v  

DAUN KI PAHIT (Tithonia diversifolia) SEBAGAI SUMBER ANTIBAKTERI DAN ANTIOKSIDAN

ADE SUHERMAN

  

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2013

vi  

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Daun Ki Pahit (Tithonia

diversivolia) sebagai Sumber Antibakteri dan Antioksidan adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2013

Ade Suherman NIM G44090026

    

 

   

iii  

ABSTRAK

ADE SUHERMAN. Daun Ki Pahit (Tithonia diversifolia) sebagai Sumber Antibakteri dan Antioksidan. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan WULAN TRI WAHYUNI.

Aktivitas antibakteri dan antioksidan telah dianalisis pada ekstrak dan minyak atsiri daun ki pahit (Tithonia diversifolia). Daya antibakteri telah diuji terhadap Staphylococcus aureus dan S. epidermidis, dan antioksidan terhadap 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH). Ekstrak teraktif adalah ekstrak metanol sisa dengan nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) terhadap S. aureus dan S. epidermidis berturut-turut sebesar 1.00 dan 2.00 mg/mL dan nilai konsentrasi bunuh minimum (KBM) > 2.00 mg/mL, dan nilai hambat 50% (IC50) terhadap radikal bebas DPPH sebesar 27.88 µg/mL. Fraksionasi ekstrak metanol sisa menggunakan kromatografi kolom menghasilkan 13 fraksi. F1 merupakan fraksi teraktif dengan KHM dan KBM 0.25 dan 1.00 mg/mL terhadap S. aureus, serta 0.50 dan 2.00 mg/mL terhadap S. epidermidis, dan aktivitas antioksidan dengan IC50 22.88 µg/mL. F1 difraksionasi lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis dan memberikan 11 fraksi. F1.2 merupakan fraksi teraktif karena pertumbuhan S. aureus dan S. epidermidis dapat dihambat pada 0.25 dan 0.50 mg/mL, serta dapat dibunuh pada 0.50 dan 2.00 mg/mL, dan 50% DPPH dapat dihambat pada 30.94 μg/mL. Berdasarkan identifikasi menggunakan spektrofotometer ultraviolet-tampak dan inframerah transformasi fourier diduga komponen senyawa aktifnya adalah golongan auron. Kata kunci: antibakteri, antioksidan, auron, fraksionasi, Tithonia diversifolia

ABSTRACT

ADE SUHERMAN. Ki Pahit Leaves (Tithonia diversifolia) as Source of Antibacterial and Antioxidant. Supervised by IRMANIDA BATUBARA and WULAN TRI WAHYUNI.

Antibacterial and antioxidant analysis have been assayed on extracts and essential oil of ki pahit leaves (Tithonia diversifolia). The antibacterial activity was tested toward Staphylococcus aureus and S. epidermidis, and the antioxidant activity was assayed toward 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH). The most active extract was the residual methanol extract with minimum inhibitory concentration (MIC) values against S. aureus and S. epidermidis were 1.00 and 2.00 mg/mL, respectively, the minimum bactericidal concentration (MBC) value >2.00 mg/mL, and the inhibition of 50% DPPH, IC50 was 27.88 µg/mL. The residual methanol extract was fractionated using column chromatography to obtain 13 fractions. F1 was the most active fraction with MIC values against S. aureus and S. epidermidis with 0.25 and 1.00 mg/L and MBC values were 0.50 and 2.00 mg/mL, respectively. The IC50 of the antioxidant was 22.88 µg/mL. The F1 fraction was further fractionated by thin layer chromatography to obtain 11 fractions. The F1.2 fraction was the most active fraction as indicated by inhibition the growth of S. aureus and S. epidermidis that of 0.25 and 0.50 mg/mL and indicated by killing the bacteria that of 0.50 and 2.00 mg/ml, respectively, and 50% DPPH that could inhibit was 30.94 µg/mL. Based on identification using ultraviolet-visible and fourier transform infrared spectrophotometers, the active compound was indicated to be in auron group. Key words: antibacterial, antioxidant, auron, fractionation, T. diversifolia

v  

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2013

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ii  

DAUN KI PAHIT (Tithonia diversifolia) SEBAGAI SUMBER

ANTIBAKTERI DAN ANTIOKSIDAN

ADE SUHERMAN

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains Pada

Departemen Kimia  

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2013

Judul Skripsi Daun Ki Pahit (Tithonia diversifolia) sebagai Sumber Antibakteri dan Antioksidan

Nama Ade Suherman NIM G44090026

Disetujui oleh

Dr Irmanida Batubara, MS Wulan Tri Wahyuni. SSi, MSi Pembimbing I Pembimbing II

Tanggal Lulus: 2 1 AUG 2013

v  

Judul Skripsi : Daun Ki Pahit (Tithonia diversifolia) sebagai Sumber Antibakteri dan Antioksidan

Nama : Ade Suherman NIM : G44090026

Disetujui oleh

Dr Irmanida Batubara, MS Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi Pembimbing I Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS Ketua Departemen Kimia

Tanggal Lulus:

vii  

PRAKATA  

Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya yang berlimpah penulis dapat menyelesaikan laporan hasil penelitian yang berjudul Daun Ki Pahit (Tithonia diversifolia) sebagai Sumber Antibakteri dan Antioksidan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Irmanida Batubara, MS selaku pembimbing pertama dan Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi atas bimbingan dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis. Budi Arifin, MSi sebagai komisi pendidikan dan penguji seminar, serta Prof Dr Ir Suminar S. Achmadi, MS dan Sri Sugiarti, PhD sebagai penguji sidang komprehensif yang telah memberikan banyak masukan akademik. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua penulis atas doa, dukungan, dan pengertiannya. Pihak yang telah berkontribusi dalam memberikan masukan teknis, antara lain Staf Kependidikan Laboratorium Kimia Analitik, yaitu Pak Eman, Bu Nunung, Pak Dede, dan Pak Kosasih, pihak di Pusat Studi Biofarmaka, yaitu Bu Nunuk, Mbak Ina, Mas Endi, dan Mas Antonio, serta teman satu tim penelitian, yaitu Iren, Fiqa, Saima, dan Rahmi.

Semoga laporan hasil penelitian ini dapat bermanfaat.

Bogor, Agustus 2013

Ade Suherman

viii  

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL vii DAFTAR GAMBAR vii DAFTAR LAMPIRAN vii PENDAHULUAN 1 BAHAN DAN METODE 2

Alat dan Bahan 2 Metode 2 Pengumpulan dan Pengeringan Sampel 2 Preparasi dan Ekstraksi Sampel 2 Isolasi Minyak Atsiri Daun Ki Pahit (Muchtaridi et al. 2003) 3 Penentuan Kadar Air dan Kadar Abu 3 Penentuan Eluen Terbaik (Houghton dan Raman 1998) 3 Uji Fitokimia (Harborne 1987) 3 Uji Aktivitas Antibakteri (Batubara et al. 2009) 3 Uji Aktivitas Antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2011) 4 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom dan KLT Preparatif 4 Uji Fitokimia Lanjutan, Uji Antioksidan dengan Metode Bioautografi, dan Uji Aktivitas Lanjutan 4 Identifikasi Senyawa 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 5 Kadar Air dan Abu 5 Ekstraksi dan Distilasi 5 Komponen Minyak Atsiri Menggunakan GCMS 6 Fitokimia Ekstrak 8 Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan Ekstrak Hasil Partisi dan Minyak Atsiri 8 Eluen Terbaik 10 Aktivitas Antioksidan dengan KLT Bioautografi dan Fitokimia Lanjutan Fraksi-Fraksi Hasil Kromatografi Kolom 11 Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan Fraksi 12 Identitas Senyawa Aktif 13

