyrimuose. Dar 1962 metais E. Zuckerkandl ir L. Paulig pateik hipotez, kad

homologini baltym ir gen sek palyginimas gali bti panaudojamas kaip priemon, kaip

molekulinis laikrodis nutolusi ri divergencijos laipsniui vertinti. Ypatingai enkl indl ri

sistematikos darbus ne DNR-DNR hibridizacij eksperimentai ir ribosomini RNR sek analiz

bei i sek palyginimo rezultatai. Amplifikacijos reakcijos ir universali pradmen

panaudojimas dideli taksonomini grupi (augalai, grybai ir kt.) ri divergencijos analizei leido

sukurti didiulius vairi organizm genetini markeri bankus, kurie ir iuo metu pastoviai

papildomi nauja informacija.


Daniausiai genomo analizei naudojamos keli tip DNR sekos. Tai VNTR (angl. variable

number of tandemly repeated sequences) sekos, skirstomos a) paprastas pasikartojanias sekas; b)

kompleksiniua minisatelitus. Paprastos pasikartojanios sekos: tai daniausiai 10 ir daugiau

nukleotid pasikartojantys motyvai. vairi genom tyrimui taip pat naudojamos sekos, turinios

ypatingas struktras ir sek pavadinimus. Tai: 1) SINES (angl. short interspersed nucleotide

elements), iki 500 bp dydio, dar vadinamos Alu sekomis. Eukariotini organizm genomuose

sutinkama j apie milijon kopij; 2) LINES (angl. long interspersed nucleotide elements), tai keli

kb dydio sekos, daniausiai turinios transpozon savybi; 3) klasikin satelitin DNR: naudojant

citogenetinius lsteli daymo metodus irykja kaip chromatino elementai, didesn j dalis danai

bna akumuliuota lytinse chromosomose; 4) mikrosatelitins sekos, kuri identifikuota apie 300

tkstani mogaus genome; 5) mitochondrin DNR, citochromo b genas; 6) REP (angl. repetitive

extragenic palindromic elements); 7) ERIC (enterobacterial repetitive intergenic nonsensus

sequences); 8) BOX sekos ir kt.

vairi genom molekulini tyrimo metod spektras labai platus ir j panaudojim nulemia

tiriamo individo genomo struktra, nukleotid sek informacija apie tiriamo objekto genom,

laboratorijos technins galimybs bei personalo metodologin kvalifikacija

Pirmas etapas atliekant molekulinius genetinius tyrimus yra DNR (deoksiribonukleinin

rgtis) iskyrimas i biologini objekt.

DNR GRYNINIMO METOD CHARAKTERISTIKA

Nukleino rgtys gali bti iskiriamos i pai vairiausi biologini objekt: kiet audini,

kraujo, seili, vairi iskyr, plauk, kaul ir t,t. Kai kuriems molekulins biologijos metodams

tinka grubs NR ekstraktai (nereikalinga aukta kokyb, pvz. takin arba dot hibridizacija);

kitiems (restrikcijos su endonukleazmis, PGR, atvirktins transkriptazs reakcijaomsir t.t.) NR

preparatai turi bti pilnai ivalyti nuo baltym, lipid, karbohidrat ir kit lstels komponent.

Pastarj keli deimtmei laikotarpiu mokslinje literatroje yra paskelbta labai daug vairi

DNR gryninimo metod. Molekulins biologijos bei diagnostikos krypi komercins firmos silo

paius vairiausius reagent rinkinius nukleino rgi gryninimui i labai plataus spektro

biologini objekt. Visus DNR iskyrimo metodus galima bt sugrupuoti kelias grupes:

DNR gryninimas organini tirpikli pagalba (proteinaz K, fenolis, chloroformas);

DNR gryninimas su chaotropiniais reagentais;

DNR gryninimas stiklo suspensij pagalba;

DNR gryninimas silikagelio kolonli pagalba;


DNR gryninimas Chelex derv pagalba;

DNR gryninimas magnetini daleli metodu;

iskirtiniai DNR gryninimas objektai, reikalaujantys speciali metodik;

automatizuoti DNR gryninimas metodai;

ir kt..

Reikalavimai DNR gryninimo metodui:

metodas, leidiantis gryninti labai plat DNR spektr (objektai ir

koncentracijos);

atsikartojantis, greitas, paprastas;

nereikalaujantis specialios technikos ar speciali biochemijos ini;

tinkantis darbui su dideliu kiekiu pavyzdi;

DNR turi bti pakankamai vari ir tinkanti fermentinms reakcijoms;

labai maa DNR perneimo tikimyb i pavyzdio pavyzd.

Plaiau paneksime apie daniausiai naudojamus DNR gryninimo metodus.

DNR gryninimas organini tirpikli pagalba

Metodas paremtas: Lsteli surinkimas centrifuguojant; lsteli suspendavimas buferiniame

tirpale ir lsteli membran suardymas detergentais; baltym hidroliz proteinaz K;

deproteinizacija fenoliu-chloroformu; DNR isodinimas etanoliu.

DNR iskyrimas, panaudojant fenol, chloroform, proteinaz K:

1. Fenolio ir chloroformo panaudojimas DNR preparat gryninimui yra paremtas i

organini tirpikli savybmis labai efektyviai denatruoti lstels baltymus (denatruoti

baltymai tampa netirpiais), tirpinti riebalus, lipidus ir kitus lsteli komponentus.