SIMPULAN DAN SARAN 14 DAFTAR PUSTAKA 14 LAMPIRAN 24 RIWAYAT HIDUP 24 

vii  

DAFTAR TABEL 1 Rendemen ekstrak dan minyak atsiri sampel 6 2 Kandungan minyak atsiri daun ki pahit menggunakan GCMS 7 3 Kandungan metabolit sekunder ekstrak sampel 8 4 Aktivitas antibakteri dan antioksidan ekstrak hasil partisi dan minyak atsiri 9 5 Antibakteri dan antioksidan hasil fraksionasi dari ekstrak metanol sisa 12 6 Antibakteri dan antioksidan hasil fraksionasi dari F1 13

DAFTAR GAMBAR 1 Tanaman ki pahit 5 2 Struktur komponen monoterpena minyak atsiri daun ki pahit 7 3 Struktur komponen seskuiterpena minyak atsiri daun ki pahit 7 4 Mekanisme penghambatan radikal bebas DPPH oleh sampel 9 5 Kromatogram ekstrak metanol sisa dengan eluen tunggal dari kiri ke kanan: n-

heksana, toluena, aseton, n-butanol, diklorometana, kloroform, asam asetat, dietil eter, dan etil asetat 10

6 Kromatogram ekstrak metanol sisa dengan eluen campuran kloroform:etil asetat dari kiri ke kanan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9) 11

7 Kromatogram bioautografi dengan pewarnaan DPPH menggunakan kloroform:etil asetat (9:1) 11

8 Struktur auron (Detsi et al. 2009) 14

DAFTAR LAMPIRAN  1 Bagan alir penelitian 17 2 Hasil determinasi tanaman ki pahit 18 3 Penentuan kadar air serbuk sampel ki pahit 19 4 Penentuan kadar abu serbuk sampel ki pahit 19 5 Penentuan rendemen ekstrak metanol sisa 20 6 Rendemen minyak atsiri 20 7 Penentuan komponen minyak atsiri menggunakan instrumen GCMS 21 8 Contoh perhitungan nilai IC50 DPPH untuk ekstrak metanol sisa 21 9 Fitokimia lanjutan dan antioksidan secara bioautografi 22 10 Hasil identifikasi senyawa F1.2 menggunakan KLT analitik (a) sebelum

ditambah uap amonia dan (b) setelah ditambahkan uap amonia 22 11 Identifikasi senyawa aktif F1.2 menggunakan spektrofotometer UV-Vis 23 12 Identifikasi senyawa aktif F1.2 menggunakan FTIR 23

1  

PENDAHULUAN

Penyakit gatal-gatal dan infeksi pada kulit masih menjadi penyakit yang

mewabah di Indonesia terutama pascabanjir atau di kalangan penduduk yang tinggal di daerah pemukiman padat dan kumuh. Salah satu penyebabnya adalah bakteri. Bakteri yang secara alami tumbuh pada kulit manusia, di antaranya Staphylococcus epidermidis dan S. aureus. Kedua bakteri tersebut dapat menyebabkan infeksi pada kulit. Banyak usaha telah dilakukan untuk melawan bakteri dengan menemukan zat yang mampu menghambat aktivitasnya, yaitu antibiotik. Antibiotik merupakan hasil langsung metabolit sekunder mikroorganisme, tetapi ada juga yang digunakan dalam bentuk turunannya yang telah mengalami modifikasi kimia untuk meningkatkan daya kerja dan efektivitasnya. Antibiotik yang banyak digunakan, antara lain amoksilin, tetrasiklin, penisilin, dan kloramfenikol. Dampak negatif penggunaan zat ini ialah dapat menyebabkan timbulnya resistensi bakteri pada kinerja antibiotik (Utami 2012). Alternatif yang dapat dilakukan dalam menanggulangi masalah ini adalah mencari zat antibakteri baru yang berasal dari tanaman.

Beberapa tanaman yang telah dilaporkan memiliki aktivitas untuk mengobati infeksi, seperti daun arbenan (Aulia 2008), rimpang temu lawak (Hudayanti 2008), dan ki pahit (Jamal dan Agusta 1999; Obafemi et al. 2006). Tanaman-tanaman yang memiliki potensi untuk mengobati infeksi perlu diuji aktivitas antibakteri dan ditentukan komponen aktifnya. Tanaman ki pahit (Tithonia diversifolia) merupakan tanaman perdu yang sangat berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat herbal. Tanaman ini umumnya digunakan sebagai insektisida botani, ekstrak air daun tanaman ini telah diteliti berpotensi sebagai insektisida botani pada hama tungau Eriophyidae (Taofik et al. 2010). Selain itu, tanaman ini dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antikanker (Wahyuningsih dan Wahyuono 1999), antimalaria (Elifuoye dan Agbedahunsi 2004), antioksidan (Shyur et al. 2005), antiradang (Chagas-Paula et al. 2011), dan antihiperglikemik (Zhao et al. 2012).

Di sisi lain, manusia dapat mengalami penuaan lebih cepat dan terkena penyakit seperti kanker dan jantung koroner karena efek dari radikal bebas dalam tubuh. Keberadaan antioksidan dapat menghambat reaksi radikal bebas. Ekstrak etanol daun ki pahit diketahui mengandung senyawa flavonoid dan beberapa golongan seskuiterpena (Jamal dan Agusta 1999). Kandungan flavonoid menyebabkan tanaman ini juga berpotensi sebagai antioksidan. Banyak penelitian telah dilakukan dalam mengidentifikasi aktivitas antioksidan dari tanaman dengan menghitung total fenol dan flavonoid seperti pada tanaman Persea americana (Asaolu et al. 2010). Metode penentuan aktivitas antioksidan antara lain dilakukan melalui metode penangkapan radikal DPPH, reduksi serium (IV), pemucatan β-karotena, dan tiosianat. Metode penangkapan radikal 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH) umum digunakan, seperti yang telah dilakukan oleh Batubara et al. (2009) dan Salazar-Aranda et al. (2011).

Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini bertujuan menentukan efektivitas ekstrak dan minyak atsiri daun ki pahit sebagai antibakteri terhadap S. epidermidis dan S. aureus, serta antioksidan dengan metode DPPH. Pencirian

2  

komponen aktif juga dilakukan setelah dimurnikan dengan menggunakan kromatografi kolom dan lapis tipis preparatif.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan, ialah seperangkat alat gelas, pelat KLT analitik, pelat KLT preparatif, alat distilasi, spektrofotometer UV-Vis, GC-MS, FTIR, microplate reader, autoklaf, laminar air flow, 96-wellplate, dan neraca analitik. Bahan-bahan yang digunakan adalah daun ki pahit, pelarut organik, S. epidermidis dan S. aureus (Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia), trypticase soy broth (TSB), trypticase soy agar (TSA), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), asam askorbat, pereaksi Lieberman-Buchard, pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendorf, DMSO, kloramfenikol, tetrasiklin, dan silika gel G60F254.

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia Analitik dan Laboratorium Bersama, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor; Herbarium Bogoriense, LIPI, Cibinong; Pusat Studi Biofarmaka Bogor; serta Laboratorium Forensik, Mabes Polri, Jakarta pada bulan Desember 2012−Mei 2013.

Metode

Bioaktivitas daun ki pahit dan identifikasi senyawa aktifnya sebagai antibakteri dan antioksidan dianalisis dengan beberapa tahap, yaitu koleksi dan preparasi sampel, penentuan kadar air dan kadar abu (AOAC 2007), ekstraksi sampel dengan partisi cair-cair, distilasi (Muchtaridi et al. 2003), uji fitokimia ekstrak ki pahit (Harborne 1987), penentuan eluen terbaik, fraksionasi menggunakan kolom dan KLT preparatif, uji fitokimia lanjutan, pengujian aktivitas antibakteri (Batubara et al. 2009), serta pengujian aktivitas antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2011) (Lampiran 1).

Pengumpulan dan Pengeringan Sampel

Tanaman ki pahit diperoleh di daerah Gulagumantung, Desa Cipelang, Kecamatan Cijeruk, Kabupaten Bogor. Sebagian daun segar didistilasi dan sebagian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 40−50 oC selama 4−5 hari. Sampel kering digiling dan diayak dengan ukuran 40 mesh.  

Preparasi dan Ekstraksi Sampel Serbuk ki pahit dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan metanol.

Nisbah sampel dan pelarut, yaitu 1:10. Maserasi dilakukan selama 24 jam. Ekstrak metanol kemudian dipartisi berturut-turut dengan pelarut n-heksana, etil asetat, dan air. Filtrat dipekatkan dengan menggunakan penguap putar. Setiap ekstrak

3  

diuapkan dengan penguap putar sampai semua pelarut menguap dan rendemen dari setiap ekstrak ditentukan. Ekstrak siap untuk dianalisis. Isolasi Minyak Atsiri Daun Ki Pahit (Muchtaridi et al. 2003)

Potongan daun ki pahit yang telah bersih dimasukkan ke dalam distilator stahl, lalu ditambahkan akuades (sampel:akuades 1:2). Distilasi air dilakukan selama 6 jam dengan suhu 100-105 oC. Distilat yang diperoleh didiamkan selama 24 jam dan minyak dipisahkan dengan cara dipartisi menggunakan etil asetat. Minyak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan penguap putar. Komponen minyak atsiri diidentifikasi kandungan senyawanya menggunakan GC-MS. Penentuan Kadar Air dan Kadar Abu

Penentuan kadar air dan abu sesuai dengan metode AOAC (2007). Penentuan Eluen Terbaik (Houghton dan Raman 1998)

Eluen terbaik ditentukan pada ekstrak dengan aktivitas antioksidan dan antibakteri terbaik. Ekstrak ditotolkan pada pelat KLT jenis silika gel G60F254 dari Merck. Setelah itu, noda kering pada pelat KLT dielusi di dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan eluen. Eluen yang digunakan adalah n-heksana, aseton, dietil eter, etil asetat, kloroform, metanol, toluena, asam asetat, dan n-butanol. Eluen terbaik ditentukan menggunakan eluen tunggal dengan membandingkan spot dan pemisahannya di bawah paparan UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen yang menghasilkan noda terbanyak dan terpisah baik dipilih sebagai eluen terbaik. Jika terdapat lebih dari 1 eluen yang memenuhi kriteria, maka eluen-eluen tersebut dicampurkan dengan nisbah tertentu. Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Uji kandungan alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, triterpenoid, dan tanin sesuai dengan metode Harborne (1987).

Uji Aktivitas Antibakteri (Batubara et al. 2009)

Bakteri uji adalah S. epidermidis dan S. aureus dengan medium trypticase soy broth (TSB). Sebanyak 100 μL medium steril dan 40 μL sampel dilarutkan dalam DMSO 20% atau kontrol, serta 5 μL inokulum bakteri dimasukkan ke dalam masing-masing sumur (96-well plate). Inokulum yang telah disiapkan pada konsentrasi 10-2 CFU/mL. Kedua bakteri diinkubasi dalam medium selama 24 jam pada suhu 37 oC. Konsentrasi sampel yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri (bening) secara visual dideskripsikan sebagai konsentrasi hambat minimum (KHM).

Sebanyak 10 μL dari medium yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri diinokulasikan pada 100 μL medium baru dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Konsentrasi yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri setelah inokulasi kedua dideskripsikan sebagai konsentrasi bunuh minimum (KBM). Kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO 20% dan kontrol positifnya adalah tetrasiklin dan kloramfenikol.

4  

Uji Aktivitas Antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2011) Uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah uji penangkapan radikal

bebas DPPH. Sampel dilarutkan di dalam etanol hingga diperoleh konsentrasi 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, dan 400 μg/mL. Alikuot sampel dan 100 μL DPPH 125 μM ditambahkan ke dalam masing-masing sumur (96-wellplate). Setelah diinkubasi 30 menit, diukur absorbansnya pada panjang gelombang 517 nm. Asam askorbat digunakan sebagai kontrol positif dan etanol sebagai kontrol negatif. Absorbans sampel dan kontrol positif dengan berbagai konsentrasi diukur tiga kali ulangan (triplo). Aktivitas inhibitor dihitung dengan persamaan:

Inhibisi (%)= [1-(A sampel-A kontrol)/(A blangko-A kontrol)] x 100% Pemisahan dengan Kromatografi Kolom dan KLT Preparatif

Ekstrak metanol sisa dipisahkan menggunakan kromatografi kolom. Elusi dilakukan dengan menggunakan eluen terbaik. Eluat yang diperoleh ditampung setiap 3 mL dan dideteksi dengan KLT. Visualisasi noda pada KLT dengan dipaparkan sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Setiap fraksi yang memiliki pola KLT yang sama digabung lalu diuji kembali aktivitasnya untuk menentukan fraksi yang paling aktif. Jika fraksi teraktif memiliki noda lebih dari satu, maka dilakukan fraksionasi lanjut menggunakan KLT preparatif. Uji Fitokimia Lanjutan, Uji Antioksidan dengan Metode Bioautografi, dan Uji Aktivitas Lanjutan

Uji fitokimia lanjutan dilakukan untuk mendeteksi flavonoid dan steroid. Deteksi keberadaan flavonoid dengan menggunakan uap amonia, sedangkan deteksi keberadaan steroid dengan menyemprotkan pereaksi Lieberman-Buchard terhadap sampel yang dielusi pada pelat KLT. Aktivitas antioksidan secara kualitatif diuji dengan metode bioautografi. Fraksi ditotolkan pada pelat KLT dan dielusi menggunakan eluen terbaik. Setelah itu pelat KLT disemprot dengan larutan DPPH 125 μM. Aktivitas lanjutan secara kuantitatif diuji seperti metode sebelumnya. Identifikasi Senyawa

Fraksi teraktif dilihat kembali pola nodanya menggunakan KLT. Senyawa aktif diidentifikasi dengan dipaparkan uap amonia. Identifikasi senyawa dilakukan juga menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Pelet KBr-sampel dikeluarkan dan diletakkan pada wadah sampel FTIR dan dimasukkan ke dalam kompartemen sampel, kemudian dilakukan pemayaran menggunakan FTIR. Sampel dilarutkan dengan metanol dan dibaca serapannya dengan panjang gelombang tertentu menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

 

 

 

5  

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar Air dan Abu

Daun ki pahit (T. diversifolia) (Gambar 1) telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) untuk memastikan spesies yang diinginkan (Lampiran 2). Daun kering digiling untuk meningkatkan luas permukaannya sehingga mempercepat perpindahan komponen ke dalam pelarut sesuai dengan kepolarannya.

Gambar 1 Tanaman ki pahit

Kadar air serbuk diperoleh sebesar 3.96% (Lampiran 3). Bahan dengan kadar air kurang dari 10% dapat memiliki umur penyimpanan yang panjang karena dapat meminimumkan pertumbuhan mikroorganisme, terutama bakteri dan kapang. Selain itu, kadar air kurang dari 10% ini merupakan syarat untuk bahan baku obat tradisional (Kemenkes RI 1994). Kadar air juga digunakan untuk mengoreksi rendemen ekstrak yang diperoleh sehingga dapat ditentukan rendemen berdasarkan bobot kering.

Penentuan kadar abu dianalisis dengan mengarangkan sampel sampai tidak mengeluarkan asap. Setelah itu, diabukan di dalam tanur untuk menghilangkan bahan organik yang terdapat dalam sampel. Kadar abu serbuk yang diperoleh sebesar 11.35% (Lampiran 4). Kadar abu yang semakin tinggi menunjukkan semakin banyaknya kandungan mineral pada sampel tersebut. Warna abu, yaitu hijau toska sesuai dengan kandungan mineral pada serbuk tersebut. Ki pahit memiliki kemampuan mengakumulasi unsur hara esensial pada jaringan tubuhnya dan daun keringnya mengandung hara yang tinggi, yaitu sekitar 3.5−4.0% nitrogen, 0.35−0.38% fosforus, 3.5−4.1% kalium, 0.59% kalsium, dan 0.27% magnesium (Chukwuka dan Omotayo 2008). Asal tempat dan kondisi tanah memengaruhi kandungan kadar air dan mineral tanaman.   