2. Visuose fenolio pagalba DNR gryninimo metoduose biologinio objekto lsteli lizatas (kieti

audiniai prie lsteli liz homogenizuojami skystame azote) yra sumaiomas su lygiu triu

fenolio arba fenolio-chloroformo miiniu ir gauta emulsija velniai maioma 10-20 minui

kambario temperatroje, po to visas miinys centrifuguojamas 10-15 minui 5000-8000

aps/min greiiu.

3. ioje stadijoje lsteli lizato ir organini tirpikli miinys isifrakcionuoja tris dalis:

virutinje vandeninje frakcijoje yra itirpusios nukleino rgtys, vidurinje kompaktikoje


frakcijoje denatruoti biologinio objekto baltymai, o apatinje organini tirpikli

frakcijoje yra itirp lipidai ir riebalai.

4. Virutinis vandeninis sluoksnis su nukleino rgtimis yra surenkamas. Deproteinizacija

fenolio-chloroformo miiniu kartojama tol, kol inyksta po centrifugavimo denatruot

baltym sluoksnis.

5. DNR gryninimo metu dalis fenolio itirpsta vandeninje frakcijoje. Precipituojant etanoliu

DNR, ioje stadijoje, kartu su DNR molekulmis nuosdas gali patekti ir fenolio kristalai,

kurie labai intensyviai inhibuos fermentines reakcijas. Todl sekanti, bet btina, DNR

gryninimo stadija vandeninio sluoksnio (su nukleino rgtimis) sumaiymas lygiu triu su

chloroformu.

6. Vandenins frakcijos ir chloroformo miinys intensyviai maiomas kelias minutes, gautas

miinys centrifuguojamas 5-7 minutes, esant 5000-8000 aps/min greiiui. Mgintuvlyje

matomi du tirpal sluoksniai: apatinis chloroformo, o virutinis vandenin frakcija - su

nukleino rgtimis.

7. Virutinis vandeninis sluoksnis surenkamas, j pilama koncentruoto natrio arba amonio

acetato tirpalo iki 0,2-0,3 M ir du triai alto etanolio arba vienas tris alto izopropanolio,

sumaioma ir paliekama valandai arba 12-ai valand 20 oC temperatroje.

8. Nukleino rgtys surenkamos centrifuguojant, tirpinamos TE buferyje (10 mM tris-HCl,

pH8, 0, 1 mM EDTA). Taip paruoti DNR preparatai danai turi RNR ir lsteli baltym

priemai, taiau yra tinkami daugeliui molekulins biologijos eksperiment, taip pat ir

DNR sek gausinimui.

1. DNR preparatai gali bti valomi papildomai nuo baltym priemai, veikiant juos vairiomis

proteazmis.

2. DNR atskyrimui nuo RNR, nukleino rgi tirpalas veikiamas ribonukleazmis, o po to dar

kart ivalomas fenolio-chloroformo miiniu ir isodinamas etanoliu.

3. DNR tirpalo varumas patikrinamas matuojant tirpalo optin tank prie 260 nm ir 280 nm.

Optini tanki santykis 260 nm/280 nm turi bti 1,7-2,0 esant variems DNR preparatams.

Pastabos:

1. Fenolis yra nuodingas, gali nudeginti od ir sorbuotis krauj per kontakt su oda.

Chloroformas taip pat yra nuodingas, pasiymi kancerogeninmis savybmis. Btina

naudotis visomis biologins laboratorijos darbo saugumo priemonmis.

2. Auktos molekulins mass DNR preparatai TE buferyje tirpsta ilgai (2-10 valandos). Nuo

baltym priemai ivalyti DNR preparatai tirpsta greiiau, nei DNR preparatai, turintys

priemaiini baltym.


3. Netirpinkite DNR preparat vandenyje. Vandenyje DNR molekuls denatruoja, ir greiiau

degraduoja iki smulki fragment.

DNR gryninimas chaotropini reagent pagalba

Moksliniai straipsniai, rekomenduojantys DNR ir RNR preparat gryninimui naudoti

chaotropini drusk tirpalus skelbiami jau nuo 1970-j met. Per pastaruosius deimtmeius

publikuota pakankamai daug ir vairi metodik, kuriuose nukleino rgi gryninimui naudojami

reagentai: guanidino chloridas, guanidino tiocianatas, natrio perchloruotas, natrio jodidas, natrio

dodecilsulfatas ir kiti.

Pagrindins chaotropini reagent savybs, dka kuri jie iki iol labai plaiai naudojami

nukleino rgi gryninimui yra ios:

1. Chaotropiniai reagentai denatruota baltymus.

2. Chaotropiniai reagentai efektyviai tirpina lipidines vairi biologini objekt lsteli

membranas. Patalpinus biologin pavyzd guanidino chlorido, tiocianato ar kito analogiko

reagento tirpal, suardoma lsteli citoplazmin membrana, suyra vis lstels struktr

membranos, suyra mitochondrijos, branduoliai, chromosomos, ribosomos ir

ribonukleoproteinai, DNR-histon kompleksai. Laisvos nuo baltym DNR molekuls

patenka tirpal.

3. Chaotropiniai reagentai susilpnina vandenilini jungi ryius tarp DNR molekuli ir tuo

paiu sumaina DNR lydymosi temperatr.

4. Chaotropiniai reagentai ne tik ne inhibuoja, bet ir aktyvina proteinaz K (ir kitas proteazes,

plaiai naudojamas DNR preparat gryninimui).

5. Chaotropini reagent tirpalai yra pakankamai stabils, ir gali bti laikomi 5-6 mnesius

kambario temperatroje tamsoje.

6. Nukleino rgi gryninimo metodikose paprastai naudojami 4-10 moliariniai chaotropini

drusk tirpalai.

7. Priklausomai nuo eksperimento tikslo ar turim DNR valymo priemoni, DNR i

homogenato ivaloma panaudojant: specialias kolonles; stiklo suspensij; ekstrakcij

fenoliu-chloroformu arba tik chloroformu ir nukleino rgi isodinim etanoliu ar

izopropanoliu.

Chaotropini reagent tirpalai labai plaiai panaudoti komercini reagent rinkini paruoimui

ir DNR, ir RNR preparat gryninimui.


Pastabos:

1. Guanidino tiocianato tirpalai kontakte su rgtimi sudaro pavojing rgt HCN (ciano

rgtis), todl ios chaotropins druskos tirpalai yra ruoiami gar boksuose.

2. Guanidino tiocianato atliekos renkamos armo tirpal (skiediama 10M NaOH iki 0,2-

0,3M).

DNR gryninimas katijonini detergent pagalba

DNR preparatai labai greitai ir variai igryninami i augal, vairi mikroorganizm, i

kraujo, seili, audini kultros lsteli ir kit biologini objekt, panaudojant stiprius

katijoninius detergentus: dodeciltrimetilamonio bromid (DTAB) ir cetiltrimetilamonio bromid

(CTAB). ie katijoniniai detergentai efektyviai lizuoja lsteli membranas, inaktyvuoja

nukleazes ir denatruota lstelinius baltymus.

1. 1.Naudojant metod DNR preparat gryninimui, tiriamo biologinio objekto lsteli

suspensija sumaioma su dviem triais 8% DTAB auktos jonins jgos tirpalo,

inkubuojama 3-5 min. 65 oC temperatroje.

2. Deprotenizuojama lygiu triu chloroformo.

3. Virutinis sluoksnis, kuriame yra nukleino rgtys, sumaiomas su CTAB tirpalu. CTAB

tam tikros jonins jgos tirpalas (0,3-0,4 M) selektyviai suria netirpius kompleksus tik

DNR.

4. DNR ir CTAB kompleksas surenkamas centrifuguojant.

5. Supernatantas paalinamas, o nuosdos tirpinamos 1,2 M natrio chlorido tirpale kambario

temperatroje maiant (DNR-CTAB kompleksas netirpsta TE buferyje ar vandenyje).

6. Itirpus nuosdoms, DNR isodinama tradicikai dviem triai alto etanolio, vl surenkama

centrifuguojant ir tirpinama TE. I 200 l kraujo iskiriama 3-5 g DNR per 20-25 min. ie

DNR preparatai bna pakankamai vars ir gali bti naudojami visuose nukleino rgi

amplifikacijos, hibridizacijos ar kituose eksperimentuose.

DNR gryninimas stiklo suspensij pagalba:

Jau pirmuose DNR preparat gryninimo eksperimentuose (1960-70 metai) buvo pastebta

pakankamai stiprus DNR molekuli prisitvirtinimas ant stiklo. Iki iol nra inomas io reikinio

molekulinis mechanizmas, taiau i DNR savyb labai plaiai naudojama mokslinse ir medicinos

diagnostikos laboratorijose bei komerciniuose DNR ir RNR preparat gryninimo reagent

rinkiniuose.


Nanograminiai susmulkinto stiklo (arba silicio dioksido dervos) kiekiai suria piko-

nanograminius DNR kiekius. DNR preparatai i lsteli lizat ant susmulkinto stiklo ar silicio

dioksido derv prisitvirtina auktos jonins jgos tirpaluose, kuri sudtyje daniausiai bna

chaotropins druskos. DNR ar RNR preparatai, prisitvirtin ant stiklo suspensij, nuo nereikaling

lstels komponent atplaunami taip pat auktos jonins jgos tirpalais. DNR ar RNR preparatai

nuplaunami nuo stiklo daleli vykdoma emos jonins jgos tirpalais, TE arba vandeniu 60-65oC

temperatroje.

Pastabos:

1. visose eksperimento stadijose stiklo suspensija turi bti labai gerai suspenduojama plovimo

ar eliucijos buferiuose;

2. btina gerai paalinti stiklo likuius i DNR ar RNR tirpalo.

DNR gryninimas silikagelio kolonli pagalba

Stiklo preparatai biologini objekt DNR preparat gryninimo eksperimentuose naudojami ne

tik kaip vairi koncentracij stiklo ar silicio dioksido suspensijos, bet ir specialiose kolonlse

tvirtint filtr pavidalu. iandien deimtys komercini firm, gaminani produkcij molekulins

biologijos profilio mokslinms ir medicininms staigoms silo vairios sudties reagent rinkinius,

skirtus DNR gryninimui silikagelio kolonli pagalba. Visi ie rinkiniai yra patentuoti, nra

skelbiama reagent rinkiniuose naudojam tirpal sudtis. Yra inoma, kad, kaip ir vairi stiklo

suspensij atveju, biologinio objekto lstels yra lizuojamos ir prisitvirtina ant filtr auktos jonins

jgos chaotropini drusk tirpal pagalba, o nuplaunamos nuo filtro vandeniu ar TE tirpalais.

Daniausiai silikagelio kolonli pagalba DNR gryninama i vairi biologins kilms skysi

ar lsteli suspensij. Didiausia rinkini dalis skirta DNR gryninimui i kraujo. iuo atveju DNR

ieiga bna 3-6 g i 200 l kraujo (apie 15-30 g/ml). Kadangi PGR testams paprastai naudojama

apie 0.1 g DNR, tai igryninto i 200 l DNR kiekio utenka 30-60 test. DNR gryninimo

kolonli pagalba rinkiniai naudojami diagnostikos tikslams kraujo bank centruose ir klinikins

analizs laboratorijose.