Ekstraksi dan Distilasi

Ekstraksi dilakukan pada suhu kamar guna mencegah rusaknya komponen-komponen pada sampel yang tidak tahan panas. Teknik ekstraksi maserasi dipilih karena sederhana dan dapat meminimumkan kerusakan komponen yang tidak

6  

tahan panas meskipun metode ini membutuhkan banyak pelarut dan rendemen yang dihasilkan umumnya lebih kecil dibandingkan dengan metode ekstraksi lainnya (Meloan 1999). Rendemen ekstrak dan minyak atsiri daun ki pahit tersaji pada Tabel 1.

Tabel 1 Rendemen ekstrak dan minyak atsiri sampel

Sampel %Rendemen berdasarkan bobot

Basah Kering Metanol sisa 2.84 ± 0.32 2.96 ± 0.33

Etil asetat 1.18 ± 0.14 1.25 ± 0.13 n-Heksana 0.78 ± 0.03 0.81 ± 0.03

Minyak atsiri 5.77 × 10-3 6.01 × 10-3

Metanol memiliki kemampuan mengekstraksi komponen polar dan nonpolar dari sampel karena memiliki tetapan dielektrik yang relatif tinggi, yaitu 32.6 (Watson 2007). Filtrat yang diperoleh berwarna hijau kehitaman. Ekstrak metanol kemudian dipartisi dengan menggunakan pelarut lain dengan kepolaran yang berbeda (dari nonpolar hingga polar) berturut-turut n-heksana, etil asetat, dan air. Prinsip ekstraksi cair-cair ini adalah kemampuan berpindahnya zat terlarut dalam cairan yang memiliki perbedaan kepolaran (like dissolve like). Pemisahan metanol dan air tidak menghasilkan residu sehingga fraksi air tidak dapat dianalisis lebih lanjut. Fraksi-fraksi yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar di bawah titik didih pelarut sampai pelarut menguap seluruhnya dan diperoleh bobot konstan. Penentuan rendemen ekstrak tersaji pada Lampiran 5.

Daun segar yang didistilasi dikumpulkan pada pagi hari. Distilat yang diperoleh dipartisi dengan etil asetat untuk memisahkan minyak atsiri. Fraksi etil asetat lalu diuapkan dengan penguap putar dan dihilangkan airnya dengan menggunakan natrium sulfat anhidrat. Rendemen minyak atsiri yang diperoleh sangat kecil, kurang dari 1% mungkin disebabkan kandungan minyak atsiri pada bagian daun tanaman ini hanya sedikit (Tabel 1). Contoh perhitungan rendemen minyak atsiri tersaji pada Lampiran 6.  

Komponen Minyak Atsiri Menggunakan GCMS

Komponen utama minyak atsiri ialah golongan terpenoid. Secara kimia, terpena minyak atsiri digolongkan menjadi monoterpena dan seskuiterpena yang mengandung kerangka isoprena CH2=C(CH3)−CH=CH2. Hasil yang diperoleh dari jumlah puncak kromatogram GC-MS menunjukkan 51 komponen pada minyak atsiri daun ki pahit dengan komponen utama golongan monoterpena dan seskuiterpena, serta komponen lainnya seperti golongan hidrokarbon dan alkohol (Lampiran 7). Komponen paling tinggi, yaitu β-kariofilena dengan kadar sebesar 21.55% (Tabel 2). Golongan monoterpena terdiri atas 2 unit isoprena, seperti 4-aliloksimino-2-karena (Gambar 2), sedangkan golongan seskuiterpena terdiri atas 3 unit isoprena, seperti β-bisabolena, β-kariofilena, trans-nerolidol, α-kopaena, dan kariofilena oksida (Gambar 3). Soetjipto et al. (2008) melaporkan bahwa minyak atsiri daun ini mengandung 29 komponen. Komponen utamanya ialah β-kariofilena (27.7%), trans-nerolidol (21.81%), kariofilena oksida (7.06%),

7  

kopatanam

 

  

aena (6.41%man ini berp

Tabel 2 K

Golongan Seskuiterpena

Monoterpena

Gambar 2

Gambar 3

%), dan β-bpengaruh pa

Kandungan

a

K4-A

Struktur ko

β-kari

β-bisab

Struktur ko

bisilogermaada kompon

minyak atsi

Komponeα-Kopaenβ-Kariofilenβ-Bisabolen

trans-NeroliKariofilena ok

Aliloksimino-2

4-aliloksiomponen m

ofilena

bolena

trans-nomponen se

akrena (4.90nen minyak

iri daun ki p

en a na na idol ksida 2-karena

imino-2-karmonoterpena

kario

norelidol eskuiterpena

0%). Perbek atsirinya.

pahit menggWaktu retensi (menit) 12.95 13.6 14.38 14.93 15.63 15.52

rena a minyak ats

α-kopaena

ofilena oksi

a minyak ats

edaan temp

gunakan GC

% kada4.58 21.55 4.27 8.89 5.90 9.32

Lain-lain hi100%

siri daun ki

a

da

siri daun ki

at tumbuh

CMS

ar

ingga

pahit

pahit

8  

Fitokimia Ekstrak Uji fitokimia pada ekstrak hasil partisi cair-cair dilakukan untuk memperkirakan kandungan metabolit sekunder pada sampel secara kualitatif (Harborne 1987). Dugaan kandungan metabolit ini berguna untuk memperkirakan metabolit sekunder yang berpengaruh pada bioaktivitas sebagai antibakteri dan antioksidan, termasuk penentuan senyawa aktifnya.

Ekstrak metanol sisa banyak mengandung flavonoid, kandungan flavonoid relatif tinggi pada ekstrak daun ki pahit seperti yang telah dilaporkan oleh Zhao et al. (2012). Kandungan lainnya adalah tanin, saponin, dan steroid. Ekstrak etil asetat memiliki kandungan metabolit sekunder yang sama, tetapi jumlahnya lebih sedikit dibandingkan dengan ekstrak metanol sisa. Ekstrak n-heksana hanya mengandung steroid dan flavonoid (Tabel 3). Kandungan flavonoid dan tanin pada ekstrak hasil partisi cair-cair tersebut berpotensi memiliki aktivitas sebagai antibakteri dan antioksidan. Flavonoid dan tanin merupakan golongan polifenol, apabila digunakan dalam konsentrasi yang tinggi akan merusak membran sitoplasma secara total dengan mengendapkan protein sel. Namun, pada konsentrasi rendah, fenol merusak membran sel yang menyebabkan kebocoran metabolit penting dan menginaktifkan bakteri (Madigan 2005).

Tabel 3 Kandungan metabolit sekunder ekstrak sampel

Jenis metabolit sekunder Metanol sisa

Etil asetat n-Heksana

Tanin + + - Saponin ++ + - Steroid ++ + ++

Triterpenoid - - - Alkaloid - - -

Flavonoid ++++ +++ + Keterangan: + intensitas sedang +++ intensitas lebih pekat

++ intensitas pekat ++++ intensitas sangat pekat - tidak teridentifikasi

Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan Ekstrak Hasil Partisi dan Minyak

Atsiri

Bakteri S. aureus dan S. epidermidis dapat menyebabkan infeksi oportunistik (menyerang kepada seseorang yang memiliki kekebalan tubuh yang lemah) (Lindsay 2008). Penentuan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode dilusi menggunakan medium steril TSB. Medium ini umum digunakan karena kaya akan nutrisi untuk pertumbuhan bakteri dan kedua bakteri yang digunakan merupakan jenis aerob fakultatif dan gram positif. Metode dilusi memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode difusi, di antaranya lebih peka, jenis mikrodilusi membutuhkan sampel relatif sedikit, serta mampu membedakan efek bakteriostatik dan bakteriosidal. Pada metode dilusi aktivitas ditentukan dengan melihat kekeruhan yang terjadi. Medium yang lebih jernih daripada sebelumnya menandakan aktivitas mikrob terhambat (Batubara et al. 2009).