Pagrindiniai io metodo privalumai:

1. maai laiko ir darbo snaud reikalaujantis eksperimentas;

2. DNR preparatai ypatingai gerai ivalomi nuo vis biologinio objekto komponent, nuo PGR

inhibitori;

3. DNR nra pervedama netirpi molekuli bv (nra isodinama etanoliu), eliucijos tirpalas

su DNR gali bti ikart naudojamas PGR testui;


4. DNR gryninimas kolonls pagalba utrunka 20-25 minutes.

DNR ekstrakcija Chelex derv pagalba

Chelex-100 yra chelatin derva, pasiyminti auktu afinikumu polivalentiniams metal

jonams. Chelex dervos parduodamos smulki granuli pavidalu ir i j ruoiami metodikose

nurodyt koncentracij tirpalai. Chelex apsaugo DNR nuo degradacijos virinimo metu. Chelex

suspensijos auktas ph (10-11) ir inkubacija auktoje temperatroje (100 oC) slygoja biologinio

objekto lsteli suardym ir DNR denatracij. Po DNR ekstrakcijos su Chelex derva, gauname

denatruotas DNR molekules, todl gauti DNR preparatai netinka RFLP analizms.

Tikslus DNR gryninimo Chelex dervos pagalba veikimo mechanizmas nra inomas

Pagrindiniai trys Chelex-100 privalumai:

madaug eis kartus padidinamas PGR efektyvumas;

nenaudojami toksiki organiniai tirpikliai;

minimalios laiko ir darbo snaudos.

Iskirtiniai DNR gryninimo objektai

Kraujo kreuliai homogenizuojami SDS tirpale virinant, po to centrifuguojami, DNR i

supernatanto prisitvirtina ant stiklo sorbento GuSCN tirpale, nuplaunama DNR emos jonins jgos

tirpalais.

Spermatozoidai.

Prieingai daugeliui induoli somatini lsteli, i spermatozoid praktikai nemanoma iskirti

DNR tradiciniais metodais. Vienas i svarbiausi skirtum tarp somatini lsteli ir spermatozoid

- somatinse lstelse DNR yra komplekse su histonais, o spermatozoiduose su maos molekulins

mass proteinais, vadinamais protaminais. ie protaminai yra labai stipriai susijung su DNR ir i

DNR yra ypa kondensuotame bvyje su mintais protaminais, todl klasikiniai DNR ekstrakcijos

metodai i DNR ekstrakcijai i spermatozoid nra taikomi.

Spermatozoid DNR ekstrakcija:

1. spermi lstels lizuojamos buferyje su: 6 M guanidino chlorido, 30 mM natrio citrato (pH

7.0), 0,5% sarkozilo, 0.2 mg/ml proteinazs K ir 0,3 M b-merkaptoetanolio;

2. Inkubuojama 55 oC temperatroje 3-4 valandas.

3. Po to lizat pilami du triai izopropanolio DNR isodinimui

4. Centrifuguojama ir DNR tirpinama vandenyje ar TE buferyje.


PGR METOD PRIVALUMAI, GALIMYBS IR PANAUDOJIMAS

Kaip rasti bakterij ar virus prajus kelioms dienoms nuo infekcijos pradios? Kaip nustatyti

individo tapatyb, turint tik mayt odos skiautel, kraujo la ar vienintel plauk? Kaip rodyti, kad

mamutas, gyvens Sibire prie 40 000 met, yra artimas iuolaikiniams drambliams ne tik tuo, kad

is gigantas turjo straubl ir iltis? Galiausiai kaip surasti adat ieno kupetoje (ieno kupeta-

individo genetin informacija, adata genas arba jo fragmentas)? tsakyti iuos klausimus

padeda molekulins biologijos metodai. Populiariausias ir plaiausiai taikomas Polimerazs

Grandinin Reakcija (PGR). is metodas ne tik padeda surasti adat ieno kupetoje, bet ir per

kelias valandas prigaminti dar vis veim toki pat adat. Pirmoji DNR sek PGR paskelbta

Saiki R. ir jo koleg i Cetus korporacijos, mogaus genetikos departamento Kalifornijoje 1985

metais. iame darbe, panaudojant DNR polimeraz Klionovo fragment ir specifinius pradmenis

buvo padaugintas beta-globino DNR fragmentas 220.000 kart. PGR metodo atradimas sukl tikr

revoliucij molekulins biologijos technologij, taikom biologijos bei medicinos moksl tyrimuose,

medicininje diagnostikoje bei teismo medicinos, praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika,

leidianti padauginti DNR fragmentus nuo pikogramini iki mikrogramini kieki. urnalas

Science 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu met mokslo vykiu. PGR metodo autoriui

K.Mullisui (JAV) 1993 metais paskirta Nobelio premija.

Kiekvienas mikroorganizmas, ar pagaliau lstel, turi genetin informacij, kuri

nea nukleino rgtis DNR. PGR metodo esm yra individo DNR fragmento padauginimas,

dalyvaujant fermentui polimerazei. Reakcijos principas lygiai toks pat kaip ir lstels dalijimosi

metu. Tik iuo atveju viskas vyksta in vitro, mgintuvlyje. PGR vyksta automatikai ciklais.