Aktivitas antioksidan dinyatakan berdasarkan kemampuan sampel menghambat aktivitas radikal bebas DPPH. Sampel yang memiliki aktivitas

9  

sebagai antioksidan akan mendonorkan atom H dan mengubah warna ungu DPPH menjadi lebih pudar (1,1-difenil-2-pikrilhidrazina) (Gambar 4).

Gambar 4 Mekanisme penghambatan radikal bebas DPPH oleh sampel

(Yuhernita dan Juniarti 2011)  

Cara mengetahui aktivitas penghambatan sampel terhadap pertumbuhan bakteri ialah dengan menentukan nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM). KHM adalah konsentrasi sampel yang menyebabkan pertumbuhan bakteri terhambat (bakteriostatik), sedangkan KBM adalah konsentrasi sampel untuk membunuh bakteri (bakteriosidal). Nilai KHM dan KBM terangkum pada Tabel 4. Ekstrak metanol sisa memiliki aktivitas antibakteri terbaik dibandingkan dengan sampel lainnya terhadap S. aureus (KHM 1.00 mg/mL) dan S.epidermidis (KHM 2.00 mg/mL), meskipun nilai KBM hanya dapat ditentukan di atas 2.00 mg/mL. Kloramfenikol sudah mampu menghambat kedua bakteri tersebut pada konsentrasi lebih rendah, yaitu 0.06 mg/mL, sedangkan tetrasiklin juga mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan S. epidermidis berturut-turut pada 0.13 dan 0.02 mg/mL. Sementara itu, kloramfenikol dan tetrasiklin mampu membunuh S. aureus dan S. epidermidis pada konsentrasi 0.25 mg/mL. Mekanisme kerja kloramfenikol dan tetrasiklin ialah dengan menghambat sintesis protein sel mikrob.

Tabel 4 Aktivitas antibakteri dan antioksidan ekstrak hasil partisi dan minyak

atsiri

Sampel

Antibakteri

Antioksidan (DPPH) IC50

(µg/mL)

S. aureus* S. epidermidis**

KHM (mg/mL)

KBM (mg/mL)

KHM (mg/mL)

KBM (mg/mL)

Ekstrak metanol sisa 1.00 >2.00 2.00 >2.00 27.88 ± 4.00 Ekstrak etil asetat 2.00 >2.00 1.00 >2.00 41.67 ± 2.18 Ekstrak n-heksana 2.00 >2.00 >2.00 >2.00 291.19 ± 30.18

Minyak atsiri 2.00 >2.00 2.00 >2.00 859.21 ± 251.20 Kloramfenikol 0.06 0.25 0.06 0.25

Tetrasiklin 0.13 0.25 0.02 0.25 DMSO 20% - - - -

Asam askorbat             6.74 ± 2.38 Keterangan: * Koloni bakteri 10-7 CFU/mL ** Koloni bakteri 10-6 CFU/mL (-) Tidak aktif ( ) Tidak diuji

10  

Aktivitas antibakteri minyak atsiri terhadap kedua bakteri (KHM 2.00 mg/mL). Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus dan S. epidermidis (KHM 2.00 dan 1.00 mg/mL), sedangkan ekstrak n-heksana (KHM 2.00 mg/mL) hanya mampu menghambat pertumbuhan S. aureus. Larutan DMSO 20% sebagai blangko dinyatakan tidak memiliki aktivitas menghambat aktivitas antibakteri (tidak aktif). Obafemi et al. (2006) melaporkan etil asetat merupakan ekstrak teraktif karena mampu menghambat bakteri Gram (+) dan (-) yang diujikan dengan menggunakan strepromisin sebagai kontrol positif. Pada konsentrasi 2.00 mg/mL, ekstrak etil asetat mampu menghasilkan zona hambat sebesar 16 mm terhadap pertumbuhan S. aureus.

Data antioksidan menunjukkan bahwa ekstrak metanol sisa memiliki kemampuan aktivitas antioksidan terbaik (IC50 27.88 μg/mL) meskipun masih hampir 5 kali kurang aktif dibandingkan dengan asam askorbat. Ekstrak metanol sisa dan etil asetat memiliki kemampuan antioksidan yang sangat kuat, sedangkan ekstrak n-heksana dan minyak atsiri memiliki kemampuan antioksidan yang sangat lemah. Shyur et al. (2005) melaporkan ekstrak metanol daun ki pahit memiliki IC50 sebesar 127 μg/mL. Nilai IC50 berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidannya, semakin kecil nilai IC50 berarti semakin baik aktivitas antioksidannya. Warna ungu radikal DPPH dapat diamati dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 50 μg/mL, kuat apabila nilai IC50 50-100 μg/mL, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 100-150 μg/mL, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 150-200 μg/mL (Molyneux 2004). Oleh sebab itu, ekstrak metanol sisa difraksionasi menggunakan kromatografi kolom untuk ditentukan aktivitas fraksi aktifnya.

Eluen Terbaik

Eluen tunggal yang dipilih memiliki sifat kepolaran yang berbeda. Eluen yang telah dimasukkan ke dalam bejana kecil didiamkan beberapa menit untuk penjenuhan agar proses pemisahan noda berlangsung lebih cepat. Berdasarkan hasil yang diperoleh, eluen tunggal terbaik yang dipilih adalah etil asetat dan kloroform.

 

 

 Gambar 5 Kromatogram ekstrak metanol sisa dengan eluen tunggal dari kiri ke

kanan: n-heksana, toluena, aseton, n-butanol, diklorometana, kloroform, asam asetat, dietil eter, dan etil asetat

Etil asetat menghasilkan pola pemisahan yang baik, noda-noda yang masih

menumpuk di bagian tengah akan dipisahkan oleh kloroform (Gambar 5).

11  

Selanjutnya dilakukan penentuan eluen campuran terbaik dengan elusi step gradient (peningkatan kepolaran) (Gambar 6). Eluen campuran terbaik yang dipilih adalah campuran kloroform:etil asetat (9:1) karena memiliki pola pemisahan yang baik dan jumlah noda yang paling banyak.

Gambar 6 Kromatogram ekstrak metanol sisa dengan eluen campuran

kloroform:etil asetat dari kiri ke kanan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9)

 Aktivitas Antioksidan dengan KLT Bioautografi dan Fitokimia Lanjutan

Fraksi-Fraksi Hasil Kromatografi Kolom

Ekstrak metanol sisa difraksionasi menggunakan eluen campuran terbaik. Eluat yang dihasilkan ditotolkan pada KLT. Fraksi yang memiliki pola pemisahan dan nilai Rf yang sama digabungkan menjadi 1 fraksi. Diperoleh 13 fraksi dengan pola pemisahan yang berbeda. Uji kualitatif aktivitas antioksidan fraksi dilakukan dengan KLT bioautografi. Fraksi yang aktif mampu memudarkan warna ungu dari DPPH (Gambar 7). Ketiga belas fraksi dinyatakan aktif (Lampiran 9). F1-F6 hanya menunjukkan sebagian noda yang aktif, sedangkan semua noda pada F7-F14 aktif. Nilai IC50 dianalisis secara kuantitatif menggunakan microplate reader. Uji flavonoid dan steroid menggunakan KLT tidak dapat terdeteksi dengan jelas maka dilakukan uji fitokimia dengan metode seperti penentuan metabolit sekunder pada ekstrak. Semua fraksi mengandung flavonoid, tetapi hanya F1 dan F2 yang mengandung steroid (Lampiran 9).