Susintetint fragment skaiius su kiekvienu ciklu dvigubja, t.y. didja geometrine progresija ir

per 25 ciklus, kuri kiekvieno trukm 1-3 min., padidja apie 1 mln. kart. Taigi, turint vienos

lstels genetin mediag, naujaisiais PGR metodais per 30-35 ciklus galima gauti tok produkto

kiek, kurio pakanka daugeliui tolimesni tyrimo etap.

Tai ypa tikslus, greitas ir jautrus metodas. Iki iol nebuvo tokio metodo, kuriam reikt

tiek maai tiriamosios mediagos. PGR pakanka keli lsteli. Kitas metodo privalumas didelis

specifikumas. Reakcijos slygos sumodeliuojamos taip, kad bt dauginamas tik iekomas DNR

fragmentas. Didiulis metodo jautrumas kelia ir problem: reikia labai saugotis, kad reakcijos

miin nepatekt alutins DNR priemaios. Todl tyrimams ir laboratorijoms, kuriose taikomas is

metodas, keliami labai aukti reikalavimai. Kad reakcija vykt sklandiai, reikia labai tiksliai

parinkti reakcijos slygas (temperatr, koncentracijas, cikl kiek ir trukm), visi reagentai turi bti

itin aukto ivalymo laipsnio.


PGR iandien vis plaiau naudojamas medicininje diagnostikoje. Dl mint savybi is

metodas puikiai tinka nustatyti ne tik bakterijas ir virusus, bet ir j genotipus. Tai ypa svarbu,

kai norima iaikinti infekcijos neiotoj, ar nustatyti infekcij prajus kelioms dienoms nuo jos

patekimo organizm. is metodas padeda: diagnozuoti paveldimas ligas, daugel i j dar prie

gimim ar iki klinikinio pasireikimo; nustatyti daugel vio form, ypa eiminio vio atvej;

tipizuoti audinius organ transplantacijai; teisminje medicinoje nustatyti asmens tapatyb

(DNR pirt atspaudai), tvyst; nustatyti patogeninius mikroorganizmus maisto produktuose.

toliau PGR iuo metu yra plaiausiai naudojamas metodas molekulinje ekologijoje, nustatant ir

apraant vairius organizmus ir j populiacin struktr. PGR yra patogus praktiniu poiriu, nes

reakcija yra labai jautri ir galima nustatyti patogen, esant minimaliam jo kiekiui. Minti tyrimai

gali pasitarnauti ir DNR analizje, kuri gali bti klonuojama, nustatoma jos pirmin struktra

(nukleotid seka) ir lyginama su pasaulinmis duomen bazmis. Taip gali bti nustatomas ne tik

atskir patogen genotip specifikumas, bet ir j paplitimas, eiminink ratas bei funkcionavimo

gamtoje ypatumai.

iuo metu PGR metodas, o ypa tikro laiko PGR yra jautresni ir specifikesni u kitus

metodus ir leidia greitai ir patikimai nustatyti DNR struktr. PGR - tai iuolaikikas ir modernus

molekulins biologijos metodas, galinantis tiksliai, greitai ir patikimai gauti norim rezultat. Pagal

apskaiiavimus, io metodo panaudojimas ateityje kas penkerius metus turt padidti apie 500%.

Yra inoma daugyb PGR metodo modifikacij, kurios naudojamos eksperimentinje

biologijoje, medicinoje, mikrobiologijoje bei kitose srityse. iuolaikiniai PGR metodai galina

atlikti PGR reakcij in situ (galimi akronimai: PCR in situ hybridization, in-cell PCR, direct

and indirect ISPCR, PCR-driven ISH, Localized in situ amplification ir kt.) pvz., lsteli

kultroje, audinyje, vienoje lstelje. iuo metodu galima nustatyti, pvz., kuri lstel kultroje yra

infekuota virusu. Yra sukonstruoti specials PCR garsintuvai, atlikti in situ PGR reakcijas (ant

objektini stikleli).

Lizdin PGR: tai PGR tipas, kai reakcijos produkto dalis yra perneama antr gausinimo

reakcij, o pradmen sek pozicijos yra tarp sek pozicij, panaudot pirmai gausinimo reakcijai.

Lizdinis PGR variantas labai efektyviai naudojamas, gausinant sekas su dideliu kiekiu C/G

nukleotid, pasiymini aukta fragment lydymosi temperatra. metod galima naudoti, kai

yra labai ema tiriamos mediagos (bakterijos, viruso ir kt.) koncentracija.

"Touchdown" PGR: PGR tipas, kai vykstant DNR sekos gausinimui 1 oC eminama

pradmens ir matricos hibridizacijos temperatra, po to gausinama apie 10-15 cikl. Priklausomai

nuo teisingai parinktos pradmen ir matricos hibridizacijos temperatros, PGR produkto ieiga

kinta 2 ir daugiau kart.


Daugin PGR. Gausinimo reakcija, kurios metu padauginami ne vienas, o keletas DNR sek

yra vadinama daugine PGR (nuo angl. multiplex PCR). Tokio tipo PGR leidia sutaupyti

eksperimentinio darbo ir laiko snaudas, nes reakcijos miin yra dedamos kelios ar keliolika

pradmen por. Daugin PGR pakankamai danai naudojama ir mokslinje, ir medicinins

diagnostikos praktikoje. Daugins PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dmesio reakcijos slyg

optimizacijai. Tai pradmen koncentracija, PGR buferio sudtis, magnio chlorido ir

nuleozidtrifosfat (dNTP) koncentracij balansas, DNR mginio ir termostabili polimerazi

koncentracija bei gausinimo reimas. Skminga daugini PGR optimizacija padidina reakcijos

jautrum, specifikum, netolyg analizuojam srii gausinimo efektyvum. Mokslinje

literatroje galima rasti pakankamai daug informacijos apie daugini PGR sistem panaudojim

virus, bakterij ir kit infekcij suklj nustatymui.