Gambar 7 Kromatogram bioautografi dengan pewarnaan DPPH menggunakan

kloroform:etil asetat (9:1)

12  

Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan Fraksi Aktivitas antibakteri terbaik ditunjukkan oleh F1, F2, dan F3 terhadap S.

aureus (KHM 0.25 mg/mL dan KBM 1.00 mg/mL). F6 dan F9 (KHM 1.00 mg/mL), dan fraksi-fraksi lainnya (KHM 2.00 mg/mL), kecuali F12 (KHM > 2.00 mg/mL). Aktivitas atibakteri kloramfenikol dan tetrasiklin masih lebih baik, dengan KHM berturut-turut 0.03 dan 0.02 mg/mL serta KBM 0.06 dan 0.03 mg/mL. Di sisi lain pada konsentrasi 0.50 mg/mL, F1, F2, dan F3 sudah mampu menghambat pertumbuhan S. aureus, F4 lebih dari 2.00 mg/mL, serta fraksi lainnya pada 2.00 mg/mL. Pada konsentrasi 2.00 mg/mL, F1, F2, dan F3 sudah mampu membunuh bakteri tersebut, sisanya lebih dari 2.00 mg/mL. Kloramfenikol dan tetrasiklin mampu menghambat bakteri berturut-turut pada 0.06 dan 0.02 mg/mL, serta mampu membunuh bakteri pada 0.06 dan 0.03 mg/mL. Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik ialah F1 dengan IC50 22.88 μg/mL, disusul oleh F9 sebesar 99.60 μg/mL. Perbedaan hasil ini dengan metode bioautografi dapat disebabkan konsentrasi yang terlalu tinggi yang ditotolkan pada pelat KLT. Asam askorbat sebagai kontrol positif uji antioksidan masih memiliki IC50 4 kali lebih rendah daripada F1, yaitu 4.77 μg/mL. F1 merupakan fraksi teraktif karena memiliki aktivitas terbaik sebagai antibakteri dan antioksidan maka dipilih untuk difraksionasi lebih lanjut menggunakan KLT preparatif dan kembali ditentukan kedua aktivitasnya untuk fraksi-fraksi yang dihasilkan. Rendemen fraksi tertinggi juga dimiliki oleh F1, yaitu 36.42%.

Tabel 5 Antibakteri dan antioksidan hasil fraksionasi dari ekstrak metanol sisa       Antibakteri

Antioksidan (DPPH) IC50

(μg/mL) Fraksi Rendemen

(%)

S. aureus* S. epidermidis** KHM

(mg/mL) KBM

(mg/mL) KHM

(mg/mL) KBM

(mg/mL) F1 36.42 0.25 1.00 0.50 2.00 22.88 ± 8.73 F2 5.36 0.25 1.00 0.50 2.00 >400 F3 2.86 0.25 1.00 0.50 2.00 325.16 ± 25.49 F4 1.74 2.00 >2.00 >2.00 >2.00 >400 F5 1.54 2.00 2.00 2.00 >2.00 >400 F6 2.58 1.00 2.00 2.00 >2.00 375.91 ± 32.31 F7 4.60 2.00 >2.00 2.00 >2.00 >400 F8 3.98 2.00 >2.00 2.00 >2.00 >400 F9 12.98 1.00 >2.00 2.00 >2.00 99.60 ± 30.36 F10 8.35 2.00 >2.00 2.00 >2.00 299.15 ± 10.58 F11 5.94 2.00 >2.00 2.00 >2.00 258.61 ± 43.71 F12 10.15 >2.00 >2.00 2.00 >2.00 265.17 ± 38.96 F13 3.58 2.00 >2.00 2.00 >2.00 186.99 ± 61.61

Asam Askorbat  4.79 ± 0.09 Kloramfenikol  0.03 0.06 0.06 0.06 Tetrasiklin  0.02 0.03 0.02 0.03 DMSO 20% - - - -   

Keterangan: * Koloni bakteri 10-7 CFU/mL ** Koloni bakteri 10-6 CFU/mL (-) Tidak aktif ( ) Tidak Diuji

13  

Fraksionasi lanjut F1 menggunakan KLT preparatif dengan eluen terbaik kloroform:etil asetat (9:1) menghasilkan 11 fraksi. Hasil uji aktivitas antibakteri dan antioksidan fraksi-fraksi tersebut tersaji pada Tabel 6.

Tabel 6 Antibakteri dan antioksidan hasil fraksionasi dari F1

Fraksi Rendemen

(%) Rf

Antibakteri S. aureus* S. epidermidis**

Antioksidan IC50 (μg/mL)

KHM (mg/mL)

KBM (mg/mL)

KHM (mg/mL)

KBM (mg/mL)

F1.1 8.21 0.16 1.00 1.00 2.00 >2.00 311.62 ± 33.84 F1.2 8.86 0.30 0.25 0.50 0.50 2.00 30.94 ± 14.96 F1.3 4.41 0.38 1.00 2.00 2.00 >2.00 252.51 ± 50.50 F1.4 5.96 0.44 1.00 1.00 2.00 >2.00 >400 F1.5 5.66 0.53 0.25 1.00 2.00 >2.00 >400 F1.6 4.51 0.60 2.00 2.00 >2.00 >2.00 >400 F1.7 4.96 0.71 2.00 >2.00 2.00 >2.00 >400 F1.8 25.84 0.76 2.00 2.00 2.00 >2.00 >400 F1.9 8.36 0.82 2.00 2.00 2.00 >2.00 199.67 ± 24.98

F1.10 4.81 0.89 >2.00 >2.00 >2.00 >2.00 >400 F1.11 5.06 0.95 2.00 2.00 2.00 >2.00 >400

Asam Askorbat Kloramfenikol Tetrasiklin DMSO 20%

3.90 ± 0.50 0.03 0.06 0.03 0.06 0.02 0.02 0.02 0.02

   - - - - Keterangan: * Koloni bakteri 10-7 CFU/mL ** Koloni bakteri 10-6 CFU/mL (-) Tidak aktif ( ) Tidak diuji

Rendemen F1.2 kedua tertinggi, yaitu 8.86%, dan memiliki aktivitas antibakteri serta antioksidan terbaik. Pada konsentrasi 0.25 mg/mL, F1.2 sudah mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan sudah mampu membunuhnya pada konsentrasi 0.50 mg/mL. Daya hambat dan bunuh F1.2 terhadap S. epidermidis berturut-turut diperoleh konsentrasi pada 0.50 dan 2.00 mg/mL. Fraksi tersebut juga memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat, yaitu mampu menghambat 50% radikal bebas (DPPH) pada konsentrasi 30.94 μg/mL. Aktivitas antibakteri kloramfenikol dan tetrasiklin dan aktivitas antioksidan asam askorbat masih lebih baik dibandingkan dengan F1.2, F1.2 berpotensi untuk digunakan sebagai antibakteri dalam mengobati penyakit kulit termasuk gatal-gatal dan infeksi dan sebagai antioksidan untuk mencegah penuaan dini.

Identitas Senyawa Aktif

Noda F1.2 pada KLT berwarna kuning hijau, setelah dipaparkan amonia berubah menjadi merah jingga di bawah paparan sinar UV 254 nm (Lampiran 10). Dapat diprediksi bahwa senyawa tersebut tergolong golongan flavonoid auron (Gambar 8) yang polaritasnya cenderung polar dan banyak ditemukan di alam sebagai glikosida (Harborne 1987). Identifikasi selanjutnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Panjang gelombang maksimum pada spektrum UV-Vis berkisar 390-430 nm (Markham 1988) yang menunjukkan panjang gelombang maksimum untuk auron (Lampiran 11). Identifikasi gugus

14  

fungsi dengan FTIR juga menunjukan senyawa tersebut adalah auron (Lampiran 12). Dugaan tersebut didukung dengan munculnya puncak pada bilangan gelombang 749.55 cm-1 (cincin aromatik 1,2 disubstitusi), 1571.10 dan 1466.22 cm-1 (C=C aromatik), 1657.11 cm-1 (C=O keton), 1281.12 dan 1069.03 cm-1(vinil eter), dan 3447.60 cm-1 (regang OH) (Pavia et al. 2001). Namun, muncul puncak-puncak kecil pada spektrum UV-Vis dan puncak lain pada spektrum FTIR yang menunjukan keberadaan golongan flavonol, khalkon, dan flavon sehingga F1.2 tidak murni seutuhnya (Markham 1988). Auron jarang ditemukan di alam, flavonoid ini hasil siklisasi dari khalkon (Harborne 1987). Gugus fenolik yang terdapat pada strukturnya berperan sebagai antibakteri dan antioksidan.