TrueStart Taq DNR polimerazi PGR miiniai. Tai Hot-Start" PGR variantas, su

chemikai modifikuota Taq polimeraze. i polimerazs nepasiymi biologiniu aktyvumu kambario

temperatroje, todl yra ivengiama ir nespecifins pradmen ir matricos hibridizacijos ir fonins

DNR sek ilginimas. ios polimerazs, prieingai Hot-Start" polimerazms, nereikalauja

specialaus fermento aktyvinimo, o aktyvuojasi pirmojo denatravimo metu. ie reagent miiniai

naudojami hot start tipo ir greitoms PGR, pasiymi ypa dideliu reakcijos specifikumu, emu

fonu, galimybe sintetinti ilgus amplikonus.

Tikro laiko PGR (angl. real-time) (toliau TL-PGR) - tai i dien ir ateities mokslini ir

diagnostikos laboratorij technologijos (toliau TL-PGR). Tai automatizuota sistema, kai PGR ir

pagausinto produkto nustatymas vyksta vienu metu. iuo metodu gali bti susekama viena DNR

sekos kopija (t.y. viena mikroparazito, viruso ar bakterijos molekul) tiriamame mginyje tai

kiekybinis patogeno kiekio vertinimas. TL-PGR sistemoje pasirinkta DNR seka dauginama

eksponentikai (PGR produkto kiekis didja proporcingai), stebimas tiesioginis ryys tarp pradinio

DNR mediagos kiekio ir jo kiekio konkreiame gausinimo cikle. Pirmoji publikacija apie tikro

laiko PGR pasirod 1993 metais. iandien TL-PGR naudojama mikroparazit nustatymui vairiuose

klinikiniuose mginiuose, gen raikos tyrimams, panaudojant iRNR preparatus, genomo kopij

skaiiaus vertinimui tiriamuose mginiuose, aleli diskriminacijos testams ir t.t.

TL-PGR mechanizmai. Per pastaruosius 12-13 met, prajusius nuo pirmos publikacijos apie TL-

PGR kinetik, sukurti nauji cheminiai reagentai, specifiniai ymenys (zondai), kuri pagalba

vertinamas reakcijoje pagausinamo produkto kiekis kiekviename konkreiame cikle. 1 lentelje

pateikti TL-PGR sistemose naudojam fuorescensini PGR produkt nustatymo metod

klasifikacija pagal naudojamus cheminius reagentus.


1 lentel. Tikro laiko PGR sistemose naudojam fuorescensini PGR produkt nustatymo metod klasifikacija (pagal Vet ir Marras, 2005).

Cheminiai reagentai (ymenys) Nustatymo sistemos1. Hidrolizs ymenys Taq MAN, Beacons, Scorpions2. Hibridizacijos ymenys Light Cycler3. iDNR molekul suriantys nespecifiniai reagentai SYBR Green

Hidrolizs ymenys. Daniausiai naudojami TL-PGR metodai, paremti ymen,

komplementari pagausint produkt sekos fragmentui, hidrolize termostabili DNR polimerazi 5'

egzonukleazinio aktyvumo dka. Hidrolizs ymen nustatymo sistemose (TaqMan TM

technologijos) naudojami taip vadinami du kartus ymti fluorescuojantys oligonukleotid ymenys

(nuo angl.: dual-labeled oligonucleotide fluorogenic probes). Prie ymens 5' galo yra chemikai

prijungtas fluorescencinis ymuo, vadinamas reporteriu (R). Prie to paties ymens 3' galo

chemikai prijungtas kitas ymuo, vadinamas slopintoju (S) (nuo angl. quencher). Kol is

ymuo reakcijos miinyje yra laisvas, nesusijungs su gausinamu produktu, fluorescencijos signalo

nebna dl labai mao atstumo tarp R ir S. PGR metu is paymtas ymuo specifikai jungiasi su

gausinamos sekos fragmentu. DNR sekos sintezs metu is ymuo yra skaldomas termostabilios

DNR polimerazs 5' nukeazinio aktyvumo pagalba. Nusklus R ymen, prasideda fluorescencija. R

atskeliamas nuo ymens kiekvieno gausinimo ciklo metu, todl fluorescencija didja kiekviename

cikle. Prietaiso sekos nustatymo sistema registruoja fluorescencij PGR metu, kuri vliau speciali

kompiuterini program pagalba pateikiama kaip kiekybini rezultat iraika. Naudojant i

metodik yra identifikuojami vairs mikroparazitai. 1 paveiksle yra pateikiama TL-PGR hidrolizs

zond mechanizmo schema.

iDNR molekul suriantys nespecifiniai reagentai (SYBR Green I panaudojimas TL-PGR).

SYBR Green I daas yra nukleotid sekai nespecifinis fluorescencinis reagentas, kuris fluorescuoja

susijungs su dvigrande DNR seka. Jam esant laisvam tirpale (nesusijungusiam su dvigrande DNR)

fluorescencija bna labai silpna, taiau ji suintensyvja, kai SYBR Green I terpiamas dvigrand

DNR sek. SYBR Green I dao jungimas TL-PGR leidia nustatyti bet koki dvigrand DNR,

nenaudojant joki sekai specifini ymen. SYBR Green I panaudojimas TL-PGR sistemoje

demonstruojamas 2 paveiksle. Gausjant TL-PGR produkto vis daugiau ir daugiau SYBR Green I

sijungia produkt. Fuorescensija registruojama kiekvieno ilginimo ciklo pabaigoje ir yra matoma

aparato ekrane. i metodika buvo panaudota Borrelia genotip nustatymui, Leptonema illini,

Campylobacter ir kitiems patogenams nustatyti. TL-PGR technologija per kelet met tapo

auksiniu standartu molekulins biologijos metoduose, kur jautrumas ir kiekybin rezultato

iraika yra btinos eksperimento slygos.


1 pav. TL- PGR nustatymo sistema, naudojant hidrolizs ymenis (pagal Arya ir kt., 2005; http://qpcr.gene-Quantification.info/).

I. Du kartus ymtas fluorescuojantis ymuo: R reporterio ymuo, S slopintojo ymuo

ymuo Tiesioginis pradmuo

Atvirktinis pradmuo

II. Gausinimo metu ymuo hibridizuojasi su gausinamos sekos DNR fragmentu. Kai abu daai yra ant ymens fluorescencija nevyksta

III. DNR sekos sintezs metu ymuo yra skaldomastermostabilios DNR polimerazs 5' nukleazinio aktyvumo pagalba.Nusklus R, prasideda fluorescencija

IV. R atskeliamas nuo ymens kiekvieno PGR ciklo metu, todl fluorescencija didja kiekviename cikle


2 pav. TL-PGR nustatymo sistema, naudojant SYBR Green I da (pagal Arya ir kt., 2005; http://qpcr.gene-Quantification.info/).

Kitas metodas plaiai naudojamas mikroparazit identifikacijai yra atvirktin linijin

blot-hibridizacija (Reverse line blot hybridization). DNR-DNR hibridizacijos eksperiment

istorijos pradia siejama su Doti grups eksperimentais, kuri metu buvo pastebta denatruot

DNR molekuli sugrimas dvigrand struktr. Renatracija vyksta specifikai, pagal DNR

komplementarumo princip. Yra sukuriami DNR ymenys kurie yra ir cheminiu ir molekulins

biologijos poiriu molekuls, turinios stipri sveik su kita molekule taikiniu arba matrica.

I. Kai SYBR Green I yra laisvas tirpale (nesusijungs su dvigrande DNR) fluorescencija bna labai silpna

Viengrand DNR

ymuo

II. DNR sekos ilginimo metu vis daugiau SYBR Green I sijungia dvigrand gausinam produkt

III. Fluorescencija stebima, kai SYBR Green I daas siterpia dvigrand DNR


Tokios sveikos pavyzdiais gali bti reakcija tarp antikno ir antigeno, lektin ir karbohidrat,

avidino ir biotino, receptoriaus ir nukleino rgties, tarp komplementari nukleino rgi. DNR

ymenys susiria su komplementaria sau molekule vandeniliniais ryiais tokiame kiekyje viet, kiek

nukleotid yra susidariusiame hibride. Visos nukleino rgtys (viengrands ir dvigrands DNR,

RNR, oligonukleotidai) gali bti paymti radioaktyviais izotopais arba neradioaktyvia yme.

Pirmieji neradioaktyvs DNR ymenys aprayti 1981 m. ir j paruoimui panaudoti ymti biotinu

deoksinukleozidtrifosfatai (biot-dNTP). Biotino jungimo DNR ymen molekules per

biotinilintus nukleotidus, ar biotino prijungimas prie pradmens yra standartin neradioaktyvaus

ymjimo procedra. Po hibridizacijos reakcijos biotinu ymti ymenys yra rykinami,

panaudojant fermentinius konjugatus baltymus avidin arba streptavidin, chemikai suritus su

fermentu, daniausiai su peroksidaze, armine fosfataze ar pirofosfatazmis. Mikroparazit

genetiniam identifikavimui ir j analizei naudojami ribosomines RNR (rRNR) koduojani gen

rajonai arba nukleotid sekos, lokalizuoti tarp gen, koduojani rDNR. ios sekos vadinamos ITS

sekomis (angl. internal transcribed spacer). rDNR ir ITS sek rajonai yra riai specifiki. ios

sekos paprastai yra gausinamos ir produkt analizei naudojami vairs imunologiniai testai,

nukleino rgi hidrolizs ar hibridizacijos metodai, besiskiriantys darbo snaudomis, jautrumu ir

specifikumu. Vienas i i metod tai atvirktin linijin blot-hibridizacija arba RLBH (angl.

reverse line bot hybridization) pastaruoju metu plaiai naudojamas ir mikroorganizm vairovs

analizei.

Metodo esm: ant nailonins membranos uneami analizuojamo organizmo riai

specifini sek oligonukleotidiniai ymenys. iam tikslui naudojamas specialus aparatas, turintis

siaurus griovelius, reikalingus tiriamos mediagos uneimui ant membranos. Oligonukleotidai

uneami siaur juosteli pavidalu. Po to membrana pasukama 90o kampu, vl dedama aparat, ir

griovelius supilamas analizuojamas radioaktyviu ar neradioaktyviu ymekliu (danai su biotinu ar

digoksigeninu) paymtas ir denatruotas DNR ar PGR produkt tirpalas.