Gambar 8 Struktur auron (Detsi et al. 2009)

  

SIMPULAN DAN SARAN

Ekstrak metanol sisa merupakan ekstrak paling efektif dibandingkan ekstrak dan minyak atsiri karena memiliki aktivitas terbaik dengan konsentrasi hambat minimum (KHM) terhadap S. aureus dan S. epidermidis berturut-turut 1.00 dan 2.00 mg/mL, konsentrasi bunuh minimum (KBM) >2.00 mg/mL, dan konsentrasi hambat 50% (IC50) antioksidan 27.88 μg/mL. Pemurnian dengan kromatografi kolom dan KLT preparatif menghasilkan F1.2 sebagai fraksi teraktif (KHM terhadap S. aureus dan S.epidermidis berturut-turut 0.25 dan 0.50 mg/mL, KBM berturut-turut 0.50 mg/mL dan 2.00 mg/mL, dan IC50 30.94 μg/mL). Namun, aktivitas antibakteri kloramfenikol dan tetrasiklin terhadap kedua bakteri tersebut masih lebih baik dibandingkan sampel (KHM terhadap S. aureus dan S.epidermidis berturut-turut 0.03 dan 0.02 mg/mL dan KBM 0.06 dan 0.02 mg/mL) dan aktivitas antioksidan asam askorbat sembilan kali lebih baik dibandingkan sampel (IC50 3.90 μg/mL). Hasil identifikasi senyawa F1.2 menggunakan pelat KLT, spektrofotometer UV-Vis, dan FTIR menunjukkan senyawa aktif yang diduga adalah auron. Karakterisasi senyawa aktif dapat didukung pula menggunakan resonansi magnetik inti (NMR) dan spektrometer massa (MS) setelah dilakukan pemurnian lebih lanjut.  

DAFTAR PUSTAKA

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2007. Official Methods of AOAC International. Revisi ke-2. Volume ke-1. Maryland: AOAC International.

Aulia IA. 2008. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat Etanolik Daun Arbenan (Duchesnea indica (Andr.) Focke) terhadap Staphylacoccus

15  

aureus dan Pseudomonas aeruginosa Multiresisten Antibiotik [skripsi]. Surakarta (ID): UMS.

Asaolu MF, Asaolu SS, Fakunle JB, Emman-Okon BO, Ajayi EO, Togun RA. 2010. Evaluation of in-vitro antioxidant activities of methanol extracts of Persea americana and Cnidosculus aconitifolius. Pakistan J of Nutr 9 (11): 1074–1077.

Batubara I, Mitsunaga T, Ohasi H. 2009. Screening antiacne potency of Indonesian medical plants: antibacterial, lipase inhibition, and antioxidant activities. J Wood Sci 55: 230–235.

Chagas-Paula DA, Oliveira RB, Silva VC, Gobbo-Neto L, Gasparoto TH, Campanelli AP, Faccioli LH, Da Costa FB. 2011. Chlorogenic acids from Tithonia diversifolia demonstrate better anti-inflammatory effect than indomethacin and its sesquiterpene lactones. J Ethnopharmacol 136: 355–362.

Chukwuka KS & Omotayo OE. 2008. Effects of tithonia green manure and water hyacinth compost application on nutrient depleted soil in South-Western Nigeria . Inter J of Soil Sc. 3: 69–74.

Detsi A, Madjalani M, Kontogiorgis CA, Hadjipavlou-Litina D, Kefalas P. 2009. Natural and synthetic 20-hydroxy-chalcones and aurones: Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant and soybean lipoxygenase inhibitory activity. Biorg and Med Chem 17: 8073–8085.

Elufioye TO, Agbedahunsi JM. 2004. Antimalarial activities of Tithonia diversifolia (Asteraceae) and Crossopteryx febrifuga (Rubiaceae) on mice in vivo. J Ethnopharmacol. 93: 167–171.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia Ed ke-2. Padmawinata K, Soedira L, penerjemah; Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method.

Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extract. London (GB): Chapman & Hall.

Hudayanti M. 2008. Aktivitas Antibakteri Rimpang Temulawak [skripsi]. Bogor (ID): IPB.

Jamal Y, Agusta A. 1995. Komponen Kimia Dan Uji Daya Antibakteri Ekstrak Daun Kirinyu (Tithonia diversifolia). Bogor (ID): Laboratorium Treub, Puslitbang Biologi-LIPI.

[Kemenkes RI] Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. 1994. Persyaratan Obat Tradisional. Jakarta (ID): Kemenkes RI.

Lindsay JA. 2008. Staphylococcus:Molecular Genetics. Inggris: Caister Aca Pr.g. Madigan M. 2005. Brock Biology of Microorganisms. London (GB): Prentice-

Hall. Markham KK. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinara K,

penerjemah; Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid Identification.

Meloan CE. 1999. Chemical Separation. Principle, Techniques and Expremints. Kanada: John Wiley and Sons.

Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioksidan activity. Songklanakarin J Sci Technol 26(2):211–219.

16  

Muchtaridi, Apriyantono A, Subarnas A, Budijanto S. 2003. Analysis of volatile active compounds of essential oils of some aromatic plants possessing inhibitory properties on mice locomotor activity. Proceeding in International Symposium on Biomedicine. Bogor: Biopharmaca Centre IPB, 18–19 September. Tumbuhan Obat Indonesia 3:23.

Obafemi CA, Sulaimon TO, Akinpelu DA, Olugbade TA. 2006. Antimicrobial activity of extracts and a germacranolidetype sesquiterpene lactone from Tithonia diversifolia leaf extract. African J of Biotech 5 (12): 1254–1258.

Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS. 2001. Introduction to Spectroscopy. Washington (US): Thomson Learning, Inc.

Salazar-Aranda R, Perez-Lopez LA, Lopez-Aroyyo L, Alanis-Garza BA, Waksman de Torres N. 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of plant from Northeast of Mexico. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.

Shyur L, Tsung J, Chen Je, Chiu C, Lo C. 2005. Antioxidant properties of extracts from medical plants popularly used in Taiwan. Inter J of App Sci and Eng 3(3):195–202.

Soetjipto H, Dewi L, Prayitno SA. 2008. Isolasi dan Identifikasi senyawa antibakteri minyak atsiri daun kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray). Berita Biologi : Jurnal Ilmiah Nasional 9: 155–162.

Taofik M, Yulianti M, Barizi A, Hayati EK. 2010. Isolasi dan identifikasi senyawa aktif ekstrak air daun ki pahit (Thitonia diversifolia) sebagai bahan insektisida botani untuk pengendalian hama tungau Eriophyidae. Alchemy 2 (1): 104–157.

Utami ER. 2012. Antibiotika, resistensi, dan rasionalitas terapi. SAINTIS 1(1): 124–138.

Watson DG. 2007. Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa farmasi dan Praktisi Farmasi. Syarief WR, penerjemah; Jakarta (ID): Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Pharmaceutical Analysis.

Wahyuningsih MSH, Wahyuono S. 1999. Skrining toksisitas dengan BST dari daun beberapa spesies tanaman yang secara tradisional untuk mengobati tumor di Indonesia. BIK 31(1):17–22.

Yuhernita, Juniarti. 2011. Analisis senyawa metabolit sekunder dari ekstrak metanol daun surian yang berpotensi sebagai antioksidan. Makara Sains seri B 1 (15): 48–52.

Zhao G, Li X, Chen W, Xi Z, Sun L. 2012. Three new sesquiterpenes from Tithonia diversifolia and their anti-hyperglycemic activity. Fitoterapia 83: 1590–1597.

 

17  

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

Distilasi daun basah Dikeringkan dan digiling

Partisi dengan etil asetat

Ekstraksi dengan metanol

Partisi dengan n-heksana, etil asetat, dan air

Analisis GCMS -Uji Fitokimia -Uji Antibakteri dan Antioksidan

-Penentuan eluen terbaik -Fraksionasi kromatografi kolom

-Uji Fitokimia Lanjutan -Uji antibakteri dan antioksidan -Fraksionasi lanjut KLT preparatif

Identifikasi senyawa dengan Spektrofotometer UV-vis dan FTIR

Koleksi sampel daun ki pahit

Distilat sampel daun Serbuk sampel daun Kadar air dan abu

Ekstrak Metanol Distilat

Rendemen minyak atsiri

Ekstrak teraktif

Kromatogram

Fraksi n-heksana

Fraksi etil asetat

Fraksi metanol

F3 F4 F5 F6 F8 F7 F9 F10 F11 F12 F13 F2 F1

F1.3 F1.4 F1.5 F1.6 F1.7 F1.8 F1.9 F1.10 F1.2 F1.1 F1.11

Fraksi Aktif

18  

Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman ki pahit

 

  

 

 

19  

Lampiran 3 Penentuan kadar air serbuk sampel ki pahit

Ulangan Bobot sampel (g)

Bobot sampel setelah

dikeringkan (g)

kadar air (%)

1 2.0001 1.9167 4.17 2 2.0013 1.9231 3.91 3 2.001 1.9249 3.8

rerata 3.96 STDEV 0.19

Contoh perhitungan:

% kadar air = B B

B x 100%

= . .

. x 100%

= 4.17 %

% rerata kadar air = % % %

= 3.96%   Lampiran 4 Penentuan kadar abu serbuk sampel ki pahit

Ulangan Bobot sampel (g)

Bobot abu (g)

kadar abu (%)

1 2.0053 0.2307 11.5 2 2.0024 0.2306 11.52 3 1.9988 0.2207 11.04

rerata 11.35 STDEV 0.27

Contoh perhitungan:

% kadar abu = B

x 100%

= . .

x 100%

= 11.5 %

% rerata kadar air = % % %

= 11.35 %  

20  

Lampiran 5 Penentuan rendemen ekstrak metanol sisa

Ulangan Bobot sampel

(g)

Bobot ekstrak pekat (g)

Randemen (%)

Basah Kering

1 49.1855 1.2198 2.48 2.58 2 49.9763 1.4743 2.95 3.07 3 50.0485 1.5465 3.09 3.22

Rerata rendemen (%) 2.84 2.96 STDEV 0.32 0.33

Contoh perhitungan:

% rendemen basah = B

x 100%

= . .

x 100%

= 2.58%

% rerata rendemen basah = % % %

= 2.84 %

% rendemen kering = B

x 100%

= .

. . x 100%

= 2.96%

% rerata rendemen kering = % % %

= 2.96 % Lampiran 6 Rendemen minyak atsiri

Bobot minyak atsiri : 0.0866 g Bobot daun segar : 1500 g Randemen minyak atsiri : 5.77 x 10-3 %

Contoh perhitungan:

% rendemen minyak atsiri = B

x 100%

= .

x 100%

= 5.77 x 10-3 %

21  

% rendemen kering = B

x 100%

= .

. x 100%

= 6.01 x 10-3 % Lampiran 7 Penentuan komponen minyak atsiri menggunakan instrumen GCMS

Lampiran 8 Contoh perhitungan nilai IC50 DPPH untuk ekstrak metanol sisa Contoh perhitungan: Penentuan IC50 y = 23.234ln(x) - 28.401 50 + 28.401 = 23.234ln(x) X = 29.207 µg/ml

Rerata IC50 = IC IC U IC

= 27.8756 µg/ml

8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

Time-->

Abundance

TIC: DP.D

10.36 10.58 11.93 12.60 12.70

12.95

13.08

13.14

13.23

13.60

13.70 13.85

13.93 14.02

14.11 14.22 14.38 14.68

14.93

15.33 15.42

15.52

15.63

15.79 15.84 15.91 15.97 16.07 16.23 16.37 16.47

16.57 16.63 16.81 16.94 17.02 17.16 17.24 17.52 17.62 17.91 18.24 18.34 18.87 19.01 19.25

19.76

20.04 20.34 21.10 22.08 22.30 22.54

24.18 26.83 29.76

22  

Lampiran 9 Fitokimia lanjutan dan antioksidan secara bioautografi

Sampel Rf Kemampuan antioksidan

Keberadaan Flavonoid

Keberadaan Steroid

Metanol 0.05, 0.08, 0.12, 0.18, 0.34, 0.59, 0.66, 0.86, 0.9, 0.94 + + +

0.44, 0.54, 0.73, 0.79 -

F1 0.05, 0.10, 0.14, 0.44, 0.66,

0.85, 0.90, 0.94 + + + 0.55, 0.74, 0.80 -

F2 0.05, 0.15, 0.43, 0.66, 0.79,

0.84, 0.90,0.95 + + - 0.55 -

F3 0.06, 0.18, 0.34, 0.55, 0.65,

0.89, 0.94 + + -

0.44, 0.78 -

F4 0.05, 0.32 + + - 0.4 -

F5 0.04, 0.06, 0.11, 0.18, 0.94 + + - 0.32, 0.41, 0.50 -

F6 0.04, 0.08, 0.11, 0.18, 0.34 + + - 0.4 -

F7 0.05 + + - F8 0.03 + + - F9 0.05, 0.11 + + - F10 0.40, 0.10, 0.15 + + - F11 0.04 + + - F12 0.06 + + - F13 0.06 + + -

Lampiran 10 Hasil identifikasi senyawa F1.2 menggunakan KLT analitik (a)

sebelum ditambah uap amonia dan (b) setelah ditambahkan uap amonia

(a) (b)

23  

Lampiran 11 Identifikasi senyawa aktif F1.2 menggunakan spektrofotometer UV-Vis

Lampiran 12 Identifikasi senyawa aktif F1.2 menggunakan FTIR

 

Panjang gelombang (nm)

Abs

orba

ns

Bilangan gelombang (cm-1)

Tran

smita

ns (%

)

24  

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Bogor, 11 Februari 1992. Penulis merupakan anak pertama dari pasangan Suparman dan Siti Jubaedah. Pada tahun 2009, penulis lulus dari SMAN 1 Cigombong dan melanjutkan studi di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI). Selama masa kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan, antara lain organisasi, kegiatan program kreativitas mahasiswa, dan mengajar privat untuk pelajar SMA dan Mahasiswa. Organisasi yang pernah diikuti selama kuliah, yaitu anggota Departemen Sosial dan Kesejahteraan Mahasiswa, Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) TPB IPB (2009-2010), Pasukan Pengibar Bendera (Paskibra) IPB (2010), Anggota Komisi III Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) FMIPA IPB mengawasi bidang sains, teknologi, komunikasi dan informasi (2010-2011), serta Dewan Pengawas Ikatan Mahasiswa Kimia (DPI) IPB (2012). Selain itu, penulis pernah menjadi asisten praktikum, antara lain Asisten Kimia B (2010-2013), Kimia Anorganik (2011), Kimia Biologis (2012), Azas Kimia Analitik (2012), Kimia Dasar 1 (2012), Kimia Dasar 2 (2012-2013), dan Asisten Spektrofotometri dan Analisis Kemometrik (2013).

Penulis pernah mengikuti pekan ilmiah mahasiswa nasional (PIMNAS) XV di Universitas Muhammadiyah Yogyakarta tahun 2012 dan mengikuti perlombaan keilmiahan lainnya. Tahun 2013, penulis memperoleh dana hibah dikti untuk program kreativitas mahasiswa (PKM) yang berjudul Hubungan Kadar Logam pada Kuku Siswa Sekolah Dasar dan Pendapatan Orang Tua, Solusi Pendeteksian Dini Tingkat Kecukupan Gizi. Penulis juga pernah melakukan praktik lapangan di Laboratorium Air dan Udara, SEAMEO Biotrop dengan judul laporan Analisis Kualitas Udara Ambien dengan Parameter Fisika, Kimia, dan Kebisingan di Industri Garmen.