Oligonukleotidini ymen ir PGR produkt uneimo linij susikirtimo vietose vyksta

hibridizacijos reakcija. Hibridizacijos signalo rykinimui gana danai naudojami

chemiliuminescentiniai substratai. io tipo substratai, suskaldyti armine fosfataze arba

peroksidaze, pasiymi ilgalaike (apie 24 val.) viesos emisija, kuri nustatoma rentgeno juost

pagalba arba specialiais prietaisais luminometrais. Chemiliuminescentins hibrid nustatymo

sistemos (dka pastovios ir ilgalaiks viesos emisijos) yra 10-30 kart jautresns negu spalvins

sistemos (3 pav., 4 pav).


3 pav. B. burgdorferi s.l. mikroparazito genotip identifikavimas, naudojant atvirktin linijin blot-hibridizacij. Virutinje eilutje pateikta: B. burgdorferi s.l. 23S-5S ITS seka, po ja atitinkam genotip DNR sekos; ir atvirktins linijins blot-hibridizacijos rezultatai (pagal Alekseev ir kt., 2001).

4 pav. Erki mikroparazit Ehrlichia, B. burgdorferi, ir Bartonella sp. nustatymas ir genotip identifikavimas, naudojant atvirktin linijin blot-hibridizacij. (A) ant membranos uneti Ehrlichia-specifiniai oligonukleotidiniai zondai; (B) - B. burgdorferi genotipams-specifiniai zondai; (C) uneti vairs zondai , specifiniai Ehrlichia, B. burgdorferi, ir Bartonella rims. Teigiam signal parodo ryki dm. (El, Ehrlichia-like; Eca, E. canis; Ech, E. chaffeensis; Epv, E. phagocytophila variant; Hv, HGE variant; Ep, E. phagocytophila; H, HGE; Bs, B. burgdorferi sensu stricto; Bg, B. garinii; Ba, B. afzelii; Bv, B. valaisiana; Bh, B. henselae; Bq, B. quintana.)

Yra inoma daug molekulini metod ir j modifikacij, kurie naudojami mikroparazit

aptikimui ir nustatymui mikrobiologijoje, medicinoje, molekulinje ekologijoje, molekulinje

sistematikoje ir kitose srityse. Molekuliniai metodai yra sudtingi, reikalaujantys brangios

aparatros, darbuotoj atitinkam darbo gdi ir brangs. Juos galima taikyti tik specializuotose

laboratorijose.


NAUDOTA LITERATRA

1. Alekseev A. N., Dubinina, H. V., Van De Pol I., Schouls L. M. 2001. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes Ticks in the Baltic Regions of Russia. J. Clin. Microbiol. 39: 2237-2242.

2. Arya M., Shergill I. S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., Patel H. R. 2005. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev Mol Diagn. 5(2): 209-219.

3. Espy M. J., Uhl J. R., Sloan L. M., Buckwalter S. P., Jones M. F., Vetter E. A., Yao J. D., Wengenack N. L., Rosenblatt J. E., Cockerill F. R. 3rd, Smith T. F. 2006. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev. 19(1): 165-256.

4. Heid C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6(10): 986-994.

5. Higuchi R ., Fockler C., Dollinger G., Watson R. 1993. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 11(9): 1026-1030.

6. Jurgeleviius V., Steponaviit D. 1999. Polimerazs grandinin reakcija: principai ir taikymo sritys. Laboratorin medicina. 3: 28 34.

7. Langer P. R ., Waldrop A. A., Ward D. C. 1981. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA. 78(11): 6633-6637.

8. Li Q., Luan G., Guo Q., Liang J. 2002. A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. Nucleic Acids Res. 30(2): E5.

9. Logan J. M., Edwards K. J., Saunders N. A., Stanley J. 2001. Rapid identification of Campylobacter spp. by melting peak analysis of biprobes in real-time PCR. J Clin Microbiol. 39(6): 2227-2232.

10. Mackay I. M . 2004. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect. 10(3): 190-212.

11. Marsh P ., Cardy D. L. 2004. Molecular diagnostics: future probe-based strategies. Methods Mol Biol. 266: 167-189.

12. Monis P. T., Andrews R. H., Saint C. P. 2002. Molecular biology techniques in parasite ecology. Int J Parasitol. 32(5): 551-562.

13. Monpoeho S., Maul A., Mignotte-Cadiergues B., Schwartzbrod L., Billaudel S., Ferre V. 2001. Best viral elution method available for quantification of enteroviruses in sludge by both cell culture and reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol. 67(6): 2484-2488.

14. Ririe K. M., Rasmussen R. P., Wittwer C. T. 1997. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem. 245(2): 154-160.

15. van Elden L. J., Nijhuis M., Schipper P., Schuurman R., van Loon A. M. 2001. Simultaneous detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR. J Clin Microbiol. 39(1): 196-200.


16. Vet J. A , Marras S. A. 2005. Design and optimization of molecular beacon real-time polymerase chain reaction assays. Methods Mol Biol. 288: 273-290.

17. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A., Rasmussen R. P. 1997. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques 22(1):130-131, 134-138.

18. Woo T. H., Patel B. K., Cinco M., Smythe L. D., Symonds M. L., Norris M. A., Dohnt M. F. 1998. Real-time homogeneous assay of rapid cycle polymerase chain reaction product for identification of Leptonema illini. Anal Biochem. 259(1): 112-117.

19. Zhang Y., Zhang D., Li W., Chen J., Peng Y., Cao W. 2003. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucleic Acids Res. 31(20): e123.

Documents

Šiuolaikinės molekulinės biologijos tyrimo metodai